CN108949895A - 一种拮抗菌筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种拮抗菌株筛选方法，所述方法包括以下步骤：制备待筛选的样品液，将其涂布接种至平板1的表面并加以培养；通过复印接种法将所述平板1表面生长的菌落转接种至已接种靶标微生物的平板2的表面，继续培养；挑选平板2表面靶标微生物生长受抑制区域生长的菌落，即为所述靶标微生物的拮抗菌株。本发明所述方法无需事先分离单菌株，节约时间，简单高效，直接从样品中筛选拮抗菌，不易遗漏样品中微生物。可精确控制条件，避免了接种不均匀、接种量难以精确控制、易导致设备污染等问题。

Description

一种拮抗菌筛选方法
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体而言，涉及一种拮抗菌筛选方法。
背景技术
拮抗菌是对其它微生物的生长具有抑制作用的微生物，在作物、采后果蔬病害的生物防治中具有重要的应用价值。
靶标微生物：本发明中的靶标微生物是指拟通过拮抗菌防治的微生物，一般是植物的病原微生物或农产品、食品、饲料中的污染微生物。
现有筛选拮抗菌方法包括以下几种：
方法1：首先将土壤样品放入锥形瓶中，加水后振荡，再将上清液涂布到含琼脂的固体培养基，于28℃～37℃倒置培养至固体培养基表面长出菌落时，分别挑取菌落接种到新的固体培养基上进行划线培养，即分离到多个菌株。然后采用平板对峙法对分离到的菌株逐个进行拮抗试验，以筛选靶标微生物的拮抗菌。
所述方法1首先需要分离培养获得单菌株，然后分别对这些菌株进行拮抗性筛选。此方法存在如下缺点：(1)费时、费力、效率低；现有方法需要大量分离菌株并分别通过拮抗实验进行筛选，工作量大，耗费时间、人力、物力和财力，从而导致效率低下。(2)菌种遗漏：土壤样品中微生物种类十分庞杂。从土壤样品中分离菌株时，其中的优势微生物会被多次重复分离，而劣势微生物则极易被遗漏，从而减少了筛选到拮抗菌种的种类。
方法2：发明专利“一种真菌拮抗菌的快速筛选方法”(公开号：CN106480162A)公开了一种利用可替代平板对峙法筛选拮抗菌的方法，其方法为：将含待测菌的琼脂基质平铺于载玻片上，然后在琼脂基质表面接种目标真菌孢子，通过观察孢子的萌发情况筛选拮抗菌。
方法3：发明专利“一种高通量快速筛选真菌拮抗细菌的方法”(公开号：CN106566870A)公开了一种利用48孔细胞培养板筛选真菌拮抗细菌的方法。
上述方法2、方法3虽然在一定程度上节约拮抗菌筛选的时间，但其应用于从土壤样品中筛选拮抗菌时仍需要先从样品中分离单菌株，因而仍需要耗费较长的时间，同时也会遗漏样品中的部分微生物。
方法4：发明专利“一种从土壤样品中高效筛选大丽轮枝菌拮抗细菌的方法”(公开号：CN106755277A)公开了一种从土壤样品中高效筛选大丽轮枝菌拮抗细菌的方法，其方案为：将土壤样品加水后获得的上清液涂平板，待长出菌落后在平板表面采用喷雾法接种大丽轮枝菌孢子悬浮液，其过程无需分离单菌株，从而节约时间并提高效率。
方法4存在如下问题：(1)目标菌孢子悬浮液喷雾量难以精确控制。喷雾过少难以达到筛选目的；喷雾过多则会使液体在培养基表面流淌，导致平板上待测菌落相互混合，从而影响拮抗菌筛选。(2)目标菌孢子悬浮液喷雾不均匀影响拮抗菌筛选。(3)目标菌孢子悬浮液喷雾泄露导致工作设备污染。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种拮抗菌株的筛选方法，所述方法无需事先分离单菌株，节约时间，简单高效，直接从样品中筛选拮抗菌，不易遗漏样品中微生物。可精确控制条件，避免了接种不均匀、接种量难以精确控制、易导致设备污染等问题。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种拮抗菌株筛选方法，所述方法包括以下步骤：
(1)制备待筛选的样品液，将其涂布接种至平板1的表面并加以培养；
(2)通过复印接种法将所述平板1表面生长的菌落转接种至已接种靶标微生物的平板2的表面，继续培养；
(3)挑选平板2表面靶标微生物生长受抑制区域生长的菌落，即为所述靶标微生物的拮抗菌株。
在一些具体的实施方式中，所述步骤(1)包括：制备不同浓度的样品液，分别涂布接种至平板1的表面，待样品液被平板1吸收后，将其置于28℃～37℃下，倒置培养24h～72h，待菌落直径达到1mm～4mm后，选择菌落密为0.5个/cm2-1.5个/cm2的平板1作为被转接种的对象。
在一些具体的实施方式中，步骤(2)所述复印接种法利用绒布或者滤纸进行菌落转接，其中，优选绒布。
在一些具体的实施方式中，步骤(2)所述平板2通过以下方式接种：在加热融化的培养基凝固之前，加入靶标微生物的孢子悬浮液或菌体悬浮液，混合均匀，倒出至培养皿中冷却凝固后备用。
在一些具体的实施方式中，步骤(2)所述孢子悬浮液或菌体悬浮液的密度为0.5×106个/mL～2×106个/mL(优选为1×106个/mL)，所述孢子悬浮液或菌体悬浮液的加入量为0.1mL/30mL～0.5mL/30mL(优选为0.25mL/30mL)培养基。
在一些具体的实施方式中，步骤(2)所述继续培养的条件包括：将菌落转接种至所述平板2后，将所述平板2置于28℃～37℃培养24h～72h。
在一些具体的实施方式中，所述方法还包括步骤(4)：对所述拮抗菌株做进一步验证；优选地，采取平板对峙法进行所述验证。
在一些具体的实施方式中，步骤(4)所述平板对峙法包括：
在平板3的中央接种直径为4mm～6mm(优选5mm)的靶标微生物，在距离所述菌饼边缘1.5cm～2.5cm(优选2cm)处接种所述拮抗菌株，于28℃～37℃培养24h～72h，验证所述拮抗菌株是否对所述靶标微生物具有显著的抑制作用。
在一些具体的实施方式中，所述样品选自土壤、食品、水样和物体表面洗脱液中的一种或多种，优选地，所述样品为土壤。
在一些具体的实施方式中，所述靶标微生物为病原微生物或污染微生物，优选地，所述病原微生物为植物的病原微生物，例如青霉或胶孢炭疽病，所述污染微生物为农产品、食品、饲料中的污染微生物。
本发明提供一种从土壤中高效分离拮抗菌的方法，所述方法包括：
(1)取1～5g土壤装入锥形瓶中，加入10ml无菌蒸馏水，封口后于28℃条件下180rpm～250rpm振荡30min，取上清液以无菌蒸馏水进行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7梯度稀释。每个梯度取1ml涂布LB平板，待液体被吸收后将平板置于28℃～37℃倒置培养24h～72h，待菌落直径达到1mm～4mm后选择菌落密度适中(菌落密度为0.5个/cm2～1.5个/cm2)的平板备用；
(2)将靶标微生物在液体培养基中培养并制备孢子悬浮液或菌体悬浮液，以血球计数板检测并调整悬浮液中孢子密度为106孢子/ml；
(3)制备含1.5％琼脂的培养基，培养基加热融化后冷却至45℃时，每30ml培养基加入步骤2制备的孢子悬浮液0.1ml～0.5ml，回旋混匀后，倒至玻璃平皿中待其冷却凝固后备用；
(4)用一块灭菌的绒布包裹并固定在直径较平板略小的圆柱状固体上，构成接种工具，用包裹绒布的圆柱体底面覆盖在步骤1制备的平板上并在保持相对位置不变同时轻轻按压，把菌落中部分菌体吸附在绒布上，然后将此绒布覆盖在步骤步骤3制备的平板上并在保持相对位置不变同时轻轻按压，将菌落接种到培养基上。将此平板置于28℃～37℃培养24hr至72h，在平板培养基上靶标微生物生长受抑制的圆形区域生长的菌落即为靶标微生物的拮抗菌株；
(5)在LB平板中央接种直径5mm的靶标微生物菌饼，在距离菌饼边缘2cm处接种初筛获得的拮抗菌株，于28℃～37℃培养24h～72h，验证初筛获得的拮抗菌是否对靶标微生物具有显著的抑制作用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)节约时间和成本，提高效率
现有拮抗菌筛选方法需要先从土壤样品中分离单菌株，然后逐一进行菌株的拮抗性筛选，所需时间长，工作量大，效率低下。本方案无需事先分离单菌株，而是直接对样品中的混合菌株进行批量筛选，节约了大量的时间和人力、物力，大幅提高效率。
(2)避免遗漏
土壤样品中微生物的种类往往十分庞杂，在分离单菌株时往往受操作场地、设备、人力和时间限制而仅能分离其中小部分种类的微生物，这就导致现有的拮抗菌筛选方法无法避免遗漏掉样品中大量的微生物种类。而本方案没有分离单菌株的步骤，直接对土壤样品中的混合微生物群进行拮抗性筛选，大幅度降低了样品中微生物的漏筛。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为筛选到的拮抗菌对柑橘青霉病的生物防治效应，其中A为空白对照，B为拮抗菌处理。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例旨在提供一种从柑橘果园土壤中筛选青霉菌拮抗菌的方法，所述方法包括：
(1)取2g柑橘果园土壤装入三角瓶，加入10ml无菌蒸馏水，封口后于28℃条件下200rpm振荡30min。取上清液以无菌蒸馏水进行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7梯度稀释，每个梯度取1ml涂布LB平板，待液体被吸收后将平板置于28℃倒置培养24h～72h，待菌落直径达到2mm后选择菌落密度适中(菌落密度为0.5个/cm2～1.5个/cm2)的平板备用。
(2)收集青霉菌孢子，制备成悬浮液，以血球计数板检测并调整悬浮液中孢子密度为106孢子/ml。
(3)制备含1.5％琼脂的LB培养基，培养基加热融化后冷却至45℃时，每30ml培养基加入步骤(2)制备的孢子悬浮液0.1ml，轻轻回旋混匀后，倒至玻璃平皿中。
(4)用一块灭菌的绒布包裹并固定在直径较平板略小的圆饼状固体上，构成接种工具，然后包裹绒布的圆饼覆盖在步骤(1)制备的平板上轻轻按压，把菌落中部分菌体吸附在绒布上，然后将此绒布步骤(3)制备的平板上轻轻按压，将菌落接种到培养基上。将此平板置于28℃培养48hr。在平板培养基上青霉菌生长受抑制的圆形区域生长的菌落即为青霉菌的候选拮抗菌株。
(5)挑取拮抗菌株，采用平板对峙法进行验证，从而获得青霉菌的拮抗菌株，具体验证方法如下所示：
在LB平板中央接种直径5mm的青霉菌菌饼，在距离菌饼边缘2cm处接种初筛获得的拮抗菌株，于28℃～37℃培养24h～72h，验证初筛获得的拮抗菌是否对青霉菌具有显著的抑制作用。
取新鲜采摘的柑橘，挑选成熟度一致、质地均匀、大小基本一致、无病害的果实用自来水浸泡2h左右后自然晾干。用接种针在每个果实的侧面的4个部位刺4mm2伤口，在伤口处接种0.02ml的107个/ml供试拮抗菌悬浮液和0.02ml的106个/ml青霉菌的孢子悬浮液。空白对照组只接种0.02ml的106个/ml青霉菌的孢子悬浮液。每个处理组设置30个果实。将处理好的果实置于相对湿度在95％左右，温度25℃的条件下贮存。10d后观察柑橘青霉病的发病情况。结果表明通过上述方法筛选到的拮抗菌均对柑橘青霉病具有防治作用，其中个别拮抗菌对柑橘青霉病具有极佳的防治效果(图1)。
实施例2
本实施例旨在提供一种从土壤中筛选胶孢炭疽菌拮抗菌的方法，所述方法包括：
(1)取2g油茶园土壤装入三角瓶，加入10ml无菌蒸馏水，封口后于28℃条件下200rpm振荡30min。取上清液以无菌蒸馏水进行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6梯度稀释，每个梯度取1ml涂布LB平板，待液体被吸收后将平板置于37℃倒置培养24h～72h，待菌落直径达到2mm后选择菌落密度适中(菌落密度为0.5-1.5个/cm2)的平板备用。
(2)收集胶孢炭疽菌孢子，制备成悬浮液，以血球计数板检测并调整悬浮液中孢子密度为106孢子/ml。
(3)制备含1.5％琼脂的LB培养基，培养基加热融化后冷却至45℃时，每30ml培养基加入步骤(2)制备的孢子悬浮液0.1ml，轻轻回旋混匀后，倒至玻璃平皿中。
(4)用一块灭菌的绒布包裹并固定在直径较平板略小的圆饼状固体上，构成接种工具，然后包裹绒布的圆饼覆盖在步骤(1)制备的平板上轻轻按压，把菌落中部分菌体吸附在绒布上，然后将此绒布步骤(3)制备的平板上轻轻按压，将菌落接种到培养基上。将此平板置于28℃培养48hr。在平板培养基上胶孢炭疽菌生长受抑制的圆形区域生长的菌落即为候选拮抗菌株。
(5)挑取拮抗菌株，采用平板对峙法进行验证，从而获得胶孢炭疽菌的拮抗菌株，所述平板对峙法具体如下所示：
在LB平板中央接种直径5mm的胶孢炭疽菌菌饼，在距离菌饼边缘2cm处接种初筛获得的拮抗菌株，于28℃～37℃培养24h～72h，验证初筛获得的拮抗菌是否对胶孢炭疽菌具有显著的抑制作用。
本发明实施例1～2所述拮抗菌株的筛选方法，所述方法无需事先分离单菌株，节约时间，简单高效，直接从样品中筛选拮抗菌，不易遗漏样品中微生物。可精确控制条件，避免了接种不均匀、接种量难以精确控制、易导致设备污染等问题。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种拮抗菌株筛选方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)制备待筛选的样品液，将其涂布接种至平板1的表面并加以培养；(2)通过复印接种法将所述平板1表面生长的菌落转接种至已接种靶标微生物的平板2的表面，继续培养；(3)挑选平板2表面靶标微生物生长受抑制区域生长的菌落，即为所述靶标微生物的拮抗菌株。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤(1)包括：制备不同浓度的样品液，分别涂布接种至平板1的表面，待样品液被平板1吸收后，将其置于28℃～37℃下，倒置培养24h～72h，待菌落直径达到1mm～4mm后，选择菌落密为0.5个/cm2-1.5个/cm2的平板1作为被转接种的对象。
3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(2)所述复印接种法利用绒布或者滤纸进行菌落转接，其中，优选绒布。
4.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(2)所述平板2通过以下方式接种：在加热融化的培养基凝固之前，加入靶标微生物的孢子悬浮液或菌体悬浮液，混合均匀，倒出至培养皿中冷却凝固后备用。
5.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，步骤(2)所述孢子悬浮液或菌体悬浮液的密度为0.5×106个/mL～2×106个/mL(优选为1×106个/mL)，所述孢子悬浮液或菌体悬浮液的加入量为0.1mL/30mL～0.5mL/30mL(优选为0.25mL/30mL)培养基。
6.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(2)所述继续培养的条件包括：将菌落转接种至所述平板2后，将所述平板2置于28℃～37℃培养24h～72h。
7.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述方法还包括步骤(4)：对所述拮抗菌株做进一步验证；优选地，采取平板对峙法进行所述验证。
8.根据权利要求7所述的筛选方法，其特征在于，步骤(4)所述平板对峙法包括：
在平板3的中央接种直径为4mm～6mm(优选5mm)的靶标微生物，在距离所述菌饼边缘1.5cm～2.5cm(优选2cm)处接种所述拮抗菌株，于28℃～37℃培养24h～72h，验证所述拮抗菌株是否对所述靶标微生物具有显著的抑制作用。
9.根据权利要求1～8任一项所述的筛选方法，其特征在于，所述样品选自土壤、食品、水样和物体表面洗脱液中的一种或多种，优选地，所述样品为土壤。
10.根据权利要求1～8任一项所述的筛选方法，其特征在于，所述靶标微生物为病原微生物或污染微生物，优选地，所述病原微生物为植物的病原微生物，例如青霉或胶孢炭疽菌，所述污染微生物为农产品、食品、饲料中的污染微生物。
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