CN102154131A - 一种醋酸棉酚降解菌s6 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种能降解游离棉酚的一种醋酸棉酚降解菌S6，经鉴定为酵母菌目酵母菌科克勒克酵母属lindneri（Kloeckeralindneri）。主要生物学特性为：克雷克酵母：乳白色，圆形；马铃薯琼脂培养基中生长，能在查氏培养基中生长，发酵葡萄糖；能以0.3%醋酸棉酚为唯一碳源进行生长。并且菌株有很好的稳定性，使棉籽粕达到使用标准，加大棉籽粕的利用率。本发明对于缓解蛋白质资源紧缺，减少大豆进口及棉籽粕廉价出口日本，控制蛋白质资源价格的不断攀升，增强国力，具有重要的意义。

Description

一种醋酸棉酚降解菌S6

一、技术领域

本发明一种高浓度棉酚耐受菌株，属于生物高技术领域，是利用微生物的方法降解游离棉酚，适用于现代高浓度棉酚含量的棉籽粕的生物处理。

二、技术背景

棉籽饼粕是重要的植物蛋白饲料资源，但由于棉籽饼粕中存在棉酚、氨基酸含量低且不平衡、粗纤维含量高等原因，成为限制其在养殖业中广泛使用的主要因素。饲粮中包含一定量的棉酚(FG)可对动物生长、繁殖以及胃肠道和体组织器官产生负面作用，FG可与棉仁中的蛋白、糖类、氨基酸、磷脂等结合而被“封闭”，使FG失去毒性，其结合后难以被动物消化吸收，但有报道指出结合棉酚在动物消化过程中又能释放出FG，产生毒性。有研究表明反刍动物对棉酚具有较大的耐受力；研究者还发现霉变的棉籽粕中棉酚含量非常低，进一步的研究表明霉菌对棉酚具有降解作用。顾赛红等(2003)和Zhang等(2006)研究表明，微生物发酵棉籽粕降低了棉粕中棉酚含量，同时提高了蛋白质、氨基酸等营养物质含量及消化吸收率，Wu等(1989)和Kornegay等(1972)亦有类似的研究结果。近年来发酵棉籽粕的研究主要集中于脱毒菌株的选育及其脱毒效果等的研究，但复合发酵菌株间协同或拈抗作用机理不明，工艺条件尚缺乏充分的理论基础。因此，本研究针对上述问题对发酵棉籽粕菌株做了进一步的筛选，研究了不同菌株的复合发酵及其适宜发酵工艺参数条件，以期为棉籽粕资源的充分利用提供更为有力的理论支持和指导。

三、发明内容

技术问题  本发明的目的在于针对生产实践中的实际问题和需求，开发研制出一种新型的游离棉酚降解菌，使用本发明的微生物可以使高棉酚含量棉粕中的游离棉酚去除率达88.88％，并且有很好的菌株稳定性。使用该降解菌株可以高效降解棉籽粕中的游离棉酚，使之达到使用标准，把棉籽粕变成可利用的饲料蛋白源，对促进我国饲养业的发展具有重要的意义。

技术方案  下面为本发明的主要内容：

一种醋酸棉酚降解菌S6，其特征在于：菌种在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2010年11月26日，保藏号为CGMCC No.4371。，该菌种S6命名为Kloeckeralindneri，经鉴定为克勒克酵母属lindneri，主要生物学特性为：克雷克酵母(S6)：乳白色，圆形；马铃薯琼脂培养基中生长，能在查氏培养基中生长，发酵葡萄糖；能以0.3％醋酸棉酚为唯一碳源进行生长。该菌株的基因序列为Seq NO.1。

电镜检验结果：可见圆形或卵圆形的单细胞，无鞭毛。

在实验室三角瓶培养条件下对游离棉酚的降解率达88.88％。经发酵效果较好的菌株S1、S3、S6分别组合发酵，棉籽粕FG含量较发酵前极显著降低(P＜0.01)，粗蛋白(CP)含量亦极显著提高(P＜0.01)，其中三菌种复合发酵效果最优：FG降解率为66.86％，CP提高率为19.36％。

使用上述醋酸棉酚降解菌工艺为：保藏菌种-摇瓶种活化-筛选培养基-一级菌种-二级菌种。

具体实施步骤为：

1)霉变棉籽粕稀释制成不同梯度后涂布于0.1％醋酸棉酚查氏培养基平板上，30℃，恒温静置培养3-5天，挑选长势良好的不同类型菌落，进一步于0.2％、0.3％的醋酸无糖查氏培养基驯化培养得到耐较高棉酚含量的菌株。

2)将活化好的菌种接入20ml马铃薯液体培养基于100ml三角瓶得到一级菌种(条件为30℃，200r/min摇床培养48h)，取一级菌种接入1ml于装有100ml马铃薯液体培养基的250ml三角瓶中为二级菌种(条件为30℃，200r/min摇床培养48h)。

3)将筛选纯化得到的菌株制备成液体菌种，接入到100g棉籽粕发酵底物，接种量为5％，30℃培养48h。烘干测定FG及CP含量，分析发酵效果。棉籽粕发酵底物的配方为：将粉碎过筛后的棉籽粕、玉米、麦麸按7∶2∶1的比例混合均匀构成基础底物。按底物与水为1∶0.8的比例加入水分发酵，121℃灭菌30min。

4)将筛选得到的性能优良的菌株(S6)制备成液体菌种，接入100g棉籽粕底物中，接种比例分别按1∶1和1∶1∶1的比例，接种量为5％，置于500ml三角瓶中，30℃，恒温静置培养48h。烘干测定FG及CP含量，分析发酵效果。

分析发酵效果，其中经菌株S6发酵后FG降解率最高，达88.88％，粗蛋白提高率为34.45％。经菌种鉴定，结果为克雷克酵母(S6)。经发酵效果较好的菌株S1、S3、S6分别组合发酵，棉籽粕FG含量较发酵前极显著降低(P＜0.01)，CP含量亦极显著提高(P＜0.01)，其中三菌种复合发酵效果最优：FG降解率为66.86％，CP提高率为19.36％。

有益效果

用树下土壤、池塘水处理棉籽粕，本发明从霉变的棉籽粕中分离到耐高浓度棉酚的优势菌，对其生物学特性和耐棉酚机理进行了初步研究，并在棉籽粕的发酵工艺中得到了成功应用。

使用该发明生产的高浓度醋酸棉酚降解菌株，具有生产使用成本低，使用方便，去除效果好的优点，适合在动物饲料的发酵工艺中投加使用，可以缩短生化处理系统的启动时间，并提高处理效果。优势菌对游离棉酚的降解率都在60.44％-88.88％之间，三株菌株按1∶1∶1比例复合发酵，效果最优，FG降解率为66.86％，CP提高率为19.36％。并且菌株有很好的稳定性，使棉籽粕达到使用标准，加大棉籽粕的利用率。本发明对于缓解蛋白质资源紧缺，减少大豆进口及棉籽粕廉价出口日本，控制蛋白质资源价格的不断攀升，增强国力，具有重要的意义。

四、具体实施方式

以下叙述本发明的实施例。

将本实验中筛选得到的几株菌株原种在筛选培养基上活化，并测定降解性能，接种于试管斜面上备用。试管种接种于含200ml马铃薯液体培养基1000ml摇瓶中，恒温振荡培养至对数期，将活化好的菌种接入20ml马铃薯液体培养基于100ml三角瓶得到一级菌种(条件为30℃，200r/min摇床培养48h)，取一级菌种接入1ml于装有100ml马铃薯液体培养基的250ml三角瓶中为二级菌种(条件为30℃，200r/min摇床培养48h)。醋酸棉酚无糖查氏培养基配方为：醋酸棉酚3g/L，NaNO3 2g/L，KCl 0.5g/L，FeSO4 0.01g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，K2HPO41.00g/L，琼脂17g/L，PH自然，121℃灭菌30min。

具体实施步骤为：

1)霉变棉籽粕稀释制成不同梯度后涂布于0.1％醋酸棉酚查氏培养基平板上，30℃，恒温静置培养3-5天，挑选长势良好的不同类型菌落，进一步于0.2％、0.3％的醋酸无糖查氏培养基驯化培养得到耐较高棉酚含量的菌株。

2)将活化好的菌种接入20ml马铃薯液体培养基于100ml三角瓶得到一级菌种(条件为30℃，200r/min摇床培养48h)，取一级菌种接入1ml于装有100ml马铃薯液体培养基的250ml三角瓶中为二级菌种(条件为30℃，200r/min摇床培养48h)。

3)将筛选纯化得到的菌株制备成液体菌种，接入到100g棉籽粕发酵底物，接种量为5％，30℃培养48h。烘干测定FG及CP含量，分析发酵效果。棉籽粕发酵底物的配方为：将粉碎过筛后的棉籽粕、玉米、麦麸按7∶2∶1的比例混合均匀构成基础底物。按底物与水为1∶0.8的比例加入水分发酵，121℃灭菌30min。

4)将筛选得到的性能优良的菌株(S6)制备成液体菌种，接入100g棉籽粕底物中，接种比例分别按1∶1和1∶1∶1的比例，接种量为5％，置于500ml三角瓶中，30℃，恒温静置培养48h。烘干测定FG及CP含量，分析发酵效果。

用本发明的微生物按5％的接种量接种到发酵底物中，进行发酵，48小时后分别取样测定发酵底物中的游离棉酚的去除率，从表2可以看出，优势菌株对游离棉酚的降解率都在60.44％-88.88％之间，并且有很好的稳定性，使棉籽粕达到使用标准，加大棉籽粕的利用率。本发明对于缓解蛋白质资源紧缺，减少大豆进口及棉籽粕廉价出口日本，控制蛋白质资源价格的不断攀升，增强国力，具有重要的意义。

试验表明，用本发明生产的降解菌株能显著降低棉籽粕的毒性，提高棉籽粕的营养价值，丰富了优良菌种资源。本发明成功地解决了饲料工业和养殖业中棉籽粕饲用率低、蛋白质饲料资源紧缺的问题。

表1醋酸棉酚无糖查氏培养基筛选菌株生长情况

注：“+”表示菌种的生长情况，“+”越多表示生长状况越好。“-”表示不生长。

表2不同菌种及组合发酵对发酵效果的影响

注：同行上标，不同大小写字母分别表示差异极显著(P＜0.01)和差异显著(P＜0.05)。

  SEQUENCE LISTING

<110>  南京农业大学

<120>  一种醋酸棉酚降解菌S6

<130> 

<160>  1    

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  1052

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  1

ccggtatttc caaggatggt caaaccagag aacacgcttt attgtccttc accttaggtg     60

tcagacaatt gattgttgct gtcaacaaga tggactccgt ggccataaag gttcctacca    120

gtttggtctc ttgtgcgaaa taacaggaag tggaatccac agtctgttaa ctaacaacga    180

cagttgttct acctgaggca taactgggac caagctagat tcactgaaat cgttaaggaa    240

acctccaact tcatcaagaa atggtgttac aacccaaaga ctgttgcttt cgtcccaatc    300

attgaccctg gttcgatcta agtgacttta gcaattcctt tggaggttga agtagttctt    360

tcaaccaatg ttgggtttct gacaacgaaa gcagggttag tctggttgga acggtgacaa    420

catgattgaa ccaaccacta acgctccatg gtacaagggt tgggaaaagg aaaccaaggg    480

gggtgttgtt aagggtaaga agaccaacct tgccactgtt gtactaactt ggttggtgat    540

tgcgaggtac catgttccca acccttttcc tttggttccg gccacaacaa ttcccattct    600

ccttattgaa agccattgac tcctgtgacc caccagccag accaactgac aagccattaa    660

gattaccatt acaagatgtc tacaagatcg gtggtattgg ggaataacct tcggtaactg    720

aggacactgg gtggtcggtc tggttgactg ttcggtaatt ctaatggtaa tgttctacag    780

atgttctagc caccataacc tacagtgcca gtcggtagag ttgaaaccgg tgtcatcaag    840

ccaggtatgg ttgttacctt cgccccagcc ggtgttacca ctgaagttaa gtccgtcgaa    900

atgtcacggt cagccatctc aactttggcc acagtagttc ggtccatacc aacaatggaa    960

gcggggtcgg ccacaatggt gacttcaatt gaggcagctt atgcaccacg aacaattaac   1020

tgaaggttta ccaggtgaca acgttggttt ca                                 1052

 

Claims (2)

1.一种醋酸棉酚降解菌S6，其特征在于：菌种在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏时间为 2010年11月26日，保藏号为CGMCC No.4371。

2.一种用权利要求1所述的醋酸棉酚降解菌，其特征在于通过以下方法获得：

1）发酵棉籽粕菌种的筛选

用树下土壤和池塘水处理棉籽粕，然后将霉变棉籽粕稀释不同梯度后涂布于0.1% 醋酸棉酚查氏培养基平板上，30℃恒温静置培养3-5天，挑选长势良好的不同类型菌落，进一步于0.2%、0.3%的醋酸无糖查氏培养基驯化培养得到耐较高棉酚含量的菌株；

2）试验种子培养制备及方法

斜面保存菌种接入20ml马铃薯液体培养基于100ml三角瓶得到一级菌种（条件为30℃，200r/min摇床培养48h），取一级菌种接入1ml于装有100ml马铃薯液体培养基的250ml三角瓶中为二级菌种，其条件为30℃，200r/min摇床培养48h；

3）单菌发酵效果研究

将筛选纯化得到的菌株制备成液体菌种，接入100g到棉籽粕发酵底物，接种量为5%，30℃培养48h；烘干测定FG及CP含量，分析发酵效果，对优势菌株进行菌种鉴定；棉籽粕发酵底物的配方为：将粉碎过筛后的棉籽粕、玉米、麦麸按7：2：1的比例混合均匀构成基础底物；按底物与水为1：0.8的比例加入水分发酵，121℃灭菌30min；

4）菌株组合发酵效果研究

将筛选得到的性能优良的菌株制备成液体菌种，接入100g棉籽粕底物中，接种比例分别按1：1和1：1：1的比例，接种量为5%，置于500ml三角瓶中，30℃，恒温静置培养48h；烘干测定FG及CP含量，分析发酵效果。