CN115161222A - 枯草芽孢杆菌jzxj-7菌株在降解生物胺中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物技术领域,具体公开了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JZXJ‑7菌株在降解生物胺中的应用。所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JZXJ‑7菌株于2022年5月9日保藏于广东省微生物菌种保藏中心,保藏编号为GDMCC No:62458。此菌株具有高效的降胺效应和较强的耐盐能力,在4%‑8%盐胁迫下在含有生物胺条件下生长良好,对尸胺、腐胺、酪胺和组胺的降解率显著增加,胺氧化酶基因yobN相对表达量被显著激活。该菌可作为发酵水产品的有效防治剂,对降低产品发酵过程中有害生物胺积累具有显著意义。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域,具体公开了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JZXJ-7菌株在降解生物胺中的应用。
背景技术
生物胺是一类具有生物活性、含氨基的低分子质量化合物。大多数食品中都含有生物胺,尤其是发酵食品,这些生物胺主要由微生物氨基酸脱羧酶作用于氨基酸脱羧而生成。适量生物胺可促进人体的正常生理活动,而过量摄入会产生不良反应,可能会引发头痛、呼吸窘迫、心悸、头晕、恶心、等各种过敏性反应。出于对食品安全的考虑,人们应尽可能降低食品中生物胺的含量。
针对食品中生物胺,目前主要有物理或化学法控制手段。而化学添加酶制剂等主要提取自动物肝脏,成本高不适合工业应用,有些添加剂成本高且可能影响食品风味;物理射线照射对微生物有灭活作用,不能应用于生物胺大量产生的发酵期,冷冻和高温则会破坏食品风味和质构。生物法具有成本低,安全高效的特点,最大程度上减少对风味的影响。已有研究报道,微生物发酵食品中乳酸菌、泛酸枝芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等具有降解生物胺的能力,但所报道的菌株对生物胺中的降解率都偏低,尤其当大多数酱类发酵食品需要盐水腌渍,在盐分胁迫下微生物的代谢酶活性容易受阻,生物增长缓慢,对生物胺的降解率下降。因此,筛选出兼具对生物胺有高效降解率且具有耐盐能力的菌株,对于生产健康安全的发酵食品具有重要意义。
发明内容
为了弥补现有技术存在的不足,本发明的第一个目的是提供了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JZXJ-7菌株在降解生物胺中的应用,所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)JZXJ-7菌株于2022年5月9日保藏于广东省微生物菌种保藏中心,保藏编号为GDMCC No:62458,保藏地址:广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
本发明的第二个目的是提供了一种降解生物胺的方法,所述方法是将上述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JZXJ-7菌株接种至含生物胺的液体、半固体或固体中。
作为本发明优选的一种技术方案,所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JZXJ-7菌株接种量为1.5%-3%。
优选地,所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JZXJ-7菌株的培养条件为31-37℃、100-120rpm/min培养24-48h。
优选地,所述液体、半固体或固体中含有4%-8%氯化钠。
更优选地,所述降解的生物胺包括尸胺、腐胺、酪胺、组胺。
本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JZXJ-7菌株源自乌虾酱,学名糠虾酱(opossum shrimp paste),采自辽宁省锦州笔架山食品厂,加入乌虾体重16%食盐搅拌均匀,将带草盖的发酵罐置于室外自然发酵,温度范围控制为10-30℃,目前已发酵3年。
本发明还提供了上述方法在食品领域降低生物胺含量方面的应用。优选地,在食品发酵生产过程中接种所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JZXJ-7菌株。
与现有技术相比,本发明具有以下优点及有益效果:
本发明中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JZXJ-7菌株具有高效的降胺效应,同时具有较强的耐盐能力。在4%-8%盐胁迫下在含有生物胺条件下生长良好,对尸胺、腐胺、酪胺和组胺的降解率显著增加,在4%盐浓度下降解率分别高达86.1%、93.6%、85.2%、85.4%,胺氧化酶基因yobN相对表达量被显著激活。该菌可作为发酵水产品的有效防治剂,对降低产品发酵过程中有害生物胺积累具有显著意义。
附图说明
图1为JZXJ-7菌株形态学特征和革兰氏染色镜检图。
图2为JZXJ-7菌株基于16S rRNA基因序列的系统发育树。
图3为DNS-Cl衍生的生物胺标准液相色谱图(1.腐胺;2.尸胺;3.组胺;4.1,7-二氨基庚烷;5.酪胺;6.亚精胺;7.精胺)。
图4为株分离菌的生物胺降解效果图。
图5为不同盐浓度胁迫对JZXJ-7菌株在含有50mg/L生物胺条件下的生长影响。
图6为不同盐浓度胁迫下的JZXJ-7菌株的生物胺降解率。
图7为不同盐浓度胁迫下的JZXJ-7菌株yobN的相对表达量。
具体实施方式
以下结合具体实施例和附图来进一步说明本发明,但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明,本发明所用试剂和材料均为市购。
本发明实施例所用材料与试剂:PrepMan Ultra Kits核酸萃取剂,购于美国ThermoFisher公司;基因组DNA提取试剂盒:上海生工生物有限公司;腐胺(≥98.4%)、尸胺(≥98.1%)、组胺(≥98.3%)、酪胺(≥99.5%)、精胺(≥97.2%)、亚精胺(≥99.2%)、丹磺酰氯(DNS-Cl)、脯氨酸和乙酸铵,均为色谱纯美国Sigma公司;乙腈、甲醇、丙酮、碳酸氢钠、氢氧化钠,均为分析纯沈阳化学试剂厂。
实施例1枯草芽孢杆菌JZXJ-7菌株分离与鉴定
1、菌株分离
乌虾酱,学名糠虾酱(opossum shrimp paste),采自辽宁省锦州笔架山食品厂,加入乌虾体重16%食盐搅拌均匀,将带草盖的发酵罐置于室外自然发酵,温度范围控制为10-30℃,目前已发酵3年。对发酵3年的乌虾酱中分离出的7株细菌进行接种,在37℃、120rpm/min,的LB肉汤培养基(pH为7.0)传代培养24h。随后挑取单菌落在LB肉汤琼脂培养基中培养24h后,再以种子液1%接种量接种于LB培养基中,培养24h,随后在4000rpm/min,4℃离心收集菌体,用pH=7.0的PBS缓冲液洗涤2次后,将菌体重悬于2mLPBS溶液中备用。
2、菌株形态学观察:将菌株ZJXJ-7的单菌落划线接种于LB固体培养基进行纯化,37℃培养48h,挑取单个菌落进行革兰氏染色,镜检。
菌株JZXJ-7在LD肉汤琼脂培养基上的菌落形态和革兰氏染色镜检如图1所示,菌落表面粗糙不透明,圆形或椭圆形,菌落密集形成皱壁,部分菌体可向外延伸呈枝丫状,菌体呈微黄色。经革兰氏染色镜检,发现菌体呈长杆状,革兰氏染色呈蓝紫色,孢子呈红色,为革兰氏阳性菌。
3、分子鉴定:
使用核酸萃取剂对JZXJ-7菌株的DNA进行提取提取,提取后的DNA通过细菌16S引物扩增。正向引物(27F)序列如SEQ ID NO.2所示:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’,反向引物(1492R)序列如SEQ ID NO.3所示:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’,扩增后对PCR产物纯化和测序,采用Applied Biosystems 3500基因分析仪进行核酸测序。序列如SEQ ID NO.1所示。
根据16s rRNA的扩增测序,经NCBI中的BLAST进行同源性分析比对,并构建其系统发育树(见图2所示),得到菌株JZXJ-7的系统发育树与Bacillus subtilis DSM 10序列相似度为100%,因此,最终鉴定菌株JZXJ-7为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
4、JZXJ-7菌株的生化特性鉴定
将菌株JZXJ-7接种于LB培养基中,37℃培养24h,培养结束后挑取单个菌落,接种到5mL脑心浸出液肉汤,37℃培养6小时,直到菌液浊度达到OD值达到0.5,将菌液通过梅里埃全自动鉴定仪VITEK进行生化反应检测。
由表1可得,菌株JZXJ-7具有亮氨酸芳胺酶、苯丙氨酸芳胺酶和L-吡咯烷酮芳胺酶阳性,表明该菌具有水解氨基酸能力。麦芽三糖、D-甘露糖、D-海藻糖、菊粉检测为阳性。可在6.5%的盐度中生长,对红四氮唑检测阳性,对多粘菌素B具有耐药性。
表1
实施例2生物胺混合降解效应评价
1、生物胺共培养:配制1L液体发酵培养基:0.5%(w/v)葡萄糖、0.15%(w/v)NaCl、0.15%(w/v)酵母提取物、0.25%(w/v)蛋白胨,1mmol/L KH2PO4、1mmol/L K2HPO4、2mmol/LMgSO4·7H2O、0.6mmol/L CaCl2、0.4mmol/L MnCl2,2.5mmol/L CuSO4-5H2O,调节使用1mol/L的NaOH,溶液调节pH=7.1。取15个灭菌试管,加入6mL发酵培养液,再加入50mg/L生物胺混合标准溶液,使浓度为50mg/L。将种子液以1.5%的接种量接种于发酵培养基中,37℃、120rpm/min培养48h。将不添加菌液的相同条件下处理的作为对照组。分别测定对照组(ρ0)与处理组上(ρ1)清液中的生物胺质量浓度(mg/L),计算6种生物胺的降解率。
降解率=(ρ0-ρ1)/ρ0×100
2、生物胺HPLC检测方法
(1)内标液和生物胺标准溶液的制备
准确称取0.1g 1,7-二氨基庚烷,溶于0.1mol/L HCl溶液,定容于100mL得到1mg/mL内标储备液,再稀释为0.1mg/mL作为内标使用液。准确称取0.01g腐胺、尸胺、组胺、酪胺、精胺和亚精胺标品粉末分别溶于0.1mol/L HCl溶液中,定容至10mL得到1mg/mL生物胺单标储备液。分别从单标储备液中取1.0mL于10mL容量瓶,用0.1mol/L HCl定容至刻度,混匀,得到含6种生物胺的混标工作液。取适量工作液进行梯度稀释并加入适量内标储备液,使内标液浓度为20mg/L,生物胺标准液质量浓度梯度为100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562mg/L。
(2)生物胺的提取及衍生
将菌培养液5000rpm/min离心15min,收集上清液,取1mL上清液加入0.2mL NaOH溶液(1mol/L),0.3mL饱和NaHCO3溶液,2mL 10mg/mL DNS-Cl溶液(丙酮配制),混匀后40℃水浴60min。水浴结束后加入0.2mL 100mg/mL脯氨酸溶液,避光放置20min,随后加入0.4gNaCl,涡旋振荡,加入1.0mL乙醚,混匀振荡30s,静置分层后吸出上层有机相,重复提取2次后合并有机相,40℃水浴挥发至干,加入1mL乙醚复溶,0.22μm有机系滤膜过滤,上机测定。
(3)高效液相色谱条件
色谱柱:Agilent C18色谱柱(4.6×250mm,5μm),柱温37℃,进样量5μL,流速1mL/min,流动相A:0.01mol/L乙酸铵缓冲液-乙腈(v:v=90:10),采用二元梯度洗脱,流动相B:0.01mol/L乙酸铵缓冲液(v:v=90:10)梯度洗脱程序为:0~18min,60~100%流动相B,19~24min,100%流动相B,25~35min,100~60%流动相B。各色谱峰在254nm处检出。
如图3所示,基于色谱条件优化,6种生物胺混标经DNS-Cl衍生后均在进样35min内出峰,且色谱峰峰型对称完整,无重叠,表明洗脱程序可将生物胺较好分离。按照出峰时间顺序流出的物质依次为腐胺(10.23min)、尸胺(11.89min)、组胺(12.26min)、酪胺(18.74min)、亚精胺(21.21min)和精胺(29.57min)。
实施例3JZXJ-7菌株的生物胺降解率
将实施例1分离得到7株芽孢杆菌添加于上述含有6种生物胺的LB发酵液体培养基中,培养48h,测定菌株对不同生物胺的降解效果,由图4可知,菌株JZXJ-1对尸胺降解能力较强,为34.2%,但对其他生物胺降解率较低,JZXJ-2对尸胺和腐胺降解率较高,分别为32.3%、34.7%。JZXJ-7对生物胺的降解率显著高于其他菌株,且对腐胺、尸胺、酪胺、组胺和精胺均具有较高降解率。
实施例4JZXJ-7菌株在含盐生物胺胁迫下的生长特性及降胺特性
1、JZXJ-7菌株在含盐生物胺胁迫下的生长特性
配制LB液体培养基,分装于5个锥形瓶,并分别加入0%,4%,8%,12%,16%的NaCl,每个盐度下分别加入50m g/L的尸胺、腐胺、组胺、酪胺、精胺、亚精胺,在生长曲线仪中分别加入1.95mL含盐生物胺的LB培养液,并加入500μL菌体PBS悬液,37℃培养70h,每隔2h在254nm处测定一次吸光度。
对JZXJ-7菌株在不同比例的盐胁迫下,对生物胺的耐受效应由图5可得,与不添加NaCl的菌株生长情况相比,在4%的盐胁迫下,尤其在含有尸胺、腐胺、组胺和精胺的培养环境中,JZXJ-7菌株的生长能力显著增加。JZXJ-7菌株具有较强的耐盐能力,在12%的NaCl添加下,在含有尸胺、酪胺、精胺、亚精胺的环境中培养48h,还表现出生长能力。在8%NaCl胁迫下,JZXJ-7菌株的在含酪胺和组胺的培养基中对数期生长时间延迟,但生长能力比未添加NaCl组强,表明JZXJ-7菌株具有较强的耐盐能力,且盐胁迫下对生物胺的耐受性也显著增加。
2、不同浓度盐胁迫对JZXJ-7菌株的生物胺降解率影响
将JZXJ-7菌株培养后按照离心获得菌悬液,以500μL接种于分别含0%、4%、8%、12%、16%NaCl的含50mg/L的LB液体发酵培养基中,以添加500μL蒸馏水作为对照组,37℃培养48h,培养结束后4000rpm/min离心获得上清液,提取并检测生物胺含量。
由图6可知,JZXJ-7菌株在0-16%NaCl的添加量下,对6种生物胺的降解率具有显著差异性,在未添加NaCl条件下,JZXJ-7菌株对生物胺的降解率为30-60%,其中对腐胺降解率较高,为57.3%。在添加4%NaCl后,JZXJ-7菌株对尸胺、腐胺、酪胺和组胺的降解率显著增加,分别为86.1%、93.6%、85.2%、85.4%(p<0.05),对精胺和亚精胺的降解率较低,仅为29.8%和20.36%。在8%NaCl添加下,生物胺降解率保持较高水平,但在12%NaCl添加下,对尸胺和酪胺的降解率显著下降(p<0.05)。在16%NaCl添加下,JZXJ-7菌株对6种生物胺的降解率显著下降,表明较高盐胁迫条件下,对JZXJ-7菌株的生物胺降解能力具有显著影响,盐胁迫促进降胺的最优添加比例为4-8%。
3、不同浓度盐胁迫对JZXJ-7菌株降胺过程的胺氧化酶基因yobN表达量的影响
根据胺氧化酶基因yobN的保守序列设计了特异性的基因引物,并以DNA gyrase b亚基(gyrB)设计内源性基因引物。引物为(5’-3’)yobN6-L、yobN6-R、gyrB1-L、gyrB1-R,序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示。将培养液离心的菌体滤纸吸干水分,称重后放入研钵中,加入液氮研磨,研磨成粉后,加到1.5mL离心管中,采用柱式真菌总RNA抽提纯化试剂盒提取总RNA,用核酸定量分析仪检测其纯度和浓度,再通过cDNA反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA,根据PCR反应的Ct值采用2-ΔΔCt法测定yobN基因表达量。
盐胁迫对菌株降胺过程胺氧化酶基因yobN表达量影响如图7所示,添加4%的NaCl显著激活yobN的表达(p<0.05),随后随NaCl添加,表达量逐渐降低,在16%NaCl添加后显著抑制yobN的表达(p<0.05)。表明激活胺氧化酶基因促进降胺效应的最佳为4%的NaCl添加量。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,其并非用以限定本发明,凡在不脱离本发明的精神和原则范围内,所做出的的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 渤海大学
<120> 枯草芽孢杆菌JZXJ-7菌株在降解生物胺中的应用
<130> ZM221199WM
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1376
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
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tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt gaggta 1376
<210> 2
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<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
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<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
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<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
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tcttgctctt gccgccatta 20
Claims (8)
1.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JZXJ-7菌株在降解生物胺中的应用,其特征在于,所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JZXJ-7菌株于2022年5月9日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为GDMCC No:62458。
2.一种降解生物胺的方法,其特征在于,所述方法是将权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JZXJ-7菌株接种至含生物胺的液体、半固体或固体中。
3.根据权利要求2所述的一种降解生物胺的方法,其特征在于,所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JZXJ-7菌株接种量为1.5%-3%。
4.根据权利要求2所述的一种降解生物胺的方法,其特征在于,所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JZXJ-7菌株培养温度为31℃-37℃、100-120rpm/min培养24-48h。
5.根据权利要求2所述的一种降解生物胺的方法,其特征在于,所述液体、半固体或固体中含有4%-8%氯化钠。
6.根据权利要求5所述一种降解生物胺的方法,其特征在于,所述生物胺包括尸胺、腐胺、酪胺、组胺。
7.权利要求2-6任一所述方法在食品领域降低生物胺含量方面的应用。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,在食品发酵生产过程中接种所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JZXJ-7菌株。
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