CN108048490A - 一种链霉菌溶藻活性物质提取方法 - Google Patents

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陈亿军
邹培
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Abstract

本发明提供一种链霉菌溶藻活性物质提取方法，属于富营养化水体生物修复领域。本发明用等体积的无水乙醇重复萃取链霉菌发酵液滤液，离心后用旋转蒸发仪将有机相浓缩至干得到粗体物，然后用甲醇溶解粗体物并进行硅胶柱层析分离；将高效溶藻活性的组分进行高效液相色谱分离，得到溶藻活性物质。本发明所采用的链霉菌来自于富营养化水体，其分泌的溶藻活性物质为次生代谢产物，安全性高，不会水体导致二次污染；溶藻活性物质可用于微囊藻、鱼腥藻、束丝藻、颤藻等典型有害藻类引发的富营养化水体治理。本发明提取方法工艺简单、可操作性强、生产成本低且溶藻效果好，适合大规模生产。

Description

一种链霉菌溶藻活性物质提取方法
技术领域
本发明属于富营养化水体生物修复领域，具体涉及一种链霉菌溶藻活性物质提取方法，同时涉及链霉菌溶藻活性物质的应用。
背景技术
富营养化不仅给水体环境、水产养殖业和海洋渔业造成严重危害，而且对人类健康甚至生命均有影响。在利用物理、化学方法治理不甚理想的情况下，寻求安全有效的水华防治途径迫在眉睫。溶藻菌是一类抑制藻类生长、杀死藻类或溶解藻细胞的细菌统称，具有较好的高效、二次污染风险低、生态安全性高等优点，尤其适合在蓝藻暴发初期使用，其在短期内即可达到控制藻类生物量，势必成为水华生物防治的重要手段。
微生物溶藻一般分为两种方式：一是直接溶藻，需要菌体与藻细胞直接接触，通过分泌溶解纤维素的酶来消化掉微藻的细胞壁，进而溶解整个藻细胞，或者细菌进入藻细胞溶藻；二是间接溶藻，即通过分泌细胞外物质溶藻，非选择性地杀伤藻细胞，或者通过竞争有限营养物质抑制微藻生长。迄今为止，已分离获得的降解蓝藻、硅藻和颤藻等溶藻微生物主要包括有假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、鞘氨醇菌属(Sphingomonas sp.)、链霉菌属(Streptomyces sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)和分枝杆菌属(Mycobacterium sp.)等。
国内对微生物溶藻的研究已取得一定成果，并且逐步向溶藻活性物质分离、提纯和结构鉴定等研究方向发展。微生物分泌的溶藻活性物质多为高极性物质，且多数溶藻物质浓度较低，性质不稳定，极有可能在浓缩提取过程中丧失；此外，微生物培养和繁殖过程中通常含有大量其它化合物，并且不同溶藻菌分泌的溶藻物质性质不一，上述因素使得溶藻活性物质的分离纯化难度加大。
发明内容
本发明目的是针对上述存在的问题提供一种链霉菌溶藻活性物质提取方法及其应用，通过该方法提取溶藻活性物质，工艺简单、可操作性强、生产成本低且溶藻效果好。
为实现本发明目的，提供了一种链霉菌溶藻活性物质提取方法，所述的提取方法包括如下步骤
a. 将链霉菌接种于其生长所需液体高氏一号培养基中发酵得发酵液；
b. 将步骤a中得到的发酵液离心分离，上清液经孔径为0.45 μm的玻璃纤维滤纸过滤得滤液；
c. 将步骤b中得到的滤液用等体积的无水乙醇重复萃取三次，离心后用旋转蒸发仪将有机相浓缩至干，得到粗体物A；
d. 将步骤c中得到的粗体物A溶解于2 ml甲醇，上样进行硅胶柱层析，采用流动相梯度洗脱；
e. 收集步骤d中不同洗脱组分，得到溶藻活性组分M1、M2、M3、M4和M5，分别验证溶藻活性；
f. 将步骤e中具有高效溶藻活性的组分M3进行高效液相色谱分离，得到溶藻活性物质H。
作为优选，所述的链霉菌对微囊藻、鱼腥藻、束丝藻、颤藻中的一种或多种有明显的抑制作用。
作为优选，所述的链霉菌生长所需液体高氏一号培养基，培养基的组成为：1000mL蒸馏水；20g可溶性淀粉；1g KNO3；0.5g K2HPO4；0.5g MgSO4·7H2O；0.5g NaCl；0.01gFeSO4·7H2O；pH=7.4~7.6。
作为优选，所述的链霉菌发酵条件为：28±2 ℃、50~150 rpm发酵3~5 d；进一步优选地，所述的链霉菌发酵条件为：28 ℃、100 rpm发酵4 d。
作为优选，所述的链霉菌发酵液离心条件为：4 ℃、8000~10000 rpm离心10~20min；进一步优选地，所述的链霉菌发酵液离心条件为：4 ℃、10000 rpm离心15 min。
作为优选，所述的硅胶柱采用径高比为1：5～10的柱子；进一步优选地，所述的硅胶柱采用径高比为1：5。
作为优选，所述的硅胶采用100～200目的硅胶。
作为优选，所述的流动相梯度洗脱为：流动相氯仿和甲醇的体积比分别为10：1、5：1、1：1、1：5和1:10，依次用不同比例分别洗脱2倍柱体积。
作为优选，高效液相色谱分析条件为：高效液相色谱柱（C18，250×4.60mm，5micron），流动相甲醇和水的体积比为17：3，流动相的流速为1mL/min，柱温为常温，进样量20μL，检测时间15min。
本发明与现有技术比较，具有以下有益效果：
(1) 本发明所述的链霉菌来自于富营养化水体，其分泌的溶藻活性物质为次生代谢产物，安全性高，不会水体导致二次污染；
(2) 本发明所述的链霉菌对微囊藻、鱼腥藻、束丝藻、颤藻中的一种或多种有明显的抑制作用，且抑藻率高于90%，可用于微囊藻、鱼腥藻、束丝藻、颤藻等典型有害藻类引发的富营养化水体治理；
(3) 本发明所述的一种链霉菌溶藻活性物质提取方法工艺简单、可操作性强、生产成本低且溶藻效果好，适合大规模生产。
(4) 为进一步合成高效专一的生物杀藻剂提供基础材料，同时为富营养化水体生物修复技术的实际应用提供理论依据。
附图说明
图1为溶藻活性物质对铜绿微囊藻的抑制效果图。
图2为溶藻活性物质对束丝藻的抑制效果图。
图3为溶藻活性物质对鱼腥藻的抑制效果图。
具体实施方式
具体实施例仅为本发明的部分体现，不能涵盖本发明的全部，在不脱离本发明设计的前提下，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明的技术范围内，可轻易想到的变化、改进或替换，都应覆盖在本发明权利要求书确定的保护范围之内。
实施例1：实验材料和方法
供试藻种铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa FACHB-905)、束丝藻属(Aphanizomenon flos-aquae FACHB-1039)，鱼腥藻属(Anabaena flos-aquae FACHB-1092)由中国科学院水生生物研究所藻种保藏中心提供，藻种经活化后接种于BG11培养基培养至对数期备用。
用亚甲基蓝溶解溶藻活性组分M1、M2、M3、M4和M5并分别定容至50 mL，按5%接种于10 mL初始叶绿素a浓度为0.1521 mg/L的藻液中，共培养4 d后测定叶绿素a含量并计算抑藻率。
藻种及溶藻实验于25 ℃、2500 lx及光暗比为14 h：10 h的条件下培养。
叶绿素a含量采用丙酮提取法测定。
抑藻率（I，%）计算公式：
其中C 0和C t 分别为t d时对照组和处理组中叶绿素a质量浓度，单位为mg/L。
实施例2： 链霉菌溶藻活性物质提取方法
一种链霉菌溶藻活性物质提取方法，包括如下步骤：
a. 将链霉菌接种于1 L液体高氏一号培养基中，于28 ℃、100 rpm条件下发酵4 d得发酵液；
b. 将步骤a中得到的发酵液于4 ℃、10000 rpm条件下离心15 min，上清液经孔径为0.45 μm的玻璃纤维滤纸过滤得滤液；
c. 将步骤b中得到的滤液用等体积的无水乙醇重复萃取三次，离心后用旋转蒸发仪将有机相浓缩至干，得到粗体物A45 mg；
d. 将步骤c中得到的粗体物A溶解于2 ml甲醇，上样进行硅胶柱层析，采用氯仿和甲醇的体积比分别为10：1、5：1、1：1、1：5和1:10的流动相梯度洗脱，依次用不同比例分别洗脱2倍柱体积；
e. 收集步骤d中不同洗脱组分，得到溶藻活性组分M1、M2、M3、M4和M5，各组分含量及抑藻率见表1；
f. 将步骤e中具有高效溶藻活性的组分M3进行高效液相色谱分离，得到溶藻活性物质H。
表1 溶藻活性组分含量及抑藻率。
实施例3： 溶藻活性物质对铜绿微囊藻的抑制效果
将本发明溶藻活性物质H用亚甲基蓝溶解并定容至50 mL，分别按0、1%、3%、5%和10%的体积比接种于100 mL初始叶绿素a浓度为0.1521 mg/L的铜绿微囊藻藻液中，于25 ℃、2500lx及光暗比为14 h：10 h的条件下共培养4 d后测定叶绿素a含量并计算抑藻率。结果表明，溶藻活性物质H对铜绿微囊藻有明显抑制作用，添加量为1%、3%、5%和10%时抑藻率分别为91.3%、93.9%、94.2%和97.6%，1%添加量即可有效抑制铜绿微囊藻的生长。
实施例4： 溶藻活性物质对束丝藻的抑制效果
将本发明溶藻活性物质H用亚甲基蓝溶解并定容至50 mL，分别按0、1%、3%、5%和10%的体积比接种于100 mL初始叶绿素a浓度为0.1375 mg/L的束丝藻藻液中，于25 ℃、2500 lx及光暗比为14 h：10 h的条件下共培养4 d后测定叶绿素a含量并计算抑藻率。结果表明，添加量为1%、3%、5%和10%时抑藻率分别为89.0%、90.9%、92.5%和96.1%，1%添加量即可有效抑制铜绿微囊藻的生长。
实施例5： 溶藻活性物质对鱼腥藻的抑制效果
将本发明溶藻活性物质H用亚甲基蓝溶解并定容至50 mL，分别按0、1%、3%、5%和10%的体积比接种于100 mL初始叶绿素a浓度为0.1147 mg/L的鱼腥藻藻液中，于25 ℃、2500 lx及光暗比为14 h：10 h的条件下共培养4 d后测定叶绿素a含量并计算抑藻率。结果表明，溶藻活性物质H对鱼腥有明显抑制作用，添加量为1%、3%、5%和10%时抑藻率分别为85.9%、90.5%、93.9%和95.5%，1%添加量即可有效抑制铜绿微囊藻的生长。

Claims (10)

1.一种链霉菌溶藻活性物质提取方法，其特征在于所述提取方法包括：
a. 将链霉菌接种于其生长所需液体高氏一号培养基中发酵得发酵液；
b. 将步骤a中得到的发酵液离心分离，上清液经孔径为0.45 μm的玻璃纤维滤纸过滤得滤液；
c. 将步骤b中得到的滤液用等体积的无水乙醇重复萃取三次，离心后用旋转蒸发仪将有机相浓缩至干，得到粗体物A；
d. 将步骤c中得到的粗体物A溶解于2 ml甲醇，上样进行硅胶柱层析，采用流动相梯度洗脱；
e. 收集步骤d中不同洗脱组分，得到溶藻活性组分M1、M2、M3、M4和M5，分别验证溶藻活性；
f. 将步骤e中具有高效溶藻活性的组分M3进行高效液相色谱分离，得到溶藻活性物质H。
2.根据权利要求1所述的一种链霉菌溶藻活性物质，其特征在于链霉菌对微囊藻、鱼腥藻、束丝藻、颤藻中的一种或多种有明显的抑制作用。
3. 根据权利要求1所述的一种链霉菌溶藻活性物质，其特征在于链霉菌生长所需液体高氏一号培养基组成为：1000mL蒸馏水；20g可溶性淀粉；1g KNO3；0.5g K2HPO4；0.5gMgSO4·7H2O；0.5g NaCl；0.01g FeSO4·7H2O；pH=7.4~7.6。
4. 根据权利要求1所述的一种链霉菌溶藻活性物质提取方法，其特征在于步骤a中链霉菌发酵条件为：28±2 ℃、50~150 rpm发酵3~5 d。
5. 根据权利要求1所述的一种链霉菌溶藻活性物质提取方法，其特征在于，步骤b中离心条件为：4 ℃、8000~10000 rpm离心10~20 min。
6.根据权利要求1所述的一种链霉菌溶藻活性物质提取方法，其特征在于硅胶柱采用径高比为1：5～10的柱子。
7.根据权利要求6所述的一种链霉菌溶藻活性物质提取方法，其特征在于硅胶采用100～200目的硅胶。
8.根据权利要求1所述的一种链霉菌溶藻活性物质提取方法，其特征在于流动变相梯度为：流动相氯仿和甲醇的体积比分别为10：1、5：1、1：1、1：5和1:10，依次用不同比例分别洗脱2倍柱体积。
9. 根据权利要求1所述的一种链霉菌溶藻活性物质提取方法，其特征在于高效液相色谱分析条件为：高效液相色谱柱（C18，250×4.60mm，5 micron），流动相甲醇和水的体积比为17：3，流动相的流速为1mL/min，柱温为常温，进样量20μL，检测时间15min。
10.根据权利要求1所述的一种链霉菌溶藻活性物质提取方法，其特征在于链霉菌来自于富营养化水体，其分泌的溶藻活性物质为次生代谢产物，安全性高，不会水体导致二次污染。
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