CN102181386B

CN102181386B - 乙酰微小杆菌l31及其应用

Info

Publication number: CN102181386B
Application number: CN2011100619817A
Authority: CN
Inventors: 闫艳春; 曲杰; 史延华; 李康; 翟逸; 王圣惠
Original assignee: Graduate School of CAAS
Current assignee: Graduate School of CAAS
Priority date: 2010-09-10
Filing date: 2011-03-15
Publication date: 2012-11-21
Anticipated expiration: 2031-03-15
Also published as: CN101948789A; CN102181386A

Abstract

本发明提供了一种乙酰微小杆菌(Exiguobacterium acetylicum)L31菌株，其保藏编号为CGMCC No.4137，其通过富集驯化的方法从山东华阳农药厂的污水处理曝气池中分离得到。该菌株能够将50mg/L氯氰菊酯农药在3天内降解71％左右，并能够维持稳定的降解能力。另外，该菌株的细胞表面疏水性很高，可以调节细胞表面疏水性的高低来完成对疏水农药的吸附降解。

Description

乙酰微小杆菌L31及其应用

技术领域

本发明涉及一种微生物菌株及其应用，具体地说是一种乙酰微小杆菌L31及其应用。

背景技术

目前国内外已经筛选到的氯氰菊酯降解菌的种类还很少，已经公布的氯氰菊酯降解菌的降解效率不是很高，并且对降解菌细胞表面特征的研究更是少有报道，主要集中在石油烃降解菌的研究中。Tallur等人于2008年通过富集驯化方法分离到一株微球菌属菌株CPN 1(Micrococcus sp.CPN 1)能够将100mg/L的氯氰菊酯在3天内降解55％左右(Biodegradation，19：77-82，2008)；Chen Zhang等人于2010年通过富集驯化的方法分离到两株降解高效氯氰菊酯的沙雷氏菌菌株(Bioresource Technology 101(2010)3423-3429)，并测定了两株菌的细胞表面疏水性差异。并通过薄层层析和高效液相色谱技术测定了菌株对氯氰菊酯的降解能力和中间代谢产物，这对于实现环境中氯氰菊酯农药的生物修复具有重要意义。

然而，在微生物生物修复的实际应用中，要设计有效的对菊酯类农药的修复策略，不仅只需要有高的农药降解率和降解途径的相关知识，更重要的是要考虑到所选的菌株本身所具有内在性质，如细胞表面疏水性高低，这样在实际的生物修复过程中才能实现高效率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种乙酰微小杆菌新菌株及其在降解农药中的应用。

本发明的菌株L31是从山东华阳农药厂的污水处理池的活性污泥样品中分离得到的乙酰微小杆菌(Exiguobacterium acetylicum)新菌株，在GenBank中16SrDNA序列的注册号为HM368664。该菌株已于2010年9月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏编号为CGMCC No.4137。

该菌体短杆状，无鞭毛，菌落呈圆形，边缘光滑，表面突起，产生黄色素，有金黄色光泽细菌。

本发明还提供制备L31菌株的方法，包括下述步骤：

1)采集来自农药厂的污水处理池的活性污泥样品接种于含有氯氰菊酯50mg/L的富集培养基中于30℃200rpm富集培养7天后，取10％转接到新鲜富集培养基中并将农药浓度提高一倍，再继续培养7天，如此连续转接，直到富集培养基中的农药浓度提高到800mg/L；

2)富集培养结束后，取10％离心收集菌体，然后转接到含有800mg/L的氯氰菊酯的无机盐培养基中，在相同培养条件下再驯化两周；

3)在以氯氰菊酯为唯一碳源的无机盐培养基内连续继代培养筛选，然后用平板稀释法将驯化后的菌液涂布到含有氯氰菊酯300mg/L的无机盐培养基平板；在降解菌筛选初期，挑选农药耐受度高、生长较快、菌落较大的菌，单菌落进行划线，直至分离获得纯化的菌株；纯培养后采用紫外分光光度法初步检测降解率，随后，选择降解率较高的菌株，采用HPLC法定量分析各个菌株对高效氯氰菊酯的降解率；最后，选择出一株在含农药培养基上生长好、传代稳定且降解能力较强的菌株Exiguobacterium acetylicum L31。

本发明进一步提供含有L31菌株的菌剂。

本发明还提供L31菌株在降解农药中的应用。

优选地，所述农药为氯氰菊酯。

具体地，本发明通过富集驯化的方法从山东华阳农药厂的污水处理曝气池中分离到一株能够高效降解氯氰菊酯菌株，通过菌株形态学特征，生理生化特征和16SrDNA序列比对将菌株鉴定为乙酰微小杆菌，命名为乙酰微小杆菌L31(Exiguobacterium acetylicumL31)，在GenBank中16SrDNA序列的注册号为HM368664。

本发明以乙酰微小杆菌L31为实验菌株，通过将菌株接种到仅以氯氰菊酯为唯一碳源的基础盐液体培养基中培养，定时取样，通过液液萃取的方法提取残留农药，应用紫外分光光度法，高效液相色谱法和气相色谱法测定农药浓度，计算出菌株对农药的降解率。通过上述方法测得L31菌株能够将50mg/L氯氰菊酯农药在3天内降解71％左右，并且能够维持稳定的降解能力。

本发明应用微生物粘着碳烃化合物法(MATH)法测定氯氰菊酯降解菌的细胞表面疏水性。本发明对二甲苯-水和正辛醇-水两相体系进行了比较，发现对于菌株的水相而言，二甲苯-水两相体系的分离速度要明显快于正辛醇-水两相体系，其稳定性要强。因此选用了二甲苯-水两相体系，且在二甲苯-水相的比为1∶4(v/v)时，菌株疏水率达到最大值。

本发明通过上述方法测定了菌株细胞表面疏水性与其降解能力的关系，结果表面，随着菌株疏水性的提高，菌株对农药的降解也在加速，农药的降解率与细胞表面疏水性成正相关，菌株疏水性维持在高峰水平过程中时，基本完成了菌体对农药的降解。随着农药残留的减少，菌体的细胞表面疏水性也随之降低。说明该菌株的细胞表面疏水性会随着农药浓度的变化而变化，当农药浓度高时该菌体可以调节细胞表面疏水性的高低来完成对疏水农药的吸附降解。

更具体地，本发明筛选到的高效降解氯氰菊酯的乙酰微小杆菌菌株L31，在30℃恒温摇床培养下3天能够将50mg/L的氯氰菊酯降解70％以上，可以用于环境的生物修复过程中。并且该菌株的细胞表面疏水性很高，在二甲苯-水两相体系体积比为1∶4时，疏水率达到68％。通过测定细胞表面疏水性与降解性之间的关系，发现随着菌株疏水性的提高，菌株对农药的降解也在加速，并且随着农药残留的减少，菌体的细胞表面疏水性也随之降低。说明该菌株的细胞表面疏水性会随着农药浓度的变化而变化，当农药浓度高时该菌体可以调节细胞表面疏水性的高低来完成对疏水农药的吸附降解。相比而言，目前国内外已经筛选到的氯氰菊酯降解菌的降解效率不是很高，本发明中筛选的菌株能够快速高效的降解氯氰菊酯，并且对细胞表面疏水性的研究也是只限于石油烃降解菌的研究中，对农药降解菌细胞表面特征的研究更是少有报道。

因此，本发明提供了一株高效快速降解氯氰菊酯的菌株L31，且具有高的细胞表面疏水性，并且得出细胞表面疏水性与农药降解性之间的关系。在注重提高农药降解率的同时，也考虑到了菌株本身具有的内在性质，这样更有利于应用到环境修复过程中。

附图说明

图1本发明乙酰微小杆菌L31菌株在含400mg/L氯氰菊酯固体培养基上的菌落形态；

图2本发明乙酰微小杆菌L31菌株的细胞表面疏水性曲线和氯氰菊酯降解曲线，

其中：◆表示不接菌时氯氰菊酯的降解；×表示菌体细胞表面疏水性；■表示接菌时氯氰菊酯的降解；

图3本发明乙酰微小杆菌L31菌株在二甲苯-水体系中的细胞表面疏水性情况，

其中，左：不加二甲苯的对照菌液，右：加二甲苯震荡后菌液。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1菌株筛选方法

1)降解菌的富集驯化

将采集于山东华阳农药厂的污水处理池的活性污泥样品1g接种于含有氯氰菊酯50mg/L的富集培养基中于30℃200rpm富集培养7天后，取10％转接到新鲜富集培养基中并将农药浓度提高一倍，再继续培养7天，如此连续转接4次，直到富集培养基中的农药浓度提高到800mg/L。富集培养结束后，取10％离心收集菌体，然后转接含有800mg/L的氯氰菊酯的无机盐培养基中，在相同培养条件下再驯化两周。

富集培养基TYC的组成如下：胰蛋白胨5g/L，酵母膏提取物5g/L，KH₂PO₄ 1g/L和琼脂15g/L，pH 7.0。

2)高效降解菌的筛选分离

在以氯氰菊酯为唯一碳源的无机盐培养基内连续继代培养筛选，然后用平板稀释法将驯化后的菌液涂布到含有氯氰菊酯300mg/L的无机盐培养基平板。在降解菌筛选初期，挑选农药耐受度高、生长较快、菌落较大的菌，单菌落进行划线，直至分离获得纯化的菌株(见图1)，纯培养后采用紫外分光光度法初步检测降解率。随后，选择降解率较高的菌株，采用HPLC法定量分析各个菌株对高效氯氰菊酯的降解率。最后，选择出一株含农药培养基上生长好、传代稳定且降解能力较强的菌株L31，进行进一步研究。

无机盐培养基MSM的组成如下：NH₄NO₃ 1g/L，MgSO₄·7H₂O0.5g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.5g/L，KH₂PO₄ 0.5g/L，NaCl 0.5g/L，K₂HPO₄1.5g/L，pH 7.0。

实施例2降解菌的降解性能

1)高效液相色谱检测氯氰菊酯降解

将菌株L31接种到不含农药的液体LB培养基中活化，培养到对数生长期，按照20％接种量接种到含有50mg/L氯氰菊酯农药的基础盐培养基中，30℃200rpm摇床培养。

液体LB培养基的组成为：胰蛋白胨10g/L，酵母膏提取物5g/L，NaCl 10g/L，pH7.0。

基础盐培养基包含以下成分：NH₄NO₃ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.5g/L，KH₂PO₄ 0.5g/L，NaCl 0.5g/L，K₂HPO₄ 1.5g/L，pH7.0。

培养液中高氯的提取方法：

定时取样后，加入等体积二氯甲烷，旋涡混合器上充分振荡抽提2min，静置一小时，取下层将有机溶剂挥发干，用等体积的乙腈重溶，放置在-20℃冰箱保藏。

将样品用0.22μm的有机系滤膜过滤后，进行HPLC-UV分析。

HPLC-UV分析条件为：Agilent 1200高效液相色谱仪，色谱柱：Eclipse-C18(150×4.6mm×5μm)，流动相为乙腈∶水＝70∶30(v/v)，流速1.0mL/min；检测波长230nm；进样量10μL。结果表明菌株L31能够将50mg/L氯氰菊酯在6天降解90％左右。

2)气相色谱和气质联用检测高效氯氰菊酯降解及代谢产物生成

定时取样后，加入等体积的正己烷，旋涡混合器上充分振荡抽提2min，离心后静置分层，取上层有机相，0.22μm的有机系滤膜过滤后，进样分析。

GC-ECD分析条件为：SHMADZU GC-2010型气相色谱仪，色谱柱：Rtx-1301(30m×0.25mm)，采用程序升温：进样口：280℃；柱温：180℃持续2min，然后以10℃/min升280℃，维持10min；ECD检测器：300℃；载气(氮气)流速：1.0ml/min；进氧量：1ul。

结果表明：菌株L31能够将50mg/L氯氰菊酯在3天降解71％左右(见图2)。

实施例3氯氰菊酯降解菌株L31细胞表面疏水性的测定

本发明采用MATH法测定高效氯氰菊酯降解菌株L31的细胞表面疏水性(Rosenberg et al.，1980)。

1)菌悬液的制备

将氯氰菊酯降解菌L31接种于LB液体培养基中(组成同实施例2)，在30℃，200rpm恒温振荡培养条件下过夜培养，将培养液于6，000g 4℃离心10min收集菌体并用50mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲溶液(pH 7.0)洗涤两次，然后用同样的缓冲液将菌体悬浮至细胞浓度为OD600＝0.6左右，制成菌悬液。

2)两相分离系统的选择

将4mL事先调整好浓度的菌悬液加入d＝10mm的圆底试管中，再按0.2、0.5、1.0、1.5和2.0mL的梯度分别加入有机相，对照组不加有机相，用玻璃小塞封口，室温剧烈震荡2min，静置30min分层，观察两相界面的菌体分布情况。用无菌注射针头快速吸取下相水溶液，以Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液为空白对照，在600nm波长下测定A值。每个处理重复三次。细菌细胞表面疏水率(CSH％)按下式计算：

CSH％＝(对照组A600nm-实验组A600nm)/对照组A600nm×100％

本发明通过对二甲苯-水和正辛醇-水两相体系进行了比较，发现对于菌株L31的水相而言，二甲苯-水两相体系的相分离速度要明显快于正辛醇-水两相体系且更稳定，因此本发明研究过程中采用二甲苯-水两相体系。

研究表明：该菌株的细胞表面疏水性很高，在二甲苯-水两相体系体积比为1∶4时，疏水率达到68％(见图3)，并且此时农药的降解速度最快。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.乙酰微小杆菌(Exiguobacterium acetylicum)L31菌株，其保藏编号为CGMCC No.4137。

2.含有权利要求1所述菌株的菌剂。

3.权利要求1所述的菌株在降解氯氰菊酯中的应用。