CN115125284B - 一种光叶苕子拮抗菌的高效筛选方法 - Google Patents

一种光叶苕子拮抗菌的高效筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种光叶苕子拮抗菌的高效筛选方法，属于菌株筛选技术领域。本发明的筛选方法包括如下步骤：(1)将光叶苕子样品液涂布于固体培养基中，培养，得到菌落；(2)将步骤(1)所述的菌落接种至已含有靶标微生物的固体培养基中，继续培养，筛选靶标微生物生长受抑制区域的菌落，得到拮抗菌。本发明的筛选方法无需事先分离单菌落，节约时间，简单高效；不易遗漏样品中的微生物；能定量把控靶标微生物的含量；还能使靶标微生物在培养基中均匀接种，避免了靶标微生物喷洒不均匀影响拮抗菌的筛选，也避免了靶标微生物泄漏导致的二次污染。为筛选植物拮抗菌提供了依据。

Description

一种光叶苕子拮抗菌的高效筛选方法
技术领域
本发明涉及菌株筛选技术领域，尤其涉及一种光叶苕子拮抗菌的高效筛选方法。
背景技术
光叶苕子(ViciavillosaRothvar)为豆科植物，其生长快，生物量大，粗蛋白含量高，是优良的饲料作物。同时其固氮能力强，也是一种优质的绿肥作物和农作物生产的重要物质基础，是绿色农业的有效技术支撑。目前，作为南方农田常用的一种冬季绿肥，不仅能充分利用农田冬闲时期的水、光、热和土地资源，翻压还田还可为农作物提供养分，起到化肥减施的效果，同时还能改善土壤理化性状，提高作物产量，改善生态环境。光叶苕子内生和根际促生菌是一种内生于植物根系和栖息于根际土壤或根系表面的有益菌，包括细菌、真菌和放线菌，可促进植物生长及营养元素的吸收和利用。拮抗有害微生物，是开发和利用微生物肥料的有效菌种资源，内生菌和根际促生菌往往对宿主植物起到促生、防病虫、固氮、抗逆境(如干旱等)、抗动物(昆虫、食草哺乳动物等)摄食等作用，能够产生对宿主有利的活性代谢产物，还可作为外源基因载体而发挥作用，所以光叶苕子内生和根际促生菌具有广阔的开发前景。
现有绿肥植物筛选拮抗菌的方法包括以下几种：
方法1为：首先需要分离培养获得单菌株，然后分别对这些菌株进行拮抗性筛选。此方法存在如下缺点：(1)费时、费力、效率低；现有方法需要大量分离菌株并分别通过拮抗实验进行筛选，工作量大，耗费时间、人力、物力和财力，从而导致效率低下。(2)菌种遗漏：样品中微生物种类十分庞杂。从样品中分离菌株时，其中的优势微生物会被多次重复分离，而劣势微生物则极易被遗漏，从而减少了筛选到拮抗菌种的种类。
方法2为CN110283879A“一种真菌拮抗菌的快速筛选方法”中公开的利用可替代平板对峙法筛选拮抗菌的方法。该方法虽然在一定程度上节约拮抗菌筛选的时间，但其应用于从土壤样品中筛选拮抗菌时仍需要先从样品中分离单菌株，因而仍需要耗费较长的时间，同时也会遗漏样品中的部分微生物。
方法3为CN106566870A“一种高通量快速筛选真菌拮抗细菌的方法”中公开的利用48孔细胞培养板筛选真菌拮抗细菌的方法。该方法存在的缺点如方法2。
方法4为CN108504578A“一种铁线莲叶斑病拮抗菌的筛选方法”中公开了一种铁线莲叶斑病拮抗菌的筛选方法，该筛选方法大大缩小了筛选对象的范围，减少了工作量，从而节约了时间提高的工作效率。但是(1)目标菌孢子悬浮液喷雾量难以精确控制。喷雾过少难以达到筛选目的；喷雾过多则会使液体在培养基表面流淌，导致平板上待测菌落相互混合，从而影响拮抗菌筛选。(2)目标菌孢子悬浮液喷雾不均匀影响拮抗菌筛选。(3)目标菌孢子悬浮液喷雾泄露导致工作设备污染。
综上可以看出，目前急需一种高效、省时，无需事先分离单菌落，并不遗漏样品中微生物，并能精准控制条件，不会导致二次污染的植物拮抗菌株的筛选方法来满足市场的需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种光叶苕子拮抗菌的高效筛选方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种光叶苕子拮抗菌的高效筛选方法，包括如下步骤：
(1)将光叶苕子样品液涂布于固体培养基中，培养，得到菌落；
(2)将步骤(1)所述的菌落接种至已含有靶标微生物的固体培养基中，继续培养，筛选靶标微生物生长受抑制区域的菌落，得到拮抗菌。
作为优选，步骤(1)所述光叶苕子样品液为光叶苕子内生菌样品液或光叶苕子根际菌样品液。
作为优选，所述光叶苕子内生菌样品液的制备方法为：将光叶苕子根与水混合研磨后，分离，取上清液进行梯度稀释，得到光叶苕子内生菌样品液；
所述光叶苕子根与水混合的质量体积比为9～11g：9～11mL。
作为优选，所述光叶苕子根际菌样品液的制备方法为：将光叶苕子根际土壤与水混合，震荡25～35min，分离，取上清液进行梯度稀释，得到光叶苕子根际菌样品液。
作为优选，步骤(1)和步骤(2)所述的固体培养基独立的为NA培养基或PDA培养基；
所述NA培养基以水为溶剂包括如下质量浓度的组分：蛋白胨4.5～5.5g/L、酵母浸膏0.8～1.2g/L、牛肉膏2.8～3.2g/L、琼脂14～16g/L、葡萄糖9～11g/L；
所述PDA培养基以水为溶剂包括如下质量浓度的组分：马铃薯190～210g/L、葡萄糖19～21g/L、琼脂19～21g/L。
作为优选，步骤(1)所述培养的温度为28～30℃；
所述培养的时间为24～72h。
作为优选，步骤(2)所述接种的菌落的直径为1～4mm。
作为优选，步骤(2)所述接种的方法为复印接种法；
所述复印接种法为：利用绒布或滤纸进行菌落转接。
作为优选，步骤(2)所述靶标微生物为病原微生物；
所述病原微生物为青霉、胶抱炭疽病或香蕉枯萎病TR4。
作为优选，步骤(2)所述继续培养的温度为28～30℃；
所述继续培养的时间为24～72h。
本发明提供了一种光叶苕子拮抗菌的高效筛选方法。本发明的方法较现有技术拮抗菌的筛选方法具有如下优点：
(1)无需事先分离单菌落，节约时间，简单高效；
(2)本发明的筛选方法直接从样品中进行筛选，这样不易遗漏样品中的微生物；
(3)本发明的筛选方法能定量把控靶标微生物的含量，不至于接种太多造成平板微生物间的混淆，也不会出现接种太少不能达到筛选的目的；
(4)本发明的筛选方法还能使靶标微生物在培养基中均匀接种，避免了靶标微生物喷洒不均匀造成影响拮抗菌的筛选，也避免了靶标微生物泄露导致的二次污染。
附图说明
图1为光叶苕子根部土壤对尖孢镰刀菌具有拮抗作用菌的验证结果图(其中，上图为根部土壤中的细菌对尖孢镰刀菌的拮抗效应，左上为正面图，右上为反面图；下图为根部土壤中的真菌对尖孢镰刀菌的拮抗效应，左下为正面图，右下为反面图)。
图2为光叶苕子根部内生菌对尖孢镰刀菌具有拮抗作用菌的验证结果图(其中，上图为根部内生细菌对尖孢镰刀菌的拮抗效应，左上为正面图，右上为反面图；下图为根部内生真菌对尖孢镰刀菌的拮抗效应，左下为正面图，右下为反面图)。
图3为光叶苕子根部土壤以及根部内生菌对尖孢镰刀菌没有拮抗作用的结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种光叶苕子拮抗菌的高效筛选方法，包括如下步骤：
(1)将光叶苕子样品液涂布于固体培养基中，培养，得到菌落；
(2)将步骤(1)所述的菌落接种至已含有靶标微生物的固体培养基中，继续培养，筛选靶标微生物生长受抑制区域的菌落，得到拮抗菌。
在本发明中，步骤(1)所述光叶苕子样品液为光叶苕子内生菌样品液或光叶苕子根际菌样品液。在本发明中，所述光叶苕子内生菌样品液的制备方法为：将光叶苕子根与水混合研磨后，分离，取上清液进行梯度稀释，得到光叶苕子内生菌样品液。在本发明中，所述光叶苕子根为长度为0.9～1.1cm的小段；优选为长度为1cm的小段；所述与水混合的光叶苕子根为经过消毒后的根，所述消毒优选为使用75％的酒精冲洗，进一步优选为75％的酒精冲洗后，利用1％的氯化汞冲洗。所述光叶苕子根与水混合的质量体积比为9～11g：9～11mL，优选为10g：10mL。
在本发明中，所述光叶苕子根际菌样品液的制备方法为：将光叶苕子根际土壤与水混合，震荡25～35min，分离，取上清液进行梯度稀释，得到光叶苕子根际菌样品液。在本发明中，所述光叶苕子根系土壤与水混合的质量体积比为10g：90mL。
在本发明中，步骤(1)和步骤(2)所述的固体培养基独立的为NA培养基或PDA培养基；
所述NA培养基以水为溶剂包括如下质量浓度的组分：蛋白胨4.5～5.5g/L，优选为5g/L；酵母浸膏0.8～1.2g/L，优选为1g/L；牛肉膏2.8～3.2g/L，优选为3g/L；琼脂14～16g/L，优选为15g/L；葡萄糖9～11g/L，优选为10g/L；
所述PDA培养基以水为溶剂包括如下质量浓度的组分：马铃薯190～210g/L，优选为200g/L；葡萄糖19～21g/L，优选为20g/L；琼脂19～21g/L，优选为20g/L。
在本发明中，步骤(1)所述培养的温度为28～30℃，优选为29℃；所述培养的时间为24～72h，优选为48h。步骤(1)所述培养为倒置培养。
在本发明中，选取菌落密度为0.5个/cm2～1.5个/cm2的平皿进行接种；优选为1个/cm2的平皿。在本发明中，步骤(2)所述接种的菌落的直径为1～4mm，优选为2.5mm。
在本发明中，步骤(2)所述接种的方法为复印接种法；所述复印接种法为：利用绒布或滤纸进行菌落转接。在本发明中，所述利用绒布或滤纸进行菌落转接的方法为：将菌落与绒布或滤纸接触，得到携带有菌体的微生物；将所述携带有菌体的微生物与含有靶标微生物的固体培养基接触，即可完成转接。在本发明中，所述含有靶标微生物的固体培养基的制备方法为：融化所述的固体培养基，待固体培养基的温度降至45℃时，加入靶标微生物菌液或孢子悬浮液，得到含有靶标微生物的固体培养基。在本发明中，步骤(2)所述靶标微生物为病原微生物；所述病原微生物为青霉、胶抱炭疽病或香蕉枯萎病TR4。在本发明中，步骤(2)所述继续培养的温度为28～30℃，优选为29℃；所述继续培养的时间为24～72h，优选为48h。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明实施例以筛选光叶苕子内生菌和根际土壤中香蕉枯萎病尖孢镰刀菌4号生理小种热带型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense tropical race 4,Foc TR4)拮抗菌的筛选方法为例进行阐述的；
本发明实施例中采用的高致病性香蕉枯萎病尖孢镰刀菌4号生理小种热带型(FocTR4菌株GD-13)菌种均取自本课题组，并保存于中国农业科学院菌种保存中心，菌株编号分别为ACCC 37969。
实施例1
光叶苕子根际土壤中香蕉枯萎病尖孢镰刀菌4号生理小种热带型拮抗菌的筛选
取光叶苕子附着于根系周围的土壤，将土壤中的杂质去除干净，取10g无杂质的土壤放入锥形瓶中，加90mL无菌水后振荡器振荡30min，得到混合液。
根际细菌的分离：分离上述所述的混合液，取上清液1mL稀释至10-4、10-5、10-6浓度梯度，得到不同稀释度的光叶苕子根际菌样品液。取不同稀释度的光叶苕子根际菌样品液0.1mL，用无菌涂布棒涂于NA培养基(配方:蛋白胨5g，酵母浸膏l g，牛肉膏3g，琼脂粉15g，葡萄糖10g，用蒸馏水定容至1000mL，调整pH至7.0，121℃灭菌20min)平板上。于30℃倒置培养24h，得到细菌菌落。
根际真菌的分离：分离上述所述的混合液，取上清液1mL稀释至10-1、10-2、10-3浓度梯度，得到不同稀释度的光叶苕子根际菌样品液。取不同稀释度的光叶苕子根际菌样品液0.1mL用无菌涂布棒涂于PDA(配方：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，去皮马铃薯煮沸30min后用蒸馅水将滤液定容至1000mL，121℃，灭菌20min)培养基平板上，于28℃倒置培养72h，得到真菌菌落。
利用血球计数板检测并调整尖孢镰刀菌4号生理小种热带型孢子悬浮液中所含孢子的密度，使其所含孢子初始密度为106孢子/mL。
将NA培养基和PDA培养基进行融化，待所述培养基的温度降至45℃时，加入尖孢镰刀菌4号生理小种热带型孢子悬浮液，每30mL培养基中加入0.1mL尖孢镰刀菌4号生理小种热带型孢子悬浮液，混合均匀后，倒入平皿中，得到含有尖孢镰刀菌4号生理小种热带型孢子的固体培养基，备用。
用一块灭菌的绒布包裹并固定在直径较平皿小0.2cm的圆饼状固体上，构成接种工具，然后包裹绒布的圆饼覆盖在细菌菌落或真菌菌落的平板上，把菌落中的菌体吸附在绒布上，然后将吸附菌体的绒布按压在含有尖孢镰刀菌4号生理小种热带型孢子的固体培养基上，NA培养基中的菌体在30℃培养48h，PDA培养基中的菌体在28℃培养72h。选取培养基上尖孢镰刀菌4号生理小种热带型生长受抑制的圆形区域生长的菌落即为尖孢镰刀菌的候选拮抗菌株。转接时细菌菌落的平板上菌落的直径为1mm，平板中菌落的密度为0.5个/cm2。转接时真菌菌落的平板上菌落的直径为2mm，平板中菌落的密度为1个/cm2。
挑取候选拮抗菌株，采用十字定位法进行验证，从而获得尖孢镰刀菌4号生理小种热带性的拮抗菌株，具体验证方法如下所示：
用十字定位法在平板直径为90cm的PDA培养基上标记刻度线，刻度线包括两条以直角穿过底面中心的直线，并且正相交。使用打孔器从TR4菌落的边缘提取含有TR4菌丝体且直径为5mm的琼脂盘，并放置在刻度交叉点的中心，然后用接种针挑取候选拮抗细菌菌落接种在距TR4菌丝盘2.5cm的刻度线上，于30℃培养48h，验证候选拮抗菌是否对尖孢镰刀菌4号生理小种热带型具有显著的抑制作用。结果如图1所示。
仍用十字定位法在平板直径为90cm的PDA培养基上标记刻度线，刻度线包括两条以直角穿过底面中心的直线，并且正相交。使用打孔器从TR4菌落的边缘提取含有TR4菌丝体且直径为5mm的琼脂盘，并放置在刻度交叉点的中心，然后用接种针挑取候选拮抗真菌菌落接种在距TR4菌丝盘2.5cm的刻度线上，于28℃培养72h，验证候选拮抗真菌是否对尖孢镰刀菌4号生理小种热带型具有显著的抑制作用。结果如图1所示。
筛选得到对尖孢镰刀菌4号生理小种热带型菌株没有拮抗作用的平皿如图3左所示。
实施例2
光叶苕子根部内生菌香蕉枯萎病尖孢镰刀菌4号生理小种热带型拮抗菌的筛选
内生菌细菌的分离：称取l0 g洗净的植物根，并剪成1cm的小断放入灭菌的研体中，加入75％的酒精，60s后用无菌水冲洗一次，重复2次，放入含有9mL无菌水的灭菌研钵中，加入石英砂研磨均匀，静置15min，取1mL稀释至10-4、10-5、10-6浓度梯度，得到不同稀释度的光叶苕子根部内生菌样品液。从各浓度梯度内生菌样品液中各取0.1mL，用无菌涂布棒涂于NA培养基(配方:蛋白胨5g，酵母浸膏l g，牛肉膏3g，琼脂粉15g，葡萄糖10g，用蒸馏水定容至1000mL，调整pH至7.0，121℃灭菌20min)平板上，于30℃倒置培养，得到细菌菌落。
内生菌真菌的分离：称取l0 g洗净的植物根，并剪成1cm的小断放入灭菌的研体中，加入75％的酒精，60s后用无菌水冲洗一次，重复2次，再加入1％的氯化汞，20s后用无菌水冲洗一次，重复2次，放入含有9mL无菌水的灭菌研钵中，加入石英砂研磨均匀，静置15min，取1mL稀释至10-1、10-2、10-3浓度梯度，得到不同稀释度的光叶苕子根部内生菌样品液。从各浓度梯度内生菌样品液中各取0.1mL，用无菌涂布棒涂于PDA(配方：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，去皮马铃薯煮沸30min后用蒸馅水将滤液定容至1000mL，121℃，灭菌20min)培养基平板上，28℃倒置培养，得到真菌菌落。
利用血球计数板检测并调整尖孢镰刀菌4号生理小种热带型孢子悬浮液中所含孢子的密度，使其所含孢子初始密度为106孢子/mL。
将NA培养基和PDA培养基进行融化，待所述培养基的温度降至45℃时，加入尖孢镰刀菌4号生理小种热带型孢子悬浮液，每30mL培养基中加入0.1mL尖孢镰刀菌4号生理小种热带型孢子悬浮液，混合均匀后，倒入平皿中，得到含有尖孢镰刀菌4号生理小种热带型孢子的固体培养基，备用。
用一块灭菌的绒布包裹并固定在直径较平皿小0.2cm的圆饼状固体上，构成接种工具，然后包裹绒布的圆饼覆盖在细菌菌落或真菌菌落的平板上，把菌落中的菌体吸附在绒布上，然后将吸附菌体的绒布按压在含有尖孢镰刀菌4号生理小种热带型孢子的固体培养基上，NA培养基中的菌体在30℃培养48h，PDA培养基中的菌体在28℃培养72h。选取培养基上尖孢镰刀菌4号生理小种热带型生长受抑制的圆形区域生长的菌落即为尖孢镰刀菌的候选拮抗菌株。转接时细菌菌落的平板上菌落的直径为1mm，平板中菌落的密度为0.5个/cm2。转接时真菌菌落的平板上菌落的直径为2mm，平板中菌落的密度为1个/cm2。
按照实施例1所述的十字定位法对筛选得到的光叶苕子根部内生候选拮抗细菌进行验证。结果如图2所示。
按照实施例1所述的十字定位法对筛选得到的光叶苕子根部内生候选拮抗真菌进行验证。结果如图2所示。
筛选得到对尖孢镰刀菌4号生理小种热带型菌株没有拮抗作用的平皿如图3右所示。
由以上实施例可知，本发明提供了一种光叶苕子拮抗菌的高效筛选方法。本发明的方法较现有技术拮抗菌的筛选方法具有如下优点：无需事先分离单菌落，节约时间，简单高效；不易遗漏样品中的微生物；能定量把控靶标微生物的含量；还能使靶标微生物在培养基中均匀接种，避免了靶标微生物喷洒不均匀造成影响拮抗菌的筛选，也避免了靶标微生物泄露导致的二次污染。为筛选植物拮抗菌提供了依据。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种光叶苕子拮抗菌的高效筛选方法在筛选香蕉枯萎病TR4拮抗菌中的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将光叶苕子内生菌样品液涂布于固体培养基中，培养，得到细菌和真菌菌落；
(2)将步骤(1)所述的细菌和真菌菌落分别接种至已含有香蕉枯萎病TR4的固体培养基中，继续培养，筛选香蕉枯萎病TR4生长受抑制区域的菌落，得到拮抗菌；
步骤(1)从所述光叶苕子内生菌样品液中分离细菌的方法为：将10g光叶苕子根剪碎，加入75%酒精消毒60s后清洗，与9mL无菌水混合研磨后，静置15min分离，取上清液进行梯度稀释，得到光叶苕子内生菌样品液，取0.1mL光叶苕子内生菌样品液涂布于NA培养基平板上，于30℃倒置培养48h，得到光叶苕子内生细菌菌落；
步骤(1)从所述光叶苕子内生菌样品液中分离真菌的方法为：将10g光叶苕子根剪碎，加入75%酒精消毒60s后清洗，再加入1%氯化汞消毒20s后清洗，与9mL无菌水混合研磨后，静置15min分离，取上清液进行梯度稀释，得到光叶苕子内生菌样品液，取0.1mL光叶苕子内生菌样品液涂布于PDA培养基平板上，于28℃倒置培养72h，得到光叶苕子内生真菌菌落；
步骤(2)所述接种的方法为复印接种法；
所述复印接种法为：利用绒布或滤纸进行菌落转接。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述NA培养基以水为溶剂包括如下质量浓度的组分：蛋白胨5g/L、酵母浸膏1g/L、牛肉膏3g/L、琼脂15g/L、葡萄糖10g/L。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述PDA培养基以水为溶剂包括如下质量浓度的组分：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述接种的菌落的直径为1～4mm。
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