CN108707564B - 一种生防菌株w176及发酵液制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生防菌株w176及发酵液制备方法和应用，生防菌株w176的制备方法，步骤是：(1)将含有PDA培养基的平板打开，无菌接种环挑一环收集到的菌种在PDA培养基中划线，获得单菌落；进一步纯化后，为菌株w176；(2)以现有病原菌为材料，通过菌株w176菌苔与多种病原菌对峙培养抑菌圈直径的测量与分析，确定出菌株w176菌苔能有效抑制柑橘采后绿霉病菌的生长；(3)将菌株w176在PDB培养基中摇菌培养，离心，上清经无菌微孔滤膜过滤，获得菌株w176和发酵滤液。该菌在制备治疗或预防柑橘采后绿霉病病原菌药物中的应用。易培养，生长增殖快，能有效地防治柑橘绿霉病菌，有其独特可行性，结果判定简单，效果好，适合纽荷尔脐橙贮藏。

Description

一种生防菌株w176及发酵液制备方法和应用

技术领域

本发明涉及柑橘贮藏及生物防治领域。更具体涉及一种高效防治柑橘采后绿霉病的生防菌株w176，同时还涉及一种高效防治柑橘采后绿霉病的生防菌株w176发酵液的制备方法，还涉及一种生防菌株w176在制备治疗或预防柑橘采后绿霉病药物中的应用。运用该生防菌株w176可降低柑橘贮藏期果实遭受绿霉病菌侵染发生的腐烂率、提高了经济效益。

背景技术

柑橘是世界第一大水果，在全球范围内广泛栽培。柑橘还是中国南方栽培面积最大的果树，经济地位举足轻重。2016年我国柑橘产量3764.87万吨，柑橘出口量约72.37万吨 (中华人民共和国国家统计局，2016)。目前，我国柑橘种植面积和产量均居世界第一(沈兆敏，2017)。柑橘产量高，并且成熟期相对较集中，为保证市场供应的平衡、提高柑橘的经济效益，柑橘果实采后贮藏显得非常重要。在采后贮藏、运输和销售环节，柑橘每年因真菌病害引起的腐烂率高达20-40％，指状青霉(Penicillium digitatum Sacc)造成的柑橘绿霉病腐烂约占整个柑橘采后腐烂损失的90％，造成的损失非常巨大(Macarisin et al.,2007；Izgu et al.,2011)。延长柑橘果实贮藏期、减少果实在贮藏期发生的腐烂，让果实能持续供应，不仅可以减少经济损失，又可以丰富果品市场。

当前控制柑橘绿霉病害主要是传统的化学防治方法。常用的化学杀菌剂有抑霉唑(imazalil,IMZ)、咪酰胺(Prochloraz，PCZ；又称施保克、扑霉灵) 类杀菌剂及噻苯咪唑(朱丽华，2005)，其次还有多菌灵、托布津和甲基托布津等。传统化学药剂的长期大量使用易造成环境污染，又能引发柑橘绿霉病菌抗药性的增强，同时带来农药残留等一系列问题(Schirra et al., 2011)，利用化学药剂防治柑橘采后绿霉的方法将会受到越来越多的限制。随着人们食品安全意识的提高，利用具有无毒、无害、环保等特点的拮抗微生物及其代谢产物防治果蔬病害，成为当前国内外果蔬病害防治的热点。

申请人采用平板对峙培养法，筛选到对柑橘采后绿霉病菌具有较强抑制效果的拮抗菌，并进一步将生防菌株w176在液体培养基中发酵培养，取发酵液和发酵滤液适当稀释后，从当前实验结果来看，实验用浓度的生防菌株w176发酵液和发酵滤液虽不能完全杀死病原真菌，但能有效延缓并降低绿霉病菌造成的柑橘果实腐烂。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种高效防治柑橘采后绿霉病的生防菌株 w176，易培养，生长增殖快，能有效抑制柑橘采后绿霉病菌的生长。

本发明的另一个目的是在于提供了一种高效防治柑橘采后绿霉病的生防菌株w176发酵液的制备方法，方法易行，操作简便，效率高。

本发明还有一个目的是在于提供了一种生防菌株w176在制备治疗或预防柑橘采后绿霉病病原菌药物中的应用，可以有效的防治柑橘绿霉病菌，有其独特可行性，结果判定简单，效果好，特别适合纽荷尔脐橙贮藏。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种高效防治柑橘采后绿霉病的生防菌株w176发酵液的制备方法，其步骤是：

(1)将含有PDA固体培养基的平板打开，放置于华中农业大学园林楼采后生物学与技术实验室中9－11min后用封口膜封皿，24－26℃培养1－ 3d；对获得的菌株，无菌接种环挑一环在PDA固体培养基中划线，28℃培养1－2d，以获得单菌落；对获得的单菌落进一步纯化，命名为菌株w176，并保存该菌株(武汉大学保藏中心)。

(2)以实验室现有病原菌为材料，通过菌株w176菌苔与多种病原菌对峙培养时抑菌圈直径的测量，对数据进行分析，确定出菌株w176菌苔能有效抑制柑橘采后绿霉病菌的生长(病原菌包括：波兰青霉A1，意大利青霉 A10、B3、P6，柑橘黑腐病菌A31-2-1，酸腐病菌AY-1，葡萄灰霉病菌B，皮落青霉B1，产黄青霉B5、Q，苹果灰霉e，指状青霉N1、P44，乌来青霉Pu，番茄根霉果腐病菌RN，葡萄座腔菌jmb-122，葡枝根霉RS，扩展青霉L、LE，胶孢炭疽病菌AISH)。

(3)根据上述结果，27－29℃环境下，将菌株w176在PDB液体培养基中180rpm摇菌培养35－37h，8000rpm离心8－12min，上清经0.22μm 无菌微孔滤膜过滤2－3次，通过菌株w176无菌发酵滤液与多种病原菌对峙培养时抑菌圈直径的测量，获得一种菌株w176，一种生防菌株w176中含有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，确定出菌株w176无菌发酵滤液能有效抑制柑橘采后绿霉病菌的生长。

该菌株于2018年5月2日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：芽孢杆菌菌株w176(Bacillus sp.w176)，保藏编号：CCTCC NO：M2018243地址：中国武汉武汉大学。一种生防菌株w176中含有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

菌株在PDA培养基上划线培养，28℃生长1d后，菌落呈乳白色、接近圆形、半透明状有凸起、粘液状、后期出现褶皱。

通过上述技术措施：获得了菌株w176及其发酵液，菌株w176及其发酵液都能抑制多种病原菌的生长，如指状青霉菌株N1、P44，意大利青霉菌株A10、B3，酸腐病菌菌株AY-1，培养36h的发酵滤液对指状青霉菌株 N1抑菌圈直径能达到36.9mm。与传统的化学药剂相比，菌株w176在有效抑制柑橘采后绿霉病菌的同时，不会造成农药残留。

一种生防菌株w176在制备治疗或预防柑橘采后绿霉病药物中的应用，其步骤是：

(1)28℃环境下，将菌株w176在PDB液体培养基中180rpm摇菌培养36h。直接收集发酵物，备用；或3000rpm离心10min，取上清，备用；

(2)挑选生产方法健全、管理方法有效的健康果园中果型大小相近、无明显机械损伤的成熟果实，将果实浸泡28－32s，自然风干后套袋；58 －62d后，统计果实果实发病率。与传统化学药剂处理组相比，经菌株w176 发酵液和发酵滤液处理的果实腐烂率在2％以内，低于化学药剂处理组。

所述的柑橘为纽荷尔脐橙。

本发明与现有技术相比，具有如下的优点和效果：

本发明提供的芽孢杆菌菌株w176对柑橘采后绿霉病菌的抑制作用效果好，培养36h的发酵滤液抑菌圈直径能达到36.9mm；贮藏两个月的纽荷尔脐橙，腐烂率低于传统化学药剂处理组，腐烂率在2％以内。与传统的化学药剂相比，菌株w176在有效抑制柑橘采后病原菌指状青霉的同时，不会造成农药残留。

附图说明

图1为一种菌株w176菌落示意图。

图2为一种菌株w176的16S rDNA序列鉴定结果电泳示意图。

其中，泳道M为DNA Marker，大小为2000bp，1-2泳道的样品为引物27F/1492R，3-4泳道的样品为27F/1541R

图3为一种菌株w176与同属已报道的一些菌种16S rDNA序列构建系统发育树示意图。

图4为一种菌株w176在PDA培养基上培养后菌苔对指状青霉N1的抑菌圈示意图。

图5为一种菌株w176在PDA培养基上培养后菌苔抑菌谱示意图。

其中，A1为波兰青霉、A10为意大利青霉、A31-2-1柑橘黑腐病菌、AY-1 酸腐病菌、B葡萄灰霉病菌、B1为皮落青霉、B3意大利青霉、B5产黄青霉、e苹果灰霉、L扩展青霉、N1指状青霉、P6意大利青霉、P44指状青霉、Pu 乌来青霉、Q产黄青霉、RN番茄根霉果腐病菌、jmb-122葡萄座腔菌、RS 葡枝根霉、LE扩展青霉、AISH胶孢炭疽病菌。

图6为一种菌株w176在PDB培养基发酵得到无菌发酵滤液产生的抑菌谱示意图。

其中，A1为波兰青霉、A10为意大利青霉、A31-2-1柑橘黑腐病菌、AY-1 酸腐病菌、B葡萄灰霉病菌、B1为皮落青霉、B3意大利青霉、B5产黄青霉、e苹果灰霉、L扩展青霉、Mc鞘氨醇单胞菌、N1指状青霉、P6意大利青霉、 P44指状青霉、Pu乌来青霉、Q产黄青霉、RN番茄根霉果腐病菌、RS葡枝根霉、LE扩展青霉、AISH胶孢炭疽病菌。

图7为一种菌株w176在PDB培养基发酵得到无菌发酵滤液的稳定性示意图。

其中，水为对照组、原液为盖上盖子静置30min、挥发为室内开盖1h、 100℃为100℃水浴30min、日光为日光暴晒30min、UV为紫外照射30min。

图8为一种菌株w176贮藏抑菌效果分析示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或者按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：

一种高效防治柑橘采后绿霉病的生防菌株w176的制备方法，其步骤是：

(1)将含有PDA固体培养基的平板打开，放置于华中农业大学园林楼采后生物学与技术实验室中，10min后用封口膜封皿，25℃培养2d；对获得的菌株，无菌接种环挑一环在PDA固体培养基中划线，28℃培养2d，以获得单菌落；对获得的单菌落进一步纯化，命名为菌株w176，并保存该菌株。

(2)将菌株w176在PDA固体培养基中28℃培养，形态如图1所示：菌落呈乳白色、接近圆形、半透明状有凸起、粘液状、后期出现褶皱。根据w176的Biolog GENIII微孔板培养数据，进行Biolog微生物鉴定系统数据库匹配鉴定，结果显示：w176菌株第一参考结果为Bacillus atrophaeus或 Bacillus subtilis,相似性指数为0.516，同时第二参考结果的相似性指数为 0.094，因此可鉴定为Bacillus atrophaeus或Bacillus subtilis，数据结果可靠。经过MIDI全自动微生物鉴定系统(Sherlock v.6.21software)鉴定结果显示，w176菌株为Bacillus atrophaeus(sim值为0.388)或Bacillus subtilis(sim值为0.324)。以菌株w176基因组为模板，进行16S rDNA与序列PCR扩增，引物序列如下：1、27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG，2、1492R： TACGGYTACCTTGTTACGACTT，3、1541R：AAGGAGGTGATCCAGCCGCA，获得约1500bp DNA片段测序，序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

在NCBI上进行Blast比对，选取同属已报道的一些序列构建系统发育树。

因此，最终将菌株w176归为Bacillus sp.。

该菌株于2018年5月2日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：芽孢杆菌菌株w176(Bacillus sp.w176)，保藏编号：CCTCC NO：M2018243地址：中国武汉武汉大学。一种生防菌株w176中含有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

实施例2：

一种生防菌株w176在制备治疗或预防柑橘采后绿霉病药物中的应用，其步骤是：

A、菌株w176菌苔对柑橘采后绿霉病菌抑制实验：

配制50mL的PDA培养基，无菌接种环挑取一环实施例1获得的生防菌菌株w176于1mL无菌水中，吸取100μL于平板中，无菌涂菌棒涂匀，28℃培养1d。用5mm打孔器打孔，挑取菌苔接种于混有菌株N1的PDA培养基中，25℃培养，结果如图，显示w176菌苔能抑制菌株N1生长。

B、菌株w176发酵滤液对柑橘采后绿霉病菌抑制实验：

配制50mL的PDB培养基，无菌接种环挑取一环实施例1获得的生防菌菌株w176，28℃、180rpm培养36h。将发酵液8000rpm离心10min，吸取上清液经0.22μm无菌微孔滤膜过滤两次，分装至无菌2mL离心管中，备用。取适量加入到用5mm打孔器打孔的混有菌株N1的PDA培养基中，加入的无菌滤液量与培养基齐平，25℃培养，结果如图，显示无菌滤液含有抑菌物质。

C、菌株w176降低柑橘贮藏过程中腐烂率情况：

(1)菌株w176发酵液的制备

分别配制两批都为4L的PDB培养基，无菌接种环各接种一环实施例1 获得的生防菌菌株w176，28℃、180rpm培养36h。a)取一批发酵液直接收集，备用；b)另一批发酵液3000rpm离心10min，吸取上清液，备用。

(2)菌株w176浸泡柑橘实验

挑选管理方法科学有效的健康果园中，果型大小相近、无明显机械损伤的成熟果实，分别按如下处理：1、化学农药浸泡，记为CK；2、w176发酵液浸泡；3、w176发酵滤液浸泡；每组10个重复，每个重复100个果实；自然风干后套袋，60天后，统计果实果实发病率。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

表1菌株w176菌苔抑菌谱示意表

菌株	抑菌圈	菌株	抑菌圈
				波兰青霉A1	﹣	扩展青霉N1	﹢
意大利青霉A10	﹢	意大利青霉P6	﹢
				柑橘黑腐病菌	﹢	指状青霉P44	﹢
酸腐A3病1-菌2-1AY-1	﹢	乌来青霉Pu	﹢
				葡萄灰霉病菌B	﹣	产黄青霉Q	﹢
皮落青霉B1	﹢	番茄根霉果腐病	﹢
				意大利青霉B3	﹢	葡萄菌座RN腔菌	﹢
产黄青霉B5	﹢	扩j展mb青-1霉22LE	﹣
				苹果灰霉e	﹢	葡枝根霉RS	﹢
扩展青霉L	﹣	胶孢炭疽病菌	﹢

注：“+”表示有抑制作用，“－”表示无抑制作用。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种生防菌株w176及发酵液制备方法和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1437

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggagctataa tgcaagtcga gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt tagcggcgga 60

cgggtgagta acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg gaaaccgggg 120

ctaataccgg atggttgttt gaaccgcatg gttcagacat aaaaggtggc ttcggctacc 180

acttacagat ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcga 240

cgatgcgtag ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac 300

tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg 360

ccgcgtgagt gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgttagggaa gaacaagtgc 420

cgttcaaata gggcggcacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc 480

cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagggc 540

tcgcaggcgg tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg agggtcattg 600

gaaactgggg aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg 660

cgtagagatg tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct ctggtctgta actgacgctg 720

aggagcgaaa gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg 780

atgagtgcta agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg cattaagcac 840

tccgcctggg gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca 900

agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat 960

cctctgacaa tcctagagat aggacgtccc cttcgggggc agagtgacag gtggtgcatg 1020

gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg 1080

atcttagttg ccagcattca gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac aaaccggagg 1140

aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca 1200

atggacagaa caaagggcag cgaaaccgcg aggttaagcc aatcccacaa atctgttctc 1260

agttcggatc gcagtctgca actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat 1320

cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga 1380

gtttgtaaca cccgaagtcg gtgaggtaac cttttaggag ccagccgccg aagggat 1437

Claims (2)

1.一种生防菌株w176，其特征在于：所述的生防菌株为芽孢杆菌(Bacillus sp.)w176，保藏编号：CCTCC NO：M2018243。

2.权利要求1所述的一种生防菌株w176在抑制柑橘采后绿霉病病原菌中的应用，其步骤是：

(1)28℃环境下，将菌株w176在PDB液体培养基中180rpm摇菌培养36h，3000rpm离心10min，取上清备用；

(2)挑选果型大小一致、无明显机械损伤的成熟果实，将果实浸泡28-32s，自然风干后套袋；58-62d后，统计果实果实发病率；所述的柑橘为纽荷尔脐橙。

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