CN104004692A - 一种枯草芽孢杆菌及其在控制白酒中土臭味的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型枯草芽孢杆菌，从高温酿酒大曲中分离得到一株枯草芽孢杆菌，2013年8月12日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M2013373。通过向白酒酿造中添加一定量短小芽孢杆菌控制白酒中土臭味的产生。该菌株能够合成抗菌脂肽类活性物质，抑制白酒酿造过程中产土臭素链霉菌的生长和土臭素的合成，从根本上控制浓、清、酱等不同香型白酒中的土臭味。

Description

一种枯草芽孢杆菌及其在控制白酒中土臭味的应用

技术领域

本发明属于食品微生物技术领域，具体涉及一株抑制白酒中土臭味的枯草芽孢杆菌的分离筛选及控制白酒中土臭味的方法。

背景技术

白酒是我国特有的一种蒸馏酒，并深得消费者喜爱。独特的开放式多菌种固态发酵，以及固态蒸馏模式赋予白酒独特的香味。白酒中的土臭味使白酒的香气和质量大打折扣，优级品率降低，白酒生产企业每年因此而蒙受多达上亿元的巨大经济损失。

现有的包括物理吸附在内的技术手段，虽然能够在一定程度上去除大曲中的土臭味，但此方法不仅耗时费力成本高，且能够同时非特异性地吸附有益香气成分，对白酒的香气和质量带来负面影响。因此这种方法有重大缺陷且难以大规模应用。

已有研究表明，土臭素是白酒中土臭味的化学来源，酿酒大曲中的链霉菌是土臭素的主要产生菌。通过一定手段控制大曲中产土臭素的链霉菌的数量应该是控制白酒中土臭味的根本方法。通过添加化学合成类抗生素来去除大曲中的链霉菌进而防止土臭味产生的方法并不能应用于实际生产过程。这是因为添加抗生素一方面造成食品安全上的巨大风险，另一方面抗生素也能破坏大曲中的有益产酒产香功能微生物的微生态结构，进而影响白酒的香气和质量。因而，目前尚未有一种既能去除白酒生产中的土臭味，又能保留白酒中的有益香气成分，维持大曲中有益功能产酒产香微生物的微生态结构的方法。

来源于土壤、植物叶子及果实表面等天然环境的诸多芽孢杆菌，例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)，地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)和短小芽孢杆菌(B.pumilus)，能够产生系列抗菌脂肽，具有抑制多种植物病原微生物及人类病原微生物的效果。许多研究者对芽孢杆菌产生的脂肽产生了浓厚的兴趣，包括其优秀的表面活性功能，生物防治及抗生素疗效方面的特征，以及在抗血栓、抗肿瘤方面的药效功能。我们首次从高温酿造大曲中分离了产抗菌脂肽的枯草芽孢杆菌B.subtilis BS-1，发现其能够有效抑制白酒酿造过程中以Streptomyces albus为代表的产土臭素链霉菌的生长以及土臭素的形成。

发明内容

针对现有的技术难点及存在的问题，本发明从酿酒高温大曲中分离、筛选获得一株产抗菌脂肽的枯草芽孢杆菌。与其它环境中分离的枯草芽孢杆菌相比，高温大曲中分离得到的枯草芽孢杆菌能耐高温：45-60℃，耐酸：pH3.0～5.0，耐乙醇：0～12％，能够在白酒酿造过程中的胁迫条件(制曲最高温度达50～60℃；发酵酒醅pH3.5～4.0之间；乙醇最高达7％左右)下生存并发挥功能。对该菌株对白酒酿造中产土臭味链霉菌的拮抗能力和抑制土臭素合成能力开展了一系列研究。

本发明从高温酿酒大曲中分离筛选获得一株对土臭素产生菌具有很好拮抗作用的微生物菌株，经16S rRNA分析和其他形态学分析，确定该菌株为枯草芽孢杆菌，并命名为枯草芽孢杆菌(B.subtilis)BS-1。该菌株已于2013年8月12日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO:M2013373。试验表明分离的枯草芽孢杆菌BS-1，能够抑制产土臭味链霉菌的生长且抑制土臭素合成，同时又对大曲中的有益功能产酒产香微生物的生长没有影响。

分离得到的枯草芽孢杆菌BS-1，与白酒酿造过程中产土臭素的链霉菌混合培养时，能有效抑制产土臭素链霉菌的生长，对土臭素的产生有显著抑制作用。

从该枯草芽孢杆菌的培养物中获得具有抗菌活性物质1，被表征为抗菌脂肽surfactin系列物质。具有如说明书所示的质谱图谱，且有如下结构：

抗菌脂肽surfactin及同系物能显著抑制白酒酿造过程中产土臭素链霉菌的生长，且对土臭素的合成有显著的抑制作用。

从该枯草芽孢杆菌的培养物中获得具有抗菌活性物质2，被表征为抗菌脂肽fengyci A和fengycin B系列物质。具有如说明书所示的质谱图谱，有如下结构：

抗菌脂肽fengycin A和fengycin B及同系物能显著抑制白酒酿造过程中产土臭素链霉菌的生长，且对土臭素的合成有显著的抑制作用。

本发明枯草芽孢杆菌在白酒生产中以菌液或固体菌剂形式添加至酿造大曲中，添加的菌体总量为大曲中链霉菌总量的1％至100％。

具体制备步骤如下所述：

1.细菌的分离筛选与鉴定：从高温大曲中分离出具有拮抗产土臭素链霉菌的细菌。对检测到的具有显著抗菌活性的细菌进行16S rRNA和形态鉴定。确定我们分离得到的是一株枯草芽孢杆菌，16S rRNA的同源性为98％。

2.抗菌活性物质的分离纯化及有效成分鉴定：对上述获得的枯草芽孢杆菌培养2天后发酵液用有机溶剂萃取(见实施例1)提取抗菌活性物质，将萃取后液体真空旋转蒸发浓缩(见实施例1)，并溶于少量的无菌蒸馏水中。用HPLC进一步分离纯化，利用洗脱曲线各峰值的组分进行抗菌活性检测。用UPLC/ESI-TOF-MASS鉴定抗菌物质。

3.对分离得到的枯草芽孢杆菌菌株拮抗产土臭素链霉菌生长及土臭素产生的应用检测。将上述分离得到的枯草芽孢杆菌菌株与产土臭素的链霉菌菌株按照不同比例接种马铃薯-葡萄糖液体培养基，30℃恒温摇床下200rpm培养50h。用qPCR鉴定混合培养中的链霉菌含量；用顶空固相微萃取气相色谱质谱联用技术(HS-SPME-GC-MS)检测混合培养体系中土臭素的含量(见实施例2)。

4.对步骤2提取的抗菌活性物质拮抗产土臭素链霉菌的生长及土臭素产生的应用检测。将提取得到的抗菌活性物质加入到接种有产土臭素链霉菌菌株的马铃薯-葡萄糖液体培养基中，30℃恒温摇床下200rpm培养50h。用qPCR鉴定混合培养中的链霉菌含量；用顶空固相微萃取气相色谱质谱联用技术(HS-SPME-GC-MS)检测混合培养体系中土臭素的含量(见实施例3)。

实施结果

通过16S rRNA分析确定我们分离的菌株为枯草芽孢杆菌，同源性98％。该菌对白酒生产过程中的土臭素产生菌S.albus，S.fradiae，S.radiopugnans，S.sampsonii，都有明显的抗菌效果。我们成功的分离到了该菌株的抗菌成分，经质谱鉴定推测为surfactin和fengycin。

将分离得到的枯草芽孢杆菌菌株按一定比例添加到产土臭素的链霉菌的培养基中，共同培养一定时间，经qPCR和HS-SPME-GC-MS检测分析，枯草芽孢杆菌能显著抑制链霉菌的生长及土臭素的产生。

将HPLC分离得到的抗菌活性物质加入到产土臭素的链霉菌的培养基中，培养一定时间，经qPCR和HS-SPME-GC-MS检测分析，抗菌活性物质能显著拮抗产土臭素链霉菌的生长及土臭素的产生。

本发明提供的枯草芽孢杆菌来源于高温酿造大曲，能产生两种抗菌脂肽，可降低酿造大曲中链霉菌含量最高至100％，降低白酒中土臭素浓度最高至100％。

附图说明

图1是枯草芽孢杆菌在PDA平板上表现的抗链霉菌活性。

图中PDA平板上涂布了80μl链霉菌孢子(1×10⁸孢子/ml)，平板中央滴加2μl过夜培养的枯草芽孢杆菌培养液。在枯草芽孢杆菌的菌落周围形成了明显的抑菌圈。

图2是枯草芽孢杆菌发酵液经甲醇萃取后的活性组分HPLC液相色谱图，共收集得到6个组分。

图3是分离提取得到的脂肽在PDA平板上表现的抗链霉菌活性。

图中PDA平板上涂布了80μl链霉菌孢子(1×10⁸孢子/ml)。Control号牛津杯中分别加入纯甲醇作为对照，1–6牛津杯为HPLC分离得到的个出峰组分。与空白对照相比，3，4，5，6号组分表现出抗链霉菌活性。

图4是surfactin的ESI-TOF-MASS图谱。

图5是fengycin A的ESI-TOF-MASS图谱。

图6是fengycin B的ESI-TOF-MASS图谱。

具体实施方式：

实施例1

1.枯草芽孢杆菌BS-1的筛选分离：

用无菌铲刀取1g不同阶段和不同曲饼位置的大曲曲粉于5ml的无菌塑料离心管中。向离心管中加入5ml的生理盐水(0.9％氯化钠溶液)，漩涡震荡2分钟，静置10分钟后吸取2μl点种涂布有链霉菌S.albus，S.fradiae，S.radiopugnans，S.sampsonii孢子的PDA平板中央(含200g马铃薯煮出液，20g葡萄糖，加蒸馏水定容至1L，加15g琼脂)于30℃恒温培养箱培养72h，检测平板中央的抑菌圈的大小。选取抑菌圈最大的菌落在PDA平板上划线分离出单菌种，分别点种涂布有有链霉菌S.albus，S.fradiae，S.radiopugnans，S.sampsonii孢子的PDA平板中央，观察抑菌圈的大小。对检测到的显著抑菌活性的细菌进行16SrRNA和形态鉴定。以LB液体培养基(含10g胰蛋白胨，10g氯化钠，5g酵母粉)，30℃-37℃过夜培养分离得到的细菌，用常规细菌基因组提取方法提取基因组DNA。以测定16S rRNA的通用引物(由上海生工生物工程技术有限公司合成)进行PCR反应。1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增出大小为1.5kb左右的DNA片段，送交上海生工生物技术有限公司进行序列测定后在NCBI中经Blast比较分析确定为枯草芽孢杆菌。

2.枯草芽孢杆菌BS-1无菌发酵液的制备：

接种保存的枯草芽孢杆菌到100ml灭菌的LB培养基中，37℃，200rpm培养过夜。然后接种1ml新鲜培养物到含有1L新鲜LB培养基的2L三角瓶中，30℃或37℃，200rpm培养48h。然后8000g离心10min收集上清，用0.22微米的滤膜过滤除菌后得到无菌发酵液4℃保存备用。

3.枯草芽孢杆菌BS-1无菌发酵液抗菌活性物质的纯化：

将得到的枯草芽孢杆菌的无菌发酵液用等体积的乙醇:三氯甲烷(1:1)萃取10-15h。有机相经真空旋转蒸发仪(BUCHI，Rotavapor R-210)60℃蒸干，再用少量蒸馏水溶解。溶解后得到的溶液经0.22微米的滤膜过滤后，采用HPLC纯化；285nm紫外检测；流动相为0.1％甲酸溶液和甲醇，得到如图2的液相色谱图。从HPLC色谱图上可以看到共有6个组分。从6个组分中分别取200μl，加到涂布有Streptomyces albus孢子的PDA平板中的牛津杯内，30℃恒温培养箱培养72h，观察各组分的抑菌情况。结果如图3，表明组分3-6均有抑菌活性，且组分3的抑菌活性最佳。

4.UPLC/ESI-TOF-MASS鉴定抗菌物质

分别对HPLC收集到的具有抑菌活性的组分3-6进行超高效液相色谱飞行时间质谱联用技术(UPLC/ESI-TOF-MASS)分析。UPLC采用UPLC^TM BEH C₁₈(100mm×2.1mm，1.7μm)色谱柱，以甲醇和水作为流动相，进行线性梯度洗脱。质谱采用正离子模式，离子扫描范围50–1500m/z。采用Masslynx4.1软件对数据进行采集和分析。结果见图4-6，分离的抑菌物质分子量为1008及同系物，推测为surfactin；分子量1463及同系物，推测为fengycin A；分子量1491及同系物为fengycin B。

实施例2：枯草芽孢杆菌BS-1抑制链霉菌生长及土臭素产生的应用检测

1.枯草芽孢杆菌BS-1与产土臭素链霉菌Streptomyces albus的混合培养

将分离得到的枯草芽孢杆菌BS-1与产土臭素的链霉菌菌株S.albus按照1:10000,1:1000,1:100,1:10,1:1的比例(对应地，枯草芽孢杆菌菌株的接种量分别为0.1‰，1‰，1％，10％，100％)接种马铃薯-葡萄糖液体培养基，30℃恒温摇床200rpm培养50h。发酵结束后，取1ml菌液离心后收集菌体，做混合培养下链霉菌菌株Streptomyces albus的生物量测定。剩余发酵液10000g离心除去菌体，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌后，得到无菌发酵液，4℃保藏备用。

2.qPCR检测混合培养体系中链霉菌Streptomyces albus生物量

采用绝对定量的方法检测混合体系中Streptomyces albus生物量。

按照用常规细菌基因组提取方法提取纯培养链霉菌S.albus(空白对照组)基因组DNA，并用NanoDrop1000(NanoDrop Technologies，Wilmington，DE，USA)测定基因组浓度，计算基因组拷贝数。按照10倍梯度稀释，得到一系列浓度梯度的Streptomyces albus基因组DNA作为qPCR模板，制作基因组拷贝数与qPCR Ct值的标准曲线。20μl qPCR体系包括：SsoFast EvaGreen Supermix10μl(Bio-Rad)，引物各0.4μl，ddH₂O8.2μl，模板1μl；扩增程序为98℃预变性2min，39个循环的98℃变性5s，60℃15s。应用Bio-Rad CFX Manager2.1进行数据采集和处理，得到基因组拷贝数与qPCR Ct值的标准曲线。

按照用常规细菌基因组提取方法提取不同枯草芽孢杆菌接种量的链霉菌S.albus基因组DNA，稀释100倍作为qPCR模板。20μl qPCR体系包括：SsoFastEvaGreen upermix10μl(Bio-Rad)，引物各0.4μl，ddH2O8.2μl，模板1μl；扩增程序为98℃预变性2min，39个循环的98℃变性5s，60℃15s，39循环。应用Bio-Rad CFX Manager2.1进行数据采集和处理，根据qPCR Ct值和基因组拷贝数与qPCR Ct值的标准曲线计算不同枯草芽孢杆菌接种量的链霉菌S.albus基因组拷贝数，并进行绝对定量，结果见表1。从结果可以看出添加1％，10％，100％的枯草芽孢杆菌能有效抑制链霉菌的生长。

表1不同接种量的B.subtilis对S.albus的抑制作用

B.subtilis接种量	S.albus抑制率
		0％(对照)	0
1％	47％
		10％	88％
100％	100％

3.混合培养对S.albus产土臭素的影响

混合培养的无菌发酵液中的土臭素含量采用HS-SPME-GC-MS方法进行定量。定量结果见表2。结果表明添加不同比例的枯草芽孢杆菌能有效抑制土臭素的产生。

表2不同接种量的B.subtilis对S.albus产土臭素的影响

B.subtilis接种量	土臭素抑制率
		0％(对照)	0
1％	50％
		10％	78％
100％	100％

实施例3：枯草芽孢杆菌BS-1抗菌活性组分拮抗产土臭素链霉菌及土臭素产生的应用检测

1.添加枯草芽孢杆菌抗菌活性组分的产土臭素链霉菌S.albus的培养

将HPLC分离得到的抗菌活性组分3，4和组分5，6分别添加到产土臭素的链霉菌菌株S.albus的马铃薯-葡萄糖液体培养基中，30℃恒温摇床下200rpm培养50h，对照组为添加等体积的甲醇。发酵结束后，取1ml菌液离心后收集菌体，做链霉菌菌株S.albus的生物量测定。剩余发酵液10000g离心除去菌体，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌后，得到无菌发酵液，4℃保藏备用。

2.qPCR检测链霉菌S.albus生物量

qPCR Ct值和基因组拷贝数的标准曲线的制作方法同实施例2

按照用常规细菌基因组提取方法提取不同枯草芽孢杆菌接种量的链霉菌S.albus基因组DNA，稀释100倍作为qPCR模板。20μl qPCR体系包括：SsoFastEvaGreen Supermix10μl(Bio-Rad)，引物各0.4μl，ddH2O8.2μl，模板1μl；扩增程序为98℃预变性2min，39个循环的98℃变性5s，60℃15s，39循环。应用Bio-Rad CFX Manager2.1进行数据采集和处理，根据qPCR Ct值和基因组拷贝数的标准曲线得到不同枯草芽孢杆菌接种量的链霉菌S.albus基因组拷贝数，结果如表3，表明添加抑菌组分能够有效抑制链霉菌S.albus的生长。

表3抑菌组分对S.albus的抑制作用

抑菌组分	S.albus抑制率
		对照	0
Surfactin	63％
		Fengycin	56％

3.抗菌活性组分对S.albus产土臭素的影响

添加抗菌活性组分的发酵液中土臭素含量采用HS-SPME-GC-MS方法进行定量，结果如表4，结果表明添加抑菌组分能够有效抑制土臭素的合成。

表4抑菌组分对对S.albus产土臭素的影响

抑菌组分	土臭素抑制率
		对照	0
Surfactin	100％
		Fengycin	96％

Claims (9)

1.一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-1，分离自高温酿酒大曲，2013年8月12日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC:M2013373。

2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，其特征是能够产生抗菌活性物质抗菌脂肽。

3.权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌，其特征是抑制白酒酿造过程中产土臭素的链霉菌(Actinomycetes)的生长及土臭素的生成。

4.权利要求2所述的枯草芽孢杆菌，其特征是抗菌脂肽为surfactin及其同系物，具有如下结构：

5.权利要求2所述的枯草芽孢杆菌，其特征是抗菌脂肽为fengycin A和fengycinB及其同系物，具有如下结构：

6.权利要求2所述的枯草芽孢杆菌，其特征是所述抗菌脂肽抑制白酒酿造过程中产土臭素链霉菌的生长及土臭素的产生。

7.一种利用枯草芽孢杆菌控制白酒中土臭味的方法，其特征是通过向白酒酿造过程中添加一定量的枯草芽孢杆菌以控制白酒中土臭味。

8.权利要求7所述方法，其特征在于所述枯草芽孢杆菌可以菌液或固体菌剂形式添加至酿造大曲中。

9.权利要求7或8所述的方法，其特征在于所述枯草芽孢杆菌的用量为大曲中链霉菌总量的1％至100％，能降低酿造大曲中链霉菌含量至47％-100％，降低白酒中土臭素浓度20％-100％。