CN105985919B - 一种芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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本发明属于微生物领域，涉及一种芽孢杆菌及其应用，所述芽孢杆菌的分类命名为芽孢杆菌(Bacillus)SIPI‑2014406，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2014618，保藏日期为2014年12月3日，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。本发明还提供了芽孢杆菌(Bacillus)SIPI‑2014406在制备异‑C15杆菌霉素D中的应用。

Description

一种芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域，涉及一种新的微生物及其应用，具体涉及一种芽孢杆菌及其在制备异-C15杆菌霉素D中的应用。
技术背景
天然药物，尤其是微生物药物在现代药物发现中起着举足轻重的作用，微生物药物在控制感染，防御疾病，保障人类健康中发挥着难以估量的作用并创造着巨大的经济效益。近年来革兰氏阴性菌的感染越来越严重地危害着人类健康，感染人群有升高趋势。铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌在许多国家与地区传播，而能够治愈该病菌感染的药物少之又少，因此研究开发革兰氏阴性菌感染的新型药物已成为当务之急。
杆菌霉素D(Bacillomycin D)一般是由芽孢杆菌产生的一种脂肽，由亲水的脂链和亲油的脂肪烃链部分组成，由于其特殊的化学组成和两亲性分子结构，在医药、食品、化妆品和微生物采油方面有着重要的应用前景。目前杆菌霉素D作为一种农业抗真菌广谱抗生素被研究开发。
杆菌霉素D的抗菌机制与传统抗生素的抗菌机制不同。传统抗生素是与病原微生物特定部位的受体结合从而使病原微生物的正常结构遭到破坏或某些生物合成途径受阻，以达到杀菌或抑菌的作用，而当病原体受体部位发生改变时，就产生耐药性，传统抗生素失去作用；而杆菌霉素D则是以物理方式作用细菌或真菌细胞壁，因作用靶点不同，此类抗生素与其它抗生素无交叉耐药性，且由于作用位点不同对人体细胞毒性极小，对环境无污染，因此在临床上受到极大重视。
Tanaka等人在“Isolation of anteiso-C17,iso-C17,iso-C16,and iso-C15Bacillomycin D from Bacillus amyloliquefaciens SD-32 and Their AntifungalActivities against Plant Pathogens”中描述了结构如式I所示的异-C15杆菌霉素D。
发明内容
本发明一方面提供一种芽孢杆菌，其分类命名为芽孢杆菌(Bacillus)SIPI-2014406，保藏编号为CCTCC NO：M2014618。该菌株从上海市静安区静安公园柏树下的土壤中分离得到，于2014年12月3日在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)进行保藏，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
所述菌株的16S rDNA序列长度为1422bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明再一方面提供芽孢杆菌(Bacillus)SIPI-2014406在制备如式I所示的异-C15杆菌霉素D中的应用。
本发明又一方面提供如式I所示的异-C15杆菌霉素D的制备方法，其包括以下步骤：
(a)将芽孢杆菌(Bacillus)SIPI-2014406进行种子培养，
(b)将步骤(a)获得的种子培养液进行发酵培养，
(c)离心步骤(b)获得的发酵液，固液分离后取菌体进行纯化以获得如式I所示的异-C15杆菌霉素D。
关于步骤(a)和(b)的培养基，可以使用合成培养基、半合成培养基或天然培养基。培养基中的营养源并无特殊规定，可使培养基中含有常用于微生物培养的碳源、氮源以及其它营养源。其中碳源可为阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、肌醇、鼠李糖、棉籽糖、甘露糖醇、甘露糖、蜜二糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖、海藻糖、水杨苷、黄嘌呤、甲壳质、淀粉、糊精、甘油、植物油等；氮源可为肉提取物、蛋白胨、蛋白粉、棉籽粉、大豆粉、花生粉、鱼粉、玉米浆、酵母抽提物、氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、尿酸等；至于其它营养源可适当添加一些无机盐类，例如磷酸盐类(例如磷酸二氢钾)、钾(例如溴化钾)、钙(例如碳酸钙)、锌、锰、铁之类的金属盐、以及硫酸镁、氯化钠等；必要时可添加例如醇类和硅化合物等作为消泡剂。这些成分可预先一次性地加入培养基中，或者间歇或连续地加入培养基中。本发明的培养基优选含有可吸收的碳、氮和无机盐等营养成分的液体培养基。在本发明的一个具体实施方案中，步骤(a)的培养基组成为葡萄糖、酵母提取物、鱼粉蛋白胨、K2SO4和微量元素；步骤(b)的培养基组成为葡萄糖、酵母提取物、鱼粉蛋白胨、K2SO4和微量元素。
步骤(a)和步骤(b)的培养方法适宜于采用振荡培养、通气搅拌培养等有氧培养方式。对温度、时间等培养条件并无严格限制，以适合菌株的生长为准。培养温度可在10℃-40℃的温度下进行，优选在27～28℃的温度下进行培养。培养时间可根据培养基的组成、温度条件来适当地设定，但是通常为0.5-5天，优选为2天。培养期间的pH值可为5.5-8.5，优选在约7.0。
步骤(c)中的发酵液优选先加入大孔树脂XAD1600搅拌吸附以充分洗脱除去色素及部分杂质，然后再使用多种常规方法进行纯化，例如反相C18柱层析、制备型HPLC等。
应当理解，对于本发明式Ⅰ化合物的制备，并不局限于使用本发明具体公开的芽孢杆菌(Bacillus)SIPI-2014406，也包括由所述菌株产生或衍生出的其它的天然或人工突变株，或变异芽孢杆菌属中可产生本发明化合物的其它种或变种的微生物。SIPI-2014406的突变种或突变株的人工制备可通过常规的、物理的或化学诱变剂来进行，例如用紫外线照射培养物或用亚硝基胍处理等。亦可使用重组DNA技术进行突变种或突变株的制备。
本发明通过芽孢杆菌(Bacillus)SIPI-2014406制得的如式Ⅰ结构所示的异-C15杆菌霉素D对革兰氏阴性菌(例如大肠杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌)显示很强的抗菌活性，且制备工艺简单，精制后纯度很高，适用于大规模工业化生产。
具体实施方式
下面列举具体实施例来对本发明做进一步描述。
实施例1：芽孢杆菌(Bacillus)SIPI-2014406的生物学特性
1.SIPI-2014406的形态学性质
菌落形态：菌株SIPI-2014406在牛肉膏蛋白胨培养基上呈浅黄色菌落，表面褶皱，边缘齿状，有隆起，不透明，干燥。
微观形态：对细菌进行革兰氏染色后于显微镜下观察SIPI-2014406微观形态。在牛肉膏蛋白胨培养基上培养1、2天观测。SIPI-2014406为紫色，呈椭圆状。
2.生理生化特征：
明胶液化；淀粉水解强；V-P试验呈阳性；甲基红试验阴性。
3.碳源利用
可很好地利用葡萄糖、蔗糖、甘露糖、乳糖、半乳糖、D-山梨糖、果糖、麦芽糖、鼠李糖。
4.16S rDNA序列测定
用27forward引物和14921reverse引物(Lane，1991)扩增得到16S rDNA序列。经测定，该菌株16S rDNA大小为1422bp，将该序列从GenBank数据库调入MEGA进行比对，选择Kimura2-parameter(Kimura，1980)计算进化距离，构建Neighbor-Joining(N-J)树，并进行Bootstrap分析，证明该菌株与一株Bacillus sp.DOA6(芽孢杆菌)同源性较高，鉴定为芽孢杆菌属，命名为Bacillus SIPI-2014406，于2014年12月3日在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)进行保藏，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2014618。实施例2：异-C15杆菌霉素D的制备和纯化
1.异-C15杆菌霉素D的制备
(a)种子培养基的组成：
葡萄糖40g，酵母提取物20g，鱼粉蛋白胨20g，K2SO42.5g，微量元素1％，蒸馏水1000ml，用适量盐酸或氢氧化钠调pH为6.5。
(b)发酵培养基的组成：
同种子培养基。
(c)将斜面保存的SIPI-2014406在无菌条件下接种于5个100ml/750ml三角瓶，并在28℃以220rpm振荡培养1.5天，作为种子培养液。将种子培养液按10％接种量接种于发酵培养基中(100ml/750ml),在28℃以220rpm条件下培养2天。
2.异-C15杆菌霉素D的分离纯化
(a)大孔树脂吸附
将发酵液离心(6000rpm/min离心30min),得上清液4500ml，加入300ml经过处理的大孔树脂(先用500ml丙酮浸泡12h，再用1M的NaOH处理，蒸馏水洗脱pH7.5)，搅拌吸附(200rpm/min)1h。将吸附完成的上清液经纱布过滤得大孔树脂，经蒸馏水洗脱1-2次，装柱。用25％的甲醇洗脱3个柱体积(除去部分色素)，50％甲醇6个柱体积(充分去除杂质，色素)，90％甲醇5个柱体积。在40℃条件下减压旋转蒸发至醇浓度为40％，过滤后待用。
(b)反相C18层析纯化
称取120g反相C18填料(50μm)(日本YMC公司生产)用甲醇充分溶胀后装柱，装柱时应尽量排去空气，柱体积约150ml，用40％的甲醇水溶液作为初始浓度平衡反相C18柱，将步骤(a)处理后的样品溶液慢慢泵入柱后，开始进行等度洗脱，分别配制55％，60％，65％，70％及75％的甲醇溶液进行洗脱，每个浓度洗脱3个柱体积，洗脱结束后，用HPLC检测，合并化合物浓度大于85％洗脱液，减压旋转蒸发除去甲醇，得到半纯化固体式Ⅰ化合物95mg，测定其纯度为90％。
3.异-C15杆菌霉素D的精制
为了得到纯度更高的样品，可再用制备型HPLC进行纯化。色谱条件如下：
色谱柱：SunFire Prep C18 OBD(10μm)(19×150mm)，美国Waters公司生产
检测波长：235nm
流动相：A)0.1％TFA(三氟乙酸)/水溶液(v/v)；
B)乙腈
流速：10ml/min
梯度洗脱方法：
HPLC梯度洗脱表
0-20分钟，以A相为90％，B相为10％洗脱；20-40分钟，A相从90％逐渐降至58％，同时B相从10％逐渐升至42％，进行洗脱；40-160分钟，A相从58％逐渐降至40％，同时B相从42％逐渐升至60％，进行洗脱。
收集：4ml/管，收集主峰进行分析，合并纯度在95％以上的样品。
经过上述纯化步骤，共获得纯度为99.1％的化合物式Ⅰ 50.25mg。
经过以上各步骤，式Ⅰ化合物的总收率为33.1％。
实施例3：式Ⅰ化合物的抑菌活性测定
使用96孔板稀释法测定对于大肠杆菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌的最小抑菌浓度(MIC)。
1.材料：
大肠杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、MH肉汤培养基、1640培养基。
2.方法：
a)受试物贮存液的配制
配制浓度为1280μg/ml的式Ⅰ化合物的溶液，置于-20℃环境中保存备用。
b)MH肉汤的配制
称取MH肉汤培养基2.1g，溶于蒸馏水中并定容至100ml，121℃高温灭菌30min。
c)接种物的配备
将冻干管保存的菌种复苏，接种于斜面培养，1.5天后用MH肉汤洗脱并校正浓度至0.5麦氏比浊标准，约含1～2×108CFU/ml。用MH肉汤将上述菌悬液进行1:100稀释后备用。
d)MIC测定
取无菌96孔板(8×12)3块，12孔为一排，除第1孔加入160μl MH肉汤外，其余每管加入MH肉汤100μl，向第1孔中加入受试物贮存液(1280μg/ml)40μl，混匀，然后吸取100μl至第2孔，混匀后再从第2孔吸取100μl至第3孔，如此连续倍比稀释至第10孔，并从第10孔中吸取1ml弃去，此时第1-10管的药物浓度依次为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5μg/ml。然后向1-10孔中加入上述制备好的接种物各100μl，使每管最终菌液浓度约为5×105CFU/ml。第1孔至第11孔药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml。蒸馏水为阴性对照。
将96孔板盖上盖子，细菌置于37℃普通空气孵箱中孵育16h。
检查接种物的传代培养情况确定其未被污染。以肉眼观察，药物最低浓度管无细菌生长者，即为受试菌的MIC。
e)结果：
从表的MIC测定结果看，式Ⅰ化合物对革兰氏阴性菌具有显著的抑菌活性。

Claims (5)

1.一种芽孢杆菌，其分类命名为芽孢杆菌(Bacillus)SIPI-2014406，保藏编号为CCTCCNO：M2014618。
2.权利要求1的芽孢杆菌，其16S rDNA序列长度为1422bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.权利要求1或2的芽孢杆菌在制备如式I所示的异-C 15杆菌霉素D中的应用；
4.一种如式I所示的异-C 15杆菌霉素D的制备方法，其包括以下步骤：
(a)将权利要求1所述的芽孢杆菌(Bacillus)SIPI-2014406进行种子培养，
(b)将步骤(a)获得的种子培养液进行发酵培养，
(c)离心步骤(b)获得的发酵液，固液分离后去除菌体进行纯化以获得如式I所示的异-C15杆菌霉素D，
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(c)中，进行反相C18层析纯化。
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CN110016490B (zh) * 2019-04-24 2021-07-23 淮阴师范学院 一种用于生产杆菌霉素d的发酵培养基和生产杆菌霉素d的方法
CN110117311B (zh) * 2019-04-30 2023-04-14 湖南师范大学 一种从解淀粉芽胞杆菌中分离纯化杆菌霉素的方法
CN115478088A (zh) * 2022-09-27 2022-12-16 淮阴师范学院 乳酸钙在提高枯草芽孢杆菌合成杆菌霉素d的应用和乳酸钙发酵培养基及方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104023533A (zh) * 2011-12-22 2014-09-03 Sds生物技术株式会社 植物病害防治剂

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104023533A (zh) * 2011-12-22 2014-09-03 Sds生物技术株式会社 植物病害防治剂

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Isolation of anteiso-C17, iso-C17, iso-C16, and iso-C15 Bacillomycin D from Bacillus amyloliquefaciens SD-32 and Their Antifungal Activities against Plant Pathogens;Keijitsu Tanaka等;《Journal of Agricultural and Food Chemistry》;20140121;第62卷;第1469-1476页 *
Study of the antifungal activity of Bacillus vallismortis ZZ185 in vitro and identification of its antifungal components;Zhenzhen Zhao等;《Bioresource Technology》;20090829;第101卷;第292-297页 *
杆菌霉素D(Bacillomycin D)的分离纯化及结构鉴定;闫大壮等;《中国医药工业杂志》;20150331;第46卷(第3期);第240-244页 *

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