CN115491319A - 一种伯克霍尔德菌及其发酵产fr901464的方法 - Google Patents

一种伯克霍尔德菌及其发酵产fr901464的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)HDCC00024，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.22290，保藏日期为2021年05月08日。所述的伯克霍尔德菌生产能力高，FR901464的效价可达到2360mg/L以上，其发酵积累FR901464的能力比现有技术中其他菌种有大幅度的提高，便于工业化生产。

Description

一种伯克霍尔德菌及其发酵产FR901464的方法
技术领域
本发明涉及工业微生物发酵技术领域，具体涉及一种伯克霍尔德菌及其发酵产FR901464的方法。
背景技术
FR901464是一种具有高效抗肿瘤活性的天然化合物，最初由Nakajima等人于1996年通过发酵从假单孢菌Pseudomonas sp.中分离纯化得到(Nakajima,H.；Sato,B.；Fujita,T.；Takase,S.；Terano,H.；Okuhara,M.Antitumor substances,FR901463,FR901464 andFR901465.I.taxonomy,fermentation,isolation,physico-chemical properties andbiological activities[J].J.Antibiot.,1996,49:1196-1203.)，其中，文中所述的假单孢菌Pseudomonas sp.No.2663发酵产量约360mg/L。其化学结构式如式1所示。
Figure BDA0003122662800000011
作为真核细胞中前体mRNA的剪接抑制剂，FR901464对肿瘤细胞生长有很强的抑制作用，活性测试表明，FR901464对人类实体肿瘤细胞产生了十分显著的抑制作用，实验测试得IC50值在0.3-3.4nM。由于FR901464在抗肿瘤方面表现了极高的活性，且其生理活性独特，刚发现就引起了科学家们的广泛关注。
由于FR901464所具有的生物学和化学特性，在开展相关的抗肿瘤生物活性检测实验中，需要大量制备相应的FR901464样品，以满足各种临床前的活性研究，而现目前，已报道的关于FR901464的制备方法主要有两种，一种为发酵获得，另一种为化学合成。发酵法获得FR901464，如上文所述，Nakajima等人于1996年通过发酵从假单孢菌Pseudomonassp.No.2663可获得360mg/L的FR901464，发酵产量较低，且考虑到FR901464在制备过程中存在结构不稳定，分离纯化工艺复杂及收率偏低等问题，因而，现阶段的发酵水平对获得高纯度的FR901464成本较高。而化学合成FR901464方面的研究也已经有了很多报道，如Jacobsen及其团队完成了FR901464的第一次全合成。随后，Kitahara和Koide及其团队报道了另外两种合成方法(Kazunori Koide,Brian J.Albert.Total Syntheses ofFR901464.2007,65(2):119-126.)。但是，总体上，化学合成存在反应步骤长，收率低，且反应过程中用到易燃易爆有机试剂，对安全性提出了很高的要求与挑战，且成本方面也没有明显优势。
针对现有技术中发酵获得FR901464存在发酵产量低，而化学合成制备工艺中存在的合成步骤长、收率低，且用到的试剂易燃易爆，较不安全等一系列的问题，因此，本发明寻求一种新的微生物，并可通过简单的发酵即可获得较高发酵产量的FR901464，从而实现FR901464较低的生产成本。
发明内容
为了解决FR901464现有制备方法不足的问题，本发明的目的之一在于提供一种新的FR901464生产菌，该菌为伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)HDCC00024，保藏编号为CGMCC NO.22290。
本发明伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)HDCC00024的微生物菌种于2021年05月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC NO.22290，分类名为伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)，并登记在册，证明存活。
本发明的目的还在于提供了一种伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)HDCC00024(CGMCC NO.22290)在制备FR901464或者含有FR901464的药物组合物的应用。
本发明还提供了一种FR901464的制备方法，该方法包括采用伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)HDCC00024(CGMCC NO.22290)在含有可同化的碳源和/或氮源的营养培养基里，进行有氧发酵的步骤。
在优选的实施方案中，上述可同化的碳源选自玉米淀粉、麦芽糊精、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、工业糖蜜、甘油、豆油、山梨醇、甘露醇之一或者上述物质的任意几种的组合，优选玉米淀粉、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇或者上述物质任意几种的组合。
在优选的实施方案中，上述可同化的氮源选自酵母抽提粉、酵母粉、酵母膏、大豆卵磷脂、黄豆饼粉、棉籽饼粉、花生饼粉、麸质粉、玉米浆干粉、豆粕、蛋白胨、尿素、铵盐之一或者上述物质的任意几种的组合，优选黄豆饼粉、棉籽饼粉、酵母抽提粉、酵母粉或者上述物质任意几种的组合。
在优选的实施方案中，上述营养培养基还包括无机盐，所述无机盐选自柠檬酸三钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸铵、碳酸钙、硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸铜、氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、氯化铁、硫酸锰之一或上述物质的任意几种的组合，优选磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钾、氯化钙或者上述物质任意几种的组合。
在优选的实施方案中，所述营养培养基含有玉米淀粉5-30g/L、葡萄糖10-50g/L、山梨醇5-20g/L、甘露醇5-20g/L、酵母抽提粉3-10g/L、黄豆饼粉5-10g/L、棉籽饼粉5-10g/L、硫酸镁1-5g/L、磷酸二氢钾2-8g/L、氯化钾1-5g/L、氯化钙1-5g/L。
在优选的实施方案中，所述有氧发酵的温度为20-30℃，优选23-28℃；培养基pH为5.0-8.0，优选5.0-7.0；培养时间为24-240小时，优选48-144小时；通气量为0.1-2.0vvm，优选0.5-2.0vvm。
在优选的实施方案中，所述伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)HDCC00024(CGMCCNO.22290)是通过种子液接种至所述营养培养基中进行所述发酵培养的；其中，所述种子液是将伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)HDCC00024(CGMCC NO.22290)在种子培养基里进行种子培养得到的；所述种子培养的条件为：种子培养的温度为20℃-30℃，优选23℃-28℃；培养基pH为5.0-8.0，优选5.0-7.0；培养时间为24-80小时，优选24-60小时。
在优选的实施方案中，所述的种子培养基含有葡萄糖5-30g/L、山梨醇5-20g/L、棉籽饼粉2-10g/L、酵母抽提粉5-20g/L、氯化钙1-10g/L，硫酸镁1-10g/L，磷酸二氢钾1-10g/L。
本发明FR901464通过以下条件进行HPLC检测：
本发明FR901464效价检测所用的液相检测方法条件如下：
色谱柱：YMC-Pack ODS-AM(250x 4.6mm,5um)
检测波长:235nm；柱温：40℃；流速:1.0ml/min；进样体积:5ul；
流动相：
乙腈：0.1％甲酸纯水＝40:60；运行：20min。
本发明伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)HDCC00024(CGMCC NO.22290)主要生物学特征为：菌落形态呈椭圆，菌落直径大小约6～10mm，菌落周边呈乳白色，中间颜色较深，呈黄色，菌落中间区域表面多褶皱，有沟纹。
本发明菌株伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)HDCC00024(CGMCC NO.22290)为一株全新的FR901464产生菌，生产能力高，其发酵积累FR901464的能力比现有技术中其他菌种有了大幅度的提高，FR901464的效价可达2360mg/L以上，便于工业化生产。
附图说明
图1为菌株HDCC00024(CGMCC NO.22290)在牛肉膏蛋白胨固体培养基培养基上的菌落特征图。
图2为菌株HDCC00024(CGMCC NO.22290)通过发酵培养后，对菌体进行分离提取，经HPLC检测的FR901464图谱。
具体实施方式
下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中采用的材料、试剂等如无特殊说明，皆为普通市售品，皆可于市场购得。
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例1：菌株来源
伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)HDCC00024(CGMCC NO.22290)是从中国浙江省杭州市天目山山坡的土壤中分离得到。
在天目山区域土壤进行交叉采样，随机取5个采样点，每个点取土壤样品10g，放入锥形瓶中，混合均匀后取样品10g，加入到一个装入90mL无菌水的锥形瓶中(瓶中有一个磁力搅拌器)，漩涡搅拌30分钟，使其充分混匀制成悬浊液，即为10-1菌悬液。用稀释涂布平板法将上述悬浊液与无菌水按照体积比1：9稀释成10-2，10-3，10-4，10-5浓度，取不同稀释倍数菌悬液0.1mL，涂布于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板中，用无菌涂布棒在培养基表面轻轻涂布，室温下静置30分钟后置于25℃恒温培养箱。待菌落长出后，观察记录菌落颜色、透明度、菌落表面、边缘形态。最终挑取1000株菌株接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基制成斜面，并进行发酵验证。用接种环挑取斜面培养的菌体一环，分别接种于含有20mL种子培养基的250mL锥形瓶中，于28℃条件下震荡培养1天后，再吸取1mL移种于含有20mL发酵培养基的250mL锥形瓶中，于25℃条件下震荡培养3天后，经HPLC检测所得发酵液中FR901464的含量，挑选出最高产菌株即伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)HDCC00024(CGMCC NO.22290)。
牛肉膏蛋白胨固体培养基(g/L)：牛肉膏3.0g/L，蛋白胨10.0g/L，NaCl 5.0g/L，蒸馏水1000mL，琼脂20g/L，pH 7.0。
种子培养基配方(g/L)：葡萄糖10g/L，玉米淀粉10g/L，棉籽饼粉10g/L，酵母抽提粉5g/L，碳酸钙15g/L，硫酸镁1.5g/L，硫酸二氢钾1g/L，加水定容至1000mL，pH 7.0±0.1。
发酵培养基配方(g/L)：玉米淀粉10g/L，麦芽糊精10g/L，葡萄糖20g/L，酵母抽提粉5g/L，酵母粉10g/L，酵母膏10g/L，碳酸钙30g/L，加水定容至1000mL，pH 7.0±0.1。
实施例2：伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)HDCC00024(CGMCC NO.22290)的形态学、培养学特征、生理生化特征。
参照根据《伯杰氏系统细菌学手册》、《常见细菌系统鉴定手册》等书中的有关内容进行鉴定，菌株的生理反应如表1所示，说明该菌株是伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)。
表1.伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)HDCC00024(CGMCC NO.22290)生理反应
Figure BDA0003122662800000071
Figure BDA0003122662800000081
备注：+：阳性；-：阴性。
实施例3菌种鉴定
伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)HDCC00024(CGMCC NO.22290)的16S rDNA序列分析参照《分子克隆实验指南》书中的有关内容进行实验。收集菌体，然后用细菌DNA提取试剂盒抽提总DNA。
设计引物：7F5’–CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’，和1540R5’–AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’进行PCR扩增，PCR产物检测采用0.8％琼脂糖凝胶电泳，PCR产物纯化回收采用SanPrep柱式PCR纯化产物试剂盒，纯化后的PCR产物直接送北京擎科生物科技有限公司杭州分公司进行序列测定。
菌株HDCC00024(CGMCC NO.22290)所测的16S rDNA的序列经校对后，与GenBank数据库中相关种、属的序列进行同源序列BLAST比较，以确定该菌株的分类地位。
菌株HDCC00024(CGMCC NO.22290)所测得到的16S rDNA序列(SEQ ID NO:1)，提交NCBI与GenBank中相关序列进行BLAST比较，结果见表2(表中只列出同源性较高的模式菌株)。
表2菌株HDCC00024(CGMCC NO.22290)和典型模式菌株的同源性
Figure BDA0003122662800000091
通过对菌株HDCC00024(CGMCC NO.22290)16S rDNA区域进行测序，与GenBank数据库中相关种、属的序列进行同源序列BLAST比较，发现其与伯克霍尔德菌属(Burkholderiamultivorans strain QYGXJ8-1、Burkholderia rinojensis strain A396、Burkholderiasp.FERM BP-3421、Burkholderia rinojensis strain LD111-1和Burkholderiamultivorans strain AU0127)同源性均高达99.43％-99.79％，同时对菌株HDCC00024(CGMCC NO.22290)进行表观特征试验，发现该菌株和伯克霍尔德菌属(Burkholderia sp.)分类相关参数非常接近，故将菌株HDCC00024(CGMCC NO.22290)鉴定为伯克霍尔德菌属(Burkholderia sp.)菌株。
实施例4制备FR901464发酵液
(1)斜面菌种的制备与培养：
斜面培养基配方(g/L)：酵母抽提粉4.0g/L，麦芽抽提物10.0g/L，葡萄糖4.0g/L，琼脂20.0g/L，消前pH 7.2～7.4，试管30×200mm，装量15mL，经121℃灭菌20min，冷却至55-60℃左右摆斜面，待冷却凝固后，接种至斜面，28±1℃培养3天后，菌种成熟。
(2)种子液的制备与培养：
种子培养基配方(g/L)：葡萄糖30g/L、山梨醇5g/L、棉籽饼粉10g/L、酵母抽提粉20g/L、氯化钙10g/L，硫酸镁10g/L，磷酸二氢钾1g/L，消前pH 7.0；250mL规格的三角摇瓶，装量50mL，121℃灭菌20min。接种107～108cfu/mL至种子培养基中，28±1℃，250rpm振荡培养24小时，此时培养液pH 6.8-7.2，菌体OD600为15-20。
(3)发酵培养基的制备与培养：
发酵培养基配方(g/L)：
玉米淀粉5g/L、葡萄糖10g/L、山梨醇5g/L、甘露醇5g/L、酵母抽提粉3g/L、黄豆饼粉5g/L、棉籽饼粉5g/L、硫酸镁1g/L、磷酸二氢钾2g/L、氯化钾1g/L、氯化钙1g/L。消前pH5.0。250mL规格的三角摇瓶，装量20mL，121℃灭菌20min。将种子液以10％(体积比)的接种量接入。在23±1℃，250rpm振荡培养48小时。
经HPLC方法检测发酵液中FR901464的含量，测得为1347mg/L。
实施例5制备FR901464发酵液
(1)斜面培养基配方及培养条件同实施例4中步骤(1)；
(2)种子培养基配方及培养条件同实施例4中步骤(2)；
(3)发酵培养基的制备与培养：
玉米淀粉20g/L、葡萄糖30g/L、山梨醇10g/L、甘露醇10g/L、酵母抽提粉6g/L、黄豆饼粉8g/L、棉籽饼粉7g/L、硫酸镁3g/L、磷酸二氢钾6g/L、氯化钾3g/L、氯化钙3g/L。消前pH6.0。250mL规格的三角摇瓶，装量20mL，121℃灭菌20min。将种子液以10％(体积比)的接种量接入。在26±1℃，250rpm振荡培养96小时。
经HPLC方法检测发酵液中FR901464的含量，测得为1950mg/L。
实施例6制备FR901464发酵液
(1)斜面培养基配方及培养条件同实施例4中步骤(1)；一级种子培养基配方及培养条件同实施例4中步骤(2)；
(2)种子罐种子液的制备：
种子罐中种子液培养基配方同实施例4中步骤(2)中种子培养基；
在15L的种子罐中投入10L的种子培养基，用蒸汽灭菌，121℃灭菌20min，待冷却至28℃后接入一级的摇瓶种子液200mL，搅拌转速200rpm，通气量1.0vvm，28±1℃培养24小时，此时种子液pH 7.0-7.4，菌体浓度12-15％(体积比)；
(3)发酵罐发酵液的制备：
发酵培养基的配方
玉米淀粉30g/L、葡萄糖50g/L、山梨醇20g/L、甘露醇20g/L、酵母抽提粉10g/L、黄豆饼粉10g/L、棉籽饼粉10g/L、硫酸镁5g/L、磷酸二氢钾8g/L、氯化钾5g/L、氯化钙5g/L。消前pH 7.0。
发酵罐体积50L，投料体积30L，用蒸汽灭菌，121℃，20min，待冷却至28℃后接入种子罐种子液3L，搅拌转速300-600rpm(转速在前3天逐渐从300rpm升至600rpm)，通气量2.0vvm，28℃培养144小时。
经HPLC方法检测发酵液中的FR901464的含量为2360mg/L。
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<400> 1
tcgtccgctt accatgcagt cgacggcagc acgggtgctt gcacctggtg gcgagtggcg 60
aacgggtgag taatacatcg gaacatgtcc tgtagtgggg gatagcccgg cgaaagccgg 120
attaataccg catacgatct acggatgaaa gcgggggatc ttcggacctc gcgctatagg 180
gttggccgat ggctgattag ctagttggtg gggtaaaggc ctaccaaggc gacgatcagt 240
agctggtctg agaggacgat cagccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg 300
gaggcagcag tggggaattt tggacaatgg gggaaaccct gatccagcaa tgccgcgtgt 360
gtgaagaagg ccttcgggtt gtaaagcact tttgtccgga aagaaatcct ttgggctaat 420
accccggggg gatgacggta ccggaagaat aagcaccggc taactacgtg ccagcagccg 480
cggtaatacg tagggtgcga gcgttaatcg gaattactgg gcgtaaagcg tgcgcaggcg 540
gtttgttaag acagatgtga aatccccggg cttaacctgg gaactgcatt tgtgactggc 600
aagctagagt atggcagagg ggggtagaat tccacgtgta gcagtgaaat gcgtagagat 660
gtggaggaat accgatggcg aaggcagccc cctgggccaa tactgacgct catgcacgaa 720
agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccctaaac gatgtcaact 780
agttgttggg gattcatttc cttagtaacg tagctaacgc gtgaagttga ccgcctgggg 840
agtacggtcg caagattaaa actcaaagga attgacgggg acccgcacaa gcggtggatg 900
atgtggatta attcgatgca acgcgaaaaa ccttacctac ccttgacatg gtcggaatcc 960
tgaagagatt cgggagtgct cgaaagagaa ccgatacaca ggtgctgcat ggctgtcgtc 1020
agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt gtccttagtt 1080
gctacgcaag agcactctaa ggagactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac 1140
gtcaagtcct catggccctt atgggtaggg cttcacacgt catacaatgg tcggaacaga 1200
gggttgccaa cccgcgaggg ggagctaatc ccagaaaacc gatcgtagtc cggattgcac 1260
tctgcaactc gagtgcatga agctggaatc gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt 1320
gaatacgttc ccgggtcttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagtgg gttttaccag 1380
aagtggctag tctaaccgca aggaggacgt caccacgtga tatggc 1426

Claims (13)

1.一种伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)HDCC00024，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.22290，保藏日期为2021年05月08日。
2.根据权利要求1所述的伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)HDCC00024在制备FR901464或者含有FR901464的药物组合物的应用。
3.一种含权利要求1所述的伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)HDCC00024的发酵液。
4.一种FR901464的制备方法，其特征在于：包括采用如权利要求1所述的伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)HDCC00024进行发酵制备。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的发酵过程包括在含有可同化的碳源和/或氮源的营养培养基里，进行有氧发酵。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述可同化的碳源选自玉米淀粉、麦芽糊精、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、工业糖蜜、甘油、豆油、山梨醇、甘露醇之一或者任意几种的组合；优选为玉米淀粉、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述可同化的氮源选自酵母抽提粉、酵母粉、酵母膏、大豆卵磷脂、黄豆饼粉、棉籽饼粉、花生饼粉、麸质粉、玉米浆干粉、豆粕、蛋白胨、尿素、铵盐之一或者任意几种的组合；优选为黄豆饼粉、棉籽饼粉、酵母抽提粉、酵母粉。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述营养培养基还包括无机盐，所述无机盐选自柠檬酸三钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸铵、碳酸钙、硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸铜、氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、氯化铁、硫酸锰之一或任意几种的组合；优选为磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钾、氯化钙。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述营养培养基含有玉米淀粉5-30g/L、葡萄糖10-50g/L、山梨醇5-20g/L、甘露醇5-20g/L、酵母抽提粉3-10g/L、黄豆饼粉5-10g/L、棉籽饼粉5-10g/L、硫酸镁1-5g/L、磷酸二氢钾2-8g/L、氯化钾1-5g/L、氯化钙1-5g/L。
10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述有氧发酵的温度为20-30℃，优选23-28℃；培养基pH为4.0-8.0，优选为5.0-7.0；培养时间为24-240小时，优选为48-144小时；通气量为0.1-2.0vvm，优选为0.5-2.0vvm。
11.根据权利要求4-10任一项所述的方法，其特征在于：所述伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)HDCC00024是通过种子液接种至所述营养培养基中进行所述发酵培养的；
其中，所述种子液是将权利要求1所述的伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)HDCC00024在种子培养基里进行种子培养得到的。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于：所述种子培养的条件为：种子培养的温度为20℃-30℃，优选为23℃-28℃；培养基pH为5.0-8.0，优选为5.0-7.0；培养时间为24-80小时，优选为24-60小时。
13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述的种子培养基含有葡萄糖5-30g/L、山梨醇5-20g/L、棉籽饼粉2-10g/L、酵母抽提粉5-20g/L、氯化钙1-10g/L，硫酸镁1-10g/L，磷酸二氢钾1-10g/L。
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