CN101993836B

CN101993836B - 枯草芽孢杆菌菌株yb-81、菌剂及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN101993836B
Application number: CN2010101997391A
Authority: CN
Inventors: 薛保国; 全鑫; 杨丽荣; 孙虎; 武超; 刘明源
Original assignee: Henan Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Henan Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2010-06-13
Filing date: 2010-06-13
Publication date: 2012-05-23
Anticipated expiration: 2030-06-13
Also published as: CN101993836A

Abstract

本发明涉及一种枯草芽孢杆菌菌株YB-81、菌剂及其制备方法和应用，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.3195。所述微生物菌剂利用枯草芽孢杆菌YB-81菌株发酵液制备而成。本发明的YB-81菌株及其菌剂抑菌谱广、抑菌效果好，对番茄灰霉病菌、小麦纹枯病菌、小麦全蚀病菌、苹果褐斑病菌、黄瓜灰霉病菌和辣椒枯萎病菌等有较强的抑制作用；该菌剂可用于番茄灰霉病、小麦白粉病的防治，高效无毒、使用简单、不造成环境污染。

Description

枯草芽孢杆菌菌株YB-81、菌剂及其制备方法和应用

一、技术领域：

本发明涉及植物病害生物防治领域，具体地说涉及一种能够防治多种植物病害的枯草芽孢杆菌，以及利用该菌株生产的微生物菌剂及其制备方法和应用。

二、背景技术：

植物病害是农业生产的大敌，据联合国粮农组织(FAO)统计每年因植物遭受病害造成的减产平均损失为总产量的10％～15％。随着人们对无污染、无公害绿色食品呼声日益提高，生物防治已经成为植物病害防治的研究热点，它在生产方式、食品安全、营养健康、生态平衡和生物多样性上都和人类未来的发展方向具有良好的相融性。

近年来，人们逐渐认识到革兰氏阳性菌在生物防治中的重要作用。特别是芽孢杆菌(Bacillus spp.)，种类繁多，资源丰富，芽孢的形成使得它们的适应性和抗逆能力强，易于工业化生产和贮藏，其中的一些菌株可以产生杆菌肽、大环脂、环脂和类噬菌体颗粒等十几种抗菌物质，应用于生产潜力大。同时，芽孢杆菌作为革兰氏阳性细菌，可以形成细胞壁不含内毒素，除个别种外绝大多数对人畜无毒，因此具有很强的环境适应性和环境友好性。

随着人类对生态环境的进一步重视以及农业可持续性发展的需要，生物防治技术势必将进一步发展，特别是现代生物技术的应用必然会开拓生防科技的新领域。微生物农药的研究和应用在新世纪之初迎来一个前所未有的历史机遇和技术挑战，产业发展前景十分广阔。因此，微生物农药在未来的10～20年里将迅速发展，在保护环境、保证人类健康，在促进农业可持续发展进程中发挥愈来愈重要的作用。

三、发明内容：

本发明旨在为多种植物病害提供一种可用于生物防治的具有高效、广谱杀菌活性的枯草芽孢杆菌菌株，以及利用这种枯草芽孢杆菌生产的微生物菌剂及其制备方法，还提供了这种枯草芽孢杆菌在植物病害防治上的用途。

技术方案：

一种枯草芽孢杆菌菌株YB-81(Bacillus subtilts YB-81)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.3195。

一种微生物菌剂，其活性成分是所述枯草芽孢杆菌菌株YB-81 CGMCCNo.3195及胞外代谢物。

上述的微生物菌剂为液态。

一种所述的微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)菌株培养与制备将枯草芽孢杆菌YB-81 CGMCC No.3195接种到TSA试管斜面培养基上，28～35℃下培养24～36小时获得菌种；

(2)种子液制备将步骤(1)制备的试管菌种接入TSB培养液内，在28～32℃下震荡12～16小时制成种子液；

(3)发酵培养基制备分别取葡萄糖、玉米粉、黄豆饼粉、磷酸氢二钾加入水配制成重量百分比为葡萄糖1.2％、玉米粉1.8％、黄豆饼3％、磷酸氢二钾0.2％的培养基；

(4)液体发酵生产对发酵设备及培养基灭菌后，将种子液按体积分5％的接种量接种于步骤(3)配好的培养基，控制发酵设备旋转，在27～34℃下发酵培养36～48小时，随后收集发酵液即得菌剂。

上述制备方法中步骤(1)中所述的TSA平板培养基组成成分及重量百分比为：胰蛋白胨1.7％，大豆蛋白胨0.3％，NaCl0.5％，KH₂PO₄0.25％，葡萄糖0.25％，琼脂1.5％，其余为水。

上述制备方法中步骤(2)中所述的TSB液体培养基组成成分及重量百分比为：胰蛋白胨1.7％，大豆蛋白胨0.3％，NaCl0.5％，KH₂PO₄0.25％，葡萄糖0.25％，其余为水。

步骤(4)中的发酵设备的转速为180rpm。

步骤(4)中发酵设备内液体PH为8.0。

步骤(4)中的发酵培养温度为28～30℃。

步骤(4)中发酵培养时间最好为40小时。

所述枯草芽孢杆菌菌株YB-81的用途，用于抑制番茄灰霉病菌、黄瓜灰霉病菌、小麦纹枯病菌、小麦全蚀病菌、小麦赤霉病菌、苹果褐斑病菌、山药炭疽病菌、西瓜枯萎病菌、辣椒枯萎病菌、芝麻枯萎病菌、黄瓜疫病菌、棉花红腐病菌。

所述枯草芽孢杆菌菌株YB-81防治黄瓜灰霉病上的用途。

所述微生物菌剂在防治黄瓜灰霉病上的用途。

所述枯草芽孢杆菌菌株YB-81在防治小麦白粉病上的用途。

所述微生物菌剂在防治小麦白粉病上的用途。

本发明菌剂的使用方法：上述微生物菌剂用水稀释后通过常规的灌根、浸种、喷雾等方法施用。可单独使用，也可以与对本生防菌株无副作用的其它杀菌剂、植物调节剂混合使用。一般在作物播种期或病害始发期施用，方法是播种前，采用发酵制剂与种子拌种；或在病害始发期，通过灌根施入作物根际或通过叶面喷雾，花蕾和果实表面喷雾施用。

本发明的有益效果：

本发明的YB-81菌株及其菌剂抑菌谱广、抑菌效果好，对番茄灰霉病菌、小麦纹枯病菌、小麦全蚀病菌、苹果褐斑病菌、黄瓜灰霉病菌和辣椒枯萎病菌等有较强的抑制作用；该菌剂可用于番茄灰霉病、小麦白粉病的防治，高效无毒、使用简单、不造成环境污染。通过实验，对黄瓜灰霉病菌的抑菌率达到92.4％，对小麦全蚀病菌和小麦纹枯病菌的抑菌率分别达到90.2％和89.6％。它对12种病原真菌的抑菌带在5.5mm～14mm之间，表现出较为广谱的抑菌效果。

四、附图说明：

图1是YB-81 16SrDNA基因PCR扩增图；

图2是YB-81菌株16SrDNA序列系统发育树。

五、具体实施方式：

实施例一：YB-81菌株的分离筛选

供试病原真菌：小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)，黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporium)，番茄灰霉病菌(Botrytis cirerea)，梨黑星病菌(Venturianashicola)，小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces grami)，黄瓜疫病菌(Phytophthoramelonis)，苹果褐斑病菌(Marssonina coronaria)，芝麻枯萎病菌(Fusariumoxysporum)，小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces raminis)，山药炭疽病菌(Colletotrid umgloeosporiodes)，小麦纹枯病菌(Rhizocto-nia cerealis)，棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)。

细菌培养基：

NA培养基：牛肉浸膏3g，酵母膏1g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，琼脂15g，水1L，pH6.8～7.0，121℃高压灭菌30min。

LB液体培养基：蛋白胨10g，酵母浸膏5g，NaCl 10g，水1L，pH7.0，121℃高压灭菌30min。

土壤中芽孢杆菌的分离与纯化：将采来的土样阴干、研磨后，称取5g，放入150ml盛有45ml生理盐水的三角瓶中，摇动3-5min，在80℃水浴中加热10min，杀灭不产芽孢的细菌和其他菌类。采用土壤稀释分离法，吸取1mL的稀释液加入到含有9mL水的试管中，振荡混匀，制得10^-2土壤稀释液；按照上述方法分别制取10^-3、10^-4、10^-5土壤稀释液。分别取10^-3、10^-4、10^-5土壤稀释液0.05mL涂布于肉汁胨培养基平板上。倒置在28℃的恒温培养箱中培养48h。挑取单菌落，镜检，采用划线分离的方法纯化，将已纯化的菌株保存于NA培养基斜面备用。

拮抗菌的初步筛选：对分离纯化到的芽孢杆菌，以供试病原真菌为靶标，采用平板对峙培养法，用皿内琼胶平板直接测定。具体方法为：将保存的菌株活化，在PDA平板中心先接种病原菌，1～2天后在四周接种待测的芽孢杆菌菌株，28℃培养一定时间，观察其抑菌效果，并测量抑菌带大小，选择拮抗性好的菌株进入复筛。

拮抗菌株复筛：

(1)无菌发酵滤液制备：将拮抗菌株接种LB培养液中，30℃摇床恒温培养24h，收集发酵液，用滤纸过滤后在4200r/min下离心10min，取上清液，经0.22μm滤膜过滤去菌体即得无菌发酵滤液。

(2)生长速率法测定颉颃性：取发酵滤液2ml于灭菌培养皿中，然后将热的PDA培养基18ml注入皿中与其混合均匀，待平板冷凝后，中央接种靶标病原菌，分别以加入无菌水和不接菌的LB培养液的PDA平板为对照，28℃恒温培养3-5d后测量菌落直径，计算抑制率。

菌落直径(mm)＝相垂直的两直径平均值-菌饼直径

本实施例通过初步筛选得到18个芽孢杆菌菌株，进一步复筛获得8个抑菌效果较好的菌株，对这些效果较好的拮抗菌株以黄瓜灰霉病菌等为指示菌进一步做拮抗试验，筛选出对其具有很好防治效果的YB-81菌株。表1为YB-81菌株对各病原菌的抑菌效果。

表1YB-81菌株对各病原菌的抑菌效果(％)

实施例2：YB-81菌株的鉴定

(1)培养特征的观察：将筛选到的生防芽孢杆菌菌株接种于NA培养基上，倒置于30℃的恒温培养箱中培养48h。观察生防菌株在不同培养基上的菌落的生长情况。

(2)菌体形态的观察：挑取在斜面培养48h的生防芽孢杆菌菌落于载玻片，分别进行革兰氏染色、芽孢染色，并在显微镜下观察拮抗菌的大小和形态。

(3)生理生化和碳源利用试验：依据的主要生理生化试验有接触酶试验、淀粉水解试验、明胶液化试验、分解酪素试验、厌氧生长试验、pH5.7生长试验、NaCl生长试验、硝酸盐还原试验、V-P试验和碳源利用试验。均采用《常见细菌系统鉴定手册》和《芽孢杆菌属》推荐的培养基及实验方法。

(4)分子鉴定：

YB-81基因组DNA的提取采用李德葆等的方法。

16SrDNA序列的PCR扩增与克隆：用于扩增的16S rDNA的上下游引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，分别为16SR：5’-AGAGTTGATCATGGCTCAG-3’16SF：5’-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’。以YB-81的基因组DNA为模板，利用引物16SR、16SF进行PCR扩增。PCR反应体系为25μL：10×PCR Buffer 2.5μL，模板0.5μL，dNTP(10mmol/L)0.5μL，引物16SR(10μmol/L)1μL，16SF(10μmol/L)1μL，TagDNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，去离子水17μL。PCR扩增条件：94℃5min；94℃1min；55℃30s；72℃1min；33个循环；72℃10min。PCR反应产物采用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，目的条带采用琼脂糖DNA回收试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)纯化后，与T-载体(Takara PMD-19T)连接，转化感受态细胞，然后在含有Amp、IPTG、X-Gal的平板上进行蓝白斑筛选，并进行菌落PCR筛选出重组质粒。

16SrDNA的全序列测定及系统发育树构建：经验证为目的片段的阳性克隆送至上海生工生物有限公司进行测序。测序结果通过检索Genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/)，采用Blast进行序列一致性比较，选取相似性较高的模式菌株的16S rDNA序列作为参比对象，运用CLUSTAL X 1.8软件进行序列比对并计算供试菌株与参比菌株之间的序列相似性，采用Mega3.0软件构建供试菌与参比模式菌株之间的系统进化树。

通过以上实验，结果如下：

(1)YB-81菌株的形态特征和生理生化特征如表2所示。

表2YB-81菌株的生理生化特征

(2)YB-81菌株分子鉴定结果

以菌株YB-81基因组DNA为模板，利用16S rDNA引物扩增出1条长度为1.5kb左右的预期片段，重组质粒PCR扩增结果与16S rDNA PCR扩增的片段大小一致(图1)。重组质粒提交测序公司测得菌株YB-81的16SrDNA基因全序列，可读序列长度全长为1511 bp。全序列提交GenBank，应用BLAST同源性搜索，与数据库中各菌株序列进行相似性分析，在前100个搜索结果中，81个均为B.subtilis菌株，且一致性均达99％以上。由菌株YB-81的16SrDNA序列分析的系统发育树(图2)可见菌株YB-81的序列与EF478861(B.subtilis)聚成一类，单独构成一个分支，遗传距离最短，树支可靠性达到100％，结合生理生化特征，由此推断YB-81菌株为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。

菌株YB-81的16SrDNA全序列1511bp

1 AGAGTTTGAT CATGGCTCAG GACGAACGCT GGCGGCGTGC CTAATACATG CAAGTCGAGC

61 GGACAGATGG GAGCTTGCTC CCTGATGTTA GCGGCGGACG GGTGAGTAAC ACGTGGGTAA

121 CCTGCCTGTA AGACTGGGAT AACTCCGGGA AACCGGGGCT AATACCGGAT GGTTGTTTGA

181 ACCGCATGGT TCAGACATAA AAGGTGGCTT CGGCTACCAC TTACAGATGG ACCCGCGGCG

241 CATTAGCTAG TTGGTGAGGT AACGGCTCAC CAAGGCGACG ATGCGTAGCC GACCTGAGAG

301 GGTGATCGGC CACACTGGGA CTGAGACACG GCCCAGACTC CTACGGGAGG CAGCAGTAGG

361 GAATCTTCCG CAATGGACGA AAGTCTGACG GAGCAACGCC GCGTGAGTGA TGAAGGTTTT

421 CGGATCGTAA AGCTCTGTTG TTAGGGAAGA ACAAGTGCCG TTCAAATAGG GCGGCACCTT

481 GACGGTACCT AACCAGAAAG CCACGGCTAA CTACGTGCCA GCAGCCGCGG TAATACGTAG

541 GTGGCAAGCG TTGTCCGGAA TTATTGGGCG TAAAGGGCTC GCAGGCGGTT TCTTAAGTCT

601 GATGTGAAAG CCCCCGGCTC AACCGGGGAG GGTCATTGGA AACTGGGGAA CTTGAGTGCA

661 GAAGAGGAGA GTGGAATTCC ACGTGTAGCG GTGAAATGCG TAGAGATGTG GAGGAACACC

721 AGTGGCGAAG GCGACTCTCT GGTCTGTAAC TGACGCTGAG GAGCGAAAGC GTGGGGAGCG

781 AACAGGATTA GATACCCTGG TAGTCCACGC CGTAAACGAT GAGTGCTAAG TGTTAGGGGG

841 TTTCCGCCCC TTAGTGCTGC AGCTAACGCA TTAAGCACTC CGCCTGGGGA GTACGGTCGC

901 AAGACTGAAA CTCAAAGGAA TTGACGGGGG CCCGCACAAG CGGTGGAGCA TGTGGTTTAA

961 TTCGAAGCAA CGCGAAGAAC CTTACCAGGT CTTGACATCC TCTGACAATC CTAGAGATAG

1021 GACGTCCCCT TCGGGGGCAG AGTGACAGGT GGTGCATGGT TGTCGTCAGC TCGTGTCGTG

1081 AGATGTTGGG TTAAGTCCCG CAACGAGCGC AACCCTTGAT CTTAGTTGCC AGCATTCAGT

1141 TGGGCACTCT AAGGTGACTG CCGGTGACAA ACCGGAGGAA GGTGGGGATG ACGTCAAATC

1201 ATCATGCCCC TTATGACCTG GGCTACACAC GTGCTACAAT GGACAGAACA AAGGGCAGCG

1261 AAACCGCGAG GTTAAGCCAA TCCCACAAAT CTGTTCTCAG TTCGGATCGC AGTCTGCAAC

1321 TCGACTGCGT GAAGCTGGAA TCGCTAGTAA TCGCGGATCA GCATGCCGCG GTGAATACGT

1381 TCCCGGGCCT TGTACACACC GCCCGTCACA CCACGAGAGT TTGTAACACC CGAAGTCGGT

1441 GAGGTAACCT TTATGGAGCC AGCCGCCGAA GGTGGGACAG ATGATTGGGG TGAAGTCGTA

1501 ACAAGGTAAC C

实施例3：一种微生物菌剂的制备方法

YB-81菌剂的制备方法步骤如下：

实施例4：YB-81菌剂对番茄灰霉病的温室盆栽防病作用

本实验在河南省农业科学院的温室内进行，供试番茄品种为中蔬四号(郑州金阳光种子有限公司)；供试药剂为50％多菌灵WP(江阴市福达农化有限公司)。以番茄灰霉病菌(为河南省农业科学院植物保护研究所生物防治实验室保存)为供试病原菌，将YB-81菌剂稀释不同倍数，采用叶面喷雾的接种方法，以50％多菌灵和清水作对照。分预防效果和治疗效果两组实验。每组实验分4个处理，每处理10盆重复。预防效果的测定：在喷药液后6h喷洒番茄灰霉孢子悬浮液，20℃保温、保湿3～4d，待对照完全发病后调查结果。治疗效果的测定：喷洒番茄灰霉孢子悬浮液，20℃保温、保湿1～2d后喷洒药液，2～3d后调查结果。按文献[2]的标准进行病害分级，并计算病情指数。

防治效果％＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100

通过预防和治疗两组实验结果(表3)表明YB-81稀释10倍的预防及治疗效果高于50％多菌灵，达到75％以上，治疗效果不及预防效果。

表3YB-81菌剂对番茄灰霉病的防治作用

实施例5：YB-81菌剂对番茄灰霉病的大棚防病作用

本实验在河南省开封市中牟县白沙镇白坟村的番茄种植大棚内进行。以大棚番茄的灰霉病为防治对象，从2008年4～5月进行连续实验并调查结果。参照《农药田间药效实验准则(一)》中番茄被害程度的分级标准，将每小区定株调查10株，每株自上而下(上、中、下三部)各取10片叶子调查，调查果实时调查定株上的全部果实。第一次喷药前调查发病基数，于最后一次施药后7d调查防治效果。计算病情指数以及病情指数增长率和校正防效。

病情指数＝∑(各级病株或病叶数×各级代表数值)/样本总数×最高级代表数值×100

病情指数增长率(％)＝(防治后病情指数-防治前病情指数)/防治前病情指数×100

校正防效(％)＝(对照区病情指数增长率-处理区病情指数增长率)/对照区病情指数

增长率×100

病叶分级标准：

0级：无病斑；

1级：病斑面积占整个叶面积的5％以下；

3级：病斑面积占整个叶面积的6％-15％；

5级：病斑面积占整个叶面积的16％-25％；

7级：病斑面积占整个叶面积的26％-50％；

9级：病斑面积占整个面积的50％以上。

通过对温室大棚番茄的防治实验，发现该菌剂对大棚番茄灰霉病有较好的防治效果。结果如表4所示。

表4：YB-81菌剂对大棚番茄灰霉病防治实验结果

实施例6：YB-81菌剂防治小麦白粉病田间实验

实验地点：河南省农科院二基地(原阳)

小麦品种：泛麦8号

实验时间：2009年5月

调查方法：(1)施药前调查病情基数

(2)每小区对角线5点取样，每点调查4株，共20株。记录病株数，病情指数，计算病情指数。

增长率×100

小麦白粉病分级标准

0级：无病；

1级：病斑面积占整片叶面积的5％以下；

3级：病斑面积占整片叶面积的6～15％；

5级：病斑面积占整片叶面积的15～25％；

7级：病斑面积占整片叶面积的26～50％；

9级：病斑面积占整片叶面积的50％以上。

通过对小麦白粉病的田间防治实验，结果如表5所示。由表10可知，YB-81菌剂对小麦白粉病的防治效果达到62.57％，与对照药剂防效相当。

表5YB-81菌剂对小麦白粉病田间防治效果

实施例7：YB-81菌株的抑菌谱

以14种病原菌为靶标菌，采用平板对峙的方法测定YB-81菌株对这14种病原菌的拮抗作用，制抑菌谱。

测定出YB-81对14种病原菌的抑菌带，结果如表6所示，发现其表现出较为广谱的抑菌效果，其中对番茄灰霉病菌、棉花黄萎病菌、小麦全蚀病菌等的抑菌效果较好。

表6YB-81菌株抑菌谱

注：“+++”：抑菌带10mm以上；“++”：抑菌带5～10mm；

“+”：抑菌带＜5mm；“-”：抑菌带＜3mm

序列表

<110>河南省农业科学院

<120>枯草芽孢杆菌菌株YB-81、菌剂及其制备方法和应用

<130>微生物保藏CGMCC No.3195

<160>1

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>1511

<212>DNA

<213>Bacillus subtilis

<400>1

agagtttgat catggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60

ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa 120

cctgcctgta agactgggat aactccggga aaccggggct aataccggat ggttgtttga 180

accgcatggt tcagacataa aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg 240

cattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag 300

ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg 360

gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt 420

cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga acaagtgccg ttcaaatagg gcggcacctt 480

gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag 540

gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct 600

gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca 660

gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc 720

agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg 780

aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg 840

tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc 900

aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa 960

ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag 1020

gacgtcccct tcgggggcag agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg 1080

agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc agcattcagt 1140

tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc 1200

atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggacagaaca aagggcagcg 1260

aaaccgcgag gttaagccaa tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac 1320

tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt 1380

tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt 1440

gaggtaacct ttatggagcc agccgccgaa ggtgggacag atgattgggg tgaagtcgta 1500

acaaggtaac c 1511

Claims

1.一种枯草芽孢杆菌菌株YB-81(Bacillus subtilts YB-81)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.3195。

2.一种微生物菌剂，其特征在于，活性成分是权利要求1所述枯草芽孢杆菌菌株YB-81 CGMCC No.3195及胞外代谢物。

3.一种权利要求2所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中的发酵设备的转速为180rpm。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中发酵设备内液体pH为8.0。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中的发酵培养温度为28～30℃。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中发酵培养时间为40小时。

8.权利要求1所述枯草芽孢杆菌菌株YB-81的用途，其特征在于，用于抑制番茄灰霉病菌(Botrytis cirerea)、小麦纹枯病菌(Rhizocto-nia cerealis)、小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces grami)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、苹果褐斑病菌(Marssonina coronaria)、山药炭疽病菌(Colletotridumgloeosporiodes)、芝麻枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、黄瓜疫病菌(Phytophthora melonis)。

9.权利要求1所述枯草芽孢杆菌菌株YB-81或权利要求2所述微生物菌剂在防治黄瓜灰霉病上的用途。

10.权利要求1所述枯草芽孢杆菌菌株YB-81或权利要求2所述微生物菌剂在防治小麦白粉病上的用途。