KR101313786B1

KR101313786B1 - 벼흰잎마름병 방제용 조성물

Info

Publication number: KR101313786B1
Application number: KR1020110143206A
Authority: KR
Inventors: 김정구; 이충환; 박샛별; 서주원; 이인애
Original assignee: 명지대학교 산학협력단; 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2011-12-27
Filing date: 2011-12-27
Publication date: 2013-10-01
Also published as: KR20130075026A

Abstract

본 발명은 스트렙토마이세스 보트로펜시스 MJM3389(Streptomyces bottropensis MJM3389) 균주로부터 생산되는 두나이마이신 D3S(Dunaimycin D3S)를 포함하는 벼흰잎마름병 방제용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 벼흰잎마름병 방제용 조성물은 세계 3대 식물 중 하나인 벼의 가장 큰 피해를 야기하는 벼흰잎마름병을 억제하여 벼 재배 지역의 피해를 최소화할 수 있다.

Description

벼흰잎마름병 방제용 조성물{Composition for rice bacterial blight suppressing activity}

본 발명은 스트렙토마이세스 보트로펜시스 MJM3389 균주로부터 생산되는 두나이마이신 D3S을 포함하는 벼흰잎마름병 방제용 조성물에 관한 것이다.

벼흰잎마름병의 병징은 묘판 후기에 아래 잎의 가장자리에 물에 젖은 듯한 작은 병반이 나타나며, 그 표면에 분출된 세균의 마른 딱지가 형성된다. 발병된 지 며칠이 지나면 병반이 노란색으로 변하게 되고, 잎의 끝부분부터 하얗게 마르면서 잎이 죽게 된다. 감수성이 매우 높은 품종에서는 묘를 이앙한 후부터 분얼 최성기까지의 벼가 갑자기 말라죽는 급성형 병징(kresek)이 있는데 잎에서는 뚜렷한 병징이 없고, 잎의 가장자리나 잎 끝에 좁쌀보다 작은 세균의 마른 딱지가 보일 뿐이다. 분얼 최성기 이후 성숙된 잎에 나타난 병증상은 5∼6cm 아래의 잎 가장자리에 물에 젖은 듯한 작은 무늬가 생긴다. 아침 이슬이 맺힐 때 이 병반의 표면에는 옅은 우유빛의 이슬이 맺히며, 이것이 말라서 황색의 딱지로 남아 있는 것을 볼 수 있다. 3~7일간 병이 진전되면 병반이 커지면서 황색∼등황색이 되고, 건강한 잎조직과의 경계는 물에 젖은 듯한 수침상으로 된다. 병반은 잎의 한쪽 또는 양쪽 가장자리에 형성되어 진전되며, 후에 잎 중앙맥까지 번지며 물결 모양으로 확대된다. 병이 더 진전되면 황백색 병반이 백색∼회백색으로 변하고, 부생균에 의해 오염되면서 더러운 색깔로 변한다.

벼흰잎마름병원균인 Xanthomonas oryzae pv . oryzae는 그람음성의 호기성 세균으로서 단극모를 가지고 있고, 막대모양이다. 고체배지 상에서 황색의 집락(colony)을 형성하며, 자라는 속도는 다소 느리고, 생육 최적온도는 26∼30℃이다. 병반에 말라붙은 세균덩어리나 병들어 죽은 식물체 속에 남아 있는 병원세균은 8개월 이상 살 수 있으나, 고온 ·다습한 환경에서는 짧은 시일 내에 죽는다.

발병을 일으키는 생태는 병원세균은 수로나 저수지에 흔히 볼 수 있는 잡초 중에 겨풀, 나도겨풀의 근권이나 병든 볏짚에서 월동한다. 월동한 병원세균들이 1차전염원이 되어 논물에 유입된 후 수면에 접촉된 벼잎의 배수선이나 기공으로 침입하여 병반을 형성하게 된다. 병반에서 증식된 병원세균이 2차 전염원이 되어 논물 속으로 배출되거나 직접 병반과 건전한 벼 조직의 접촉에 의하여 전염된다. 강한 바람은 벼에 상처를 주어 병원세균이 침입하기 쉽게 하고, 병반부에서 누출된 병원세균을 바람에 실어 50m 이상 운반한다. 또한 태풍에 동반된 많은 비로 인해 벼가 물에 잠기게 되면 배수선이나 기공을 통한 병원세균의 침입이 더욱 쉬워진다. 7월 평균기온이 22∼24℃로 저온일 때, 7월의 강수량이 200mm 이상으로 많은 비가 올 때, 15m/sec 이상의 강풍이 불 때 이 병의 발생이 특히 많아진다. 모판이나 본답에서 질소비료를 많이 주게 되면 벼가 감수성으로 되어 이 병의 발병을 촉진시킨다.

일본 공개특허공보: 2004-210648(2004.7.29공개)

본 발명은 벼흰잎마름병의 활성을 억제하는 벼흰잎마름병 방제용 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 두나이마이신 D3S를 포함하는 벼흰잎마름병 방제용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 (a)스트렙토마이세스 보트로펜시스 MJM3389(Streptomyces bottropensis MJM3389) 균주를 배양하는 단계; (b)상기 배양물을 유기용매로 추출하는 단계; (c)상기 추출물에 대해 크로마토그래피를 수행하여 활성분획을 수득하는 단계; (d)상기 활성분획을 정제하는 단계를 포함하는 두나이마이신 D3S의 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 방제용 조성물을 벼, 벼의 종자 또는 벼의 재배 토양에 처리하는 것을 특징으로 하는 벼흰잎마름병 방제 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 벼흰잎마름병 방제용 조성물은 세계 3대 식물 중 하나인 벼의 가장 큰 피해를 야기하는 벼흰잎마름병을 억제하여 벼 재배 지역의 피해를 최소화할 수 있다.

도 1은 스트렙토마이세스 보트로펜시스 MJM3389 균주에서 유래된 두나이마이신 D3S의 화학식이다.
도 2는 스트렙토마이세스 보트로펜시스 MJM3389 균주에서 유래된 보트로마이신 A2 및 두나이마이신 D3S의 동정을 위한 실험계획을 나타낸 도면이다.
도 3은 화합물A를 LC-ESI/MS로 분석한 크로마토그램과 스펙트럼이다. (A: Sephadex LH-20 겔크로마토그래피를 통해 용출된 활성 분획의 크로마토그램과 C18 RP-HPLC로 정제된 순수한 화합물A의 크로마토그램 B: 화합물A의 양이온모드 m/z값을 나타낸 스펙트럼.)
도 4는 벼잎 외식편의 벼흰잎마름병 감염에 대한 화합물A(두나마이신 D3S)의 생물활성도를 그래프로 나타낸 것이다.

본 발명은 도 1의 두나이마이신 D3S를 포함하는 벼흰잎마름병 방제용 조성물을 제공한다.

스트렙토마이세스에서 유래되는 백색 고체인 두나마이신은 면역억제제, 항진균제 활성이 알려져 있고, A1, C1, C2, D2, D2S, D3, and D4S D3S의 구성이 있다. 두나마이신 D3S는 C8 위치에 당 잔기를 포함하는 매크로라이드(macrolide)로 알려져 있으며, 구조는 도 1과 같다.

본 발명의 한 구체예에서, 두나마이신 D3S가 벼흰잎마름병에 항균 활성을 나타냄을 처음으로 확인하였고, 벼잎 외식편에서 두나마이신 D3S의 활성이뛰어남을 알아내었다.

본 발명은 상기 두나이마이신 D3S가 스트렙토마이세스 보트로펜시스 MJM3389(Streptomyces bottropensis MJM3389) 균주에서 유래된 것인 벼흰잎마름병 방제용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 벼흰잎마름병이 잔토모나스 속 세균에 의해 발생되는 식물병임을 특징으로하는 벼흰잎마름병 방제용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 한 구체예에서, 신규한 균주 스트렙토마이세스 보트로펜시스 MJM3389 유래 두나이마이신 D3S가 벼흰잎마름병을 유발하는 병원균 Xanthomonas oryzae pv . oryzae KACC 10331에 대한 우수한 항균활성을 가진다는 것이 본 발명자들에 의하여 확인되었다.

특히, 식물병원체에 대한 억제 활성이 알려진 자연 페놀 화합물인 Pseudomonas fluorescens 그람음성박테리움 DAPG(2,4-diacetylphloroglucinol)보다 더 큰 저항활성을 보임을 실험적으로 밝혔다.

본 발명은 (a)스트렙토마이세스 보트로펜시스 MJM3389(Streptomyces bottropensis MJM3389) 균주를 배양하는 단계; (b)상기 배양물을 유기용매로 추출하는 단계; (c)상기 추출물에 대해 크로마토그래피를 수행하여 활성분획을 수득하는 단계; (d)상기 활성분획을 정제하는 단계를 포함하는 보트로마이신 A2 및 두나이마이신 D3S의 제조방법을 제공한다.

상기 활성분획을 수득하는 단계 후에, (e) 상기 수집된 물질에 대해 질량분석을 수행하여 보트로마이신 A2 및 두나이마이신 D3S을 확인 하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 (b)단계의 유기용매는 물과 섞이지 않는 적절한 극성도의 용매는 모두 가능하나 잔효가 길어 환경오염을 유발하는 염화메틸렌, 클로로포름 등의 유기염소계 용매 보다 아세트산에틸 등의 용매가 바람직하다.

상기 (b)단계의 크로마토그래피는 이에 제한되는 것은 아니지만 흡착제로서 실리카겔, 역상실리카겔, 세파덱스류, 다이아이온 레진류, 알루미나, 활성탄, 규산마그네슘, 탄산칼슘, 인산칼슘, 인산마그네슘, 마그네시아 또는 수산화칼륨 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 세파덱스류를 사용할 수 있다. 보다 구체적으로는, 세파덱스 겔 컬럼 크로마토그래피를 수행한 후 고성능 액체 크로마토그래피를 한번 더 수행할 수 있다.

본 발명에 따른 두나이마이신 D3S를 생산하는 스트렙토마이세스 보트로펜시스 MJM3389균주 또는 그 배양 여액을 포함하는 벼흰잎마름병 방제용 조성물을 제공한다.

상기 두나이마이신 D3S 유효성분으로 포함하여 벼흰잎마름병 방제용 살균제를 제조하기 위하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 충전제, 중량제, 계면활성제 등을 혼합하여 벼흰잎마름병 방제용 조성물을 제조하는 것이 가능하다.

본 발명의 한 구체예에서, 실시예3의 표2를 함고하면, 본 발명의 두나이마이신 D3S는 기존에 알려진 항생제인 DAPG에 비해 적은 양으로도 항균 활성을 나타내는 바, 벼흰잎마름병원균의 방제에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 방제용 조성물을 벼, 벼의 종자 또는 벼의 재배 토양에 처리하는 것을 특징으로 하는 벼흰잎마름병 방제 방법을 제공한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1> 벼흰잎마름병에 항균 활성을 갖는 스트렙토마이세스 보트로펜시스 MJM3389( Streptomyces bottropensis MJM3389 ) 균주의 분리 및 동정

임실군(전북, 한국)에서 얻은 1g의 토양 샘플을 세척하여 60℃에서 30분 동안 가열하였다. 스트렙토마이세스를 분리하기 위해 샘플을 HV(Humic acid vitamin) 한천 배지로 옮겼다.

스트렙토마이세스를 10l의 GSS 배지 (가용 녹말 1%, 글루코스 2%, 대두박 2.5%, 쇠고기 추출물 0.1%, 효모 추출물 0.4%, NaCl 0.2%, K2HPO4 0.025%, and CaCO3 0.2%, at pH 7.2)에서 발효시키고 16개의 2l 삼각 플라스크에 650 ml씩 나누어 담았다. 발효는 배양기를 200rpm으로 흔들면서 28℃에서 7일간 수행하였다.

스트렙토마이세스 균주의 전장 16S rDNA 를 유니버셜 프라이머 세트(universal primer set)인 27F (5'-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3') 및 1492R (5'-GGA TAC CTT GTT ACG ACT T-3')를 이용하여 증폭하였고, 상기 서열을 NCBI 홈페이지 (National Center for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 분석하였다(도 2).

그 결과 분리된 스트렙토마이세스 균주는 스트렙토마이세스 보트로펜시스 GU201851 (S. bottropensis GU201851) 균주와 99%의 상동성을 가짐을 확인하였다. 따라서 분리된 스트렙토마이세스 균주를 스트렙토마이세스 보트로펜시스 MJM3389 (Streptomyces bottropensis MJM3389)로 명명하고 희귀유용미생물추출은행 ECUM (http://www.ecum.or.kr)에 등록하였으며, 명지대학교에서 분양 받을 수 있다.

< 실시예 2> 스트렙토마이세스 보트로펜시스 MJM3389 로부터 두나이마이신 D3S 의 분리

스트렙토마이세스 보트로펜시스 MJM3389 10 l를 원심분리하여 상등액을 에틸아세테이트로 추출하였다. 상기 추출물을 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피(컬럼 직경은 2.2 cm, 길이는 110 cm)로 분별하여 1시간 동안 매분 마다 활성 분획을 C18 RP-HPLC(reverse-phase high-performance liquid chromatography)에 의해 분리해 내었다. 32분에 활성 화합물A를 수득하였다.

분자량을 LC-ESI/MS로 분석한 결과 화합물A의 분자량은 907 (m/z값: [M+H]+ 908, [M+FA-H]- 952)였고, 분자식은 C₅₀H₈₅NO₁₃ ([M+H]+ 908.6101, HR-FAB/MS)으로 분석되었다.

두나이마이신 D3S의 이론적인 HR/MS 값은 [M+H]+ 908.6099이다. 600 MHz에서의 1H NMR 데이터를 기존의 연구들과 비교 분석한 결과, 화합물 1 및 2는 각각 보트로마이신 A2와 두나이마이신 D3S임을 확인하였다(도 3).

Identification	LC-ESI/MS			HR/MS			Formula	UV λmax (nm)
Identification	tR (min)a	[M+H]+ (m/z)	MSn fragmentation	[M+H]+ (m/z)	Calc.b (m/z)	Error ppm	Formula	UV λmax (nm)
화합물A (Dunaimycin D3S)	17.9	908.8	656.9 > 621.1 > 223.5	908.6101e	908.6099	0.2	C₅₀H₈₅NO₁₃	224, 255

< 실시예 3 > 두나이마이신 D3S 의 in vitro 와 벼잎 외식편에서의 활성 실험

Xanthomonas oryzae pv . oryzae KACC 10331 (이하, 'Xoo'라고 한다)에 대한 스타우로스포린의 항균 활성을 스크리닝 하기 위해Xoo 배양 배지를 포함하는 벼잎 외식편에서 벼흰잎마름병의 억제 활성을 2배 연속 희석법을 사용하여 96웰 플레이트에서 수행하였다. 그 효능은 병변 잎 면적의 % (DLA %, Diseased Leaf Area%)로 변환하였으며, DLA%로 식물병의 심각성을 평가하였다. 벼잎 외식편의 감염 면적은 우선 Adobe photoshop CS2를 이용한 이미지 변환 후 그 이미지를 이미지 분석 프로그램으로 분석하여 측정하였다. DPAG를 양성 대조군으로 사용하였으며, MIC값은 병변 잎 면적이 10% 이하로 억제될 때의 최저 농도로 결정하였다.

두나이마이신 D3S는 0.06㎍/㎖의 MIC값을 보였고, 그람음성박테리움 DAPG(2,4-diacetylphloroglucinol)는 32㎍/㎖ MIC값을 나타냈다(도 4).

Compound	MIC (μg/ml)
Compound	In rice explants
CompoundA (Dunaimycin D3S)	0.06
DAPG	32

Claims

하기 화학식Ⅰ의 두나이마이신 D3S(Dunaimycin D3S)를 포함하는 벼흰잎마름병 방제용 조성물.
[화학식Ⅰ]
제1항에 있어서,
상기 두나이마이신 D3S는 스트렙토마이세스 보트로펜시스 MJM3389(Streptomyces bottropensis MJM3389) 균주에서 유래된 것인 벼흰잎마름병 방제용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 벼흰잎마름병은 잔토모나스(Xanthomonas) 속 세균에 의해 발생되는 식물병임을 특징으로하는 벼흰잎마름병 방제용 조성물.
(a)스트렙토마이세스 보트로펜시스 MJM3389(Streptomyces bottropensis MJM3389) 균주를 배양하는 단계; (b)상기 배양물을 유기용매로 추출하는 단계; (c)상기 추출물에 대해 크로마토그래피를 수행하여 활성분획을 수득하는 단계; (d)상기 활성분획을 정제하는 단계를 포함하는 두나이마이신 D3S의 제조방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 방제용 조성물을 벼, 벼의 종자 또는 벼의 재배 토양에 처리하는 것을 특징으로 하는 벼흰잎마름병 방제 방법.