CN102212487B

CN102212487B - 一种杀虫绿僵菌菌株及其应用

Info

Publication number: CN102212487B
Application number: CN2011101349764A
Authority: CN
Inventors: 夏玉先; 彭国雄; 曾德玉
Original assignee: Chongqing University
Current assignee: Chengdu Zhongnong Jinwei Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2011-05-24
Filing date: 2011-05-24
Publication date: 2012-07-25
Anticipated expiration: 2031-05-24
Also published as: CN102212487A

Abstract

一种绿僵菌菌株（Metarhizium flavoviridevar.minus）CQMf1072，保藏编号为CGMCC NO.4717，其ITS1－5.8S－ITS2序列为SEQIDNO.1。本发明从自然感染的稻飞虱直接分离筛选的绿僵菌菌株CQMf1072，产孢能力强、产孢率可达2.5%、其生产性状好、生长迅速；同时对稻飞虱杀虫活性强、杀虫效果好，对稻飞虱幼虫的LT₅₀（致死中时）和LT₉₀（致死终时）分别为5.8天和8.7天。利用该菌株生产的杀虫真菌制剂，有效地控制了稻飞虱种群数量。

Description

一种杀虫绿僵菌菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一种微生物新菌株，具体涉及一种杀虫绿僵菌菌株及其应用，属于生物农药领域。

技术背景

稻飞虱是水稻主要的迁飞性害虫，国内广泛分布于全国主要稻区，严重的威胁着我国粮食生产。目前，主要施用广谱性化学农药控制稻飞虱，不仅直接影响人体健康和水产养殖业的安全，而且由于稻飞虱抗药性产生和化学农药大量使用，杀伤稻飞虱天敌，破坏稻田生态平衡，严重削弱田间自然控制能力，容易导致稻飞虱的再猖獗、难以控制。因此，开发安全、具有持续控制作用的杀虫真菌农药替代化学农药对保护水稻种植区环境安全与生物多样性具有重要意义。

昆虫病原真菌是最重要的杀虫微生物类群，在自然条件下约70%的昆虫病害是真菌引起的，是唯一具有触杀特性和流行性的病原微生物，其致病机制复杂，因而尽管它是最早应用于害虫防治的微生物，但是仍未发现有抗性害虫产生，对解决害虫的抗药性问题极具潜力。因此，真菌作为重要的替代农药，近年来受到广泛关注；国内对生防真菌的研究始于20世纪50年代，目前在杀虫真菌液固两相生产技术、制剂研发和规模化生产等方面处于国际领先地位。迄今为止，国内外先后登记注册杀虫真菌农药100多个。杀虫真菌具有较强的垂直和水平扩散能力，容易形成流行病，有助于害虫的持续控制，对于迁飞性害虫稻飞虱的控制尤为有利，但利用真菌控制稻飞虱尚未见到相关报道，其主要原因之一是缺乏高杀虫活性、生产性状好的真菌菌株。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对稻飞虱杀灭效果好、生产性状好的绿僵菌菌株CQMf1072。

本发明菌株是通过采集自然感染的稻飞虱僵虫直接分离筛选出的一株生产性状好、对稻飞虱具有高毒力的黄绿绿僵菌小孢变种（Metarhizium flavoviride var. minus）菌株CQMf1072，已于2011年04月11日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，地址：北京市朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC NO.4717。

本发明绿僵菌菌株 CQMf1072接种在PDA平板上，28℃培养观察菌落形态特征，显示在PDA培养基上培养初期菌落呈白色棉絮状，产孢时橄榄绿色；菌丝具有分隔和分支、透明，直径为1.5-2.0μm；分生孢子孢子梗单生或聚集或紧密排列，呈帚状分支，直径约为2.1μm，其末端产生瓶形小梗，8-16 ×1.5-2μm；从瓶梗的末端以向基式连续形成串链的分生孢子，分生孢子单细胞，长椭圆形，大小5-7 ×2-3 μm。

本发明技术方案是经过采集自然感病稻飞虱僵虫→分离纯化菌株→鉴定菌株的分类地位→确定菌株的培养条件→平板固体发酵→干孢子粉收集→室内、室外杀虫效果测定等步骤，反复筛选出的一株对稻飞虱具有高杀虫活性、生产性状好的黄绿绿僵菌小孢变种（Metarhizium flavoviride var. minus）菌株CQMf1072。

为了进一步提高本发明菌株的产孢性状、以便更适于孢子批量生产，对本发明菌株发酵优选的培养基为大米加入20%（V/W）的1/16 PDA营养液（pH 6.5），121℃高压湿热灭菌30 min；自然冷却后按1：10（菌液：大米，V /W）比例接种绿僵菌CQMf1072菌液并拌匀均匀，置于28℃的发酵室中静止发酵15天后升温干燥（30℃-34℃），至物料含水量低于5%，其产孢率可达2.5%。

本发明绿僵菌菌株 CQMf1072具体如下的有益效果：

本发明从自然感染的稻飞虱直接分离筛选的绿僵菌菌株CQMf1072，产孢能力强、产孢率可达2.5%、其生产性状好、生长迅速；同时对稻飞虱杀虫活性强、杀虫效果好，对稻飞虱幼虫的LT₅₀（致死中时）和LT₉₀（致死终时）分别为5.8天和8.7天。利用该菌株生产的杀虫真菌制剂，有效地控制了稻飞虱种群数量。

附图说明

图1： CQMf1072菌株产孢结构与孢子形态大小；

图2：绿僵菌属（Metarhizium）的ITS1－5.8S－ITS2 rDNA 区域分支系统树；

图3： CQMf1072对稻飞虱杀虫活性测定结果；

图4： CQMf1072对稻飞虱室外防治生测结果。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1 菌株的分离

将采集到的自然感染的稻飞虱僵虫用70%酒精表面消毒，放入28℃培养箱中保湿培养3-5天，使其昆虫表面生长出新鲜孢子；在无菌条件下，用接种环挑取微量新鲜孢子在含有100微克/毫升氨苄青霉素的PDA培养基平板上划线；将划线好的培养皿翻转放置于28℃恒温箱中培养；3—4日后挑选长出的典型而无杂菌的菌落，在菌落边缘用移菌针挑取带有菌丝的培养基一小块，转入试管斜面培养基中央，28℃恒温培养15天。

实施例2 菌株的鉴定

（1）、形态鉴定

将分离到的CQMf1072菌株接种在PDA平板上，28℃培养观察菌落形态特征，产孢结构和孢子形状与大小。结果显示在PDA培养基上培养初期菌落呈白色棉絮状，产孢时橄榄绿色。菌丝具有分隔和分支、透明，直径为1.4-1.8μm；分生孢子孢子梗单生或聚集或紧密排列，呈帚状分支，直径约为2.2μm，其末端产生瓶形小梗，10.2-16.1 ×1.5-2.5μm；从瓶梗的末端以向基式连续形成串链的分生孢子，分生孢子单细胞，长椭圆形，大小5.2-7.1×2-3.2 μm（图1所示）。从以上特征看，菌株CQMf1072应该为黄绿绿僵菌小孢变种（Metarhizium flavoviride var. minus）。

（2）、CQMf1072菌株的ITS序列扩增、序列测定及分子分类

将CQMf1072在PDA液体培养基摇瓶培养3天（180rpm，28℃），离心(10000 g，20min)收集菌丝，液氮研磨破碎后采用DNA提取试剂盒提取菌株CQMf1072的总DNA。以总的DNA为模板，参照Curran扩增绿僵菌ITS1-5.8S-ITS2 rDNA区域。所用引物为TW81 5’-gtttccgtaggtgaacctgc -3’和AB28 5’-atatgcttaagttcagcgggt -3’，产生591bp扩增条带。PCR反应在PCR仪上的反应程序：95℃ 4min，1个循环；94℃ 0.5min，53℃ 0.5min，72℃ 0.5min，30循环；最后72℃ 10min。将扩增产物用凝胶回收试剂盒回收纯化，由上海生工进行双向脱氧法测序。CQMf1072 ITS1-5.8S-ITS2测序结果见SEQ ID No.1。

该序列与NCBI数据库中已之序列比对，符合预期长度，无与其序列相同的菌株。该序列5’端包含18S rDNA部分基因序列（1-33），3’端包含部分28S rDNA基因序列（547-591），其余的分别为ITS1区域(34-181), 5.8S rDNA基因全序列（182-340）以及ITS2区域(341-546)。利用MEGA v4.1 (www.megasoftware.net) 软件构建系统树（1000次重复）证实：CQMf1072菌株为Metarhizium flavoviride var. minus黄绿绿僵菌小孢变种（图2所示）。

实施例3 CQMf1072对稻纵卷叶螟室内杀虫活性的测定

收集在PDA 平板上培养的CQMf1072成熟孢子，用0.05%（W/V）吐温-80分散，配置成终浓度为1×10⁸个孢子/ml的悬浮液。稻飞虱转入长有麦苗的500ml三角瓶中，每瓶30-50只稻飞虱，采用喷雾塔（POTTER，BURKARD 公司）喷雾接种，每瓶接种50μl.，接种后在室温28℃，湿度50-70%的生侧室中，设5个重复，以清水为空白对照。记录死虫数，计算存活率，经DPS2000软件统计分析得到真菌LT₅₀（致死中时）和LT₉₀（致死终时）。

从图3可以看出，绿僵菌CQMf1072菌株对稻飞虱有明显的杀虫活性。接种后5-7天死亡高峰期，稻飞虱幼虫感病死亡后虫体僵硬，保湿培养3天后长出白色菌丝，5-7天虫体长满绿色孢子。统计分析结果表明，其CQMf1072菌株对稻飞虱幼虫的LT₅₀（致死中时）和LT₉₀（致死终时）分别为5.8天和8.7天。

实施例4 CQMf1072菌株产孢特性

将浓度为1×10⁸个孢子/ml的CQMf1072孢子悬浮液接种在PDA平板上（100μl/皿），在不同温度（15℃，20℃，24℃，26℃，28℃，30℃，37℃）的培养条件下培养15天后测定单位面积上的产孢量，确定CQMf1072菌株在28℃条件下产孢最佳。分别配制pH为4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5的PDA平板，按上述方法测定产孢量，确定CQMf1072菌株在pH为6.5条件下产孢最佳。

实施例5 CQMf1072菌株固体发酵物料的优化

液体培养CQMf1072菌丝作为发酵种子。固体发酵物料配置：在培养固体物料大米或碎玉米或小麦中分别加入15%或20%或25%或30%（V/W）的营养液（pH 6.5）或水；营养液为PDA或1/8PDA或1/6PDA或1/32PDA。拌匀后装入两端透气的聚丙烯袋袋中，121℃高压湿热灭菌30 min；自然冷却后加入按培养物料与菌液=10：1的比例（W/V）接种绿僵菌CQMf1072菌液并拌匀均匀，置于28℃的发酵室中静止发酵15天后升温干燥（30℃-34℃），至物料含水量低于5%。随机抽取物料发酵样品，混匀后取5g左右的样品，放入装有20mL 0.05%Tween-80的50ml三角瓶中，充分混匀后用血球计数板测定产品的含孢量，按200×10⁸个/g换算出固体发酵的产孢率。以产孢率为优化指标，最后确定CQMf1072的固体发酵物料配方为：大米加入20%（V/W）的1/16 PDA营养液（pH 6.5）。

实施例6 CQMf1072菌株的室外防治效果

CQMf1072接种在PDA 平板上液体培养基摇瓶培养3天（180rpm，28℃）；将菌液接种在灭菌的大米上，拌匀后28℃下培养15天；收集孢子后用色拉油配制成终浓度为2×10¹⁰个孢子/ml油悬浮剂。

设置室外网罩（1m×2m，间距1米以上），接种稻飞虱（50-100只虫/网罩），自然繁殖15天后调查基数；采用泰山-18型机动喷雾器进行超低容量喷施CQMf1072孢子油悬浮剂(2×10¹³个孢子/公顷)。以喷施清水为空白对照。施药后每天调查网罩内虫情。

根据室外生测结果表明：施药后13天，绿僵菌CQMf1072菌株对稻飞虱的防治效果达到90%以上；绿僵菌CQMf1072菌株处理组的虫口密度（/百丛）约为130只，而对照组的成虫数（/百丛）达到2000只（图4-A）。施药后20天，对照组水稻枯毁，而绿僵菌CQMf1072菌株处理组正常（图4-B）。

实施例7 CQMf1072菌株固体发酵产孢率

配制pH初始值为6.5的1/16PDA营养液，按 20%（V/W）的比例加入大米中，拌匀后装入两端透气的聚丙烯袋中，121℃高压湿热灭菌30 min；自然冷却后按1：10（菌液：大米，V /W）比例接种绿僵菌CQMf1072菌液并拌匀均匀，置于28℃的发酵室中静止发酵15天后升温干燥（30℃-34℃），至物料含水量低于5%。随机抽取10袋发酵料，混匀后每袋混匀后各取5g左右的样品，放入装有20mL 0.05%Tween-80的50ml三角瓶中，充分混匀后用血球计数板测定产品的含孢量，按200×10⁸个/g换算出固体发酵的产孢率。以清水代替1/16 PDA 营养液设为对照。

表1 CQMf1072菌株固体发酵产孢率

从表1可以看出：CQMf1072菌株的产孢特性良好，对照组中的产孢率为1.2%，在经优化的大米物料上的产孢率为2.5%，较对照提高约200%，达到极显著水平。

序列表

<110> 重庆大学

<120>　一种杀虫绿僵菌菌株及其应用

<160> 1

<210> 1

<211> 591

<212> DNA

<213> 绿僵菌菌株（Metarhizium flavoviride var. minus）CQMf1072

<400> 1

gtttccgtag gtgaacctgc ggagggatca ttatcgagtt tactttacaa ctcccaaacc 60

ccctgtgaac ttatacctgt ctaccgttgc ctcggcgggc tcgcccgccg cgggaccgac 120

aaacaaaact cttgtatttc tatctttggc atgtctgagt ggaatcacac ataaatgaat 180

caaaactttc aacaacggat ctcttggttc tggcatcgat gaagaacgca gcgaaatgcg 240

ataagtaatg tgaattgcag aattcagtga atcatcgaat ctttgaacgc acattgcgcc 300

cgccggtatt ctggcgggca tgcctgttcg agcgtcatta caaccctcaa gaccccccgg 360

cgacgggaaa cgggcttggt gttggggacc ggccaccggt gccctgctgc tcctgcggca 420

ggcgcccggc cgcccccgaa atgaattggc ggccccgtcg cggcctccct ctgcgcagta 480

gcacatgtct cgcagctgga gcgcggcgcg gccactgccg taaaacgcac caactttctt 540

cttttagttg acctcgaatc aggtaggaat acccgctgaa cttaagcata t 591

Claims

1.一种杀虫绿僵菌菌株，其特征在于：所述菌株是黄绿绿僵菌小孢变种（Metarhizium flavoviride var. minus）菌株CQMf1072，保藏编号为 CGMCC NO.4717。

2.如权利要求1所述的杀虫绿僵菌菌株，其特征在于：所述菌株的ITS1－5.8S－ITS2序列为SEQ ID NO.1。

3.如权利要求1或2所述的菌株，其特征在于：该菌株的适宜产孢温度为28℃，适宜产孢pH为6.5。

4.如权利要求1或2所述的菌株，其特征在于：所述菌株适宜产孢培养基为大米加入20%（V/W）的1/16 PDA营养液。

5.如权利要求1或2所述菌株在制备防治稻飞虱的真菌制剂中的应用。