CN102925511B - 星形孢菌素的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种星形孢菌素的制备方法，所述的星形孢菌素的分子式为C28H26N4O3，其是通过发酵疮痂链霉菌许昌亚种CGMCC No.5213制备得到的。本发明利用疮痂链霉菌发酵生产星形孢菌素，为星形孢菌素的生产提供了新的途径。由疮痂链霉菌许昌亚种产生的星形孢菌素对多种植物病原真菌具有很强的拮抗作用，对TMV也有较强的体外钝化作用，具备作为农用抗生素的开发潜力。
Description
技术领域
本发明属于化合物合成的技术领域，主要涉及一种利用发酵方法制备星形孢菌素的制备方法。
背景技术
农药是解决世界粮食问题，保证农作物稳产、高产不可缺少的重要物资，同时也是一个能获得巨大经济利益和社会效益的产业。然而，化学农药残留所引起的环境污染、人畜中毒、病虫抗药性增强等问题日趋严重，大力研究、开发、生产和应用生物农药，已成为全球农业产业发展的新趋势。目前世界各国正在采取实际步骤减少化学农药的使用，如美国环保局曾宣布撤销91种化学农药的登记；欧盟制定了减少一半化学农药使用量的五年和十年计划。我国也将发展生物农药和绿色食品列入《中国21世纪议程》。因此，创制和开发拥有我国自主知识产权、高效、安全的生物农药是实现我国农业可持续发展的迫切需要。
星形孢菌素由Omura等(1977)首次从S.staurosporeus代谢产物中分离，是一类吲哚生物碱类抗生素。随后，S.actuosus、S.roseoflavus等从链霉菌中分离获得。研究证明，星形孢菌素是一类非特异性蛋白激酶C抑制剂，能够诱导细胞凋亡，具有抗肿瘤活性。目前，国外研究多集中于其生物活性及抗肿瘤、抗癌的机理。尽管Staurosporine是一种典型的三磷酸腺苷竞争性激酶抑制剂，但由于其非特异性而限制了在临床上的应用，目前，已明确了该化合物的生物合成途径，由于其结构合成的复杂性和重要的生理活性而引起了众多有机合成化学家的兴趣，将其作为先导化合物开发潜在的抗癌抗肿瘤潜在药物将成为今后研究的重点。在植物病害防治研究方面，S.roseoflavus strain LS-A24产生的星形孢菌素对多种细菌和植物病原真菌具有较强的抑制作用，且对辣椒疫霉(Phytophthora capsici)引起的辣椒疫病具有良好的防治作用。
链霉菌是放线菌中产生抗生素种类最多的属，目前，大约发现了550种链霉菌，而且仍然有新的种在不断被发现。在已发现的链霉菌中，只有少数种是植物病原菌，其中，疮痂链霉菌是引起马铃薯疮痂病的主要病原菌之一。目前国内外对马铃薯病原菌的研究主要集中在多样性、致病性、毒素及其遗传多样性等方面，近年来国外已有报道将其作为有益菌株进行开发研究。在国内还未见将链霉菌作为生防菌株进行研究的相关报道，因此，将该菌作为生防菌株进行发酵条件的优化和代谢产物的分离纯化等方面的研究具有重大的意义。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明的目的在于提供一种星形孢菌素的制备方法。由疮痂链霉菌许昌亚种产生的星形孢菌素对多种植物病原真菌具有很强的拮抗作用，对TMV也有较强的体外钝化作用，具备作为农用抗生素的开发潜力。
为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种星形孢菌素的制备方法，所述的星形孢菌素的分子式为C28H26N4O3，结构式为，其是通过发酵疮痂链霉菌许昌亚种CGMCC No.5213制备得到的。
其中，疮痂链霉菌许昌亚种CGMCC No.5213是从河南省许昌市小麦和油菜耕作田土壤中分离筛选获得，并且已于2011年09月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏登记号为CGMCC No.5213。
其中，发酵所述疮痂链霉菌许昌亚种CGMCC No.5213的最佳培养基的组成为：可溶性淀粉2wt％，黄豆饼粉4wt％，MgSO40.075wt％、K2HPO40.1wt％、FeSO4·7H2O 0.001wt％，余量为水。
其中，发酵所述疮痂链霉菌许昌亚种CGMCC No.5213的最佳发酵条件为：发酵温度28℃，转速200r/min，发酵时间5d。
其中，发酵所述疮痂链霉菌许昌亚种CGMCC No.5213的最佳发酵条件为：初始pH 7.0，发酵温度28℃，种子液种龄48h，接种量6wt％，转速200r/min，发酵时间5d。
其中，所述制备方法，还包括分离纯化步骤，并且其分离纯化步骤：发酵液经无水乙醇预处理后，采用乙酸乙酯萃取，萃取液通过硅胶柱层析和硅胶薄层层析，层析液再经高效液相。
其中，所述的乙酸乙酯萃取步骤是指将3倍(V/V)体积的乙酸乙酯加入到浓缩10倍的预处理发酵液中，然后动态萃取2h，静止30min，收集有机相，反复萃取3次，合并有机相，减压蒸干得乙酸乙酯相，再用氯仿和甲醇(V/V＝1∶1)溶解有机相得到所述萃取液。
其中，所述的硅胶柱层析步骤包括：取柱层用硅胶，用无离子水浸泡3h，抽干；再用浓HCl洗涤除去残留的铁和铝，然后用无离子水洗至中性，抽干，用无水乙醇浸泡过夜，抽干；120℃干燥至恒重；然后，采用石油醚-氯仿-甲醇梯度洗脱，先用石油醚洗脱，然后逐渐增大氯仿的比例，最后增大到用甲醇把所有斑点洗脱下来，洗脱速度1.0mL/min，按洗脱梯度分管收集；以紫外吸收法和滤纸片法测定洗脱液抑菌活性；合并活性组分，减压浓缩，即得粗提品。
其中，所述的硅胶薄层层析步骤包括：薄板的制备：称取薄层层析用硅胶30g，羟甲基纤维素钠0.3g，加无离子水100mL，研磨均匀后，按照每块板约3g硅胶的量，均匀铺板，室温下自然风干，使用前置于烘箱中120℃活化30min，其中板的大小为5cm×20cm；展层剂为氯仿和甲醇，氯仿和甲醇的体积比为10∶1；将上述得的粗提品溶于体积比为1∶1氯仿和甲醇的溶液样品，沿横线均匀点在薄板上，横线距薄板底端的距离为1.5cm，点样量约50μL，上行展层；展层完毕后，将薄板取出，自然风干，置于紫外光照箱中观察、照相，用铅笔在薄板上标出所显示的带谱，利用生物活性测定找到活性带谱；用无菌水将指示菌枣青霉病菌制成孢子悬液，待熔化的PDA培养基放置至45℃左右时混入其中，定量倒入平板，凝固后，将展层完毕后并经紫外线灭菌薄板轻轻反扣在平板上，轻轻压平，静置45min，取下薄板，置25℃恒温培养箱培养48h，观察活性组分的出现情况并测定Rf值。
其中，所述的高效液相色谱纯化步骤包括：取硅胶薄层样品充分溶于甲醇中，用0.45μm微孔过滤器过滤，自动进样器进样，每次进样量为1.5mL；以100％甲醇为流动相，3.5mL/min的泵流速进行循环分离，利用UV检测器在波长291nm处检测所对应的洗脱液并进行活性检测，将所得样品真空浓缩干燥得到星形孢菌素。
本发明利用疮痂链霉菌发酵生产星形孢菌素，为星形孢菌素的生产提供了新的途径。
附图说明
图1菌株SCY114对部分植物病原真菌的抑菌效果A；辣椒疫霉病菌；B：稻曲病菌；C：小麦全蚀病菌；D：小麦纹枯病菌；E：黄瓜枯萎病菌；
图2菌株SCY11416S rRNAPCR产物的琼脂糖凝胶电泳
图3菌株SCY114的16S rDNA全序列分析聚类结果；
图4菌株SCY114 ISR PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；
图5菌株SCY114的ISR全序列分析聚类结果；
图6乙酸乙酯的萃取结果(指示菌为小麦全蚀病菌)A：甲醇∶氯仿(1∶1)；B：粗提液；C：水相；D：有机液；
图7层析液和粗提液的薄层层析结果(枣青霉)A：柱层析液；B：粗提液；
图8薄层层析活性带谱的紫外检测；
图9薄层层析样品的循环制备液相色谱图；
图10不同色谱峰的活性检测，A：保留时间为17.333min和19.166min的混合液；B：保留时间为24.833min；
图11活性物质的高效液相色谱图；
图12活性物质的高分辨率质谱图；
图13活性物质的核磁共振氢谱图；
图14活性物质的HMQC图谱；
图15活性物质的核磁共振碳谱图；
图16活性物质的1H-1H COSY图谱；
图17活性物质的HMBC图谱；
图18活性物质的1H-1H COSY和HMBC谱中主要的相关图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。
主要试剂和仪器
菌株DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；凝胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒和Maker均购自上海莱枫生物科技有限公司；英国Oxoid公司的琼脂糖和牛肉膏；美国Sigma公司的3K30型高速离心机；德国Biometra公司的T-gradient型PCR仪；美国UVP公司的GelDoc-IT型凝胶成像系统；北京六一仪器厂的DYY-8B型电泳仪和DYY-III型电泳槽；日本OLYMPUS公司B202型多功能光学显微镜；日本日立公司S-3400NII型扫描电子显微镜；KP-48型三用石英紫外线检测仪；SPD10101型离心浓缩仪；RE-5000型旋转蒸发仪；日立UV-VIS3010型紫外可见分光光度计；岛津分析型HPLC；日本分析工业株式会社LC-9101型循环制备HPLC；美国Agilent公司液相色谱-质谱Agilent1200series LC/MSD Trap SL ESI；美国Nicolet公司Nicolet6700型傅立叶红外-拉曼-显微光谱仪；美国Bruker公司高分辨四极杆飞行时间串联质谱仪；瑞士Bruker公司Avance500型核磁共振仪；Perkin/Elmer公司Lambda35 UV/VIS Spectrometer。
培养基
分离培养基
高氏一号培养基：可溶性淀粉20.0g，KNO31.0g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO40.01g，琼脂粉15.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.2～74。
活性检测培养基
PDA培养基：土豆200.0g，葡萄糖10.0g，琼脂粉15.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.2。
培养特征观察培养基
(1)胰胨酵母琼脂培养基(ISP1)：胰胨5.0g，酵母膏3.0g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，pH 7.0～7.2。
(2)麦芽汁酵母琼脂培养基(ISP2)：酵母膏4.0g，麦芽提取物10g，葡萄糖4g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，pH 7.3。
(3)燕麦粉琼脂培养基(ISP3)：燕麦粉20g，琼脂18g，无机盐溶液1000mL，pH 7.2。
(4)无机盐淀粉琼脂培养基(ISP4)：溶液I：可溶性淀粉10g，加水溶解总量500mL；溶液II：K2HPO41.0g，MgSO41.0g，NaCl 1.0g，(NH4)2SO42.0g，CaCO32.0g，蒸馏水500mL，无机盐1.0mL，将溶液I和溶液II混合，加琼脂20g，pH7.0～7.4。
(5)甘油天冬酰胺琼脂培养基(ISP5)：L-天冬酰胺1.0g，甘油10.0g，K2HPO410.0g，蒸馏水1000mL，无机盐1.0mL，琼脂20.0g，pH 7.0～7.4。
(6)铁蛋白胨酵母膏琼脂培养基(ISP6)：水解蛋白胨铁琼脂30.0g，蒸馏水1000mL，酵母膏1.0g，pH 7.0～7.2。
(7)酪氨酸琼脂培养基(ISP7)：甘油15.0g，L-酪氨酸0.5g，L-天冬酰胺1.0g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O0.5g，NaCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，蒸馏水1000mL，无机盐1.0mL，琼脂20g，pH 7.2～7.4。
生理生化特征鉴定培养基
(1)牛奶凝固胨化培养基：脱脂鲜牛奶1000mL，CaCO30.02g。
(2)明胶液化培养基：蛋白胨5.0g，葡萄糖20.0g，明胶200.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.2～7.4。
(3)纤维素水解培养基：滤纸条(长5.0cm，宽0.8cm)，MgSO40.5g，NaCl 0.5g，K2HPO40.5g，KNO31.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.2。
(4)硝酸盐还原培养基：MgSO40.5g，K2HPO40.5g，KNO31.0g，蔗糖20.0g，NaCl 0.5g，蒸馏水1000mL，pH 7.2～7.4。
(5)黑色素产生培养基：L-Tyr 1.0g，酵母膏1.0g，NaCl 8.5g，琼脂粉15.0g，蒸馏水1000mL。
(6)柴斯纳(Tresner)培养基：蛋白胨10.0g，柠檬酸铁0.5g，琼脂粉15.0g，蒸馏水1000mL。
(7)碳源利用基础培养基：(NH4)2SO42.64g，K2HPO45.65g，KH2PO42.38g，MgSO4·7H2O 1.0g，CuSO45H2O 0.0064g，FeSO47H2O 0.01g，MnCl2·4H2O0.0079g，ZnSO4·7H2O 0.0015g，蒸馏水1000mL，pH 7.2～7.4。
(8)淀粉水解培养基：可溶性淀粉10.0g，K2HPO40.3g，MgCO31.0g，KNO31.0g，琼脂粉15.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.2～7.4。
其他培养基
(1)LB培养基：酵母提取物5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 10.0g，琼脂粉15.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.0。
(2)发酵培养基：
A：黄豆粉20g，碳酸钙5g，葡萄糖20g，水1000mL。
B：黄豆饼粉10g，葡萄糖10g，蛋白胨3g，食盐2.5g，碳酸钙2g，水1000mL。
C：牛肉浸膏10g，蛋白胨10g，食盐5g，水1000mL。
D：蛋白胨10g，牛内浸膏10g，甘油10g，水1000mL。
E：玉米粉35g，黄豆饼粉10g，磷酸二氢钾1g，食盐3g，碳酸钙3g，硫酸铵4g，水1000mL。
F：黄豆饼粉20g，玉米粉20g，葡萄糖10g，硫酸铵4g，碳酸钙6g，水1000mL。
G：葡萄糖2g，酵母膏2g，牛肉浸膏2g，蛋白胨2g，甘油20g，黄豆饼粉20g，硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾1g.碳酸钙1g，水1000mL。
H：黄豆饼粉15g，可溶性淀粉10g，葡萄糖20g，食盐4g，硫酸铵2.5g，磷酸二氢钾02g，碳酸钙1g，水1000mL。
I：蛋白胨5g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖30g，水1000mL。
J：淀粉20g，食盐0.5g，硝酸钾1g，硫酸亚铁0.01g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.005g，水1000mL。
K：黄豆饼粉20g，可溶性淀粉20g，KNO31.0g，K2HPO40.5g，MgSO4.7H2O 0.5g，FeSO4.7H2O 0.01 g，蒸馏水1000mL，PH7.2～7.4。
L：可溶性淀粉10g，磷酸二氢钾0.3g，氯化钠0.5g，硫酸镁1g，硝酸钾1g，水1000mL。
M：马铃薯20g，葡萄糖20g，水1000mL。
N：玉米粉50g，磷酸二氢钾0.23g，磷酸氢二钠1.15g，硫酸镁0.2g，氯化钾0.2g，水1000mL。
O：黄豆粉饼20g，玉米粉15g，葡萄糖15g，酵母粉4g，磷酸二氢钾1g，碳酸钙3g，氯化钠1g，水1000mL。
(3)种子培养基：同发酵培养基K。
相关溶液
(1)1g/L标准葡萄糖溶液：准确称取1.00g分析纯的无水葡萄糖(100-105℃下烘干至恒重)，溶解于1000mL蒸馏水中。
(2)1％酚酞指示剂：1g酚酞用95％乙醇溶解后，定容到100mL。
(3)碘-碘化钾溶液：称取5.0g碘，10.0g碘化钾溶于100mL蒸馏水中。
(4)DNS试剂：称取5g 3，5-二硝基水杨酸溶于200mL水中，全部溶解后，加入20g NaOH、200g酒石酸钠，加入蒸馏水，使总体积至500mL左右，加热溶解后，加5g苯酚、0.5g无水亚硫酸钠，加热搅拌至全部溶解，冷却，甩水稀释至1000mL，储于棕色瓶中，1周后使用。
(5)0.1mol/L标准甘氨酸溶液：准确称取750mg甘氨酸，溶解后定容至100mL。
(6)中性甲醛溶液：在50mL 36～37％分析纯甲醛溶液中加入1mL0.1％酚酞乙醇水溶液，用0.1mol/L的氢氧化钠溶液滴定到微红，贮于密闭的玻璃瓶中。
实验方法
土壤样品的采集
采集土样时，先用小铲除掉表土，取5～10cm深处的土壤约200～300g，分装入塑料袋中，放入标签后带回实验室分离放线菌，若短时间内不能马上分离土样，则将土样晾干，置于阴凉处保存。
放线菌的分离和纯化
将土样自然风干，120℃干热处理1h，过60目筛，采用梯度稀释法，用添加50mg/L重铬酸钾的高氏一号培养基进行菌种分离，28℃培养7d，将成熟的单菌落转接到高氏一号平板培养基上28℃培养7d后，再挑选单菌落接种到高氏斜面培养基上保存。
目的菌株的筛选
以小麦全蚀病菌为靶标，利用传统的平板对峙法进行初筛，以杯蝶法进行复筛，筛选对小麦全蚀病菌有拮抗活性的链霉菌，记录其编号，并分别转接到高氏一号斜面培养基上保存。
拮抗菌株SCY114(即疮痂链霉菌许昌亚种CGMCC No.5213)的抑菌谱测定
采用琼脂块皿内对峙法：取PDA平板培养基上培养好的靶标真菌菌饼(5mm)接种到PDA平板的中心，2d后将高氏一号平板培养基上培养7d的链霉菌菌饼(5mm)对称接种到距链霉菌菌饼边缘2cm处，重复3皿，25℃培养5～7d后，测量抑菌带的有无和大小。
拮抗菌株SCY114的分类鉴定
形态及培养特征
采用插片法将菌株SCY114接种到高氏一号平板培养基上，同时将灭菌的盖玻片(1cm×1cm)斜插入培养基内，28℃培养7d后在光学显微镜和电子扫描显微镜下观察气生菌丝、基内菌丝、孢子丝和孢子的形态特征。参照《国际链霉菌计划》(ISP)中所推荐的分类培养基(表3)和方法进行，28℃培养7-10d后观察并记录其特征。参照《链霉菌鉴定手册》色谱记录(中国科学院微生物研究所放线菌分类组，1975)。
生理生化特征
(1)明胶液化试验：将菌株SCY114接种在明胶液化培养基上，28℃培养，于5、10、20、30d观察液化程度，观察前要将菌种试管放在4℃冰箱中30min左右，以未接种的明胶培养为对照。
(2)牛奶凝固与胨化：将菌株SCY114接种在牛奶凝固胨化培养基中，28℃培养，分别于2、4、6、8、10d观察，如有凝块产生则为凝固现象，同时观察酪蛋白被水解成透明或半透液体即为胨化现象，以未接种的脱脂牛奶为对照。
(3)淀粉水解：将菌株SCY114接种在淀粉琼脂培养基上，28℃培养5～7d后在平板上加几滴碘液，淀粉如果被水解，则菌落周围的培养基无色，其余部分呈紫色。
(4)纤维素利用：将菌株SCYI14接种在灭菌的滤纸条(0.8cm×8cm)上，然后放入试管中，一半浸入无碳源的液体合成培养基中，28℃培养，分别于5、10、15、30d观察菌株是否能生长和分解滤纸条，以未接种的滤纸条为对照。
(5)硝酸盐还原反应：将菌株SCY114接种在硝酸盐还原培养基上，28℃培养7、14d时测定。每1mL菌液加入溶液I与溶液II各2滴，如为阳性则呈红色，以未接种的培养基作对照。溶液I：氨基苯磺酸0.5g，醋酸(80％醋酸，加2倍水稀释)；溶液II：二苯胺0.1g，水20mL，(二苯胺先溶于少量乙醇中再加水，经煮沸后加150mL稀释的醋酸)。
(6)硫化氢的产生：将菌株SCY114接种在Tresner培养基上，28℃培养7d后观察，如果产生黑色素，则表明该菌能产生硫化氢，以未接种的Tresner培养基为对照。
(7)碳源的利用：将菌株SCY114制成菌悬液(切勿带培养基)，取几滴菌悬液，滴在基础培养基上，用涂布棒涂匀。分别滴加葡萄糖、棉子糖、肌醇、鼠李糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖和果糖，如果菌株能在滴加碳源的地方生长，则表明该菌株能利用此碳源，否则为不能利用。
(8)对氯化钠的耐受性：将菌株SCY114分别接种在含不同浓度的NaCl的高氏一号琼脂培养基上，28℃培养7d后观察该菌株生长情况。
(9)对酸碱的耐受性：将菌株SCY114分别接种在pH 2～13的高氏一号琼脂培养基上，28℃培养7d后观察该菌株生长情况。
(10)生长温度的测定：将菌株接种到高氏一号平板上，分别在4、10、20、28、35、40、45、50℃的温箱中培养10d后观察生长状况。
细胞壁氨基酸分析
(1)菌株的培养和收集：菌株采用液体培养好后，将菌体离心(6000r/min，离心10min)，除去培养液得到菌体，再用蒸馏水进行洗涤(离心)2～3次，然后用无水乙醇浸泡24h，将菌体放置在通风橱中进行过滤、干燥得到干菌体。
(2)菌体水解：称取10mg干菌体，装入安瓿管内，加入6mol/L HCl 1mL，熔封安瓿管，置于110℃水浴中保温水解18h(用于氨基酸分析的水解液以黑褐色为宜)。在室温下冷却，然后打开安瓿管，用滤纸对水解液进行过滤，保留滤液，再用3～4滴无菌水洗涤残渣，再过滤，合并滤液2次，于沸水浴上蒸发至干，再加少量蒸馏水洗涤，再蒸干，反复洗涤3次，以除去滤液中的HCI，最后在干残余物中加入0.3mL的无菌水，稀释成待测定的试样。
(3)点样和层析：采用新华1号滤纸，根据样品的份数剪裁成适当大小，标出点样的起始线。点样时，放线菌菌株鉴定及其发酵液中抑菌成分初步分离的研究用微量进样器抽取菌体水解液20～30μL点样。对照点标准氨基酸的混合液，其中包括二氨基庚二酸、天门冬氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸和赖氨酸(浓度均为0.01mol/L)，点样量为10～15μL。用下行法层析，展层剂为甲醇∶水∶10mol/L HCl∶吡啶＝80∶17.5∶2.5∶10(V/V)。反复展层3次或连续展层48h，然后再取出滤纸晾干。用0.4％茚三酮正丁醇溶液喷施滤纸，置于100～110℃下烘箱烘干5min显色(文才艺等，2006；蒋凌月等，2001；白林泉等，1997)。16S rRNA和ISR序列分析
(1)链霉菌基因组DNA的提取：将菌种置于250mL装有100mL高氏液体培养基的三角瓶中，于28℃，180r/min培养1～2d，取1.5mL的培养物离心12000r/min离心2min收集菌体。往收集菌体中加入180μL的TE缓冲液，在漩涡振荡器上振荡至菌体被均匀打散，完全混匀。加入9μL 100mg/mL溶菌酶、22μL 20％SDS和20μL 20mg/mL的蛋白酶K，混匀，于37℃温浴1.5h，每15min混匀一次。用宝生物工程(大连)有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒进行放线菌基因组DNA的提取，操作步骤宝生物工程(大连)有限公司细菌基因组DNA提取试剂盒的说明书进行。-20℃保存备用。
(2)16S rRNA片段的扩增：16S rRNA基因序列的PCR扩增引物为通用引物(Brunel et al.，1997)：正向引物为A：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3；反向引物为B：5-AAGGAGG TGATCCAGCCGCA-3。16S rRNA PCR反应体系如下(25μL)：模板DNA(1μL)；10×PCR buffer(2.5μL)；2.5mmol/L dNTP(1μL)；PrimerA(1μL)；Primer B(1μL)；Taq Polymerase(0.2μL)；ddH2O(18.3μL)。16S rRNA PCR扩增条件为：94℃预变性4min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。采用1％琼脂糖凝胶对PCR产物电泳检测。
(3)ISR片段的扩增：ISR的PCR扩增引物为通用引物：正向引物为A’：5-GAAGTCGTAA CAAGG-3；反向引物为B’：5-CAAGGCATCCACCGT-3(Hirsch et al.，1995)。ISR PCR反应体系如下(25μL)：模板DNA(1μL)；10×PCRbuffer(2.5μL)；2.5mmol/LdNTP(1μL)；PrimerA’(1μL)；PrimerB’(1μL)；TaqPolymerase(0.2μL)；ddH2O(18.3μL)。ISR PCR扩增条件为：94℃预变性5min，然后94℃变性30s，46.8℃退火30s，72℃延伸30s，31个循环，最后72℃延伸3min，4℃保存。采用1％的琼脂糖凝胶对PCR产物电泳检测。
(4)目的DNA的纯化：使用上海莱枫生物科技有限公司的纯化试剂盒纯化PCR产物。将得到的含有16S rRNA和ISR片段的胶块置于凝胶成像仪上，用刀片将亮带处胶块小心切下，置于1.5mL干净离心管中，用上海莱枫生物科技有限公司回收试剂盒对目的DNA片段进行纯化。
(5)质粒载体与目的DNA的连接：根据TA克隆原理，将目的片段与pMD18-T克隆载体(大连宝生物公司TaKaRa产品)按以下比例混合后，于4℃或16℃连接过夜。连接体系如下：PCR回收产物(2.0μL)；pMD-18T载体(0.5μL)；Solution I(2.5μL)。
(6)感受态细胞制备：采用CaCl2法制备大肠杆菌宿主菌株DH5α的感受态细胞。接种大肠杆菌单菌落于3mLLB培养液中，37℃培养过夜，获得母液。取50μL母液于3mL新鲜LB培养液中，37℃培养至OD600值为0.4左右时，收集菌液，于12,000r/min，离心15s，每mL菌体用500μL预冷的0.1mol/LCaCl2重悬，再离心一次后，加入预冷的0.1mol/L CaCl2100μL/管，悬浮，4℃放置12h后即可使用。
(7)质粒的转化和提取：取5μL连接产物，加入50μL感受态细胞，充分混匀后，冰浴30min，42℃热击90s，冰浴2min，加入450μL灭菌LB液体培养基，于37℃下150r/min振荡复苏培养1.5h，取150μL左右的菌液均匀涂布于抗性LB平板(含青霉素100mg/mL)，吹干后倒置培养皿，于37℃培养18-24h。挑取平板上的白色菌落，按照上海莱枫生物科技有限公司的质粒提取试剂盒纯说明步骤进行重组质粒的提取。
(8)双酶切检验：根据pMD-18T载体的酶切图谱，选取克隆位点两端的酶切位点HindIII和BamHI，按以下比例配制酶切体系，并于37℃酶切2～3h，最后电泳分析所挑菌落是否为阳性克隆。酶切反应体系：提纯质粒(4.0μL)；HindIII限制性内切酶(0.5μL)；BamHI限制性内切酶(0.5μL)；10×K(1.0μL)；D.D.W(4.0μL)。
(9)目的片段的测序：挑取培养好的重组菌液送到宝生物工程(大连)有限公司进行序列测定。将所测得的16S rRNA和ISR序列与Genbank数据库中的已有序列进行Blast分析比对，选取同源性较高的模式菌株的16S rRNA和ISR序列作为参比对象，运用Clustal X 1.8软件进行多重序列匹配排列(Multiple alignments)分析，运用Mega 4.0软件中的N-J法构建系统进化树。
G+C mol％含量测定
委托中国科学院微生物研究所完成该实验。菌株基因组DNA的G+Cmol％含量测定使用熔解温度(Tm)法，以大肠埃希氏菌(E.coli K12，CGMCC 1.365)为参比对照，步骤如下：(1)将待测DNA样品用0.1×SSC稀释至OD260nm值于0.3-0.4之间。(2)在波长260nm首先记录25℃的OD值，然后设定升温程序，从65℃开始到95℃，其间每分钟升高1℃。(3)OD值上升表示变性开始，记录比色皿温度和OD值，直至OD值不变表示变性完毕。(4)根据热变性曲线，得出熔链温度(TM)，计算G+C mol％含量。在0.1×SSC溶液中计算公式为：
G+C mol％＝G+C mol％1.365+2.08(Tm-Tm1.365)(其中G+C mol％1.365为51.2)
3.2.6菌株SCY114发酵条件的优化
斜面菌种的培养
采用高氏一号斜面培养基，用接种环从保存斜面菌种的冷冻管中划线接种将菌株SCY114孢子转接到新鲜培养基中，然后将其放置在28℃恒温培养箱培养7d，待斜面完全被孢子覆盖，取出放冰箱(4℃)保存备用。
种子培养
用接种针将培养好的斜面菌种挖块接种于装有150mL种子培养基的500mL三角瓶中，置摇床28℃，180r/min振荡培养48h，使菌体处于对数生长期，作为种子液备用。
发酵培养
吸取5mL液体种子液加到装液量为80mL发酵培养基的250mL三角瓶中，置摇床28℃，180r/min振荡培养120h。
发酵液抑菌活性的测定
(1)杯碟法：以小麦全蚀病菌为指示菌。将PDA倒成平板待培养基凝固后，将病原菌菌饼(5mm)放在PDA平板中心25℃培养3d，然后按照要求均匀摆放牛津杯，每杯加入发酵液150μL，25℃恒温培养箱培养7d，十字交叉法准确测量抑菌带宽，重复3次。
(2)含毒介质法：以小麦全蚀病菌为指示菌，取发酵上清液1mL加入50mL冷却到45℃的PDA培养基中，混匀后倒成平板，待培养基凝固后，将病原菌菌饼(5mm)放在PDA平板中心25℃培养7-10d后，十字交叉法准确测量病原菌直径，并计算抑制率，重复3次，以没有加发酵上清液为对照。
菌株SCY114代谢产物的研究
发酵液预处理
(1)无水乙醇沉淀法：发酵液用4～5倍(V/V)体积的无水乙醇沉淀2h，抽滤，滤液减压浓缩，浓缩液用中性无离子水定容至原发酵液体积，以原始发酵液为对照，用含毒介质法测定其生物活性，3次重复。
(2)丙酮沉淀法：发酵液用3～4倍(V/V)体积的丙酮沉淀2h，抽滤，滤液减压浓缩，浓缩液用中性无离子水定容至原发酵液体积，以原始发酵液为对照，用含毒介质法测定其生物活性，3次重复。
(3)酸沉淀法：分别用1mol/LHCl和1mol/L草酸调节滤液pH值至2～3，置于60℃水浴锅中保温1h，过滤，滤液用中性无离子水定至原发酵液体积并将pH调至原发酵水平，以原始发酵液为对照，用含毒介质法测定其生物活性，3次重复。
(4)碱沉淀法：用1mol/L NaOH调节滤液pH值至9，置于60℃水浴锅中保温1h，过滤，滤液用中性无离子水定至原发酵液体积并将pH调至原发酵水平，以原始发酵液为对照，用含毒介质法测定其生物活性，3次重复。
发酵液稳定性的测定
(1)热稳定性实验：取发酵液10mL，分别置于60、80、100℃水浴中加热30min和121℃湿热灭菌30min。待自然冷却后，以原始发酵液为对照，用管碟法测定其生物活性，3次重复。
(2)酸碱稳定性实验：用HCl和NaOH将发酵液的pH分别调节为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0后在室温下处理60min，然后再将发酵液调至发酵终了的自然pH，以原始发酵液为对照，用含毒介质法测定其生物活性，3次重复。
(3)紫外稳定性实验：取发酵液10mL，在40W、波长紫外灯下分别照射2、4、6、8、10h后，以原始发酵液为对照，用含毒介质法测定其生物活性，3次重复。
(4)光照稳定性实验：取发酵液10mL，在40W日光灯下分别照射3、6、9、12、15h后，以原始发酵液为对照，用含毒介质法测定其生物活性，3次重复。
抗生素的鉴别
(1)层析样品的制备：取100mL发酵液，加入100mL无水乙醇以沉淀蛋白质和其它可能妨碍层析的杂质。将混合液在水浴中缓缓加热至50℃，维持10min冷却至室温。将沉淀滤去，将滤液浓缩至10mL于冰箱中保存备用。
(2)抗生素类别的分析：Doskochilova 8溶剂系统层析法。八种溶剂系统如下：1)水饱和的正丁醇；2)水饱和的正丁醇含2％对甲基苯磺酸；3)正丁醇∶醋酸∶水(V/V＝2∶1∶1)；4)水饱和的正丁醇含2％的六氢吡啶；5)正丁醇饱和的0.5mol/LpH7.0的磷酸缓冲液；6)正丁醇饱和的水含2％对甲基苯磺酸；7)苯∶甲醇(V/V＝4∶1)，滤纸预先用0.5mol/LpH7.0的磷酸缓冲液处理；8)75％甲醇，25％水(内含3％氯化钠)，滤纸预先用5％硫酸钠处理。
层析方法：滤纸条长20cm，宽0.5cm，在距层析纸条下端2.0cm处点样，点样量为20μL，在有密闭玻璃塞的展层缸中上行展层。当溶剂扩展到距上端1.5cm处时取出滤纸条，自然晾干。
生物显影：用无菌水将指示菌枣青霉病菌制成孢子悬液，待熔化的PDA培养基放置至45℃左右时混入其中，定量倒入平板，凝固后，将展层完毕后并经紫外线灭菌的滤纸条均匀贴上，置25℃恒温培养箱培养48h，观察活性组分的出现情况并测定Rf值。
(3)抗生素的溶解度及极性：Betina溶剂系统层析法。五种溶剂系统如下：1)蒸馏水；2)70％甲醇；3)正丁醇的水饱和溶液；4)乙酸乙酯的水饱和溶液；5)苯的水饱和溶液。展层和生物显影方法同前。
(4)pH纸层析：取9条滤纸(20cm×0.5cm)，用pH2-8的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液及pH9-10的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液分别处理，使形成不同的pH缓冲区间。自然晾干后，在距纸条下端2cm处点样，点样量20μL，分别在水饱和的乙酸乙酯、水饱和的正丁醇溶剂系统中上行展层。展层和生物显影方法同前。
抗生素的分离纯化
(1)抗生素的溶媒萃取：将3倍(V/V)体积的乙酸乙酯加入到浓缩10倍的预处理发酵液中，然后动态萃取2h，静止30min，收集有机相，反复萃取3次，合并有机相，减压蒸干得乙酸乙酯相，再用氯仿和甲醇(V/V＝1∶1)溶解有机相，用于检测其活性。
(2)活性物质的追综生物测定(滤纸片法)：用打孔器将滤纸打成直径7cm的滤纸片，高温灭菌后，2层为一组，分别滴加萃取液和萃余液，加样量为10～60μL，待溶剂挥发完全后，等距离放置于培养3d的小麦全蚀病菌平板上，(或用无菌水将指示菌枣青霉病菌制成孢子悬液，待熔化的PDA培养基放置至45℃左右时混入其中，定量倒入平板，凝固后，将滤纸片放置在平板上，25℃恒温培养2d后观察抑菌圈大小。)，25℃恒温培养7d后，观察并测量抑菌带宽。以滤纸片上滴加相应的有机溶剂和粗提液为对照，3次重复。
(3)硅胶柱层析：硅胶的预处理：取大约200g柱层用硅胶(100～200目)，用无离子水浸泡3h，除去细小颗粒，抽干；再用浓HCl洗涤以除去残留的铁和铝，然后用无离子水洗至中性，抽干；用无水乙醇浸泡过夜，抽干；临用前120℃干燥至恒重。湿法装柱。采用石油醚-氯仿-甲醇梯度洗脱，即：先用石油醚洗脱，然后逐渐增大氯仿的比例，最后增大到用甲醇把所有斑点洗脱下来。洗脱速度1.0mL/min，按洗脱梯度分管收集。以紫外吸收法和滤纸片法(以枣青霉病菌为指示菌)测定洗脱液抑菌活性。合并活性组分，减压浓缩，即得粗提品。
(4)薄层层析法分离纯化抗生素：1)薄板的制备：称取薄层层析用硅胶(GF254)30g，羟甲基纤维素钠0.3g，加无离子水100mL，研磨均匀后，按照每块板(5cm×20cm)约3g硅胶的量，均匀铺板，室温下自然风干，使用前置于烘箱中120℃活化30min。2)展层剂：氯仿∶甲醇(10∶1)。3)展层：将上述得的粗提品溶于氯仿和甲醇(v/v＝1∶1)的溶液样品沿横线均匀点在薄板上，横线距薄板底端的距离为1.5cm，点样量约50μL，上行展层。展层完毕后，将薄板取出，自然风干，置于紫外光照箱中观察、照像，用铅笔在薄板上标出所显示的带谱，利用生物活性测定找到活性带谱。4)活性测定：用无菌水将指示菌枣青霉病菌制成孢子悬液，待熔化的PDA培养基放置至45℃左右时混入其中，定量倒入平板，凝固后，将展层完毕后并经紫外线灭菌薄板轻轻反扣在平板上，轻轻压平，静置45min，取下薄板，置25℃恒温培养箱培养48h，观察活性组分的出现情况并测定Rf值。
(5)高效液相色谱纯化制备：取硅胶薄层样品充分溶于甲醇中，用0.45μm微孔过滤器过滤，自动进样器进样，每次进样量为1.5mL；以100％甲醇为流动相，3.5mL/min的泵流速进行循环分离，利用UV检测器在波长291nm处检测所对应的洗脱液并进行活性检测，将所得样品真空浓缩干燥。
(6)样品纯度的验证：取少量纯品溶于100％甲醇，利用分析型HPLC，以70％甲醇为流动相，色谱条件为：C18反相柱，柱温30℃，UV检测器，检测波长为291nm，SIL-10ADVP自动进样器进样1μL。
抗生素化学结构的鉴定
高分辨质谱测定、红外光谱测定和核磁共振谱测定均委托北京师范大学分析测试中心质谱实验室、红外实验室和核磁共振实验室完成。
(1)紫外光谱测定：将纯化样品溶于100％甲醇，用紫外可见分光光度计在190～400nm波长范围内进行全波长扫描。
(2)液质联用质谱测定：LC条件：美国Agilent公司色谱柱，Zorbax Eclipse XDB-C18(4.6*150mm，5μm)及其保护柱(4.6*12.5，5um)；流动相为50％A和50％B，其中A为0.1％甲酸水溶液(含5％甲醇)，B为0.1％甲酸甲醇溶液；波长291nm；流速1.0mL/min(柱后分流速0.2mL/min)；柱温40℃；进样量10μL；MS条件：电喷雾离子源(ESI)；毛细管电压：3.5kV；干燥气压力40psi，流速8L/min，温度350℃；扫描范围100～2200m/z；正离子模式检测。
(3)高分辨质谱测定：采用ESI法测定，负离子方式检测；质谱条件：毛细管电压4kV，离子源温度180℃，扫描范围(m/z)300～2000，泵流速1.5mL/min。
(4)红外光谱测定：采用KBR压片法，对样品在400～4000cm-1区域扫描，进行红外吸收光谱分析。
(5)核磁共振谱测定：以氘代二甲基亚砜(d-DMSO)为溶剂，四甲基硅烷(TMS)为内标，进行氢谱(1HNMR)、(13CNMR)及异核多键相关谱(HMBC)等的测定。
实验结果分析
土壤放线菌分离和筛选结果
从土壤中分离出128株放线菌，然后通过平板对峙法进行初筛得到对小麦全蚀病菌有拮抗作用的菌株49株，通过杯蝶法进行复筛得到拮抗作用较强的菌株8株，其中以SCY114菌株拮抗效果最好。
表18株拮抗菌发酵液对小麦全蚀病菌的抑制效果
菌株SCY114抑菌谱
对菌株SCY114的抑菌谱进行测定，结果如表2所示，发现其对子囊菌门中的5个病原菌、半知菌门中的9个病原菌和卵菌门中的2个病原菌有不同程度的抑制作用。图1显示了菌株SCY114对部分植物病原真菌的抑菌效果，其中A；辣椒疫霉病菌；B：稻曲病菌；C：小麦全蚀病菌；D：小麦纹枯病菌；E：黄瓜枯萎病菌。说明菌株SCY114产生的活性物质的抑菌谱较广，对不同的病原菌具有一定的选择性。
表2菌株SCY114对16种植物病原真菌的抑菌效果
菌株SCY114分类鉴定结果
形态及培养特征
菌株SCY114菌落在高氏一号培养基上呈欧灰色，单菌落边缘呈放射丝状，有褐色可溶性色素。气生菌丝发达，不断裂，孢子链螺旋状或直-柔曲状，孢子表面光滑，呈圆柱形。菌株在7种不同培养基上的培养特征如表3所示。
表3菌株SCY114的培养特征
注：“+”生长差Growing badly；“++”生长一般Growing generally；“+++”生长良好Growing well.生理生化特征
由表4可见，菌株SCY114能使明胶液化，淀粉水解弱，能产生H2S和黑色素，能使牛奶凝固与胨化，硝酸盐不还原，纤维素上生长。利用棉子糖，肌醇，鼠李糖，蔗糖，葡萄糖和木糖；不利用阿拉伯糖，甘露糖和果糖。菌株SCY114耐受NaCl浓度为5％，当培养基中NaCl浓度为1％～2％时产生可溶性色素；当pH＜5或pH＞11时菌株不能生长；菌株的生长温度范围为10℃～45℃，当温度高于40℃时，其产孢受抑制。
表4菌株SCY114的生理生化特征
注：“+”：阳性结果Positive results；“-”：阴性结果Negative results
细胞壁化学组分分析结果
细胞水解液的TCL层析结果表明，菌株SCY114细胞壁化学组成中含有L，L-DAP及甘氨基酸、天冬氨酸，无特征性糖(糖型C)，细胞壁化学组分属于I型。符合链霉菌属(Streptomyces)的化学分类特性。
分子鉴定结果
如图2所示，菌株SCY114的16S rRNA序列PCR扩增得到了一条约1500bp的条带(图5)，测序结果为1523bp，该序列在Genbank数据库中登录号为GU045542。
将SCY114的16S rRNA序列与NCBI数据库中相关序列进行Blast比对，选取与其同源性较高的7株模式菌株的16S rDNA序列进行系统发育分析，用MEGA4.0软件中的Neighbor-Joining法构建系统进化树，由图3可以看出，SCY114菌株处于进化树中的独立分支，与模式菌株Streptomyces scabiei ATCC 49173(AB026199)同源性达99.8％，与S.scabiei strain PK-41(AY438566)的同源性达99.7％。虽然与S.scabiei的16S rDNA序列的同源性较高，但是三者之间在形态特征和生理生化特征等方面存在着一定的差异，所以利用ISR序列的比对分析进行进一步的验证分析。
由图4可知，菌株SCY114的ISR序列PCR扩增得到了一条约400bp左右的条带，测序结果为398bp，该序列在Genbank数据库中登录号为GU358064。
将SCY114的ISR序列与NCBI数据库中相关序列进行Blast比对，选取与其同源性较高的9株模式菌株的ISR序列进行系统发育分析，用MEGA4.0软件中的Neighbor-Joining法构建系统进化树，如图5所示，菌株SCY114与S.scabieiATCC 49173(AB026199)聚于同一分支，其同源性为87.8％。
G+C mol％测定结果
菌株SCY114的Tm值为81.8℃，G+C mol％为61.6％。
从上述结果可以看出，菌株SCY114与S.scabiei(ATCC 49173)的培养特征和形态特征近似，孢子颜色都为灰色、光滑且孢子链都为螺旋状，二者的6S rDNA序列同源性达99.8％，其ISR序列同源性为87.8％，应归属于疮痂链霉菌；但菌株SCY114与模式菌株在生理生化方面还有一定的差别(见表7)，SCY114硝酸盐不还原，不能利用甘露糖和果糖，能利用棉子糖和鼠李糖，能在45℃培养下生长，耐盐度为4％。模式菌株可还原硝酸盐，能利用甘露糖和果糖，能利用棉子糖和鼠李糖，不能在45℃培养下生长，耐盐度为9％。菌株SCY114与模式菌株的G+C mol％存在一定的差异，两者之间的G+C mol％差值大于5。一般认为同种内不同菌株G+C含量的差异不大于5，否则即可判定菌株属于不同的种(张纪中，1990；林万明，1989)，至于菌株SCY114是否为新种还需要进行DNA-DNA杂交。根据菌株SCY114的形态特征、培养特征、生理生化特征、全细胞壁氨基酸和糖类分析及分子鉴定结果，将菌株SCY114初步鉴定为疮痂链霉菌许昌变种，暂命名为Streptomyces scabiei var xuchangensis，
表5 SCY114与已知近似种的比较
菌株SCY114代谢产物研究
发酵液预处理
试验结果表明，发酵液经过盐酸、草酸或碱处理后，其抑菌活性明显降低。而用无水乙醇和丙酮处理后，发酵液抑菌活性保持不变。从成本来说，乙醇和丙酮可以回收反复使用，处理液经减压浓缩后，还可以有效地浓缩原始发酵液。因此，用无水乙醇和丙酮沉淀法对发酵液进行预处理，无论处理效果还是经济效益来说，都是可行的。但是，考虑到有机溶剂的毒性问题，本研究采用无水乙醇沉淀法。
抗生素稳定性测定结果
热稳定性
实验结果表明，该抗生素具有良好的热稳定性。抗生素在121℃条件下处理30min，其抑菌活性基本不变，完全符合微生物农药对热稳定性的要求。
酸碱稳定性
酸碱稳定性实验结果表明该抗生素在酸或碱的环境中都比较稳定。因此，该抗生素使用过程中可以与碱性或酸性药剂混用，在分离纯化时也不必担心酸性或碱性环境对其抑菌活性的影响。
紫外稳定性
紫外稳定性实验结果表明抗生素在波长的紫外照射2～10h后，其抑菌活性基本不变。从某种程度上来说，实验室所用的紫外线辐射强度远远大于自然阳光中的紫外辐射强度。因此，该抗生素对紫外线具有稳定而持久的耐性，达到农药使用时对紫外辐射稳定性的要求。
光照稳定性
实验表明该抗生素良好的光照稳定性。样品在光照3～15h后，其抑菌活性基本不变，说明该抗生素在光照下基本能保持较稳定的抑菌活性。
由此可见，该抗生素具有良好的稳定性，具有生产、储藏和应用上的优势，有望进一步研究并开发具有实用价值的新型农用抗生素。
抗生素的鉴别
抗生素类别分析
由于各种抗生素在同一种溶剂系统中溶解度存在差别，它们在纸层析试验中表现出各自特有的迁移率(Rf)。因此，可根据其在同一溶剂系统中Rf值的不同来判断彼此之间的差别。但有些不同的抗生素在少数溶剂系统中也会出现相同的Rf值。为了提高鉴别能力，通常使用多种溶剂系统来进行纸层析试验。目前大多采用捷克Doskochilova溶剂系统，中国医学科学院抗生素研究所根据上述方法把已知抗生素的图谱分为7类。粗提液纸层析试验结果表明，在溶剂系统5和6中Rf值极小，而在其他溶剂系统中均移动较大，成为倒船帆形，因此，应属于非水溶性I型抗生素。
抗生素溶解度及极性分析
Betina溶媒系统具有极性由强到弱的特点，该溶剂系统常用米判断抗生素极性的大小以及在不同溶剂中的溶解度。本实验根据溶剂的极性特点，在原溶剂系统I、II之间设计了极性介于其间的另一个展层剂，即70％甲醇。从层析结果)看，抗生素有效成分在蒸馏水中Rf值为0，在其他溶剂中的Rf值随着溶剂的极性降低而增大，其中，水饱和的乙酸乙酯溶液中Rf值最大。由此可见，抗生素的活性成分为中等极性。
pH纸层析
用经一系列不同pH缓冲液处理的层析纸为固定相，以合适的溶剂系统为移动相，对不同类型的抗生素进行层析后，其Rf值有一定的规律性变化。碱性抗生素在pH层析图谱中Rf值呈S形曲线，曲线的最大值在碱性区域，而其最小值在酸性区域；两性抗生素在pH层析图谱中Rf值从酸性侧到碱性侧先减小后增大；中性抗生素在pH层析图谱中，Rf值变化不大，呈水平直线型。抗生素pH层析图谱结果有助于选择适宜的萃取剂及萃取条件如用有机溶剂萃取活性成分时，其最适pH即为pH层析谱中Rf值最大时的pH。菌株SCY114代谢活性物质的pH纸层析结果表明在水饱和的正丁醇和水饱和的乙酸乙酯溶剂系统中，Rf值随着pH的增大先降低后上升，属两性抗生素。
抗生素的分离纯化结果
溶媒萃取
经无水乙醇处理的浓缩液，用乙酸乙酯动态萃取3次后基本上能将活性物质完全萃取出米，如图6所示，萃余液无抑菌活性。由此可见，采用乙酸乙酯动态萃取法能有效地从发酵液中分离出活性成分。
硅胶柱层析
在硅胶柱层析中，以石油醚-氯仿-甲醇为洗脱剂，对乙酸乙酯萃取液进行梯度洗脱，合并有抑菌活性的氯仿-甲醇洗脱液(氯仿∶甲醇＝3∶1、1∶1)。将此洗脱液浓缩，再用氯仿和甲醇(V/V＝1∶1)溶解进行硅胶薄板层析检测。柱层析液在薄板上展层后在紫外箱中可以观察到2条谱带，Rf值分别为0.32和0.69；而萃取液在薄板上展层后在紫外光下可以观察到4条谱带，Rf值分别为0.275、0.375、0.44和0.66。生物活性测定表明，柱层液和萃取液都只有一个有活性的谱带，如图7所示，Rf值分别为0.69和0.66，且活性带在紫外下能产生蓝色荧光，如图8所示。由此可见，通过硅胶柱层析可有效除去非活性成分。
薄层层析
由于活性带在紫外光下能产生蓝色荧光，用干净的单面刀片将其轻轻刮下，大量收集活性带，用100％甲醇浸提过夜，抽滤，再用100％甲醇反复洗涤5～6次，然后减压浓缩。以60％甲醇为流动相，用高效液相色谱对样品进行纯度检测，纯度为92.91％。
高效液相色谱纯化制备
高效液相分离制备结果如图9所示，薄层层析获得的样品主要有3个吸收峰，保留时间分别为17.333min、19.166min和24.833min。将3个保留时间的组分分别收集，生物活性测定结果表明，只有保留时间为24.833min的组分有抑菌活性，如图10所示，即为主要的活性成分。对保留时间为24.833min的组分进行大量的分离制备后，进行浓缩干燥，得到浅黄色粉末即为纯品。高效液相色谱进行纯度检测结果表明，分离制备的活性组分纯度为100％，如图11。制备物在100％甲醇中低温处理后出现浅黄色结晶，易溶于二甲基亚砜、氯仿和乙酸乙酯，微溶于石油醚、甲醇和乙醇，不溶于水。
活性物质结构鉴定结果
活性化合物为淡黄色固体，溶于二甲亚砜、二甲基甲酰胺，甲醇等，微溶于氯仿、乙酸乙酯，不溶于环己烷和水。化合物的ESI-MS：m/z 467.2[M+H]+，933.4[2M+H]+，确定其相对分子质量为466，如图12所示。该化合物1H NMR(500MHz，DMSO-d6)谱中，如图13所示，在低场显示多个烯氢，在高场显示出3个甲基峰[δH3.34(3H，s，H-8’)，2.31(3H，s，H-7’)，1.44(3H，s，H-7’)]，结合HMQC谱分析(如图14所示)，发现分子结构中可能存在两个与氮原子连接的氢原子[δH 8.56(1H，s，H-6)，4.14(1H，s，H-10’)]。13C NMR(125MHz，DMSO-d6)谱中，如图15所示，发现有28个碳原子信号峰，结合该化合物的HMQC谱，初步判断该化合物的分子结构中含1个甲氧基碳δC 57.1(CH3，C-8’)，2个甲基碳[δC 29.7(CH3，C-7’)，33.2(CH3，C-9’)]，2个亚甲基碳[δC 45.3(CH2，C-7)，29.3(CH2，C-5’)]，1个羰基碳δC172.1(C，C-5)和其它不饱和碳原子。根据碳氢原子个数及相对分子质量初步推测化合物的分子式为C28H26N4O3。
如图16所示，在该化合物的1H-1H COSY谱图中，可以观测到H-1～H-4，H-8～H-11和H-3’～H-6’的相关信号。如图17所示，在该化合物的HMBC谱图中，可以观测到H-1与C-4a、H-2与C-13a、H-4与C-13a、H-8与C-11a以及H-11与C-7c的相关信号，证实了分子结构中存在两个苯环结构。H-3’、4’及6’均与C-2’存在相关信号，表明该化合物分子结构中存在一个吡喃环。H3-7’与C-2’、3’，H-3’与C-8’及H3-9’与C-4’分别存在相关峰，则表明C-2’位连接一个甲基、C-3’位连接一个甲氧基和C-4’位连接一个甲胺基，如图18所示。
以上对该化合物的NMR谱数据的综合分析，结合文献检索，发现与文献报道的化合物星形孢菌素(Staurosporine)的NMR数据完全一致(Omura et al.，1977 Morioka et al.，1985；Oka et al.，1986；Takahashi et al.，1989；Park et al.，2006)，其化学结构式如下所示：
本发明的具体实施方式仅用于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，因而不能依据实施例限定本发明的范围，凡在本发明的权利要求书要求保护的范围内所做出的等同的变形和改变的实施方式均在本发明所要求保护的范围内。
Claims (3)
1.一种星形孢菌素的制备方法，所述的星形孢菌素的分子式为C28H26N4O3，结构式为其是通过发酵疮痂链霉菌许昌亚种CGMCC No.5213制备得到的；其中，发酵所述疮痂链霉菌许昌亚种CGMCC No.5213的培养基的组成为：可溶性淀粉2wt％，黄豆饼粉4wt％，MgSO40.075wt％、K2HPO40.1wt％、FeSO4·7H2O 0.001wt％，余量为水；而发酵所述疮痂链霉菌许昌亚种CGMCC No.5213的发酵条件为：初始pH7.0，发酵温度28℃，种子液种龄48h，接种量6wt％，转速200r/min，发酵时间5d。
2.权利要求1所述的星形孢菌素的制备方法，其特征在于还包括分离纯化步骤，并且其分离纯化步骤为：发酵液经无水乙醇预处理后，采用乙酸乙酯萃取，萃取液通过硅胶柱层析和硅胶薄层层析，层析液再经高效液相色谱纯化。
3.权利要求2所述的星形孢菌素的制备方法，其特征在于所述的乙酸乙酯萃取步骤是指将3倍体积的乙酸乙酯加入到浓缩10倍的预处理发酵液中，然后动态萃取2h，静止30min，收集有机相，反复萃取3次，合并有机相，减压蒸干得乙酸乙酯相，再用体积比为1∶1的氯仿和甲醇混合溶液溶解有机相得到所述萃取液；所述的硅胶柱层析步骤包括：取柱层析用硅胶，用无离子水浸泡3h，抽干；再用浓HCl洗涤除去残留的铁和铝，然后用无离子水洗至中性，抽干，用无水乙醇浸泡过夜，抽干；120℃干燥至恒重；然后，采用石油醚-氯仿-甲醇梯度洗脱，先用石油醚洗脱，然后逐渐增大氯仿的比例，最后增大到用甲醇把所有斑点洗脱下来，洗脱速度1.0mL/min，按洗脱梯度分管收集；以紫外吸收法和滤纸片法测定洗脱液抑菌活性；合并活性组分，减压浓缩，即得粗提品；所述的硅胶薄层层析步骤包括：薄板的制备：称取薄层层析用硅胶30g，羟甲基纤维素钠0.3g，加无离子水100mL，研磨均匀后，按照每块板约3g硅胶的量，均匀铺板，室温下自然风干，使用前置于烘箱中120℃活化30min，其中板的大小为5cm×20cm；展层剂为氯仿和甲醇，氯仿和甲醇的体积比为10∶1；将上述所得的粗提品溶于体积比为1∶1氯仿和甲醇的溶液样品，沿横线均匀点在薄板上，横线距薄板底端的距离为1.5cm，点样量50μL，上行展层；展层完毕后，将薄板取出，自然风干，置于紫外光照箱中观察、照相，用铅笔在薄板上标出所显示的带谱，利用生物活性测定找到活性带谱；用无菌水将指示菌枣青霉病菌制成孢子悬液，待熔化的PDA培养基放置至45℃时混入其中，定量倒入平板，凝固后，将展层完毕后并经紫外线灭菌薄板轻轻反扣在平板上，轻轻压平，静置45min，取下薄板，置25℃恒温培养箱培养48h，观察活性组分的出现情况并测定Rf值；所述的高效液相色谱纯化步骤包括：取硅胶薄层样品充分溶于甲醇中，用0.45μm微孔过滤器过滤，自动进样器进样，每次进样量为1.5mL；以100％甲醇为流动相，3.5mL/min的泵流速进行循环分离，利用UV检测器在波长291nm处检测所对应的洗脱液并进行活性检测，将所得样品真空浓缩干燥得到星形孢菌素。
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