CN102952757B - 一株滇牡丹内生拟茎点霉菌 - Google Patents

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本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种具有广谱抗菌活性的微生物菌株。本发明所述的滇牡丹内生拟茎点霉菌命名为拟茎点霉菌YE3250（Phomopsissp.YE3250），现保藏在国家知识产权局指定的保藏单位，保藏编号为CCTCC NO：M 2012364。本发明首次从滇牡丹植物（Paeoniadelavayi）中分离获得拟茎点霉类型的内生真菌，并发现拟茎点霉菌YE3250对2种革兰氏阳性细菌、1种革兰氏阴性细菌、2种人体致病真菌和4种植物病原真菌，共9种病原微生物具有较明显的抑制生长作用。本发明目的是利用植物内生真菌资源，通过发酵以求获得医用或农用的新型天然抗菌药物活性成分。

Description

一株滇牡丹内生拟茎点霉菌
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种具有广谱抗菌活性的微生物菌株。
背景技术
滇牡丹 (Paeonia delavayi Franch.) 属芍药科芍药属牡丹组植物，为中国西南地区特有种，其性寒、味酸辛，根皮用于清热凉血, 治吐血、尿血、血痢、痛经等，也被用作丹皮药用，可抑制中枢神经系统，有扩张冠状血管，降压、抑菌、抗炎、抗凝血等功能。我们从生长在云南省嵩明县的滇牡丹植物中分离获得了内生真菌，并进行了形态鉴定和抗菌活性的筛选（苗翠苹等，中国药学杂志，2011,46,738）。
发明内容
本发明的目的在于提供一种分离自中国云南省嵩明县滇牡丹(Paeonia delavayi Franch.)植物活体中具有广谱抗菌活性的微生物菌株：滇牡丹内生拟茎点霉菌。
本发明所述的滇牡丹内生拟茎点霉菌系从中国云南省嵩明县滇牡丹植物活体中分离获得。现在国家知识产权局认可的保藏单位保藏，保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，简称：CCTCC，保藏单位地址：中国，武汉大学，邮政编码：430072。保藏日期为2012年9月19日，保藏编号为CCTCC No：M 2012364。
本发明所述的滇牡丹内生拟茎点霉菌命名为拟茎点霉菌YE3250（Phomopsis sp. YE3250），现保藏在国家知识产权局认可的保藏单位，保藏编号为CCTCC No：M 2012364。
菌株YE3250的固体培养特征：
1、PDA培养基上菌落生长迅速，28℃培养7天，菌落直径达7.5 cm，菌丝灰白色，生长松散，呈辐射状，边缘整齐。培养15天后，在培养基表面出现载孢体，载孢体基内生长，成熟后位于培养基表面。
2、查氏培养基上菌落生长较慢，28℃培养10天，菌落直径达8.1 cm，中间向上鼓起，白色绒状，菌落灰白色，边缘整齐。培养15天无载孢体产生。
 3、麦芽汁培养基上菌落生长最慢，28℃培养12天，菌落直径达7.9 cm，菌丝较薄，生长较为松散，四周菌丝匍匐状，表面灰白色，边缘整齐。培养15天无载孢体产生。
菌株YE3250的显微形态特征：（见图1、图2、图3）
菌丝生长旺盛，交织生长，透明有隔，有核。取子座剖开后压片观察，有α、β两种分生孢子，分生孢子梗无色，单枝至合轴分枝，α分生孢子无色，油球一般为2个，β分生孢子无色，一端为钩型，单胞。
菌株YE3250的分子生物学特征：
采用分子生物学PCR技术，DNA序列测定分析，菌株YE3250的ITS rDNA基因组由558个碱基（bp）组成。以ITS rDNA序列为基础构建系统发育树，该菌为拟茎点霉属（见图4）。
菌株YE3250的液体发酵培养：
1、PDB培养基摇瓶培养7天，培养温度28±2℃。
2、发酵培养特征：培养第1天，有零星的白色菌丝点出现；培养第3天，发酵液中白色菌丝增多，有少量菌丝帖壁；培养第5天，发酵液菌丝体密集，菌丝体呈灰白色；培养第7天，发酵液菌丝体密集成块状，呈灰白色，发酵液粘稠。
菌株YE3250的发酵工艺：活化菌种（PDA培养基，28±2℃，培养7天）
——制备种子液（PDB培养基，28±2℃，摇床200 r/min，培养3-4天）——液体发酵（按5%接种量，PDB培养基，28±2℃，摇床200 r/min，培养7天）。
上述发酵工艺中PDB培养基（马铃薯葡萄糖液体培养基）的制备：取新鲜马铃薯200克，去皮切成小块，加水1升煮沸30分钟，过滤，滤液加水补足至1升，加入葡萄糖20克，pH自然。
上述培养基中加入15克琼脂，即为PDA培养基。
发酵完毕，加入等体积95%乙醇浸提48小时，过滤，将滤液浓缩至干，加入无菌水制得抗菌发酵液制品。
本发明所述的菌株YE3250的抗菌活性试验：
1、病原指示菌共14株：革兰氏阳性细菌包括：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、藤黄八叠球菌（Sarcina lutea）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）；革兰氏阴性细菌包括：大肠杆菌 (Escherichia coli)、铜绿色假单孢菌 (Pseudomonas aeruginosa)；人体致病真菌包括：白色念珠菌 (Candida albicans)、星形石膏样毛癣菌 (Trichophyton gypseum)、紧密单孢枝霉 (Hormodendrum compactum)；植物病原真菌包括：稻瘟霉（Pyricularia oryzae）、灰葡萄孢（Botrytis cinerea）、禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）、燕麦镰孢（Fusarium avenaceum）、玉蜀黍长蠕孢(Helminthosporium maydis)、黑曲霉(Aspergillus niger)。
2．病原指示菌培养基：细菌类指示菌采用牛肉膏蛋白胨培养基；人体致病真菌类指示菌采用沙氏培养基；植物病原真菌类指示菌采用PDA培养基。
3．内生真菌的培养：
将滇牡丹内生拟茎点霉菌株YE3250接入含7 mL PDB液体培养基的三角瓶中，置于28±2℃，摇床200r/min培养7天，加入等体积95%乙醇浸提48小时，过滤，将滤液浓缩至干，加入无菌水制成浓度为1mg/ml的发酵液样品备用。
4．抗菌活性的测定：
采用滤纸片扩散法(Barry A L et al, J. Clin. Microbiol.,1979, 10, 885)测定对14种病原微生物的抑制生长活性，滤纸片直径为10mm。在无菌条件下分别取供试指示菌悬液0.2mL，加入相应的固体培养基制成含菌平板，然后取蘸有发酵液样品的无菌滤纸片放入平板内，细菌和人体致病真菌置于37±1℃，植物致病真菌置于28±1℃，培养48h后，分别测量抑菌圈直径大小，结果见图5。
本发明首次从滇牡丹植物（Paeonia delavayi）中分离获得拟茎点霉类型的内生真菌，确定为拟茎点霉菌（Phomopsis sp.），发现该菌对2种革兰氏阳性细菌、1种革兰氏阴性细菌、2种人体致病真菌和4种植物病原真菌，共9种病原微生物具有比较明显的抑制生长作用。本发明利用植物内生真菌资源，通过发酵获得农用或医用新型天然抗菌药物活性成分。
附图说明
图1为本发明所述的拟茎点霉菌YE3250的分生孢子梗显微形态图（400X）。
图2为本发明所述的拟茎点霉菌YE3250的分生孢子显微形态图（400X）。
图3为本发明所述的拟茎点霉菌YE3250的菌丝显微形态图（400X）。
图4为本发明所述的拟茎点霉菌YE3250及其相近种的系统发育树图。
图5为本发明所述的拟茎点霉菌YE3250的抑菌活性结果（抑菌圈直径）。
具体实施方式
    实施例：
拟茎点霉菌YE3250菌株是通过发酵获得农用或医用新型天然抗菌药物活性成分的微生物药源。
取YE3250菌种，在无菌条件下用接种针挑取少量菌丝，接种于装有已灭菌的PDA培养基试管中，置培养箱内于28±2℃活化培养7天，备用。在无菌条件下，将活化好的菌种以相同方法接入已灭菌的PDB培养基中，在28±2℃培养3-4天，即为YE3250菌株的种子液。
将配制好的PDB培养基100ml装入500ml三角瓶内，121℃灭菌30分钟备用。取YE3250菌株的种子液，在无菌条件下接种于装有100ml PDB培养基的500ml三角瓶内，接种量按5%（v/v）计，置于28±2℃摇床（200 r/min）培养7天，期间注意检查有无染菌现象。
发酵完毕，向发酵液中加入等体积95 %乙醇浸提48小时，过滤，将滤液浓缩至干，加入无菌水即制成抗菌发酵液样品。
本发明所述的拟茎点霉菌YE3250的ITS rDNA基因组由558个碱基（bp）组成，其序列如下：
1 AGAAATGGCT GGACGCGCTT CGGCGCACCC AGAAACCCTT TGTGAACTTA
51 TACCTTTTAG TTGCCTCGGC GTCAGGCCGG CCCCCTAGGG GCCCCTCGGA
101 GACGAGGAGC AGGCCCGCCG ACGGTACACC AAACTCTTGT TTTTACACTG
151 AAACTCTGAG AAACAAACAT AAATGAATCA AAACTTTCAA CAACGGATCT
201 CTTGGTTCTG GCATCGATGA AGAACGCAGC GAAATGCGAT AAGTAATGTG
251 AATTGCAGAA TTCAGTGAAT CATCGAATCT TTGAACGCAC ATTGCGCCCT
301 CTGGTATTCC GGAGGGCATG CCTGTTCGAG CGTCATTTCA ACCCTCAAGC
351 CTGGCTTGGT GATGGGGCAC TGCTTCCGAG AGGGGGCAGG CCCTGAAATC
401 TAGTGGCGAG CTCGCCAGGA CCCCGAGCGC AGTAGTTAAA CCCTCGCTCT
451 GGAAGGCCCT GGCGGTGCCC TGCCGTTAAA CCCCCAACTT CTGAAAATTT
501 GACCTCGGAT CAGGTAGGAA TACCCGCTGA ACTTAAGCAT ATCAATAAGG
551 CGGAGGAA
 
 

Claims (2)

1.一种滇牡丹内生拟茎点霉菌，其特征在于命名为拟茎点霉菌（Phomopsis  sp.）YE3250，现保藏在国家知识产权局指定的保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M 2012364。
2.按照权利要求1所述的滇牡丹内生拟茎点霉菌在制备抗菌药物中的应用。
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