CN105219691B - 一种提高小球藻对苯酚耐受性和降解率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种提高小球藻对苯酚的耐受性和降解率的方法，包括：首先选择对数生长期的小球藻，在一定温度和光照条件下，以一定初始密度摇床培养于含有苯酚的培养基中，培养设定的时间作为一个适应性进化周期；然后将经过一个周期进化的小球藻稀释，取与上述步骤相同的初始密度、在相同的条件下摇床培养于另一培养基中，培养相同时间；再重复上述培养过程，直至小球藻的生长速率和对苯酚的降解率趋于稳定。本发明通过对小球藻进行适应性进化实验，提高了小球藻的生长速率、对高浓度苯酚的耐受性和降解率，同时降低初始接种密度，缩短完全降解高浓度苯酚所需要的时间，节省废水处理成本，为工业废水的处理提供优势藻株。
Description
技术领域
本发明涉及微藻生物技术领域，特别是涉及一种既能提高小球藻对高浓度苯酚的耐受性，又能提高小球藻对高浓度苯酚降解率的方法。
背景技术
水是生命之源，然而随着经济的发展，人们生活水平日益提高，冶金、化工、电镀、造纸、印染、制革等行业随之迅速发展，各种有毒有机物的排放量日益增多。酚类化合物主要存在于炼油、煤气洗涤、炼焦、造纸、合成氨、木材防腐、石油化工、化学、制药、油漆、涂料、塑料农药等工业废水中。苯酚是一种高毒物质，可以通过皮肤接触或经口腔进入人体，与细胞原浆中的蛋白质接触形成不溶性蛋白而使细胞失去活性，对皮肤和粘膜具有强烈的腐蚀作用，对神经系统也具有较大的危害。
工业废水中苯酚浓度范围为600-42000mg/L，文献调研发现，实验室中使用的菌类(芽孢杆菌)能处理的最大苯酚浓度为2000mg/L，其对苯酚的降解率为10.42％[Banerjee,A.and A.K.Ghoshal,Phenol degradation by Bacillus cereus:Pathway and kineticmodeling.Bioresource Technology,2010.101(14):p.5501-5507]，实验室中使用的微藻(小球藻)能处理的最大苯酚浓度为700mg/L，初始接种密度为6.3g/L时能将浓度为800mg/L的苯酚经过8天能被完全降解[Klekner,V.and N.Kosaric,DEGRADATION OF PHENOLS BYALGAE.Environmental Technology,1992.13(5):p.493-501.]，但其初始接种密度为3.4g/L，需要大约7天能将700mg/L苯酚完全降解。钢铁工业水污染排放标准规定，企业废水总排放口要求挥发酚的含量应<0.5mg/L，因此，寻找一种简单、高效、快捷的含苯酚废水处理方法至关重要。
20世纪50年代，Oswald等[OswaldW J，GotaasH B，Golueke C G，et al.Algae inwastetreatment[J].Sewage and Industrial Wastes，1957，29(4):437-457.]提出利用微藻处理污水，奠定了藻类污水处理技术的基础。
苯酚废水流入江河，可导致鱼类大量死亡，从而破坏水体的氧平衡。藻类不仅可以降解苯酚，还可以通过光合作用产生大量氧气，减少水中生物的死亡及水体因缺氧而产生的恶臭气味。此外，藻类能够去除废水中含氮、含磷化合物，减少水体富营养化，同时能够富集重金属离子，降解有毒有机物。利用藻类处理废水具有净化效率高、系统建造运行费用低、操作简单等优点。因此，用藻类处理污水[Volesky B,Schiewer S.In:Flickinger M CDrew(eds),Encylopedia of bioprocess engingeering.Wiley,NewYork,1999:433-453.]在水质的改善中得到越来越广泛的应用。
A.H.Scragg[Scragg,A.H.,The effect of phenol on the growth ofChlorella vulgaris and Chlorella VT-1.Enzyme and Microbial Technology,2006.39(4):p.796-799.]分别以不同浓度(0mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L)苯酚培养两种小球藻，发现两种小球藻均能降解苯酚，但是苯酚浓度为400mg/L时，两种小球藻生长均受到抑制。HIROOKA等[Hirooka,T.,et al.,Removal of hazardous phenols bymicroalgae under photoautotrophic conditions.Journal of Bioscience andBioengineering,2003.95(2):p.200-203.]在光合自养条件下，以2,4-二硝基苯酚培养小球藻发现，5d后90％的40μM的硝基酚和DNP被完全去除，氯酚和2,4-二氯苯酚也可以被去除，但去除效果不明显。Abel E.Navarro等[Navarro,A.E.,et al.,Effect of pH onphenol biosorption by marine seaweeds.Journal of Hazardous Materials,2008.156(1–3):p.405-411.]研究初始pH对两种海藻降解苯酚的影响发现，pH为10时，两种海藻对苯酚的降解率分别为10％、35％，并且两种海藻对苯酚的降解依赖于溶液初始pH。
现有的关于小球藻降解高浓度苯酚的研究存在两大问题，一是小球藻的初始接种密度过高，二是小球藻对高浓度苯酚的耐受性较差，降解率不高。因此，我们提出对小球藻进行适应性进化的实验方法，该方法既能提高在较低细胞接种密度下小球藻对高浓度苯酚的耐受性，又能提高小球藻对高浓度苯酚的降解率。
所谓的实验室适应性进化是使微生物在某一特定条件下持续处于对数生长期状态。在对数生长期时，细胞增殖快，容易发生遗传物质的重组并且容易产生适宜外界条件变化的种株。它是一种广泛存在的、能够增强微生物潜在途径、表型优化及环境适应性。实验室环境条件下，微生物的适应性进化实验可以作为研究进化的工具，也可以作为工业开发新菌株的手段。
Fu等[Fu,W.Q.,Gudmundsson,O.,Feist,A.M.,Herjolfsson,G.,Brynjolfsson,S.,Palsson,B.,2012.Maximizing biomass productivity and cell density ofChlorella vulgaris byusing light-emitting diode-based photobioreactor.J.Biotechnol.161,242–249.]在国际上首先报道了小球藻在光生物反应器内的适应进化，他对普通小球藻进行38个周期(114天)的不断增加光照强度及CO2通气速率(2.5–9.5％(v/v))实验。CO2通气速率进化试验结束后，小球藻的生长速率由0.84gDCW/L/day增加到到1.75gDCW/L/day；光照强度进化试验结束后，小球藻的生物量在第4个周期时达到最大为1.32gDCW/E。Fu等[Fu,W.Q.,Gudmundsson,O.,Paglia,G.,Herjolfsson,G.,Andresson,Q.S.,Palsson,B.O.,Brynjolfsson,S.,2013.Enhancement of carotenoid biosynthesisin the greenmicroalga Dunaliella salina with light-emitting diodes andadaptive laboratory evolution.Appl.Microbiol.Biotechnol.97,2395–2403.]将盐生杜氏藻在红光(128μE/m2/s)、蓝光(42μE/m2/s)组合下进行16个周期的实验室适应性进化发现，β-胡萝卜素和叶黄素的含量分别比原始值增加了3.3、2.3倍，生长速率平均增加0.40±0.01gDCW/L/day，生物量平均增加0.27±0.01gDCW/E，大约是初始值的1.8倍。Yu等[YuS,Zhao Q,Miao X,et al.Enhancement of lipid production in low-starch mutantsChlamydomonas reinhardtii by adaptive laboratory evolution[J].Bioresourcetechnology,2013,147:499-507.]采用莱茵衣藻的三个淀粉合成缺陷藻株在进行实验室进化后发现，三者的生长速率较未进化的藻株加快，生物量分别是未进化藻株的1.17、1.33、1.48倍，油脂产量分别从32％、24.27％增加到36.67％、44.67％。
本专利和上述研究不同，研究对象为不能耐受且不能降解高浓度苯酚的小球藻，适应性进化后，不仅使得小球藻的生长速率明显增加，而且小球藻能够耐受并且降解的苯酚的浓度也显著提高。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种提高小球藻对苯酚的耐受性和降解率的方法，用于解决现有技术中小球藻的初始接种密度过高且小球藻对高浓度苯酚的耐受性较差以及降解率不高的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种提高小球藻对苯酚的耐受性和降解率的方法，所述方法至少包括如下步骤：
1)选择对数生长期的小球藻，在一定温度和光照条件下，以一定初始密度摇床培养于含有苯酚的培养基中，培养设定的时间作为一个适应性进化周期；
2)将步骤1)中经过一个周期进化的小球藻稀释，取与步骤1)相同的初始密度、在相同的条件下摇床培养于具有相同苯酚浓度的另一培养基中，培养相同时间；
3)重复上述培养过程，直至小球藻的生长速率和对苯酚的降解率趋于稳定。
作为本发明提高小球藻对苯酚耐受性和降解率的方法的一种优化的方案，所述小球藻的培养条件为：温度为25～35℃，光照强度为50～200μmol/m2/s，摇床培养的振荡频率为50～200rpm。
作为本发明提高小球藻对苯酚耐受性和降解率的方法的一种优化的方案，所述小球藻在每一个适应性进化周期中的初始密度为0.1～1.0g/L。
作为本发明提高小球藻对苯酚耐受性和降解率的方法的一种优化的方案，所述培养基均采用TAP液体培养基，含苯酚浓度为300～700mg/L，初始pH值为6.0～8.0。
作为本发明提高小球藻对苯酚耐受性和降解率的方法的一种优化的方案，所述小球藻一个适应性进化周期的时间为2～5天，培养周期为20～50个。
作为本发明提高小球藻对苯酚耐受性和降解率的方法的一种优化的方案，每一个适应性进化周期培养完，测量所述小球藻的干重和所述培养基中剩余的苯酚浓度。
作为本发明提高小球藻对苯酚耐受性和降解率的方法的一种优化的方案，测量所述小球藻干重的方法为：
首先，将微孔滤膜烘干，称量所述微孔滤膜的干重为W1；
然后，取小球藻液于干燥后的所述微孔滤膜上抽滤；
接着，将抽滤后的微孔滤膜烘干，称量所述微孔滤膜的干重为W2；
最后，计算单位体积的小球藻液的干重为(W2-W1)/V，其中V为小球藻液的体积。
作为本发明提高小球藻对苯酚耐受性和降解率的方法的一种优化的方案，采用国标HJ503-2009测量所述培养基中剩余的苯酚浓度。
作为本发明提高小球藻对苯酚耐受性和降解率的方法的一种优化的方案，经过多个适应性进化周期培养，对获得的小球藻与未进化生长的小球藻进行苯酚耐受性和降解率的对比评价分析。
如上所述，本发明的提高小球藻对苯酚的耐受性和降解率的方法，包括：首先选择对数生长期的小球藻，在一定温度和光照条件下，以一定初始密度摇床培养于含有苯酚的培养基中，培养设定的时间作为一个适应性进化周期；然后将经过一个周期进化的小球藻稀释，取与上述步骤相同的初始密度、在相同的条件下摇床培养于具有相同苯酚浓度的另一培养基中，培养相同时间；再重复上述培养过程，直至小球藻的生长速率和对苯酚的降解率趋于稳定。本发明通过对不能耐受及降解高浓度苯酚的小球藻进行适应性进化实验，结果表明小球藻的生长速率、对高浓度苯酚的耐受性和降解率均有明显提高，这不仅可以解决现有研究中小球藻对高浓度苯酚耐受性较差及降解率不高的问题，还可以降低小球藻的初始接种密度，同时缩短小球藻完全降解高浓度苯酚所需要的时间，节省废水处理成本，本专利还可以为工业废水的处理提供降解高浓度苯酚的优势藻株。
附图说明
图1为未进化小球藻与进化后小球藻的生物量对比示意图。
图2为未进化小球藻与进化后小球藻的培养液中剩余的苯酚浓度比较示意图。
图3为未经进化的小球藻在不同浓度苯酚条件下的生物量曲线示意图。
图4为未经进化的小球藻培养液中剩余的苯酚浓度曲线示意图。
图5为进化后的小球藻在不同浓度苯酚条件下的生物量曲线示意图。
图6为进化后的小球藻培养液中剩余的苯酚浓度曲线示意图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
以下结合实施例对本发明做进一步阐述。根据下述实施例可以更好的了解本发明，但不限定本发明。
本发明所用藻株是由本课题组前期从本地分离纯化所得，经形态学及18s rDNA鉴定为小球藻(Chlorella sp.)。选择的小球藻处于对数生长期。
将小球藻培养于TAP液体培养基中进行适应性进化周期培养，TAP液体培养基的配方如下：
其中，微量元素配制方法如下：
【实施例1】
本实施例以初始不能降解浓度为500mg/L苯酚的小球藻(Chlorella sp.)为例，说明本技术方案的可行性。
小球藻的基础培养基是上述TAP液体培养基，培养条件：初始pH＝6.0，温度为29±0.8℃，光照强度为117.67±6.89μmol/m2/s，连续光照，150rpm摇床振荡培养，培养液中苯酚浓度为500mg/L。
初代将小球藻以初始接种密度为0.6g/L接种于含苯酚浓度为500mg/L的100mL的TAP培养基中(250mL的三角摇瓶)，培养3天后测量其干重及液体培养基中剩余的苯酚浓度。
接着，取培养3天后初代的小球藻稀释继续以初始接种密度0.6g/L接种于含苯酚浓度为500mg/L的100mL的TAP液体培养基中(培养基为重新配制)培养3天后测定其干重及培液体培养基中剩余的苯酚浓度。重复上述过程，进行30个周期的循环培养，后面的几个周期测定的小球藻的干重及剩余的苯酚浓度几乎不变，说明小球藻的生长速率(生物量)和对苯酚的降解率趋于稳定。
上述干重法测定生物量的具体方法为：
(1)微孔滤膜(0.45μm/50mm)于105℃烘箱过夜烘干，称量滤膜干重为W1；
(2)取5mL小球藻液于干燥后的滤膜上抽滤；
(3)将第(2)步抽滤后的滤膜置于105℃烘箱中烘干至恒重(24h)，称量滤膜的重量为W2；
(4)利用公式DW(g/L)＝(W2-W1)/V计算出单位体积小球藻液的干重，其中，DW为单位体积藻液的干重(g/L)，V为小球藻液的体积。
培养基中剩余苯酚浓度的测定则采用国标HJ503-2009(4-氨基安替比林直接分光光度法)来测定。测定方法是常规方法，在此不再一一赘述。
经过30个周期的传代培养后，对进化的小球藻和未进化的小球藻进行对比试验。具体地，将上述进化的小球藻和未进化的原始小球藻均以初始接种密度0.6g/L接入苯酚浓度为300、500、700mg/L的新配制的TAP液体培养基中，以相同的培养条件培养8天，每天取样测定两种藻株的生物量及培养液中剩余的苯酚浓度。
图1及图2均是将小球藻在苯酚浓度为500mg/L的TAP培养基中进行培养。
较低初始接种密度的小球藻(Chlorella sp.)在未经适应性进化前既不能耐受浓度为500mg/L的苯酚，也不能降解浓度为500mg/L的苯酚，生物量基本没有发生变化(图1)，且培养液中剩余的苯酚浓度也没有发生变化(图2)。
较低初始接种密度的小球藻(Chlorella sp.)经过适应性进化后能耐受浓度为500mg/L的苯酚，且生物量由0.6g/L在8天时间内增加到3.4g/L(图1)，培养液中剩余的苯酚浓度在第7天降为0mg/L(图2)。
图3为未经进化的小球藻在不同浓度苯酚条件下的生物量曲线示意图；图4为未经进化的小球藻培养液中剩余的苯酚浓度曲线示意图。
较低初始接种密度下未经进化的小球藻仅能耐受浓度为300mg/L的苯酚，浓度为500mg/L、700mg/L的苯酚均对小球藻的生长均有抑制作用(图3)，且未经进化的较低初始接种密度的小球藻不能降解浓度浓度为300mg/L、500mg/L、700mg/L的苯酚(图4)。
进化后的小球藻既能在较低初始接种密度条件下耐受浓度为500mg/L、700mg/L的苯酚(图5)，又能在第6天将浓度为300mg/L的苯酚降解至浓度为0mg/L，在第7天能将浓度为500mg/L的苯酚降解至浓度为0mg/L，同时浓度为700mg/L的苯酚在第8天降为94mg/L(图6)。
进化后的小球藻在培养液中的苯酚浓度减少的同时，生物量显著增加(图5)。
【实施例2】
小球藻的基础培养基是上述TAP液体培养基，培养条件：初始pH＝6.0，温度为25℃，光照强度为100μmol/m2/s，连续光照，100rpm摇床振荡培养，培养液中苯酚浓度为450mg/L。
初代将小球藻以初始接种密度为0.8g/L接种于含苯酚浓度为450mg/L的100mL的TAP培养基中(250mL的三角摇瓶)，培养2天后测量其干重及液体培养基中剩余的苯酚浓度。
接着，取培养2天后初代的小球藻稀释继续以初始接种密度0.8g/L接种于含苯酚浓度为450mg/L的100mL的TAP液体培养基中(培养基为重新配制)培养2天后测定其干重及培液体培养基中剩余的苯酚浓度。重复上述过程，进行40个周期的循环培养，后面的几个周期测定的小球藻的干重及剩余的苯酚浓度几乎不变，说明小球藻的生长速率(生物量)和对苯酚的降解率趋于稳定，至此，适应性进化周期培养结束。
【实施例3】
小球藻的基础培养基是上述TAP液体培养基，培养条件：初始pH＝7.0，温度为35℃，光照强度为200μmol/m2/s，连续光照，200rpm摇床振荡培养，培养液中苯酚浓度为700mg/L。
初代将小球藻以初始接种密度为1.0g/L接种于含苯酚浓度为700mg/L的100mL的TAP培养基中(250mL的三角摇瓶)，培养5天后测量其干重及液体培养基中剩余的苯酚浓度。
接着，取培养5天后初代的小球藻稀释继续以初始接种密度1.0g/L接种于含苯酚浓度为700mg/L的100mL的TAP液体培养基中(培养基为重新配制)培养5天后测定其干重及培液体培养基中剩余的苯酚浓度。重复上述过程，进行50个周期的循环培养，后面的几个周期测定的小球藻的干重及剩余的苯酚浓度几乎不变，说明小球藻的生长速率(生物量)和对苯酚的降解率趋于稳定，至此，适应性进化周期培养结束。
【实施例4】
小球藻的基础培养基是上述TAP液体培养基，培养条件：初始pH＝7.0，温度为30℃，光照强度为150μmol/m2/s，连续光照，175rpm摇床振荡培养，培养液中苯酚浓度为300mg/L。
初代将小球藻以初始接种密度为0.1g/L接种于含苯酚浓度为300mg/L的100mL的TAP培养基中(250mL的三角摇瓶)，培养4天后测量其干重及液体培养基中剩余的苯酚浓度。
接着，取培养4天后初代的小球藻稀释继续以初始接种密度0.1g/L接种于含苯酚浓度为300mg/L的100mL的TAP液体培养基中(培养基为重新配制)培养4天后测定其干重及培液体培养基中剩余的苯酚浓度。重复上述过程，进行35个周期的循环培养，后面的几个周期测定的小球藻的干重及剩余的苯酚浓度几乎不变，说明小球藻的生长速率(生物量)和对苯酚的降解率趋于稳定，至此，适应性进化周期培养结束。
【实施例5】
小球藻的基础培养基是上述TAP液体培养基，培养条件：初始pH＝8.0，温度为28℃，光照强度为50μmol/m2/s，连续光照，50rpm摇床振荡培养，培养液中苯酚浓度为600mg/L。
初代将小球藻以初始接种密度为0.3g/L接种于含苯酚浓度为600mg/L的100mL的TAP培养基中(250mL的三角摇瓶)，培养3.5天后测量其干重及液体培养基中剩余的苯酚浓度。
接着，取培养3.5天后初代的小球藻稀释继续以初始接种密度0.3g/L接种于含苯酚浓度为600mg/L的100mL的TAP液体培养基中(培养基为重新配制)培养3.5天后测定其干重及培液体培养基中剩余的苯酚浓度。重复上述过程，进行38个周期的循环培养，后面的几个周期测定的小球藻的干重及剩余的苯酚浓度几乎不变，说明小球藻的生长速率(生物量)和对苯酚的降解率趋于稳定，至此，适应性进化周期培养结束。
综上所述，本发明提供一种提高小球藻对苯酚的耐受性和降解率的方法，包括：首先选择对数生长期的小球藻，在一定温度和光照条件下，以一定初始密度摇床培养于含有苯酚的培养基中，培养设定的时间作为一个适应性进化周期；然后将经过一个周期进化的小球藻稀释，取与上述步骤相同的初始密度、在相同的条件下摇床培养于另一培养基中，培养相同时间；再重复上述培养过程，直至小球藻的生长速率和对苯酚的降解率趋于稳定。本发明以一定密度接种微藻细胞，选择对小球藻有抑制作用的苯酚浓度作为环境压力，通过多个周期的适应进化，获得既能耐受苯酚又能降解苯酚的藻株。
所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (7)
1.一种提高小球藻对苯酚耐受性和降解率的方法，其特征在于，所述方法至少包括：
1)选择对数生长期的小球藻，在一定温度和光照条件下，以一定初始密度摇床培养于含有苯酚的培养基中，培养设定的时间作为一个适应性进化周期；
2)将步骤1)中经过一个周期进化的小球藻稀释，取与步骤1)相同的初始密度、在相同的条件下摇床培养于具有相同苯酚浓度的另一培养基中，培养相同时间；
3)重复上述培养过程，直至小球藻的生长速率和对苯酚的降解率趋于稳定；
其中，所述小球藻在每一个适应性进化周期中的初始密度为0.1～1.0g/L，所述培养基均采用TAP液体培养基，含苯酚浓度为300～700mg/L，初始pH值为6.0～8.0。
2.根据权利要求1所述的提高小球藻对苯酚耐受性和降解率的方法，其特征在于：所述小球藻的培养条件为：温度为25～35℃，光照强度为50～200μmol/m2/s，摇床培养的振荡频率为50～200rpm。
3.根据权利要求1所述的提高小球藻对苯酚耐受性和降解率的方法，其特征在于：所述小球藻一个适应性进化周期的时间为2～5天，培养周期为20～50个。
4.根据权利要求1所述的提高小球藻对苯酚耐受性和降解率的方法，其特征在于：每一个适应性进化周期培养完，测量所述小球藻的干重和所述培养基中剩余的苯酚浓度。
5.根据权利要求4所述的提高小球藻对苯酚耐受性和降解率的方法，其特征在于：测量所述小球藻干重的方法为：
首先，将微孔滤膜烘干，称量所述微孔滤膜的干重为W1；
然后，取小球藻液于干燥后的所述微孔滤膜上抽滤；
接着，将抽滤后的微孔滤膜烘干，称量所述微孔滤膜的干重为W2；
最后，计算单位体积的小球藻液的干重为(W 2-W 1)/V，其中V为小球藻液的体积。
6.根据权利要求1所述的提高小球藻对苯酚耐受性和降解率的方法，其特征在于：采用国标HJ503-2009测量所述培养基中剩余的苯酚浓度。
7.根据权利要求1所述的提高小球藻对苯酚耐受性和降解率的方法，其特征在于：经过多个适应性进化周期培养，对获得的小球藻与未进化生长的小球藻进行苯酚耐受性和降解率的对比评价分析。
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