CN102154116B

CN102154116B - 拟茎点霉属内生真菌及其用途

Info

Publication number: CN102154116B
Application number: CN 201010600416
Authority: CN
Inventors: 王国平; 章初龙; 林福呈; 夏静; 周转忠
Original assignee: ZHEJIANG DAHUA BIOTECHNILOGY CO Ltd
Current assignee: Zhejiang Dayang Biotech Group Co., Ltd.
Priority date: 2010-12-22
Filing date: 2010-12-22
Publication date: 2013-06-12
Anticipated expiration: 2030-12-22
Also published as: CN102154116A

Abstract

本发明公开了一种拟茎点霉属内生真菌，菌株ZJWCF252，保藏名称为：Phomopsis wenchengensis，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2010年11月01日，保藏号：CGMCC NO.4301，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。本发明还同时公开了上述拟茎点霉属内生真菌的用途，用于制备2,3-dihydro-2-hydroxy-2,4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one，其对多种植物病原真菌都具有很强的抑制作用。

Description

拟茎点霉属内生真菌及其用途

技术领域

本发明涉及微生物学及生物医药技术领域，具体地说，本发明涉及一种新的拟茎点霉属植物内生真菌ZJWCF252(Phomopsis wenchengensis)和其在制备抗真菌化合物2，3-dihydro-2-hydroxy-2，4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one过程中的作用，以及利用该菌株发酵制备2，3-dihydro-2-hydroxy-2，4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one的方法。

背景技术

长期以来不合理用药甚至肓目用药促使病菌抗药性的迅速产生，导致许多种老品种药物现在已没有多少应用价值，寻找开发新型活性化合物愈加显得重要。植物源药物来源范围较窄，加上近年药物需求逐年增多，许多珍贵的药用植物无序开发，导致野生植物资源溃泛，甚至于多种药用植物面临着绝种的风险。植物资源的短缺和不可再生性，导致许多药物更加难以满足市场需求。内生菌的生物多样性和化学多样性，成为发现新的活性化合物和先导化合物的重要来源。越来越多的学者开始注重对其的开发利用，从中寻找有价值次生代谢产物并应用于医药、环境和农业等领域。

植物内生真菌(endophytic fungi)是真菌的一个重要类群，据估计内生真菌总数达100万种。现在已有少数几种被用于医药、农艺生产或工业应用方面，但是植物内生真菌资源还远远未被充分发掘。内生真菌具有多种多样的生态学功能，内生真菌的生态学功能很可能是与其多样性相关，而内生真菌的多样性意味着其化学多样性。内生真菌可以产生各种各样的次生代谢产物，它们在人类生活、生产中具有重要的应用潜力，如内生真菌可以产生紫杉醇等抗肿瘤化合物、oreganic acid等新抗肿瘤活性物质；抗白色念珠菌、须癣毛癣菌和红色发癣菌等病原真菌的新化合物cryptocin、cryptocandin等能产生具有抗幽门螺杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷氏菌和鼠伤寒沙门氏菌等病原细菌的periconicins、rhizoctonic acid等。真菌与人类的关系非常密切，真菌可用以制造医药、食品、化工等工农业上重要的产品。著名的青霉素和头孢霉素是迄今为止真菌带给医药界的最珍贵的药物之一，也是目前最重要的抗生素，被广泛应用于细菌感染疾病的治疗上，并挽救了千千万万人类的生命。

化合物2，3-dihydro-2-hydroxy-2，4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one是JohnFrederick Grove^[1]于1971年在葡柄霉属(Stemphylium radicinum)菌株C.M.I.105654中发现；2009年王鸿升等^[2]从中药朝天罐根部分离获得化合物

2，3-dihydro-2-hydroxy-2，4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one。2000年ClaudiaOsterhage^[3]报道，海洋真菌Ascochyta salicorniae能产生化合物

2，3-dihydro-2-hydroxy-2，4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one，在加入海盐的固体培养基中Ascochyta salicorniae进行静止发酵培养，用乙酸乙酯浸取培养物，通过减压浓缩后所得乙酸乙酯浸膏反复通过硅胶-60和反相材料RP-18进行色谱分离纯化，最终获得该化合物；Donald B.Stierle^[4]于1997年从短叶红豆杉内生真菌Penicillium sp.菌株NRRL21208的发酵液中分离获得化合物

2，3-dihydro-2-hydroxy-2，4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one，菌株NRRL 21208在10g/L蛋白胨+40g/L葡萄糖+10g/L磷酸镁的液体培养基中静止培养21天后，将菌丝体与发酵液分离，得7升发酵液，每次用1升二氯甲烷反复萃取3次，得浸膏1.37克(0.2克/升)。浸膏通过高速逆流色谱进行分离纯化，流动相所用溶剂为正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝2∶2∶2∶1，从低极性部位分离出纯净的目标化合物样品158mg。Donald B.Stierle进行了不同培养条件发酵生产化合物

2，3-dihydro-2-hydroxy-2，4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one的对比试验，在10g/L蛋白胨+40g/L葡萄糖+10g/L磷酸镁的液体培养基中静止培养21天的产率为22mg/L，在10g/L蛋白胨+40g/L葡萄糖的液体培养基中静止培养21天的产率仅为4mg/L。

参考文献：

[1]John Frederick Grove.Metabolic products of Stemphylium radicinum.Part lV.Minorproducts(葡柄霉属Stemphylium radicinum菌株产生的代谢化合物).J.Chem.Soc.C，1971，2261-2263.

[2]王鸿升，王跃虎，石亚娜，李兴玉，龙春林..Chemical constituents in roots of Osbeckiaopipara(朝天罐根部的化学成分)，China Journal of Chinese Material Medica，2009，34(4)：414-418.

[3]Claudia Osterhage，Ronald Kaminsky，Gabriele M.Ko¨nig，Anthony D.Wright.Ascosalipyrrolidinone A，an Antimicrobial Alkaloid，from the Obligate MarineFungus Ascochyta salicorniae(一种来自海蓬子属海洋专性真菌壳二孢的生物碱类杀菌剂Ascosalipyrrolidinone A，)，J.Org.Chem.2000，65：6412-6417.

[4]Donald B.Stierle，Andrea A.Stierle，and Barbie Ganser.New Phomopsolides from aPenicillium sp.J.(一种来自于青霉属真菌的新化合物Phomopsolides)Nat.Prod.1997，60，1207-1209

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种拟茎点霉属新菌株，该菌株能用于制备化合物2，3-dihydro-2-hydroxy-2，4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种拟茎点霉属内生真菌，菌株ZJWCF252，保藏名称为：Phomopsis wenchengensis，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2010年11月01日，保藏号：CGMCC NO.4301，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明还同时提供了该拟茎点霉属内生真菌的用途：用于制备2，3-dihydro-2-hydroxy-2，4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one。

本发明还同时2，3-dihydro-2-hydroxy-2，4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one的制备方法，依次包括以下步骤：

1)、将菌株ZJWCF252在PDA培养基上进行活化；

2)、将活化后所得的ZJWCF252菌饼接入pH 3～8的液体种子培养基中，于50～300rpm的转速进行培养；培养温度为10～35℃，培养时间为2～10d；得种子培养液；

3)、将种子培养液按照重量比为1～20％的接种量接入pH 3～8的液体发酵培养基中，于50～300rpm的转速进行培养；培养温度为20～30℃，培养时间为1～12d，得发酵液；所述发酵液中含有2，3-dihydro-2-hydroxy-2，4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one。

作为本发明的2，3-dihydro-2-hydroxy-2，4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one的制备方法的改进：

步骤1)的活化条件为：将将菌株ZJWCF252转接在PDA培养基平板上，置于25～28℃的培养箱中培养7～10天。

作为本发明的2，3-dihydro-2-hydroxy-2，4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one的制备方法的进一步改进：

所述步骤2)中的液体种子培养基为马铃薯葡萄糖培养液、MID改订培养液、淀粉酵母培养液或蔗糖酵母培养液；

所述步骤3)中的液体发酵培养基为硫酸铵、硝酸钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钾、硫酸锌、硫酸锰、氯化铁、硼酸、碘化钾、酵母提取物、淀粉、葡萄糖和土豆汁的组合物。

①、将ZJWCF252的发酵液经压滤后收集滤液，所述滤液用0.6～3倍体积的溶剂进行提取，分离水相和有机相；有机相先用无水硫酸钠干燥，过滤，将所收集的有机相减压蒸馏，回收溶剂，得褐色的粗提物浸膏；

②、将所述粗提物浸膏进行硅胶柱层析分离，将粗提物浸膏与3～5质量倍的硅胶拌样，减压抽去溶剂，得硅胶拌均后样品；

称取粗提物浸膏50～100质量倍的200～300目柱层析硅胶装入玻璃层析柱，然后将硅胶拌均后样品装入层析柱，按极性从小到大的顺序，用石油醚/乙酸乙酯＝7/3～3/7体积比的阶梯配比的溶剂系统进行洗脱，收集洗脱液，通过薄层层析(TLC)检测，将斑点位置相同的洗脱液收集到一起，减压浓缩；然后用滤纸片法跟踪测试各组分对指示菌的抑制活性，得对终极腐霉具有抑菌活性的粗分样品；

③、将上述步骤②所得的对终极腐霉具有抑菌活性的粗分样品进行硅胶柱纯化细分，得细分样品；

④、将上述步骤③所得的细分样品通过凝胶柱层析分离，得目标化合物2，3-dihydro-2-hydroxy-2，4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one。

作为本发明的2，3-dihydro-2-hydroxy-2，4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one的制备方法的进一步改进：步骤③为：

将硅胶与6/2体积比的石油醚/乙酸乙酯的流动相混匀，湿法装入玻璃层析柱；硅胶是粗提物浸膏的50～100质量倍；

将对终极腐霉具有抑菌活性的粗分样品用6/2体积比的石油醚/乙酸乙酯的流动相溶解，过滤后湿法上样；按极性从小到大顺序，选择不同极性的石油醚/乙酸乙酯＝6/2-6/6的体积比的混合溶剂进行洗脱，收集洗脱液；采用高效薄层层析色谱(TLC)追踪斑点，选择最优化展开剂系统，以254nm及365nm紫外光照射或碘蒸汽显迹，同时用滤纸片法进行活性追踪；选择对终极腐霉具有强抑菌活性的，作为细分样品。

作为本发明的2，3-dihydro-2-hydroxy-2，4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one的制备方法的进一步改进：步骤④为：

干的sephadex LH20在甲醇中浸泡，装入玻璃层析柱，用甲醇冲洗；

将步骤③所得的细分样品溶于甲醇，通过有机微孔滤膜过滤，再装入上述层析柱，用甲醇洗脱分离；

收集洗脱液，采用高效薄层层析色谱(TLC)追踪斑点，选择最优化展开剂系统，以254nm及365nm紫外光照射或碘蒸汽显迹，斑点位置相同且有抑菌活性的部位就是目标化合物2，3-dihydro-2-hydroxy-2，4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one。

作为本发明的2，3-dihydro-2-hydroxy-2，4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one的制备方法的进一步改进：步骤①中的溶剂为石油醚、乙酸乙酯、氯仿和正丁醇中的至少一种。

在本发明的2，3-dihydro-2-hydroxy-2，4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one的制备方法中，

马铃薯葡萄糖培养液即PDB液体培养基。

MID改订培养液为每升含：蔗糖30.00g，蛋白胨1.00g，酵母提取物0.25g，酒石酸铵5.00g，Ca(NO₃)₂0.28g，KNO₃0.08g，NaCl 0.06g，MgSO₄0.36g，NaH₂PO₄·H2O 0.02g，FeCl₃·6H₂O 2.0mg，MnSO₄ 5.0mg，ZnSO₄·7H₂O 2.5mg，H₃BO₃1.4mg，KI 0.7mg，其余为水；pH 5.0。

淀粉酵母培养液为每升含：淀粉30g、葡萄糖10g，酵母提取物5.0g、蛋白胨3.0g、Ca(NO₃)₂ 0.4g，KNO₃0.12g，NaCl 0.2g，MgSO₄ 0.25g，FeCl₃·6H₂O 5.0mg，MnSO₄5.0mg，ZnSO₄·7H2O 5.0mg，H₃BO₃2.0mg，KI 1.0mg，其余为水；pH5.0。

蔗糖酵母培养液为每升含：蔗糖30g、葡萄糖10g，蛋白胨2g、酵母提取物5g，尿素1.0g，Ca(NO₃)₂0.4g，KNO₃0.12g，NaCl 0.2g，MgSO₄0.25g，FeCl₃·6H₂O 5.0mg，MnSO₄5.0mg，ZnSO₄·7H2O 5.0mg，H₃BO₃2.0mg，KI 1.0mg，其余为水；pH5.0。

步骤2)中的液体种子培养基优选马铃薯葡萄糖培养液、淀粉酵母培养液和蔗糖酵母培养液，最优选为淀粉酵母培养液。

步骤2)种子培养液的制备在控制的温度以及pH和转速下生长，以获得高细胞密度的培养物。优选的温度为20～32℃之间，最优选为28℃。优选的pH为4～7，最优选为5.0。优选的转速为100～250rpm，最优选为180rpm。培养时间优选为3～8d，最优选为5d。培养之后，采收全部种子培养液。

步骤3)中的液体发酵培养基为钙离子、镁离子、铁离子、尿素、氯化钠、硫酸铵、酒石酸铵、磷酸盐离子和其它微量元素、蛋白胨、酵母提取物、大豆饼粉、蔗糖、淀粉、葡萄糖、麸皮、土豆汁和玉米浆的组合物；更优选为硝酸钙、硫酸镁、硫酸铵、尿素、磷酸二氢钾、氯化钠、硫酸锌、硫酸锰、氯化亚铁、酒石酸铵、硼酸、碘化钾、蛋白胨、酵母提取物、大豆饼粉、葡萄糖、淀粉、土豆汁和玉米浆的组合物，最优选为硫酸铵、硝酸钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钾、硫酸锌、硫酸锰、氯化铁、硼酸、碘化钾、酵母提取物、淀粉、葡萄糖和土豆汁的组合物。步骤3)中：优选温度为22～28℃，最优选为25℃；优选的pH为4～7，最优选为5.5。优选接种时种子培养液与液体发酵培养基的比例为5-15％(体积比)，最优选10％。优选的转速为100～250rpm，最优选为180rpm。优选的生长时间为3～10d，最优选为7d。

本发明的拟茎点霉属新菌株的核糖体脱氧核糖核酸内转录间隔区(Internal transcribedspacer of ribosomal DNA，ITS rDNA)、翻译延伸因子(translation elongation factor 1alpha，tefl)、交配型(mating-type，MAT)基因具有独特的序列。

本发明的拟茎点霉属新菌株的代谢产物为2，3-dihydro-2-hydroxy-2，4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one，其是一种有效的杀菌剂，对立枯丝核菌、终极腐霉、尖孢镰刀菌、细链格孢(Alternaria alternata)、曲霉(Aspergillussp)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、蚕豆葡萄孢(Botrytis fabae)、圆形刺盘孢(Colletotrichumorbiculare)、泻根亚隔孢壳(Didymella bryoniae)、褐孢霉(Fulvia fulva)、淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)、指状青霉(Penicillum digitatum)、柿盘多毛孢(Pestalotiadiospyri)、稻梨孢菌(Pyricularia oryzae)、齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)、核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)、大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)等多种病原菌都具有抑制或杀灭作用。

采用本发明的拟茎点霉属新菌株发酵制备化合物

2，3-dihydro-2-hydroxy-2，4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one，具有发酵效率高、培养工艺简单、所选溶媒低毒价廉、提取分离纯化回收率高、纯化后样品纯度高、成本低廉等优点。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为内生真菌ZJWCF252的菌落形态及产孢结构图；

图1中：

1-A-1为内生真菌ZJWCF252在PDA培养基上的菌落形态图(1×)；

1-A-2为内生真菌ZJWCF252在PDA培养基上通过诱导后的产孢器图(1×)；

1-B-1为内生真菌ZJWCF252的孢子形态图(1000×)；

1-B-2为内生真菌ZJWCF252产孢结构切片图(200×)；

图2为菌株ZJWCF252核糖体rDNA内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer，ITSrDNA)构建的进化树；

图3为菌株ZJWCF252交配型(mating-type，MAT)DNA序列构建的进化树；

图4为菌株ZJWCF252延伸因子(translation elongation factor 1alpha gene，tef1)和交配型(mating-type，MAT)DNA序列结合构建的进化树；

图5为菌株ZJWCF252核糖体rDNA内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer，ITSrDNA)，延伸因子(translation elongation factor 1alpha gene，tef1)和交配型(mating-type，MAT)DNA序列结合构建的进化树；

图6为拟茎点霉属植物内生真菌新种ZJWCF252和尖孢镰刀菌对峙培养的抑制活性图；

图7为菌株ZJWCF252在优化前的培养条件下发酵产生活性化合物2，3-dihydro-2-hydroxy-2，4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one的色谱图；

图8为菌株ZJWCF252在优化后的培养条件下发酵产生活性化合物2，3-dihydro-2-hydroxy-2，4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one的色谱图；

图9为发酵液萃取相含活性化合物2，3-dihydro-2-hydroxy-2，4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one的浓度的色谱图；

图10是ZJWCF252菌株发酵液粗提物经纯化后的活性化合物2，3-dihydro-2-hydroxy-2，4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one样品色谱图；

图11是ZJWCF252菌株发酵液粗提物经纯化后的活性化合物2，3-dihydro-2-hydroxy-2，4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one样品液质图谱；

图12是ZJWCF252菌株发酵液粗提物经纯化后的活性化合物2，3-dihydro-2-hydroxy-2，4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one样品氢谱；图注：样品溶剂为CDCL3；

图13是ZJWCF252菌株发酵液粗提物经纯化后的活性化合物2，3-dihydro-2-hydroxy-2，4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one样品氢谱；图注：样品溶剂为CDCL3

图14是化合物2，3-dihydro-2-hydroxy-2，4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one对终极腐霉的抑制活性。

具体实施方式

实施例1、拟茎点霉属植物内生真菌新种ZJWCF252的分离纯化：

(1)植物组织标本的采集：于浙江文成石垟林场(地理位置为120°05E，27°47′N，位于浙江省文成县西北部，地处文成、景宁和泰顺交界，为典型的中亚热带海洋性季风气候。有国家重点保护野生植物8种，占浙江省文成县国家重点保护野生植物总数11种的72.7％，其中用材树种8种、药用植物4种、观赏植物8种、油料植物2种、科研植物5种)，2007年5月中旬，在海拔500～1000m区域采集植物标本，其中包括中华猕猴桃(Chinese goosebeery)和喜树(Camptotheca acuminata)，桑科药用植物仙女果(Ficuscarica L.)，采集部位包括根、茎、叶和果实，采集后保存于保鲜袋，在4℃条件下保存时间不超过48h，共采集49份植物样本。

(2)内生真菌的分离培养：将样品带到浙江大学生物技术研究所参照Schulz等方法进行内生真菌的分离纯化；具体为：内生真菌的分离纯化参照Schulz等方法进行，将步骤(1)无病斑无虫害的植物标本组织，用自来水冲洗洗去表面的尘土及其它杂质，晾干水份后将根、茎、枝条及叶片分别用75％(质量浓度)酒精表面消毒30-90s，之后再用无菌水冲洗，将样品组织置于5％(质量浓度)次氯酸钠溶液中消毒5-10min，最后用无菌水冲洗数次并置于无菌吸水纸上吸干游离水。在无菌条件下将叶片沿着叶脉剪切成3～10mm×3～10mm左右大小，根、茎及枝条先用手术刀刮去外皮，将韧皮部切成3～10mm×3～10mm左右大小；以此作为植物标本移接在含100μg/ml氨苄青霉素和链霉素的PDA平板(即，在每ml的PDA液体培养基内加入100μg的氨苄青霉素和100μg的链霉素)上，25℃培养3～10d，待菌丝长出后将菌丝顶端移接到PDA培养基(即PDA固体培养基)上，连续重复纯化3次(即重复上述将菌丝顶端移接到PDA固体培养基上的步骤共3次)后用石蜡油或冷冻法进行保存。将上述表面消毒处理过的植物标本不做剪切直接植于PDA平板上作为对照检查表面消毒是否彻底，确保分离得到的真菌是植株的内生真菌而非表面附生菌。

此次从上述49个植物样本中共分离内生真菌586份。从桑科植物仙女果(Ficus caricaL.)的枝条中分离获得的菌株命名为ZJWCF252。

实施例2、植物内生真菌ZJWCF252的鉴定

通过形态学和分子系统学进行鉴定，用PDA培养基和促孢培养基，用多种促孢手段进行进行培养，对分离到的内生真菌进行菌落形态、颜色、生长速率及显微形态特征进行观察，根据其产孢结构、分生孢子梗着生情况、孢子形态与颜色等，并结合核糖体脱氧核糖核酸内转录间隔区(Internal transcribed spacer of ribosomal DNA，ITS rDNA)、翻译延伸因子(translation elongation factor 1alpha，tef1)、交配型(mating-type，MAT)DNA序列进行分类鉴定。内生真菌ZJWCF252具有以下微生物学特性：

内生真菌ZJWCF252在PDA培养基、麦芽汁培养基和促孢培养基中生长都很慢，20d菌落直径仅为6-8cm，菌落边缘有一圈黑色突起物，菌落不规则，菌落中间有许多黑色和白色突起，菌丝为白色，菌丝中间致密边缘稀疏，能分泌棕红色水溶性色素，能产孢(见图1-A-1和1-A-2)；产孢器黑色而坚硬，上顶端呈圆锥形且有三个开口，底部呈圆形伸入基质，产孢器分隔成三个腔，大小为542.9-628.6μm×685.7-742.9μm，分生孢子呈椭圆形，大小为3.9-5.4μm×10.8-13.1μm(见图1-B-1和1-B-2)。

内生真菌ZJWCF252的ITS rDNA、tef1和MAT序列的PCR扩增引物ITS15′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和ITS45′-T CCTC CG CTTATTGATATGC-3′，tef1序列PCR扩增引物EF-728F5′-CAT CGAGA AGTT C GAGAAGG-3′和EF-986R5′-TACTTGAAGGAACCCTTACC-3′，MAT序列PCR扩增引物MAT1-1-FW5′-GCAA MIG TKTIKACTCAC A-3′和MAT 1-1-1RV 5′-GTCT MTGACCARGACCATG-3′均由上海生工合成，DNA模板的提取参照文献进行，菌丝体在液氮中研成粉末，按每管约100mg的量分装于1.5mL离心管中。采用DNeasy Plant Mini Kits(QIAGEN)，按厂商的程序提取基因组DNA。在100mg菌体粉末中加入400μl裂解缓冲液AP1和4μl 100mg/mlRNase A贮存液，剧烈振荡混匀60s，65℃保温10min裂解细胞，隔3min振荡混匀1次；裂解液中加130μl缓冲液AP2，混匀，冰浴5min后14000rpm/min离心5min；取上清液至QIAshredder离心柱，14000rpm/min离心2min；将滤过液移至1.5ml eppendorf管，加1.5倍沉淀缓冲液AP3/E，用枪头吸打混匀；取650μl反应液至DNeasy微型柱，11000rpm/min离心1min，弃去收集管中的滤液；将余下的反应液移至DNeasy微型柱，11000rpm/min离心1min，弃去收集管和滤液；将DNeasy微型柱置于另一收集管，加500μl缓冲液AW至DNeasy微型柱，11000rpm/min离心1min，弃去收集管中的滤液；将DNeasy微型柱重新置于收集管中，加500μl缓冲液AW至DNeasy微型柱，14000rpm/min离心2min，弃去收集管和滤液；将DNeasy微型柱置于另一1.5ml eppendorf管上，加100μl预热(65℃)的缓冲液AE至DNeasy膜上，室温静止5min，11000rpm/min离心1min，收集滤液即为基因组DNA。-20℃保存备用。取5μl样品在1.4％Agarose胶上电泳，检测DNA的分子大小，同时取1μl稀释50倍，测定OD₂₆₀/OD₂₈₀，检测DNA含量及质量。PCR体系：DNA模板1.0μl，10×PCR缓冲液(含25mmol/L MgCl₂)5.0μl，dNTP(5mmol/L)1.0μl，引物(100μg/m1)各0.4μl，Taq DNA聚合酶(2U/μ1)1μl，加水补足50μl。PCR反应条件如下表所述，PCR扩增产物用QIAGEN公司的QIA quick PCR纯化试剂盒纯化：在PCR反应产物中加5倍体积的PB缓冲液，涡旋混匀；将上述混合液转至QIAquick微型柱中，离心柱置于2mL收集管上，13000rpm离心30-60s；弃去收集管中的滤液，将微型柱重新放回收集管中；加0.75mL PE缓冲液至微型柱中，13000rpm离心30-60s；弃去收集管中的滤液，将微型柱重新放回收集管中，14000rpm离心1min；将微型柱置于1.5mL离心管上，加30μL EB缓冲液或水，静止1min后13000rpm离心1min，收集滤液即为纯化的PCR产物。纯化后的PCR产物-20℃保存备用。取2μL滤液在琼脂糖凝胶上电泳，估算浓度，PCR扩增纯化产物测序由上海泽衡公司完成。

表1核糖体脱氧核糖核酸内转录间隔区(Internal transcribed spacer of ribosomal DNA，ITS rDNA)、延伸因子(translation elongation factor 1alpha gene，tef1)、交配型(mating-type，MAT)DNA序列的PCR扩增条件

内生真菌ZJWCF252的ITS rDNA序列长为714bp，tef1序列长为349bp和MAT基因序列长度为序144bp。利用BLAST软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)与GenBank数据库中的序列进行比对分析，获得最相近菌株的序列，用Clustal x1.8按照最大同源性的原则进行排序，系统发生树的构建由软件MEGA4完成，应用距离法进行系统发生分析，应用自举分析评估树的可靠性，设置自举值为500。从所构建的进化树可以看出(图2～图5)，内生真菌ZJWCF252与其它典型菌株之间的序列差异明显，遗传距离差异较大，形成一个明显的独立分枝。结合形态学特征，ZJWCF252与拟茎点霉属其它菌株有较大的差异，根据现代微生物的分类标准确定该菌株为拟茎点霉属新种Phomopsiswenchengensis。本发明所述的拟茎点霉属新种内生真菌ZJWCF252的ITS rDNA、tef1和MAT基因序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所述。

实施例3、具有抑菌活性的内生真菌筛选

采用两点对峙培养法进行活性菌株的筛选，用直径为5mm的不锈钢打孔器切取纯化后的内生真菌菌饼，接入直径为90mm的PDA平板一侧(距中心30mm)，25℃培养2d后在PDA平板另一侧(距中心30mm)接入病原指示菌，同时以只接病指示菌为对照，2-5d后观察菌落的生长及抑菌情况，用卡尺测量内生真菌与病原菌菌落生长的相向半径：r_内、r_病，以及对照半径r₀，病原菌与内生菌菌落相交后，观察记录内生真菌对病原菌的包围、抑制及覆盖病原菌菌落占领其营养空间的过程，筛选出对病原菌具有抑制作用的内生菌。

病菌的生长抑制率可采用下列公式计算：＝对照病原菌直径r₀-病原菌菌落直径r_病/对照病原菌直径r₀×100％

对分离纯化后的586株内生真菌菌株(实施例1所得)分别进行了上述生物活性筛选，分别以尖孢镰刀菌、灰葡萄孢、立枯丝核菌、终极腐霉为指示菌，结果发现：从桑科植物仙女果(Ficus carica L.)的枝条中分离获得的菌株ZJWCF252对所选的指示菌都具有很强抗菌活性(尖孢镰刀菌的抗菌活性见图6)。

该菌株ZJWCF252进行了保藏，保藏名称为：Phomopsis wenchengensis，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2010年11月01日，保藏号：CGMCC NO.4301，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

实施例4、由拟茎点霉属新种内生真菌ZJWCF252发酵制备化合物2，3-dihydro-2-hydroxy-2，4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one

1)、将菌株ZJWCF252在PDA固体培养基上进行活化；活化条件为：将保存管中的菌种用无菌接种针挑取少许菌体，转接在事先准备好的PDA培养基平板上，置于25-28℃的培养箱中培养7-10天；

2)、活化后的ZJWCF252菌体用直径为5mm的打孔器切取菌饼，400ml淀粉酵母培养液(pH＝5)中接入10块菌饼，在28℃，转速为180rpm条件下培养5d；全部采收作为种子培养液。

淀粉酵母培养液为每升含：淀粉30g、葡萄糖10g，酵母提取物5.0g、蛋白胨3.0g、Ca(NO₃)₂ 0.4g，KNO₃0.12g，NaCl 0.2g，MgSO₄0.25g，FeCl₃·6H₂O 5.0mg，MnSO₄5.0mg，ZnSO₄·7H2O 5.0mg，H₃BO₃2.0mg，KI 1.0mg，其余为水；pH5.0。

3)、将种子培养液按照10％(重量比)的接种量接入液体发酵培养基(pH＝5.5)中，在25℃、转速为180rpm条件下培养7d，培养之后采收发酵液，并通过抽滤收集滤液，该滤液中含有浓度为405mg/l的2，3-dihydro-2-hydroxy-2，4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one，测试结果如图8。

如果不选择上述优化后的工艺条件，所得滤液中含有浓度为131mg/l的化合物2，3-dihydro-2-hydroxy-2，4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one。测试结果如图7。

上述液体发酵培养基每升含：硫酸铵0.5g、硝酸钙0.8g、硫酸镁0.25g、磷酸二氢钾0.4g、氯化钾0.15g、硫酸锌5mg、硫酸锰5mg、氯化铁5mg、硼酸2mg、碘化钾1mg、酵母提取物5g、淀粉10g、葡萄糖20g，其余为20％土豆汁，pH＝5.5。20％土豆汁的制备方法如下：将200g去皮后土豆切成小块，加水800g，加热煮沸30min后，过滤，收集滤液，定容至1L。

实施例5、发酵液中化合物2，3-dihydro-2-hydroxy-2，4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one的提取以及它的分离纯化

1)、将实施例4抽滤后所得的滤液，用0.6～3倍体积的石油醚、乙酸乙酯、氯仿、正丁醇或它们的组合物提取(优选乙酸乙酯为溶剂，萃取3次，每次的用量是滤液的0.3体积倍)，将水相和有机相分离，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤后所收集的有机相减压(-0.098Mpa，50℃)蒸馏，回收溶剂，得褐色的粗提物浸膏。

萃余液(水相)中活性化合物2，3-dihydro-2-hydroxy-2，4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one经液相色谱测试仅为2.6ml/l，提取率达到99.36％，萃余液残留结果见图9。

2)、褐色的粗提物浸膏进行硅胶柱层析分离：称取10g粗提物浸膏，用30g200-300目的柱层析硅胶拌样，混合均匀后再减压(-0.098Mpa，50℃)抽去溶剂，得硅胶拌均后样品。称取600g的200-300目柱层析硅胶，干法装入直径为5.5cm、长度为110cm的玻璃层析柱，轻轻敲打直至沉降不再变动，将上述硅胶拌均后样品装入层析柱，按极性从小到大的顺序，用石油醚/乙酸乙酯＝7/3～3/7(体积比)不同配比的溶剂系统进行洗脱，具体为：石油醚/乙酸乙酯的体积比依次为：7/3，6/4，5/5，4/6和3/7，每份溶剂的量均为1000ml。

每100ml收集1份洗脱液，通过薄层层析(TLC)检测，将斑点位置相同的洗脱液收集到一起，减压(-0.098Mpa，50℃)浓缩后收集粗分样品，并用滤纸片法跟踪测试各组分对指示菌的抑制活性。

3)、为获得纯品，收集上述步聚2)中的第44-57瓶之间所收集的粗分样品4780mg(对终极腐霉具有抑菌活性)再次进行硅胶柱纯化细分。具体操作如下：将300～400目的层析硅胶(青岛海洋化工集团)置于120℃活化1h，称取约600g活化后的硅胶与1000mL的石油醚/乙酸乙酯(6/2的体积比)的流动相混匀，并用超声波赶除汽泡后湿法装入直径5.5cm、长为110cm的玻璃层析柱，轻轻敲打10min后再静止平衡2h，将4780mg粗分样品用10mL石油醚/乙酸乙酯(6/2的体积比)的流动相溶解，过滤后湿法上样。按极性从小到大顺序，选择不同极性的石油醚/乙酸乙酯＝6/2-6/6(体积比)混合溶剂进行洗脱，即，具体为：石油醚/乙酸乙酯的体积比依次为：6/2，6/3，6/4，6/5和6/6，每份溶剂的量为1000ml。

50mL为单位收集洗脱液，共收得100份洗脱液。采用高效薄层层析色谱(TLC)追踪斑点，选择最优化展开剂系统，以紫外光(254nm及365nm)照射或碘蒸汽显迹，同时用滤纸片法进行活性追踪。其中所收集的第64-70瓶之间的样品为同一斑点，且对终极腐霉具有很强的抑菌活性。第64-70瓶汇总后经减压(-0.098Mpa，50℃)浓缩共4300mg样品。

4)、为了更进一步纯化样品，上述所收集的第64-70瓶之间的样品4300mg(主要斑点相同，但主斑点附近还是有一杂质斑点)，通过硅胶柱层析无法得到纯品，因此需要进行凝胶柱层析分离。

将100g干的sephadex LH20在500ml甲醇中浸泡24h，装入玻璃层析柱(直径为3.5cm，长度为150cm)，然后用10-20倍柱体积的甲醇冲洗。将上述所收集的第64-70瓶之间的样品4300mg溶于10ml甲醇，通过孔径为0.45微米的有机微孔滤膜过滤，再装入层析柱，用甲醇洗脱分离。以20ml为单位收集洗脱液，采用高效薄层层析色谱(TLC)追踪斑点，选择最优化展开剂系统，以紫外光(254nm及365nm)照射或碘蒸汽显迹，其中第20-22号组分为目标化合物2，3-dihydro-2-hydroxy-2，4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one。第20-22瓶汇总后经减压(-0.098Mpa，50℃)浓缩共收集样品量为4085mg，经液相色谱测定，纯度≥99.0％，测试结果见图10。

实施例6、化合物2，3-dihydro-2-hydroxy-2，4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one(实施例5所得)的分析鉴定

通过外观、熔点、旋光性、NMR、HPLC/MS和生物活性对化合物进行分析鉴定，该化合物为淡黄色晶体，熔点97-99℃，[R]20D+20.3°(C0.022MeOH)。根据ESI-MS中准分子离子峰m/s：169[M+H]⁺以及¹³C-NMR和¹H-NMR可得其分子式为C₉H₁₂O₃，分析测试图谱见图10～12。

表2化合物2，3-dihydro-2-hydroxy-2，4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one的氢谱和碳谱数据

position	δ_H	δ_C
			1	1.534(3H，S，H-9)	5.33.，C-10
2	1.696(3H，S，H-10)	18.95，C-9
			3	1.986(3H，dd，H-8)	22.18，C-8
4	5.392(H，-OH)	102.27，C-2
			5	6.378(H，dd，H-6)	106.86，C-4
6	6.863(H，m，H-7)	118.93，C-6
			7		139.58，C-7
8		176.92，C-5
			9		202.94，C-3

利用内生真菌新种ZJWCF252可以发酵制备的抗菌活性化合物2，3-dihydro-2-hydroxy-2，4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one，其结构式为：

活性化合物2，3-dihydro-2-hydroxy-2，4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one的高效液相色谱测试条件如下：Waters高效液相色谱仪(1525二元高压梯度泵、2487紫外双波长检测器，Breeze工作站)，色谱柱为C18柱(sunfire C185μm 4.6×250mm)，流动相为甲醇∶水(V/V)＝3∶2，流速1.0mL/min，检测波长为310nm，室温。其中发酵液样品中含有较多的水溶性蛋白和糖类分子，为确保检测柱的安全高效，样品进入检测柱前进行必要的预处理，减少蛋白、糖分子及其它颗粒杂质进入色谱柱，处理的方法是在发酵液样品加入等体积的色谱纯甲醇，混匀后10000rpm离心5min，去除沉淀，取上清液进样检测。

实施例7化合物2，3-dihydro-2-hydroxy-2，4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one(实施例5所得)的抗真菌活性测试

活性化合物2，3-dihydro-2-hydroxy-2，4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one抗真菌活性研究，采用滤纸片和混药法来测试抑菌活性。用无菌水将供试样品稀释成6个梯度后加入到PDA中，混匀后倒入直径60mm的培养皿中制成有毒平板。每个梯度3个重复，并以无菌水为空白(CK)对照。将活化的供试病原菌菌饼(直径5mm)接种至有毒平板中央，25℃培养至对照皿菌菌即将长满平皿时，用十字交叉法测量各处理皿的菌落直径。

用下式计算抑制率：

利用DPS统计软件，采用剂量对数-抑菌率机值法计算求得半抑制稀释倍数(ID50)或半抑制浓度(IC50)及毒力回归方程。

测试所选用的指示菌有立枯丝核菌、终极腐霉、尖孢镰刀菌、细链格孢(Alternariaalternata)、曲霉(Aspergillus sp)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、蚕豆葡萄孢(Botrytis fabae)、圆形刺盘孢(Colletotrichum orbiculare)、泻根亚隔孢壳(Didymella bryoniae)、褐孢霉(Fulviafulva)、淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)、指状青霉(Penicillum digitatum)、柿盘多毛孢(Pestalotia diospyri)、稻梨孢菌(Pyricularia oryzae)、齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)。

活性物质2，3-dihydro-2-hydroxy-2，4-dimethyl-5-trans-propenyl furan-3-one对供试的15种植物病原真菌都具有很强的抑制作用，对终极腐霉的活性最强，半抑制浓度EC₅₀为9.51μg/ml，测试结果见图14和表3。

表3活性代谢产物2，3-dihydro-2-hydroxy-2，4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one对不同病原真菌的抑菌活性

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

SEQ ID NO：1

核糖体rDNA 内转录间隔区（Internal Transcribed Spacer ,ITS rDNA ）基因序列

tatagaatac tcaagctatg catccaacgc gttgggagct ctcccatatg gtcgacctgc 60

aggcggccgc gaattcacta gtgatttccg taggtgaacc tgcggaggga tcattgctgg 120

aacgcgcccc aggcgcaccc agaaaccctt tgtgaactca tacctactgt tgcctcggcg 180

ctagctggtc cctatggggc cccttggaga caaggagcgg cgcgccggcg gccaaccaaa 240

ctctgtttct tagtgaatct ctgagtaaaa aacaaatgaa tcaaaacttt caacaacgga 300

tctcttggtt ctggcatcga tgaagaacgc agcgaaatgc gataagtaat gtgaattgca 360

gaattcagtg aatcatcgaa tctttgaacg cacattgcgc cctctggtat tccggagggc 420

atgcctgttc gagcgtcatt tcaaccctca agcctggctt ggtgctgggg cgctgcttct 480

cacaggagca ggccctgaaa ttcagtggcg agctcgccag gactccgagc gtagtagtat 540

atctcgttct ggaaggcctg gcggtgccct gccgttaaac cccaacttct gaaaatttga 600

cctcggatca ggtaggaata cccgctgaac ttaagcatat caataagcgg aggaatcgaa 660

ttcccgcggc cgccatggcg gccgggagca tgcgacgtcg ggcccaattc gccc 714

SEQ ID NO：2

延伸因子（translation elongation factor 1 alpha gene，tef1）基因序列

catcgagaag ttcgagaagg aaggttagta aacataacaa tcacagcccg tgtcatttag 60

ccctcaacct ggacccatac catcagcgtg cggctggttg cgactgtccg ttgctccaga 120

ggcgcatttt cacccctcgc tctgcatttt ttcccatttc agtgcgggtg cggggtccgc 180

ttatcagggg gcttatctcc tacgcccaaa aaccctgttg catcactcac tccttgccac 240

catcataacc tccgtcacca atcccaccgc ccccgttaac tacaacccat gctaacctgt 300

tatccccaca gccgccgagc ttggtaaggg ttccttcaag taaatcact 349

SEQ ID NO：3

交配型（mating-type，MAT）基因序列

tgtctatgac caagaccatg ttgtaggtgt tgagccaaag gtcaggctga gtcaaacgag 60

tctcttcgat ggcggcaacg gcgtattgca aggtgctgtt gaatccgcca ctgaaatcgc 120

ggatgtgagt ccaaaccgtt gcaa 144

Claims

1.拟茎点霉属内生真菌（Phomopsis wenchengensis）菌株ZJWCF252，其保藏号为：CGMCC NO.4301。

2.如权利要求1所述的拟茎点霉属内生真菌的用途，其特征是：用于制备2,3-dihydro-2-hydroxy-2,4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one；所述2,3-dihydro-2-hydroxy-2,4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one的分子式为C₉H₁₂O₃ 、结构式为：

。

3.一种2,3-dihydro-2-hydroxy-2,4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one的制备方法，其特征是依次包括以下步骤：

1）、将菌株ZJWCF252在PDA培养基上进行活化；

2）、将活化后所得的ZJWCF252菌饼接入pH 3~8的液体种子培养基中，于50~300 rpm的转速进行培养；培养温度为10~35℃，培养时间为2~10 d；得种子培养液；

所述液体种子培养基为马铃薯葡萄糖培养液、MID改订培养液、淀粉酵母培养液或蔗糖酵母培养液；

马铃薯葡萄糖培养液为PDB液体培养基；

MID改订培养液为每升含：蔗糖30.00 g，蛋白胨1.00 g，酵母提取物0.25 g，酒石酸铵5.00 g，Ca(NO₃) ₂ 0.28 g，KNO₃ 0.08g，NaCl 0.06 g，MgSO₄ 0.36 g，NaH₂PO₄·H2O 0.02 g，FeCl₃·6H₂O 2.0 mg，MnSO₄ 5.0 mg，ZnSO₄·7H₂O 2.5 mg，H₃BO₃ 1.4 mg，KI 0.7 mg，其余为水；pH 5.0；

淀粉酵母培养液为每升含：淀粉30g、葡萄糖10g，酵母提取物5.0g、蛋白胨3.0g、Ca(NO₃) ₂ 0.4 g，KNO₃ 0.12 g，NaCl 0.2 g，MgSO₄ 0.25 g， FeCl₃·6H₂O 5.0 mg，MnSO₄ 5.0 mg，ZnSO₄·7H2O 5.0mg，H₃BO₃ 2.0 mg，KI 1.0 mg，其余为水；pH5.0；

蔗糖酵母培养液为每升含：蔗糖30g、葡萄糖10g，蛋白胨2g、酵母提取物5g，尿素1.0g，Ca(NO₃) ₂ 0.4 g，KNO₃ 0.12 g，NaCl 0.2 g，MgSO₄ 0.25g， FeCl₃·6H₂O 5.0 mg，MnSO₄ 5.0 mg，ZnSO₄·7H2O 5.0mg，H₃BO₃ 2.0 mg，KI 1.0 mg，其余为水；pH5.0；

3）、将种子培养液按照重量比为1~20%的接种量接入pH 3~8的液体发酵培养基中，于50~300 rpm的转速进行培养；培养温度为20~30℃，培养时间为1~12d，得发酵液；所述发酵液中含有2,3-dihydro-2-hydroxy-2,4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one；

所述液体发酵培养基为硫酸铵、硝酸钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钾、硫酸锌、硫酸锰、氯化铁、硼酸、碘化钾、酵母提取物、淀粉、葡萄糖和土豆汁的组合物。

4.根据权利要求3所述的2,3-dihydro-2-hydroxy-2,4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one的制备方法，其特征是：

所述步骤1）的活化条件为：将将菌株ZJWCF252转接在PDA培养基平板上，置于25~28℃的培养箱中培养7~10天。

5.根据权利要求3或4所述2,3-dihydro-2-hydroxy-2, 4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-

3-one的制备方法，其特征是：将步骤3）所得的发酵液继续依次进行以下步骤：

①、将发酵液经压滤后收集滤液，所述滤液用0.6~3倍体积的溶剂进行提取，分离水相和有机相；有机相先用无水硫酸钠干燥，过滤，将所收集的有机相减压蒸馏，得褐色的粗提物浸膏；

②、将所述粗提物浸膏进行硅胶柱层析分离，将粗提物浸膏与3~5质量倍的硅胶拌样，减压抽去溶剂，得硅胶拌均后样品；

称取粗提物浸膏50~100质量倍的200~300目柱层析硅胶装入玻璃层析柱，然后将硅胶拌均后样品装入层析柱，按极性从小到大的顺序，用石油醚/乙酸乙酯=7/3～3/7体积比的阶梯配比的溶剂系统进行洗脱，收集洗脱液，通过薄层层析检测，将斑点位置相同的洗脱液收集到一起，减压浓缩；然后用滤纸片法跟踪测试各组分对指示菌的抑制活性，得对终极腐霉具有抑菌活性的粗分样品；

④、将上述步骤③所得的细分样品通过凝胶柱层析分离，得目标化合物2,3-dihydro-2-hydroxy-2,4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one。

6.根据权利要求5所述的2,3-dihydro-2-hydroxy-2,4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one的制备方法，其特征是：所述步骤③为：

将硅胶与6/2体积比的石油醚/乙酸乙酯的流动相混匀，湿法装入玻璃层析柱；所述硅胶是粗提物浸膏的50~100质量倍；

将对终极腐霉具有抑菌活性的粗分样品用6/2体积比的石油醚/乙酸乙酯的流动相溶解，过滤后湿法上样；按极性从小到大顺序，选择不同极性的石油醚/乙酸乙酯=6/2-6/6的体积比的混合溶剂进行洗脱，收集洗脱液；采用高效薄层层析色谱追踪斑点，选择最优化展开剂系统，以254nm及365nm紫外光照射或碘蒸汽显迹，同时用滤纸片法进行活性追踪；选择对终极腐霉具有强抑菌活性的，作为细分样品。

7.根据权利要求6所述的2,3-dihydro-2-hydroxy-2,4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one的制备方法，其特征是：所述步骤④为：

收集洗脱液，采用高效薄层层析色谱追踪斑点，选择最优化展开剂系统，以254nm及365nm紫外光照射或碘蒸汽显迹，斑点位置相同且有抑菌活性的部位就是目标化合物2,3-dihydro-2-hydroxy-2,4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one。

8.根据权利要求7所述的2,3-dihydro-2-hydroxy-2,4-dimethyl-5-trans-propenylfuran-3-one的制备方法，其特征是：所述步骤①中的溶剂为石油醚、乙酸乙酯、氯仿和正丁醇中的至少一种。