CN103820351B

CN103820351B - 一种卡伍尔氏链霉菌及其应用

Info

Publication number: CN103820351B
Application number: CN201210590374.4A
Authority: CN
Inventors: 潘华奇; 于素亚; 胡江春; 王书锦
Original assignee: Institute of Applied Ecology of CAS
Current assignee: Institute of Applied Ecology of CAS
Priority date: 2012-12-28
Filing date: 2012-12-28
Publication date: 2015-12-23
Anticipated expiration: 2032-12-28
Also published as: CN103820351A

Abstract

本发明属于微生物技术领域，更具体地说是一种卡伍尔氏链霉菌及其应用。卡伍尔氏链霉菌（Streptomyces？cavourensis），于2012年12月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC？M2012530。所述卡伍尔氏链霉菌（Streptomyces？cavourensis）能发酵产生较高含量的巴佛洛霉素（bafilomycins）。且发酵所得巴佛洛霉素bafilomycin？B1和bafilomycin？C1具有良好的生物活性，对包括尖孢镰刀菌、棉花串珠镰刀菌、番茄立枯丝核菌、番茄灰霉等在内的许多病原真菌具有较好的拮抗作用显示出良好的应用前景。

Description

一种卡伍尔氏链霉菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，更具体地说是一种卡伍尔氏链霉菌及其应用。

背景技术

地球面积的70%被海洋所覆盖，海洋中的生物种类繁多，浩瀚的海洋已经成为人们寻找各种新兴资源的巨大宝库，海洋微生物能够产生各种活性物质而被世界各国越来越重视。从海洋微生物特别是深海微生物发掘具有产生物活性的特殊资源具有重要意义。

巴佛洛霉素(bafilomycins)是具有十六元大环内酯结构的一类化合物。它们是特异性的液泡型H+-ATPase（vacuolar-typeH+-ATPase，V-ATPase）抑制剂，在极低的nmol/l水平即可对V-ATPase具有抑制作用。V-ATPase广泛分布于真核生物的液泡，反式高尔基体，溶酶体，核内体，分泌颗粒等细胞内膜系统中，根据各细胞器官的微小环境酸性差别，各自发挥独立机能，是一种新的药物靶点。因此bafilomycins具有广泛的生物活性，如抗细菌、抗真菌、杀虫、抗肿瘤和免疫抑制等活性。另外bafilomycinB1还被报道可作为治疗骨溶性疾病的潜在抗骨质疏松剂。目前他们作为商品化的分子工具，可以有效阻止突触小泡在经历胞吐作用时的再次酸化。可见bafilomycins具有很强的应用潜力。

然而，已报道的bafilomycins产量都不是很高，Werner等从100L灰色链霉菌的发酵产物中分离得到bafilomycinC1120mg，Yu等从菌株YIM56209的9.6L发酵产物分离得到bafilomycinC11.8mg。MASARUUYEDA等从链霉菌NO.758的5L发酵产物分离得到AH75810mg。由此可见，bafilomycins产量较低是其应用受到较大的限制的重要原因。

发明内容

本发明目的在于提供一种卡伍尔氏链霉菌及其应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种卡伍尔链霉菌，卡伍尔链霉菌NA4（StreptomycescavourensisNA4），于2012年12月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCM2012530。

卡伍尔链霉菌的应用，所述卡伍尔链霉菌（Streptomycescavourensis）作为巴佛洛霉素（bafilomycins）的产生菌。

所述卡伍尔链霉菌（Streptomycescavourensis）经发酵产生bafilomycinB1和bafilomycinC1，产生的bafilomycinB1和bafilomycinC1含量分别达23.45mg/L和6.603mg/L。

所述卡伍尔链霉菌（Streptomycescavourensis）的发酵产物作为抗真菌抑制剂。

所述卡伍尔链霉菌（Streptomycescavourensis）的发酵产物作为抗植物病原真菌的抑制剂。

所述所述卡伍尔链霉菌（Streptomycescavourensis）的发酵产物作为抗尖孢镰刀菌、棉花串珠镰刀菌、番茄立枯丝核菌、番茄灰霉、黄瓜枯萎病菌、榛子枯萎病菌、禾谷镰刀菌、哈密瓜枯萎病菌、腐皮镰刀菌、棉花串珠菌或杉木枯萎病菌的抑制剂。

将卡伍尔链霉菌（Streptomycescavourensis）NA4经海水高氏一号培养基活化后接种于NM2培养基中，温度25-37℃，转速100-300rpm，发酵培养4-10d，离心收集发酵液上清液依次经HP20固相萃1-24h、10%乙醇水除杂，95%乙醇水洗脱，收集洗液与上述离心所得菌体沉淀的甲醇提取液合并,减压浓缩获得含bafilomycinB1和bafilomycinC1的粗提物。

所述含bafilomycinB1和bafilomycinC1的粗提物经正向硅胶柱色谱二氯甲烷和甲醇混合液洗脱收集洗脱液，收集按体积比为20～5:1的二氯甲烷和甲醇混合液中组分。

所述NM2培养基(NovelMedium2)：葡萄糖1.0～3.0g，乳糖5.0～25.0g，甘油5.0～40.0mL，大豆蛋白胨2.0～10.0g，硝酸铵1.0～3.0g，酵母粉1.0～5.0g，微量元素母液0.1～1.0mL，用蒸馏水配平至1L，pH5.0～8.0；上述培养基所用微量元素母液成分为：FeSO₄·7H₂O0.1g，MnCl₂·4H₂O0.1g，ZnSO₄·7H₂O0.1g，蒸馏水1L。

所产bafilomycinB1和bafilomycinC1其应用范围不局限于专利所提及的抗真菌方面。

本发明所具有的优点：经本发明卡伍尔链霉菌（Streptomycescavourensis）NA4发酵能产生较高含量的巴佛洛霉素bafilomycinB1和bafilomycinC1，巴佛洛霉素bafilomycinC1的产量为6.603mg/L，bafilomycinB1的产量为23.45mg/L。且它们具有良好的生物活性，对包括尖孢镰刀菌、棉花串珠镰刀菌、番茄立枯丝核菌、番茄灰霉等在内的许多病原真菌具有较好的拮抗作用。

附图说明

图1为本发明实施例提供的经卡伍尔链霉菌产生的巴佛洛霉素（bafilomycins）BafilomycinB1和bafilomycinC1的结构图。

图2为本发明实施例提供的StreptomycescavourensisNA4的形态特征图。

图3为本发明实施例提供的StreptomycescavourensisNA4基于其16SrRNA基因序列构建的进化树。

具体实施方式

为了更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例作进一步说明，但本专利的保护内容不仅限于此。

实施例1深海放线菌NA4的鉴定

巴佛洛霉素（bafilomycins）的产生菌为卡伍尔链霉菌NA4（StreptomycescavourensisNA4）于2012年12月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCM2012530；保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学。其分离自南海-1464m的深海沉积物。

将StreptomycescavourensisNA4菌株在海水高氏一号培养基上其基内菌丝生长旺盛无横隔、不断裂，平板背面呈黄色，气生菌丝生长旺盛，暗烟灰色，有白斑，孢子丝较长含50个左右孢子，孢子表面光滑椭圆形。初步鉴定为链霉菌属Streptomycessp.NA4的菌落形态和孢子丝的电镜照片如图2所示。

将菌株NA4接种到国际通用的ISP系列菌种鉴定培养基和放线菌鉴定中常用的几种培养基，培养7d后观察其培养特征，该菌在ISP2、ISP3、ISP4、ISP5和PSA培养基上生长良好，不产生色素；在ISP2培养基培养时不易产生孢子，气丝灰色至白色，基丝白色至棕色；在葡萄糖天冬素培养基上生长一般如表2所示。

参照《放线菌的分离与鉴定》与《链霉菌鉴定手册》对菌株NA4进行生理生化特征的测定，结果见表3：该菌不能产生酪氨酸酶，但在酪氨酸平板上能产生黑色色素，明胶液化实验培养72h后出现阳性反应，且有褐色色素产生。可以水解淀粉、纤维素，能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。能利用阿拉伯糖、葡萄糖、D-果糖、甘露醇、木糖、不利用鼠李糖、棉子糖、肌醇。

将菌株NA4液体培养72h后，提取总DNA，经纯化后采用通用引物进行16SrDNA基因序列的PCR扩增，PCR产物经检测、纯化后进行测序，得到16SrDNA序列如下所示，在GenBank核酸序列数据库进行相关种属序列比较，结果显示，菌株NA4与Streptomycescavourensis、Streptomycesalbolongus、Streptomycescelluloflavus同源性均为100%，NA4在进化树上和上述3种菌在同一分支上（见图3），因此只凭借分子生物学特征尚不能确定该菌株具体种的归属。

>NA416SrRNA

ACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAAACCGCTTCGGTGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTTCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATAATACTCCTGCCTGCATGGGTGGGGGTTGAAAGCTCCGGCGGTGAAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGCAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGATGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCATTCGATACGGGCTAGCTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATATACCGGAAAGCATCAGAGATGGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTATACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTCTGTGTTGCCAGCATGCCTTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATGCCGTGAGGCGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTTGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGACTGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGG

结合菌种NA4的形态特征、生理生化特征及分子生物学特征的多种指标来确定菌株NA4的种属。该菌株与Streptomycescavourensis、Streptomycesalbolongus、Streptomycescelluloflavus相似性均为100%，但是这三种菌的形态特征存在很大差异，如Streptomycesalbolongus孢子呈长柱形，酪氨酸酶阳性且产黑色素，Streptomycescelluloflavus孢子链螺旋形，酪氨酸酶阴性不产黑色素，只有Streptomycescavourensis孢子丝很长椭圆形，酪氨酸酶阳性但产黑色素。因此菌株NA4与Streptomycescavourensis特征更为相近，因此鉴定该菌为卡伍尔链霉菌（Streptomycescavourensis）。

表2StreptomycescavourensisNA4的培养特征

表3StreptomycescavourensisNA4的生理生化特征

特征	结果	色素	特征	结果
					酪氨酸酶产生	-	黑色素	阿拉伯糖	+
明胶液化	+	褐色素	葡萄糖	+
					硝酸盐还原	+	褐色素	D-果糖	+

革兰氏染色	+		鼠李糖	-
					淀粉水解	+	无	棉子糖	-
纤维素分解	+	黑色素	肌醇	-
					H2S产生	+		甘露醇	+

实施例2

菌株NA4活性代谢产物的制备

菌种活化：将菌株NA4用划线法接种于人工海水高氏一号平板上，28℃恒温培养72h；

所述人工海水高氏培养基为：可溶性淀粉20g，KNO₃1g，K₂HPO₄0.5g，MgSO₄·7H₂O0.5g，FeSO₄·7H₂O0.01g，人工海水（含2.5%海盐）1L，琼脂20g，pH7.0-7.2,115℃高温灭菌30min。种子液的制备：在平板上菌株生长浓密处用打孔器取直径5mm菌块，接种于装有50mLNM2液体培养基的250mL三角瓶中，28℃180rpm恒温摇床培养72h；所述NM2培养基(NovelMedium2)：葡萄糖1.0～3.0g，乳糖5.0～25.0g，甘油5.0～40.0mL，大豆蛋白胨2.0～10.0g，硝酸铵1.0～3.0g，酵母粉1.0～5.0g，微量元素母液0.1～1.0mL，用蒸馏水配平至1L，pH5.0～8.0；上述培养基所用微量元素母液成分为：FeSO₄·7H₂O0.1g，MnCl₂·4H₂O0.1g，ZnSO₄·7H₂O0.1g，蒸馏水1L。

大瓶发酵：用容量为1L-3L的三角瓶，每瓶装NM2液体培养0.3-1L，115℃灭菌30min后备用。每瓶接种种子液20-50mL，28℃180rpm恒温摇床培养7d；

粗提物的获得：将发酵物于2000rpm离心20min，收集上清液，每100mL上清液发酵液加入6mL湿HP20大孔吸附树脂，在摇床上以180rpm处理2h，再以清水洗涤HP20并弃去洗涤液，然后用10%乙醇洗脱并弃去溶媒，最后用95%乙醇洗涤数次并收集洗脱液，至大孔树脂接近初始颜色为止，将得到的液体减压蒸馏后并冷冻干燥得发酵液粗提物。发酵液经离心得到的菌体用甲醇超声提取3次，同样经减压蒸馏并冷冻干燥得到粗提物。后经HPLC分析，发酵液和菌体粗体物峰型相似，故合并后再进行活性产物的分离纯化。

2.5中压柱色谱初步砍段分离：首先将发酵液粗提物和菌体粗提物合并后，用甲醇溶解，待不溶物静置沉降后，轻轻吸出溶液后按沉降物产物与硅胶质量比约为1:2的比例拌样，减压蒸馏至完全干燥。同时准备规格为330g的空柱管，装柱层析硅胶（500-600目）至距柱口4cm，轻轻敲打使硅胶密实平整，用循环水真空泵抽柱管下端，使柱子更加紧密，备用。然后，将拌好的上述混合硅胶的沉降物样品铺至柱子中，同样用真空泵减压使新加进的样品密实。最后采用二氯甲烷/甲醇体系进行梯度洗脱分离，流速为2.5mL/min，用220nm和280nm双波长检测。用纯二氯甲烷洗脱30min出现第一个峰为组分nf1，逐步提高甲醇的比例，在甲醇浓度为2-5%和6-11%时分别洗脱出现2个吸收最强的色谱峰，命名为nf2和nf3,；甲醇为12-19%，保留时间在80-100min时出现第四个峰，命名为nf4，甲醇为20-50%保留时间115-130min时出现第五个峰nf5，此后130min-200min间未出现明显峰，一起收集命名为nf6，200-240min出现峰命名为nf7，255min时采用纯甲醇洗脱时出现最后一个峰nf8。活性测试结果发现抗真菌活性最强的组分是nf2和nf3，经HPLC分析其化合物组分相似。

2.6TLC制备分离

组分nf2在TLC薄层板的成点性较好，在254nm紫外光照射下显现暗斑，由此可用TLC薄层层析法进行分离，采用二氯甲烷/甲醇混合液作为展开剂二氯甲烷/甲醇体积比例为20-10:1时分离效果最佳。将展开后的薄层板按条带收集后用纯甲醇洗脱，减压蒸馏后冷冻干燥得白色粉末状化合物Ⅰ和黄色粉末状化合物Ⅱ。采用TLC色谱分离，所得的两个化合物里面都存在少量杂质，故采用sephadex-LH20色谱柱进行除杂，洗脱体系为二氯甲烷/甲醇体积比例为1:1，杂质显橘黄色，化合物Ⅰ在凝胶柱不显颜色，化合物Ⅱ显黄色，所以根据色带即可分离。对这两个化合物进行HPLC纯度的检测，用C18分析柱，洗脱体系为85%的乙腈/水，0.53mL/min等度洗脱，检测波长为220nm，纯度均达90%以上。StreptomycescavourensisNA4产生bafilomycinB1和bafilomycinC1含量分别达23.45mg/L和6.603mg/L。

所述bafilomycinB1和bafilomycinC1通过1H-NMR、13C-NMR、HMBC、HSQC和HR-ESI-MS等手段进行了鉴定（图1和表1），其特征如下：

化合物bafilomycinC1，白色粉末状，HR-ESI-MS：m/z743.4006[M+Na]+，分子量720.4085，分子式为C₃₉H₆₀O₁₂。¹³C-NMR（DMSO）显示39个碳的特征如下；化合物bafilomycinB1，黄色粉末，HR-ESI-MS：m/z838.4345[M+Na]⁺，分子量815.4456，分子式为C₄₄H₆₅NO₁₃。¹³C-NMR（DMSO）显示44个碳的特征如下。

表1BafilomycinB1和bafilomycinC1的NMR特征

实施例3活性产物生物活性的测定

首先将立枯丝核菌或黄瓜枯萎病菌等病原真菌活化后用打孔器打9mm菌块，接种到PDA平板中央，28℃恒温培养，待菌落生长至直径大于4cm时，将上述分离纯化的化合物bafilomycinB1和bafilomycinC1配制成浓度分别为1mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL的溶液。用滤纸片法测定抗真菌活性，上样量为10μL，每种浓度设置3个重复，滤纸片直径为8mm，继续28℃恒温培养至菌丝生长到没过对照滤纸片，测量抑菌圈直径，计算出抑菌圈平均值并给出标准差。待病原真菌生长至铺满整个平板时记录抑菌圈的直径大小，抑菌圈直径越大则说明该菌株的抗真菌的活性越强。实验结果表明，这两种化合物对植物病原真菌具有很好的广谱抗性，结果如表4所示。

表4BafilomycinC1和B1对病原真菌的抑制活性

Claims

1.一种卡伍尔氏链霉菌，其特征在于：卡伍尔氏链霉菌(Streptomycescavourensis)，于2012年12月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCM2012530。

2.一种权利要求1所述的卡伍尔氏链霉菌的应用，其特征在于：所述卡伍尔氏链霉菌(Streptomycescavourensis)作为巴佛洛霉素(bafilomycins)的产生菌。

3.按权利要求2所述的卡伍尔氏链霉菌的应用，其特征在于：所述卡伍尔氏链霉菌(Streptomycescavourensis)经发酵产生bafilomycinB1和bafilomycinC1，产生的bafilomycinB1和bafilomycinC1含量分别达23.45mg/L和6.603mg/L；

所述卡伍尔氏链霉菌(Streptomycescavourensis)经发酵产生的bafilomycinB1和bafilomycinC1作为抗尖孢镰刀菌、棉花串珠镰刀菌、番茄立枯丝核菌、番茄灰霉、黄瓜枯萎病菌、榛子枯萎病菌、禾谷镰刀菌、哈密瓜枯萎病菌、腐皮镰刀菌、棉花串珠菌或杉木枯萎病菌的抑制剂。

4.按权利要求2或3所述的卡伍尔氏链霉菌的应用，其特征在于：将卡伍尔氏链霉菌(Streptomycescavourensis)经海水高氏一号培养基活化后接种于NM2培养基中，温度25-37℃，转速100-300rpm，发酵培养4-10d，离心收集发酵液上清液依次经HP20固相萃1-24h、10％乙醇水除杂，95％乙醇水洗脱，收集洗液与上述离心所得菌体沉淀的甲醇提取液合并,减压浓缩获得含bafilomycinB1和bafilomycinC1的粗提物；

所述NM2培养基(NovelMedium2)的成分为：葡萄糖1.0～3.0g，乳糖5.0～25.0g，甘油5.0～40.0mL，大豆蛋白胨2.0～10.0g，硝酸铵1.0～3.0g，酵母粉1.0～5.0g，微量元素母液0.1～1.0mL，用蒸馏水配平至1L，pH5.0～8.0；上述培养基所用微量元素母液成分为：FeSO₄·7H₂O0.1g，MnCl₂·4H₂O0.1g，ZnSO₄·7H₂O0.1g，蒸馏水1L。

5.按权利要求4所述的卡伍尔氏链霉菌的应用，其特征在于：所述含bafilomycinB1和bafilomycinC1的粗提物经正向硅胶柱色谱二氯甲烷和甲醇混合液洗脱，收集洗脱液，收集按体积比为20～5:1的二氯甲烷和甲醇混合液中组分。