CN108048385B - 一种提高霉菌毒素降解菌降解效率的菌种驯化方法 - Google Patents

一种提高霉菌毒素降解菌降解效率的菌种驯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了微生物技术领域的一种提高霉菌毒素降解菌降解效率的菌种驯化方法，所述方法，包括以下步骤：将降解菌活化；将活化后的降解菌在霉菌毒素浓度递增的一系列培养基中进行诱导培养。本发明提供的提高霉菌毒素降解菌降解效率的菌种驯化方法，没有使降解菌的霉菌毒素降解效率在传代培养的过程中逐渐降低，而是通过梯度毒素浓度培养基诱导，反而提高了降解菌降解效率，按照本发明的方法，霉菌毒素降解效率可以调高到95％。另外，本发明的方法简单、有效，驯化时间短，适合大量的生产。

Description

一种提高霉菌毒素降解菌降解效率的菌种驯化方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体的是涉及一种提高霉菌毒素降解菌降解效率的菌种驯化方法。
背景技术
随着消费者对食品卫生和安全性的普遍关注以及研究者对霉菌毒素研究的不断深入，原料和饲料中的霉菌毒素污染情况也日益引起动物营养界和饲料界的重视。目前已知的霉菌毒素有300多种，其中对人和动物危害相对严重的有黄曲霉毒素B1(AFB1)、玉米赤霉烯酮(ZEN)和呕吐毒素(DON)等。AFB1中毒主要表现为对肝脏的损伤，并使动物的免疫力降低，临床表现为消化系统功能紊乱、饲料利用率降低以及贫血等。ZEN具有类雌性激素的作用，可与子宫内雌激素受体不可逆结合，从而影响动物的生殖生理。DON可在人与动物体内蓄积，诱发急性或慢性疾病，具有致畸性、神经毒性、胚胎毒性和免疫抑制等作用。
迄今为止，已知的去除饲料中霉菌毒素的方法包括物理法、化学法和生物法。然而，物理和化学的脱毒方法在实际应用中均有其弊端：脱毒不彻底、二次污染等。利用微生物脱毒的方法有很多报道，多集中在野生菌的筛选。但是野生菌的优良特质容易在传代中逐渐丢失。如何保持并提高筛选得到的野生菌的优良特质是一个国际性技术难题，并且在实际应用中十分必要。
发明内容
本发明的要解决的技术问题是为了克服现有技术中存在的霉菌毒素降解菌野生株优良特质容易在传代中逐渐丢失的问题，提供一种提高霉菌毒素降解菌降解效率的菌种驯化方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种提高霉菌毒素降解菌降解效率的菌种驯化方法，包括以下步骤：
将降解菌活化；
将活化后的降解菌在霉菌毒素浓度递增的一系列培养基中进行诱导培养。
上述菌种驯化方法中，所述霉菌毒素浓度以原始培养基中的霉菌毒素浓度为100％进行设置，所述原始培养基中的霉菌毒素浓度为25ppb。
上述菌种驯化方法中，所述霉菌毒素浓度递增的一系列培养基中，以原始培养基中的霉菌毒素浓度为基准，最低霉菌毒素浓度为5％-25％，最高霉菌毒素浓度为20000％-40000％，设置浓度梯度为3个或3个以上。
上述菌种驯化方法中，优选的，所述霉菌毒素浓度递增的一系列培养基设置为3-5个，所述培养基选自：5％-25％霉菌毒素浓度培养基、25％-50％霉菌毒素浓度培养基、50％-100％霉菌毒素浓度培养基、100％-500％霉菌毒素浓度培养基、500％-1000％霉菌毒素浓度培养基。
上述菌种驯化方法中，优选的，所述霉菌毒素浓度递增的一系列培养基设置浓度梯度为3-5个，所述培养基选自：50％-250％霉菌毒素浓度培养基、250％-500％霉菌毒素浓度培养基、500％-1000％霉菌毒素浓度培养基、1000％-5000％霉菌毒素浓度培养基、5000％-10000％霉菌毒素浓度培养基。
上述菌种驯化方法中，优选的，所述霉菌毒素浓度递增的一系列培养基设置浓度梯度为3-5个，所述培养基选自：200％-1000％霉菌毒素浓度培养基、1000％-2000％霉菌毒素浓度培养基、2000％-4000％霉菌毒素浓度培养基、4000％-20000％霉菌毒素浓度培养基、20000％-40000％霉菌毒素浓度培养基。
上述菌种驯化方法中，所述霉菌毒素降解菌为枯草芽孢杆菌，优选的，所述霉菌毒素降解菌为枯草芽孢杆菌ANSB060、ANSB01G、ANSB471。
所述枯草芽孢杆菌ANSB060，其保藏号为CGMCC No.3440，在CN 101705203A中公开。
所述枯草芽孢杆菌ANSB01G，其保藏号为CGMCC No.4297，在CN 102181376A中公开。
所述枯草芽孢杆菌ANSB471，其保藏号为CGMCC No.7344，在CN 103243047A中公开。
上述菌种驯化方法中，所述霉菌毒素为黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和呕吐毒素。
上述菌种驯化方法中，所述诱导培养的培养基为固体培养基，除霉菌毒素外，其余成分相同，其每800-1200mL，包含如下组分：胰蛋白胨8-12g、酵母浸膏1.5-3g、琼脂12.8-19.2g、葡萄糖1.5-4g、牛肉膏2-5g、氯化钠3-6g、磷酸氢二钠2.5-4g、七水硫酸镁0.5-1.5g；pH值为7.0-7.4。
上述菌种驯化方法，还包括：在进行霉菌毒素浓度培养基培养后，挑取菌株进行液体发酵培养，然后将发酵培养后的菌种接种于下一霉菌毒素浓度培养基进行培养。
上述菌种驯化方法中，所述液体发酵培养使用的培养基，每800-1200mL，包含如下组分：胰蛋白胨8-12g、酵母浸膏1.5-3g、葡萄糖1.5-4g、牛肉膏2-5g、氯化钠3-6g、磷酸氢二钠2.5-4g、七水硫酸镁0.5-1.5g，pH值为7.0-7.4。
上述菌种驯化方法中，所述液体发酵培养为摇瓶培养，发酵温度为30-37℃，发酵时间为16-24h，转速为180-220r/min。
上述菌种驯化方法中，所述诱导培养的条件为：温度为30-37℃，一个浓度培养时间为60-72h。
优选的，一种提高霉菌毒素降解菌降解效率的菌种驯化方法，包括以下步骤：
将枯草芽孢杆菌ANSB060活化；
将活化后的枯草芽孢杆菌ANSB060在黄曲霉毒素B1浓度递增的一系列培养基中进行诱导培养；
所述黄曲霉毒素B1浓度以原始培养基中的黄曲霉毒素B1浓度为100％进行设置，所述原始培养基中的黄曲霉毒素B1浓度为25ppb；
所述黄曲霉毒素B1浓度递增的一系列培养基设置为3-5个，所述培养基选自：5％-25％黄曲霉毒素B1浓度培养基、25％-50％黄曲霉毒素B1浓度培养基、50％-100％黄曲霉毒素B1浓度培养基、100％-500％黄曲霉毒素B1浓度培养基、500％-1000％黄曲霉毒素B1浓度培养基；
所述诱导培养的条件为：温度为30-37℃，一个浓度培养时间为60-72h。
优选的，一种提高霉菌毒素降解菌降解效率的菌种驯化方法，包括以下步骤：
将枯草芽孢杆菌ANSB01G活化；
将活化后的枯草芽孢杆菌ANSB01G在玉米赤霉烯酮浓度递增的一系列培养基中进行诱导培养；
所述玉米赤霉烯酮浓度以原始培养基中的玉米赤霉烯酮浓度为100％进行设置，所述原始培养基中的玉米赤霉烯酮浓度为25ppb；
所述玉米赤霉烯酮浓度递增的一系列培养基设置为3-5个，所述培养基选自：50％-250％玉米赤霉烯酮浓度培养基、250％-500％玉米赤霉烯酮浓度培养基、500％-1000％玉米赤霉烯酮浓度培养基、1000％-5000％玉米赤霉烯酮浓度培养基、5000％-10000％玉米赤霉烯酮浓度培养基；
所述诱导培养的条件为：温度为30-37℃，一个浓度培养时间为60-72h。
优选的，一种提高霉菌毒素降解菌降解效率的菌种驯化方法，包括以下步骤：
将枯草芽孢杆菌ANSB471活化；
将活化后的枯草芽孢杆菌ANSB471在呕吐毒素浓度递增的一系列培养基中进行诱导培养；
所述呕吐毒素浓度以原始培养基中的呕吐毒素浓度为100％进行设置，所述原始培养基中的呕吐毒素浓度为25ppb；
所述呕吐毒素浓度递增的一系列培养基设置浓度梯度为3-5个，所述培养基选自：200％-1000％呕吐毒素浓度培养基、1000％-2000％呕吐毒素浓度培养基、2000％-4000％呕吐毒素浓度培养基、4000％-20000％呕吐毒素浓度培养基、20000％-40000％呕吐毒素浓度培养基。
所述诱导培养的条件为：温度为30-37℃，一个浓度培养时间为60-72h。
本申请中所述的X％霉菌毒素浓度培养基是指培养基中霉菌毒素浓度为原始培养基的X％，例如，50％、25％、12.5％霉菌毒素浓度分别为上述原始培养基霉菌毒素浓度的50％、25％、12.5％。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的提高霉菌毒素降解菌降解效率的菌种驯化方法，没有使降解菌的霉菌毒素降解效率在传代培养的过程中逐渐降低，而是通过梯度毒素浓度培养基诱导，反而提高降解菌降解效率，按照本发明的方法，霉菌毒素降解效率可以调高到95％。另外，本发明的方法简单、有效，驯化时间短，适合大量的生产。
具体实施方式
下面将通过具体的实施例对本发明作进一步详细的说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。以下实施例中所使用的试剂和仪器，如无特殊说明，均为市售。
在以下实施例中使用的枯草芽孢杆菌ANSB060，其保藏号为CGMCC No.3440，在CN101705203A中公开；枯草芽孢杆菌ANSB01G，其保藏号为CGMCC No.4297，在CN 102181376A中公开；枯草芽孢杆菌ANSB471，其保藏号为CGMCC No.7344，在CN 103243047A中公开。
实施例1
1、枯草芽孢杆菌种子液的制备
取枯草芽孢杆菌ANSB060 1mL(活菌浓度均为109CFU/mL，此时枯草芽孢杆菌ANSB060对AFB1降解效率为73％，不经过诱导，传3代后的枯草芽孢杆菌ANSB060降解率有不同程度的降低)，接种于50mL培养基中进行摇瓶发酵培养，发酵温度为37℃，pH值7.0，转速180r/min，发酵时间20h，得到种子液。
其中，摇瓶发酵培养基由下述组分组成：胰蛋白胨8g、酵母浸膏1.5g、葡萄糖1.5g、牛肉膏2g、氯化钠3g、磷酸氢二钠2.5g、七水硫酸镁0.5g、蒸馏水定容至800mL，pH值为7.0。
发酵结束后，将种子液保存在4℃冰箱内备用。
2、梯度毒素浓度培养基的诱导培养
蘸取实施例1中得到的枯草芽孢杆菌ANSB060菌液，划线于毒素含量为2.5ppbAFB1的LB固体培养基上，恒温培养箱37℃培养72h。挑取代表性菌落于含5mL液体培养基的玻璃瓶中进行摇床发酵培养，发酵温度为37℃，转速为180r/min，发酵时间24h，得到枯草芽孢杆菌ANSB060发酵液A。
取上述枯草芽孢杆菌ANSB060发酵液A，划线于毒素含量为25ppb AFB1的LB固体培养基上，恒温培养箱37℃培养72h。挑取代表性菌落于含5mL液体培养基的玻璃瓶中进行摇床发酵培养，发酵温度为37℃，转速为180r/min，发酵时间24h，得到枯草芽孢杆菌ANSB060发酵液B。
取上述枯草芽孢杆菌ANSB060发酵液B，划线于毒素含量为250ppb AFB1的LB固体培养基上，恒温培养箱37℃培养72h。挑取代表性菌落于含5mL液体培养基的玻璃瓶中进行摇床发酵培养，发酵温度为37℃，转速为180r/min，发酵时间24h，得到经过AFB1梯度浓度培养基诱导的枯草芽孢杆菌ANSB060发酵液。
其中，LB固体培养基由下述组分组成：胰蛋白胨8g、酵母浸膏1.5g、琼脂15g、葡萄糖1.5g、牛肉膏2g、氯化钠3g、磷酸氢二钠2.5g、七水硫酸镁0.5g、蒸馏水定容至800mL，pH值为7.0。
摇瓶发酵培养基见上述1部分。
3、霉菌毒素降解效率的测定
取900μL经过AFB1梯度浓度培养基诱导的枯草芽孢杆菌ANSB060发酵液和100μL100ppb AFB1于7mL离心管，作为试验组；同时设置900μL液体培养基和100μL 100ppb AFB1的作为空白对照组，进行摇床培养，温度为37℃，转速为180r/min，反应时间72h。
通过高效液相色谱的方法检测两组的OTA峰值，计算降解率。降解率的计算公式为：
降解率(％)＝[(空白对照组峰值-试验组峰值)/空白对照组峰值]*100％。
结果显示，通过诱导培养，枯草芽孢杆菌ANSB060的AFB1降解率为81％。
实施例2
1、枯草芽孢杆菌种子液的制备
取枯草芽孢杆菌ANSB01G 1mL(活菌浓度均为109CFU/mL，此时枯草芽孢杆菌ANSB01G对ZEN降解效率为82％，不经过诱导，传3代后的枯草芽孢杆菌ANSB01G降解率有不同程度的降低)，接种于50mL培养基中进行摇瓶发酵培养，发酵温度为37℃，pH值7.0，转速180r/min，发酵时间20h，得到种子液。
其中，摇瓶发酵培养基成分见实施例1。
发酵结束后，将种子液保存在4℃冰箱内备用。
2、梯度毒素浓度培养基的诱导培养
蘸取1中得到的枯草芽孢杆菌ANSB01G种子液，划线于毒素含量为25ppb ZEN的LB固体培养基上，恒温培养箱37℃培养72h。挑取代表性菌落于含5mL液体培养基的玻璃瓶中进行摇床发酵培养，发酵温度为37℃，转速为180r/min，发酵时间24h，得到枯草芽孢杆菌ANSB01G发酵液A。
取上述枯草芽孢杆菌ANSB01G发酵液A，划线于毒素含量为250ppb ZEN的LB固体培养基上，恒温培养箱37℃培养72h。挑取代表性菌落于含5mL液体培养基的玻璃瓶中进行摇床发酵培养，发酵温度为37℃，转速为180r/min，发酵时间24h，得到枯草芽孢杆菌ANSB01G发酵液B。
取上述枯草芽孢杆菌ANSB01G发酵液B，划线于毒素含量为2.5ppm ZEN的LB固体培养基上，恒温培养箱37℃培养72h。挑取代表性菌落于含5mL液体培养基的玻璃瓶中进行摇床发酵培养，发酵温度为37℃，转速为180r/min，发酵时间24h，得到经过ZEN梯度浓度培养基诱导的枯草芽孢杆菌ANSB01G发酵液。
其中，LB固体培养基和摇瓶发酵培养基的成分见实施例1。
3、霉菌毒素降解效率的测定
取900μL经过ZEN梯度浓度培养基诱导的枯草芽孢杆菌ANSB01G发酵液和100μL500ppb ZEN于7mL离心管，作为试验组，同时设置900μL液体培养基和100μL 500ppb ZEN的作为空白对照组，进行摇床培养，温度为37℃，转速为180r/min，反应时间72h。
通过高效液相色谱的方法检测两组的OTA峰值，计算降解率。
结果显示，通过诱导培养，枯草芽孢杆菌ANSB01G的ZEN降解率为88％。
实施例3
1、枯草芽孢杆菌种子液的制备
取对枯草芽孢杆菌ANSB471 1mL(活菌浓度均为109CFU/mL，此时枯草芽孢杆菌ANSB471对呕吐毒素降解效率为83％，不经过诱导，传3代后的枯草芽孢杆菌ANSB471降解率有不同程度的降低)，接种于50mL培养基中进行摇瓶发酵培养，发酵温度为37℃，pH值7.0，转速180r/min，发酵时间20h，得到种子液。
其中，摇瓶发酵培养基的组成见实施例1。
发酵结束后，将种子液保存在4℃冰箱内备用。
2、梯度毒素浓度培养基的诱导培养
蘸取1中得到的枯草芽孢杆菌ANSB471种子液，划线于毒素含量为100ppb DON的LB固体培养基上，恒温培养箱37℃培养72h。挑取代表性菌落于含5mL液体培养基的玻璃瓶中进行摇床发酵培养，发酵温度为37℃，转速为180r/min，发酵时间24h，得到枯草芽孢杆菌ANSB471发酵液A。
取上述枯草芽孢杆菌ANSB471发酵液A，划线于毒素含量为1ppm DON的LB固体培养基上，恒温培养箱37℃培养72h。挑取代表性菌落于含5mL液体培养基的玻璃瓶中进行摇床发酵培养，发酵温度为37℃，转速为180r/min，发酵时间24h，得到枯草芽孢杆菌ANSB471发酵液B。
取上述枯草芽孢杆菌ANSB471发酵液B，划线于毒素含量为10ppm DON的LB固体培养基上，恒温培养箱37℃培养72h。挑取代表性菌落于含5mL液体培养基的玻璃瓶中进行摇床发酵培养，发酵温度为37℃，转速为180r/min，发酵时间24h，得到经过DON梯度浓度培养基诱导的枯草芽孢杆菌ANSB471发酵液。
其中，其中，LB固体培养基和摇瓶发酵培养基的成分见实施例1。
3、霉菌毒素降解效率的测定
取900μL经过DON梯度浓度培养基诱导的枯草芽孢杆菌ANSB471发酵液和100μL1ppm DON于7mL离心管，作为试验组，同时设置含900μL液体培养基和100μL 1ppm DON的作为空白对照组，进行摇床培养，温度为37℃，转速为180r/min，反应时间72h。
通过高效液相色谱的方法检测两组的OTA峰值，计算降解率。结果显示，通过诱导培养，枯草芽孢杆菌ANSB471的DON降解率为95％。

Claims (3)

1.一种提高霉菌毒素降解菌降解效率的菌种驯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
将降解菌活化；
将活化后的降解菌在霉菌毒素浓度递增的一系列培养基中进行诱导培养；
所述霉菌毒素浓度以原始培养基中的霉菌毒素浓度为100%进行设置，所述原始培养基中的霉菌毒素浓度为25 ppb；
所述霉菌毒素浓度递增的一系列培养基设置为3-5个，
所述培养基选自：5%-25%霉菌毒素浓度培养基、25%-50%霉菌毒素浓度培养基、50%-100%霉菌毒素浓度培养基、100%-500%霉菌毒素浓度培养基、500%-1000%霉菌毒素浓度培养基；所述霉菌毒素为黄曲霉毒素B1；所述霉菌毒素降解菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) ANSB060；
或者 所述培养基选自：50%-250%霉菌毒素浓度培养基、250%-500%霉菌毒素浓度培养基、500%-1000%霉菌毒素浓度培养基、1000%-5000%霉菌毒素浓度培养基、5000%-10000%霉菌毒素浓度培养基；所述霉菌毒素为玉米赤霉烯酮；所述霉菌毒素降解菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) ANSB01G；
或者 所述培养基选自：200%-1000%霉菌毒素浓度培养基、1000%-2000%霉菌毒素浓度培养基、2000%-4000%霉菌毒素浓度培养基、4000%-20000%霉菌毒素浓度培养基、20000%-40000%霉菌毒素浓度培养基；所述霉菌毒素为呕吐毒素；所述霉菌毒素降解菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) ANSB471。
2.根据权利要求1所述的菌种驯化方法，其特征在于，所述诱导培养的培养基为固体培养基，除霉菌毒素外，其余成分相同，其每800-1200 mL，包含如下组分：胰蛋白胨8-12 g、酵母浸膏1.5-3 g、琼脂12.8-19.2 g、葡萄糖1.5-4 g、牛肉膏2-5 g、氯化钠3-6 g、磷酸氢二钠2.5-4 g、七水硫酸镁0.5-1.5 g；pH值为7.0-7.4。
3.根据权利要求1或2所述的菌种驯化方法，其特征在于，所述菌种驯化方法还包括：在进行霉菌毒素浓度培养基培养后，挑取菌株进行液体发酵培养，然后将发酵培养后的菌种接种于下一霉菌毒素浓度培养基进行培养；所述液体发酵培养使用的培养基，每800-1200mL，包含如下组分：胰蛋白胨8-12 g、酵母浸膏1.5-3 g、葡萄糖1.5-4 g、牛肉膏2-5 g、氯化钠3-6 g、磷酸氢二钠2.5-4 g、七水硫酸镁0.5-1.5 g，pH值为7.0-7.4。
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