CN114292775A - 一株甲苯降解菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，提供了一株甲苯降解菌株及其应用。该菌株可用于石化农化等工业含甲苯废水的处理中，所述菌株经过16SrDNA鉴定为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)，该菌株已于2021年6月保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌株代码为YJY21‑01，保藏号为CGMCC No.22756。本发明的菌株对甲苯具有较好的降解特性，且不会对环境造成二次污染，提高了甲苯废水的处理效率，可将其应用于甲苯污染废水及土壤或含甲苯有机废气的修复领域。

Description

一株甲苯降解菌株及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，提供了一株甲苯降解菌株及其应用。

背景技术

甲苯属于苯系物的一种，是一种疏水性的有机污染物，主要来源于石油、化工、油漆、农药、医药等生产过程中，人在短时间内吸入较高浓度的甲苯会急性中毒，产生晕眩、反胃、气短、手脚无力等症状，严重者会导致痉挛甚至休克。长期接触甲苯则会造成慢性中毒，引发神经衰弱综合征，还会出现肝肿大、皮肤皴裂等现象。甲苯对人体有很强的毒性和致畸性，同时也会危害环境、污染空气和水源。自20世纪70年代以来，美国、欧盟、世界卫生组织、日本与中国先后将甲苯列入了水体中“优先控制污染物”名单，作为优先研究和处理的对象。

随着工业的发展和人口的增长，甲苯的污染也越来越严重，甲苯化学结构中的苯环有着很强的疏水性和稳定性，导致其不易降解，稳定存在于土壤、水体和空气中，具极强的生物毒性。处理甲苯污染的方法很多，主要包括物理方法、化学方法及生物方法，在甲苯的前期修复中，主要集中于通过氧化、水解、生物吸附等物理化学反应来清除甲苯所造成的污染，随着国家对环保领域的重视度提升，生物降解法作为一种安全环保的修复方法在甲苯修复领域的重要性日渐凸显，通过对甲苯降解途径的研究发现微生物的降解既是清除甲苯最有效的方法也是甲苯降解的最终途径，微生物可直接将甲苯作为碳源或能源来直接利用，由于其降解效果显著、成本低廉、技术简单且不会造成二次污染，因此被广泛使用。

微生物降解作为解决甲苯污染的重要途径与最终手段，筛选高效甲苯降解菌株是生物降解方法的关键，通过文献及专利的搜索，有关甲苯高效降解菌株的研究不多，且多集中于含低浓度甲苯有机废气的降解研究，有关甲苯污染废水的微生物修复报道不多。

现有技术CN103013885A中公开了四株菌株复合的固定化苯系物复合菌剂，虽然提及了其对苯系物具有一定的降解性能，但其降解甲苯能力不是很清楚，整体苯系物降解能力也仍有待提高。

发明内容

本发明针对现有技术问题，提供了一株甲苯降解菌株及其应用。本发明所述菌株是经过采集并进行筛选分离纯化后获得，其甲苯降解效率高、易于培养且具有稳定的传代特性，编号YJY21-01。该菌株经过16SrDNA鉴定为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)，该菌株已于2021年6月保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌株代码为YJY21-01，保藏号为CGMCC No.22756。可用于石化及农化等工业含甲苯废水的处理中，对甲苯具有较好的降解特性，且不会对环境造成二次污染，提高了甲苯废水的处理效率，可将其应用于甲苯污染废水及土壤或含甲苯有机废气的修复领域。

本发明所述菌株YJY21-01形态特征：革兰氏阴性小杆菌，菌体呈杆状，有荚膜，无芽孢；该菌株在普通营养琼脂上形成近圆形中等的乳白色菌落，边缘不整齐，菌落扁平，在LB液体培养基中生长时，瓶底会出现黄色不溶物。

所述菌株YJY21-01，其16SrDNA核苷酸全序列如Seq ID No:1所示，该16SrDNA序列进行BLAST比对，结果显示，该菌株的16SrDNA的核苷酸序列与假单胞菌属(Pseudomonsadaceae)不同菌株的核苷酸序列有大于99％的同源性，与其中明确标记为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)的菌株有100％的同源性。

获得上述菌株所述菌株YJY21-01后，发明人还提供了对应的菌剂生产方法，包括如下步骤：

(1)菌种活化：将保存菌种取出，于室温条件下活化3h-4h，由于菌种保藏与试管斜面营养琼脂培养基上，活化过程无需额外补加营养。

(2)种子液制备：在灭菌的无菌台中，取10ml灭菌的蒸馏水加入保菌的试管中，反复吹打制成菌悬液，然后将菌悬液接入100ml无菌的常规LB液体培养基中，震荡培养16-20h制备种子液；

(3)发酵：发酵罐中加入发酵培养基，灭菌后，按体积比2‰接种种子液，发酵过程中控制温度35℃，罐压0.05MPa，起始转速200rpm，溶氧≧20％，气液比1：1；待溶氧降为20％，pH上升至8.8即为发酵完成。

灭菌方式优选121℃灭菌0.5小时；

发酵培养基配方为：葡萄糖1.2％-1.8％、玉米浆干粉0.85％-1％、豆粕3％-4％、硫酸铵0.01％-0.02％、硫酸镁0.03％-0.05％、氯化钠0.01％-0.03％、硫酸亚铁0.002-0.005％、氯化钙0.01％-0.02％，聚醚消泡剂0.1％，余量为水。

应用时，将上述发酵获得的菌剂直接加入好氧池即可，添加上述菌剂后，好氧池中初始有效活菌菌量为10⁵-10⁶cfu/ml。

本发明所述菌株YJY21-01的应用条件为：温度31-37℃，优选34℃；pH6-8，优选pH7；溶氧量2-4mg/L，优选4mg/L。

可见本发明所提供的菌株对于甲苯有非常显著的降解效果。

综上所述，利用本发明提供的菌株制备的菌剂应用于工业含甲苯废水的生物法处理，本发明的菌株对甲苯具非常好的降解特性，甲苯耐受浓度可达1400mg/L以上，利用本发明菌株及方法，显著提高了甲苯废水的处理效率。能够显著缓解甲苯对污水处理系统的冲击作用。

保藏信息

保藏时间：2021年6月23日

保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏编号：CGMCC No.22756

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

分类命名:施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)

附图说明

图1为菌株降解甲苯pH优化实验结果；

图2为菌株降解甲苯温度优化实验结果；

图3为菌株应用效果趋势图。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围，除特殊说明外，下述实施例中均采用常规现有技术完成。

实施例1菌株的获得

从山东京博石油化工有限公司厂区焦化装置周围及山东清远环保工程有限公司所取的样品中分离出5株对甲苯有降解效果的菌株，并分别进行分离纯化。

对5株待选菌株分别进行后续的甲苯降解实验的研究，最终筛选出一株甲苯降解效率高、易于培养且有稳定的传代特性的菌株，将其命名为YJY21-01。

该菌株形态特征革兰氏阴性小杆菌，菌体呈杆状，有荚膜，无芽孢；该菌株在普通营养琼脂上形成近圆形中等的乳白色菌落，边缘不整齐，菌落扁平，在LB液体培养基中生长时，瓶底会出现黄色不溶物。

发明人对其进行了16SrDNA测序，其核苷酸序列如Seq ID No:1所示，该序列为菌株的16SrDNA的全序列；所测得的16SrDNA序列进行BLAST比对，比对结果显示，该菌株的16SrDNA的核苷酸序列与假单胞菌属(Pseudomons adaceae)不同菌株的核苷酸序列有大于99％的同源性，与其中明确标记为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)的菌株有100％的同源性。

因此发明人将其菌株代码命名为YJY21-01；并对其进行了生物保藏，其生物保藏编号为CGMCC No.22756。

实施例2菌株的发酵

(1)菌种活化：将保存在4℃冰箱中的菌种取出，于室温条件下活化3h-4h，由于菌种保藏与试管斜面营养琼脂培养基上，活化过程无需额外补加营养。

(2)液体种子制备：在灭菌的无菌台中，取10ml灭菌的蒸馏水加入保菌的试管中，反复吹打制成菌悬液，然后将菌悬液接入100ml无菌的常规LB液体培养基中，震荡培养16-20h制备种子液；

(3)发酵：发酵罐中加入发酵培养基，灭菌后，按体积比2‰接种种子液，发酵过程中控制温度35℃，罐压0.05MPa，起始转速200rpm，溶氧≧20％，气液比1：1；待溶氧降为20％，pH上升至8.8即为发酵完成；

其中，灭菌方式121℃灭菌0.5小时；

发酵培养基配方为：葡萄糖1.2％-1.8％、玉米浆干粉0.85％-1％、豆粕3％-4％、硫酸铵0.01％-0.02％、硫酸镁0.03％-0.05％、氯化钠0.01％-0.03％、硫酸亚铁0.002-0.005％、氯化钙0.01％-0.02％，聚醚消泡剂0.1％，余量为水。

实施例3菌株降解甲苯条件

采用实施例2发酵的菌液进行以下实验：

①pH筛选实验

配置50ml含有500mg/L甲苯的无机盐培养基，菌液接种率为5％，培养基pH分别设定为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，30℃、140rpm震荡培养24h进行剩余甲苯的测定，同时设空白对照。

结果如图1所示，pH为7.0时菌株对甲苯的降解效果最佳，24h降解率达93.59％。

②温度筛选实验

配置50ml含有500mg/L甲苯的无机盐培养基，培养基pH调为7.0，菌液接种率为5％，分别设定温度为25℃、28℃、31℃、34℃、37℃，140rpm震荡培养24h进行剩余甲苯的测定，同时设空白对照。

结果如图2所示，温度为34℃时菌株对甲苯的降解效果最佳，24h降解率达96.22％。

降解条件优化试验中所用无机盐培养基配方：磷酸氢二钠0.15-0.25％，磷酸二氢钾0.15-0.25％，硫酸铵0.5-1.5％，七水硫酸镁0.02-0.05％，七水硫酸亚铁0.002-0.005％，氯化钙0.001-0.003％，五水硫酸铜0.005mg/L，吐温-80 0.2％，水余量，PH7.0，高压灭菌后分别加入500mg/L甲苯。

实施例4菌株效果验证

将保存的菌株在超净工作台中接入无菌的LB液体培养基中，35℃、180rpm震荡培养16-20h，培养好的菌液以体积比为5％的接种量接入含有甲苯500mg/L的液态培养基内，为减少甲苯挥发，在液态培养基中另加体积比为0.2％的吐温-80，同时用保鲜膜封口，将摇瓶放于30℃、140r/min条件的恒温摇床中生长24h，取样检摇瓶内剩余甲苯的质量浓度，计算得出菌株对甲苯的降解率。

结果如表1所示，菌株YJY21-01对含500mg/L甲苯的溶液24h降解率达92.13％.

表1菌株对甲苯降解效果验证

实施例5菌株应用于石化含甲苯废水的处理

某石化废水处理装置受到含甲苯的焦化废水冲击，菌株发酵后的菌液(同实施例2)按照体积比万分之一的比例加入东好氧池O₁池中进行甲苯降解效果验证，同时以不加菌剂的西好氧池O₁为对照，东好氧池O₁中甲苯降解菌的初始菌量为10⁵cfu/ml，好氧池温度30℃，溶解氧4mg/L，pH7.55，水力停留时间12h，每天跟踪检测体系中甲苯含量。

两池中甲苯初始浓度均调节为1425.22mg/L，处理结果如图3所示，东好氧池O₁中甲苯含量呈直线下降趋势，第3天时甲苯含量为1.06mg/L，降解率达99.92％。而对照池中甲苯含量也呈下降趋势，但下降速度较慢，第3天时池中甲苯含量仍为1268.55mg/L。可见本发明所提供的菌株对于甲苯有明显的降解效果。

实施例6菌株应用于农化含甲苯废水的处理

某农化车间废水中含有约600mg/L的甲苯，进入废水处理系统后造成系统处理性能的下降，将发酵后的菌株(同实施例2)按照万分之一的比例加入农化好氧池中，初始有效菌量为10⁵cfu/ml，温度30℃，pH7.51，溶解氧4mg/L，水力停留时间15h，每天跟踪检测体系中剩余甲苯含量，结果表明，系统中甲苯含量从初始的632.54mg/L经48h降解为0.52mg/L，系统出水指标恢复稳定，菌株极大缓解了甲苯对污水处理系统的冲击作用。

对比例

将本发明菌株与CN103013885A中复配菌剂同条件降解对比试验：

按照CN103013885A实施例1部分([0025]-[0026]段)，取0.1g甲苯降解菌剂加入含有200mg/L甲苯的筛选培养基(同CN103013885A实施例1)中，在30℃、115rpm摇床里培养，每隔6h进行甲苯浓度的检测。

表2菌株降解性能对比试验

结果由表2可知，6h时菌株对甲苯的降解率达31.89％，12h时降解率达100％，在同等条件下，本申请的菌株对甲苯的降解效果远高于CN103013885A中复合菌剂对BTEX的降解效果。

序列表

<110> 黄河三角洲京博化工研究院有限公司

<120> 一株甲苯降解菌株及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1405

<212> DNA

<213> 施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)

<400> 1

ggtaccgtcc tcccgaaggt tagactagct acttctggtg caacccactc ccatggtgta 60

acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgcg acattctgat tcgcgattac 120

tagcgattcc gacttcacgc agtcgagttg cagactgcga tccggactac gatcggtttt 180

gtgggattag ctccacctcg cggcttggca accctctgta ccgaccattg tagcacgtgt 240

gtagcccagg ccgtaagggc catgatgact tgacgtcatc cccaccttcc tccggtttgt 300

caccggcagt ctccttagag tgcccaccat gacgtgctgg taactaagga caagggttgc 360

gctcgttacg ggacttaacc caacatctca cgacacgagc tgacgacagc catgcagcac 420

ctgtctcaat gttcccgaag gcaccaatcc atctctggaa agttcattgg atgtcaaggc 480

ctggtaaggt tcttcgcgtt gcttcgaatt aaaccacatg ctccaccgct tgtgcgggcc 540

cccgtcaatt catttgagtt ttaaccttgc ggccgtactc cccaggcggt caacttaatg 600

cgttagctgc gccactaaga gctcaaggct cccaacggct agttgacatc gtttacggcg 660

tggactacca gggtatctaa tcctgtttgc tccccacgct ttcgcacctc agtgtcagta 720

tcagtccagg tggtcgcctt cgccactggt gttccttcct atatctacgc atttcaccgc 780

tacacaggaa attccaccac cctctaccat actctagctc gacagttttg aatgcagttc 840

ccaggttgag cccggggatt tcacatccaa cttaacgaac cacctacgcg cgctttacgc 900

ccagtaattc cgattaacgc ttgcaccctc tgtattaccg cggctgctgg cacagagtta 960

gccggtgctt attctgtcgg taacgtcaaa acactaacgt attaggttaa tgcccttcct 1020

cccaacttaa agtgctttac aatccgaaga ccttcttcac acacgcggca tggctggatc 1080

aggctttcgc ccattgtcca atattcccca ctgctgcctc ccgtaggagt ctggaccgtg 1140

tctcagttcc agtgtgactg atcatcctct cagaccagtt acggatcgtc gccttggtga 1200

gccattacct caccaactag ctaatccgac ctaggctcat ctgatagcgc aaggcccgaa 1260

ggtcccctgc tttctcccgt aggacgtatg cggtattagc gtccgtttcc gagcgttatc 1320

ccccactacc aggcagattc ctaggcttta ctcacccgtc cgccgctctc aagaggtgca 1380

agcacctctc taccgctcga ctgca 1405

Claims (7)

1.一株甲苯降解菌株，其特征在于，该菌株为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)，该菌株已于2021年6月保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.22756。

2.权利要求1所述菌株在甲苯降解方面的应用。

3.一种甲苯降解方法，其特征在于，将权利要求1所述的甲苯降解菌株加入好氧池。

4.根据权利要求3所述的一种甲苯降解方法，其特征在于，添加甲苯降解菌株后，好氧池中初始有效活菌菌量为10⁵-10⁶cfu/ml。

5.根据权利要求3所述的一种甲苯降解方法，其特征在于，好氧池处理条件包括：温度31-37℃；pH6-8；溶氧量2-4mg/L。

6.根据权利要求3或5所述的一种甲苯降解方法，其特征在于，好氧池处理条件包括：温度34℃；pH7；溶氧量4mg/L。

7.根据权利要求3所述的一种甲苯降解方法，其特征在于，甲苯降解菌株制备成菌剂后加入好氧池，菌剂生产方法，包括如下步骤：

(1)菌种活化：将保存菌种取出，于室温条件下活化3h-4h；

(2)种子液制备：在灭菌的无菌台中，取10ml灭菌的蒸馏水加入保菌的试管中，反复吹打制成菌悬液，然后将菌悬液接入100ml无菌的常规LB液体培养基中，震荡培养16-20h制备种子液；

(3)发酵：发酵罐中加入发酵培养基，灭菌后，按体积比2‰接种种子液，发酵过程中控制温度35℃，罐压0.05MPa，起始转速200rpm，溶氧≧20％，气液比1：1；待溶氧降为20％，pH上升至8.8即为发酵完成；

发酵培养基配方为：葡萄糖1.2％-1.8％、玉米浆干粉0.85％-1％、豆粕3％-4％、硫酸铵0.01％-0.02％、硫酸镁0.03％-0.05％、氯化钠0.01％-0.03％、硫酸亚铁0.002-0.005％、氯化钙0.01％-0.02％，聚醚消泡剂0.1％，余量为水。

Images