CN115181705A - 一种提高霉菌物脱氢转化率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种提高霉菌物脱氢转化率的方法。本发明的提高霉菌物脱氢转化率的方法，包括如下步骤：S1：将简单节杆菌依次接种至梯度霉菌物浓度的培养基中进行驯化，得到驯化简单节杆菌；S2：采用驯化简单节杆菌对霉菌物进行脱氢，得到霉菌脱氢物。本发明的方法通过梯度霉菌物浓度对简单节杆菌进行驯化，从而增强了简单节杆菌对霉菌物毒性的抗性，提高了霉菌物脱氢转化率；上述方法操作简单、驯化时间短，驯化简单节杆菌的稳定性好，霉菌物转化率高，特别适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及一种提高霉菌物脱氢转化率的方法。
背景技术
糖皮质激素是机体内极为重要的一类调节分子，对机体的发育、生长、代谢以及免疫功能等起着重要的调节作用，是机体应激反应最重要的调节激素，也是临床上使用最为广泛而有效的抗炎和免疫抑制剂。目前，临床常见的糖皮质激素类药物包括泼尼松、甲泼尼松、倍他米松、丙酸倍氯米松、泼尼松龙、氢化可的松、地塞米松等，该类药物具有抗炎、抗毒、抗过敏、抗休克、非特异性抑制免疫及退热作用等多种作用，可以防止和阻止免疫性炎症反应和病理性免疫反应的发生。
霉菌脱氢物是糖皮质激素的重要中间体，主要合成方法包括化学合成法和微生物合成法。化学合成法普遍存在工艺复杂、合成路线长、收率低等问题；相对于化学合成法，微生物合成法具有反应条件温和、污染小、转化率相对较高等优势,从而有利于环境保护并降低生产成本。然而，在微生物合成法中，如何保持甚至提高菌种的脱氢转化特性，一直是业内的一个技术难点。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高霉菌物脱氢转化率的方法，其能够增强简单节杆菌对霉菌物毒性的抗性，并且稳定地提高霉菌物脱氢转化率。
本发明提供一种提高霉菌物脱氢转化率的方法，包括如下步骤：
S1：将简单节杆菌依次接种至梯度霉菌物浓度的培养基中进行驯化，得到驯化简单节杆菌；
S2：采用驯化简单节杆菌对霉菌物进行脱氢，得到霉菌脱氢物。
本发明的方法利用霉菌物浓度递增的一系列培养基对简单节杆菌进行诱导培养，有效克服了现有简单节杆菌在传代过程中霉菌物脱氢等优良特性丢失等问题，同时提高了该菌种对霉菌物的抗毒性，特别是显著且稳定地提高了霉菌物脱氢转化率。
在本发明中，梯度霉菌物浓度的培养基指的是含有不同霉菌物浓度的一系列培养基，霉菌物浓度为霉菌物的质量浓度；可以理解，驯化时是将简单节杆菌从最低霉菌物浓度的培养基中逐级接种至上一级高霉菌物浓度的培养基中。
本发明的方法对梯度霉菌物浓度的范围不作严格限制，只要简单节杆菌能够在各梯度霉菌物浓度的培养基中生长即可；具体地，梯度霉菌物浓度中的最低霉菌物浓度可以为0.01-0.05％，最高霉菌物浓度可以为8-10％。此外，梯度霉菌物浓度可以包括3个以上霉菌物浓度，例如可以包括3-5个霉菌物浓度。
在一实施方式中，梯度霉菌物浓度包括五个霉菌物浓度，五个霉菌物浓度依次为：0.01％≤霉菌物浓度<0.05％，0.05％≤霉菌物浓度<0.25％，0.25％≤霉菌物浓度<0.5％，0.5％≤霉菌物浓度<1.0％和1.0％≤霉菌物浓度≤2.0％。
在另一实施方式中，梯度霉菌物浓度包括五个霉菌物浓度，五个霉菌物浓度依次为：0.05％≤霉菌物浓度<0.25％，0.25％≤霉菌物浓度<1.25％，1.25％≤霉菌物浓度<2.5％，2.5％≤霉菌物浓度<5.0％和5.0％≤霉菌物浓度≤7.0％。
在再一实施方式中，梯度霉菌物浓度包括五个霉菌物浓度，五个霉菌物浓度依次为：0.5％≤霉菌物浓度<2.5％，2.5％≤霉菌物浓度<5.0％，5.0％≤霉菌物浓度<7.0％，7.0％≤霉菌物浓度<9.0％和9.0％≤霉菌物浓度≤10.0％。
本发明对驯化方法不作严格限制；具体地，驯化方法可以包括：将简单节杆菌依次接种至梯度霉菌物浓度的固体培养基中进行固体培养；其中，固体培养基除霉菌物之外还可以包括：蛋白胨6-9g/L，玉米浆10-15g/L，葡萄糖6.0-9.0g/L，磷酸氢二钾0.1-0.2g/L，琼脂10.0-20.0g/L；固体培养基的pH值为7.0-7.4。
进一步地，在固体培养之后还可以包括：从固体培养物中挑取菌株接种至液体培养基中进行液体发酵培养，将液体发酵培养物接种于下一霉菌物浓度的固体培养基中进行固体培养；其中，液体培养基可以包括：蛋白胨8-12g/L，玉米浆1.5-3.0g/L，葡萄糖1.5-4.0g/L，磷酸氢二钾2-5g/L；液体培养基的pH值为7.0-7.4。
此外，液体发酵培养的条件可以包括：发酵温度为30-37℃，发酵时间为24-72h，转速为180-220r/min。
在本发明中，采用驯化简单节杆菌对霉菌物进行脱氢时，霉菌物的浓度可以为5-10％。
本发明的实施，至少具有以下优势：
1、本发明的方法通过梯度霉菌物浓度对简单节杆菌进行驯化，增强了简单节杆菌对霉菌物毒性的抗性，提高了霉菌物脱氢转化率；
2、本发明的方法操作简单、驯化时间短，驯化简单节杆菌的稳定性好，霉菌物转化率高，转化时间短，特别适合工业化生产；
3、本发明的方法能够使简单节杆菌在高浓度霉菌物条件下生长并进行霉菌物脱氢转化，大大提高了生产效率。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1、制备培养基
称取蛋白胨6g、玉米浆10g、葡萄糖6g、磷酸氢二钾0.1g、琼脂10g，按照设置的梯度霉菌物浓度0.01％、0.05％、0.25％、0.5％、1.0％分别加入霉菌物，用饮用水定容至1000mL，调节pH值为7.0左右，即制得梯度霉菌物浓度的固体培养基。
称取蛋白胨8g、玉米浆1.5g、葡萄糖1.5g、磷酸二氢钾2g，用饮用水定容至1000mL，调节pH值为7.0左右，即制得液体培养基。
2、制备种子液
取简单节杆菌斜面菌种(即原始简单节杆菌)，接种于1000mL的液体培养基中进行活化培养；活化培养时，控制培养温度为34℃，转速为180r/min，培养时间为48h，得到简单节杆菌种子液。
3、驯化诱导培养
蘸取上述活化培养得到的种子液，划线于霉菌物含量为0.01％的固体培养基上，于恒温培养箱中30℃固体培养72h。随后，挑取固体培养获得的代表性菌落，接种于1000mL的液体培养基中进行液体发酵培养，发酵培养温度为34℃，转速为180r/min，发酵培养时间为48h，得到简单节杆菌发酵液A。
取上述简单节杆菌发酵液A，划线于霉菌物含量为0.05％的固体培养基上，于恒温培养箱中30℃固体培养72h。随后，挑取固体培养获得的代表性菌落，接种于1000mL的液体培养基中进行液体发酵培养，发酵培养温度为34℃，转速为180r/min，发酵培养时间为48h，得到简单节杆菌发酵液B。
取上述简单节杆菌发酵液B，划线于霉菌物含量为0.25％的固体培养基上，于恒温培养箱中30℃固体培养72h。随后，挑取固体培养获得的代表性菌落，接种于1000mL的液体培养基中进行液体发酵培养，发酵培养温度为34℃，转速为180r/min，发酵培养时间为48h，得到简单节杆菌发酵液C。
取上述简单节杆菌发酵液C，划线于霉菌物含量为0.5％的固体培养基上，于恒温培养箱中30℃固体培养72h。随后，挑取固体培养获得的代表性菌落，接种于1000mL的液体培养基中进行液体发酵培养，发酵培养温度为34℃，转速为180r/min，发酵培养时间为48h，得到简单节杆菌发酵液D。
取上述简单节杆菌发酵液D，划线于霉菌物含量为1.0％的固体培养基上，于恒温培养箱中30℃固体培养72h。随后，挑取固体培养获得的代表性菌落，接种于1000mL的液体培养基进行摇床发酵培养，发酵培养温度为34℃，转速为180r/min，发酵培养时间为24h，得到驯化菌株；随后，向发酵培养体系中投入不同量的霉菌物(投入量见表1)，继续摇床发酵转化，转化温度为37℃，转速为180r/min，转化时间为48h，霉菌物脱氢转化率结果见表1。
4、传代培养
将上述获得的驯化菌株传代培养30代后接种于1000mL霉菌物含量为1.0％的液体培养基进行摇床发酵培养，发酵培养温度为34℃，转速为180r/min，发酵培养时间为24h，得到驯化菌株；随后，向发酵培养体系中投入霉菌物100g，继续摇床发酵转化，转化温度为37℃，转速为180r/min，转化时间为48h，霉菌物脱氢转化率结果见表2。
实施例2
1、制备培养基
称取蛋白胨7.5g、玉米浆12.5g、葡萄糖7.5g、磷酸氢二钾0.15g、琼脂15g，按照设置的梯度霉菌物浓度0.05％、1.25％、2.5％、5.0％、7.0％分别加入霉菌物，用饮用水定容至1000mL，调节pH值为7.2左右，即制得梯度霉菌物浓度的固体培养基。
称取蛋白胨10g、玉米浆2.5g、葡萄糖1.5g、磷酸二氢钾3g，用饮用水定容至1000mL，调节pH值为7.2左右，即制得液体培养基。
2、制备种子液
取简单节杆菌斜面菌种，接种于1000mL的液体培养基中进行活化培养；活化培养时，控制培养温度为34℃，转速为180r/min，培养时间为48h，得到简单节杆菌种子液。
3、驯化诱导培养
蘸取上述活化培养得到的种子液，划线于霉菌物含量为0.05％的固体培养基上，于恒温培养箱中30℃固体培养72h。随后，挑取固体培养获得的代表性菌落，接种于1000mL的液体培养基中进行液体发酵培养，发酵培养温度为34℃，转速为180r/min，发酵培养时间为48h，得到简单节杆菌发酵液A。
取上述简单节杆菌发酵液A，划线于霉菌物含量为1.25％的固体培养基上，于恒温培养箱中30℃固体培养72h。随后，挑取固体培养获得的代表性菌落，接种于1000mL的液体培养基中进行液体发酵培养，发酵培养温度为34℃，转速为180r/min，发酵培养时间为48h，得到简单节杆菌发酵液B。
取上述简单节杆菌发酵液B，划线于霉菌物含量为2.5％的固体培养基上，于恒温培养箱中30℃固体培养72h。随后，挑取固体培养获得的代表性菌落，接种于1000mL的液体培养基中进行液体发酵培养，发酵培养温度为34℃，转速为180r/min，发酵培养时间为48h，得到简单节杆菌发酵液C。
取上述简单节杆菌发酵液C，划线于霉菌物含量为5.0％的固体培养基上，于恒温培养箱中30℃固体培养72h。随后，挑取固体培养获得的代表性菌落，接种于1000mL的液体培养基中进行液体发酵培养，发酵培养温度为34℃，转速为180r/min，发酵培养时间为48h，得到简单节杆菌发酵液D。
取上述简单节杆菌发酵液D，划线于霉菌物含量为7.0％的固体培养基上，于恒温培养箱中30℃固体培养72h。随后，挑取固体培养获得的代表性菌落，接种于1000mL的液体培养基进行摇床发酵培养，发酵培养温度为34℃，转速为180r/min，发酵培养时间为24h，得到驯化菌株；随后，向发酵培养体系中投入不同量的霉菌物，继续摇床发酵转化，转化温度为37℃，转速为180r/min，转化时间为48h，霉菌物脱氢转化率结果见表1。
4、传代培养
将上述获得的驯化菌株传代培养30代后接种于1000mL的液体培养基进行摇床发酵培养，发酵培养温度为34℃，转速为180r/min，发酵培养时间为24h，得到驯化菌株；随后，向发酵培养体系中投入霉菌物100g，继续摇床发酵转化，转化温度为37℃，转速为180r/min，转化时间为48h，霉菌物脱氢转化率结果见表2。
实施例3
1、制备培养基
称取蛋白胨9g、玉米浆15g、葡萄糖9g、磷酸氢二钾0.2g、琼脂15g，按照设置的梯度霉菌物浓度0.5％、2.5％、5.0％、8.0％、10.0％分别加入霉菌物，用饮用水定容至1000mL，调节pH值为7.4左右，即制得梯度霉菌物浓度的固体培养基。
称取蛋白胨12g、玉米浆3g、葡萄糖4g、磷酸二氢钾5g，用饮用水定容至1000mL，调节pH值为7.4左右，即制得液体培养基。
2、制备种子液
取简单节杆菌斜面菌种，接种于1000mL的液体培养基中进行活化培养；活化培养时，控制培养温度为34℃，转速为180r/min，培养时间为48h，得到简单节杆菌种子液。
3、驯化诱导培养
蘸取上述活化培养得到的种子液，划线于霉菌物含量为0.5％的固体培养基上，于恒温培养箱中30℃固体培养72h。随后，挑取固体培养获得的代表性菌落，接种于1000mL的液体培养基中进行液体发酵培养，发酵培养温度为34℃，转速为180r/min，发酵培养时间为48h，得到简单节杆菌发酵液A。
取上述简单节杆菌发酵液A，划线于霉菌物含量为2.5％的固体培养基上，于恒温培养箱中30℃固体培养72h。随后，挑取固体培养获得的代表性菌落，接种于1000mL的液体培养基中进行液体发酵培养，发酵培养温度为34℃，转速为180r/min，发酵培养时间为48h，得到简单节杆菌发酵液B。
取上述简单节杆菌发酵液B，划线于霉菌物含量为5.0％的固体培养基上，于恒温培养箱中30℃固体培养72h。随后，挑取固体培养获得的代表性菌落，接种于1000mL的液体培养基中进行液体发酵培养，发酵培养温度为34℃，转速为180r/min，发酵培养时间为48h，得到简单节杆菌发酵液C。
取上述简单节杆菌发酵液C，划线于霉菌物含量为8.0％的固体培养基上，于恒温培养箱中30℃固体培养72h。随后，挑取固体培养获得的代表性菌落，接种于1000mL的液体培养基中进行液体发酵培养，发酵培养温度为34℃，转速为180r/min，发酵培养时间为48h，得到简单节杆菌发酵液D。
取上述简单节杆菌发酵液D，划线于霉菌物含量为10.0％的固体培养基上，于恒温培养箱中30℃固体培养72h。随后，挑取固体培养获得的代表性菌落，接种于1000mL的液体培养基进行摇床发酵培养，发酵培养温度为34℃，转速为180r/min，发酵培养时间为24h，得到驯化菌株；随后，向发酵培养体系中投入不同量的霉菌物，继续摇床发酵转化，转化温度为37℃，转速为180r/min，转化时间为48h，霉菌物脱氢转化率结果见表1。
4、传代培养
将上述获得的驯化菌株传代培养30代后接种于1000mL的液体培养基进行摇床发酵培养，发酵培养温度为34℃，转速为180r/min，发酵培养时间为24h，得到驯化菌株；随后，向发酵培养体系中投入霉菌物100g，继续摇床发酵转化，转化温度为37℃，转速为180r/min，转化时间为48h，霉菌物脱氢转化率结果见表2。
对比例1
取实施例3的简单节杆菌种子液10mL，接种于1000mL的液体培养基中进行摇床发酵培养，发酵温度为34℃，转速为180r/min，发酵时间24h，投入不同量的霉菌物，继续摇床发酵转化，转化温度为37℃，转速为180r/min，转化时间48h，霉菌物脱氢转化率结果见表1。
将原始简单节杆菌传代培养30代后接种于1000mL实施例3的液体培养基进行摇床发酵培养，发酵培养温度为34℃，转速为180r/min，发酵培养时间为24h，得到驯化菌株；随后，向发酵培养体系中投入霉菌物100g，继续摇床发酵转化，转化温度为37℃，转速为180r/min，转化时间为48h，霉菌物脱氢转化率结果见表2。
表1霉菌物脱氢转化率
表2传代30代后的霉菌物脱氢转化率
| 实施例/对比例 | 霉菌物脱氢转化率 |
| 实施例1 | 70.1％ |
| 实施例2 | 71.8％ |
| 实施例3 | 79.1％ |
| 对比例1 | 53.9％ |
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种提高霉菌物脱氢转化率的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：将简单节杆菌依次接种至梯度霉菌物浓度的培养基中进行驯化，得到驯化简单节杆菌；
S2：采用驯化简单节杆菌对霉菌物进行脱氢，得到霉菌脱氢物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，梯度霉菌物浓度中的最低霉菌物浓度为0.01-0.05％，最高霉菌物浓度为8-10％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，梯度霉菌物浓度包括3个以上霉菌物浓度，优选包括3-5个霉菌物浓度。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，梯度霉菌物浓度包括五个霉菌物浓度，五个霉菌物浓度依次为：0.01％≤霉菌物浓度<0.05％，0.05％≤霉菌物浓度<0.25％，0.25％≤霉菌物浓度<0.5％，0.5％≤霉菌物浓度<1.0％和1.0％≤霉菌物浓度≤2.0％。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，梯度霉菌物浓度包括五个霉菌物浓度，五个霉菌物浓度依次为：0.05％≤霉菌物浓度<0.25％，0.25％≤霉菌物浓度<1.25％，1.25％≤霉菌物浓度<2.5％，2.5％≤霉菌物浓度<5.0％和5.0％≤霉菌物浓度≤7.0％。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，梯度霉菌物浓度包括五个霉菌物浓度，五个霉菌物浓度依次为：0.5％≤霉菌物浓度<2.5％，2.5％≤霉菌物浓度<5.0％，5.0％≤霉菌物浓度<7.0％，7.0％≤霉菌物浓度<9.0％和9.0％≤霉菌物浓度≤10.0％。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，驯化方法包括：将简单节杆菌依次接种至梯度霉菌物浓度的固体培养基中进行固体培养；其中，固体培养基除霉菌物之外还包括：蛋白胨6-9g/L，玉米浆10-15g/L，葡萄糖6.0-9.0g/L，磷酸氢二钾0.1-0.2g/L，琼脂10.0-20.0g/L；固体培养基的pH值为7.0-7.4。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在固体培养之后还包括：从固体培养物中挑取菌株接种至液体培养基中进行液体发酵培养，将液体发酵培养物接种于下一霉菌物浓度的固体培养基中进行固体培养。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，液体培养基包括：蛋白胨8-12g/L，玉米浆1.5-3.0g/L，葡萄糖1.5-4.0g/L，磷酸氢二钾2-5g/L；液体培养基的pH值为7.0-7.4。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，液体发酵培养的条件包括：发酵温度为30-37℃，发酵时间为24-72h，转速为180-220r/min。
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2022
- 2022-07-27 CN CN202210895663.9A patent/CN115181705A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009034398A1 (en) * | 2007-09-11 | 2009-03-19 | Richter Gedeon Nyrt. | Process for the synthesis of 6-hydroxymethyl-l,4- androstadien-3.17-dione |
| CN108048385A (zh) * | 2018-01-19 | 2018-05-18 | 中国农业大学 | 一种提高霉菌毒素降解菌降解效率的菌种驯化方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 王嘉等: "霉菌氧化物简单节杆菌脱氢过程底物投料研究", 《第三届全国化学工程与生物化工年会论文摘要集（上）工程科技I》, pages 271 * |
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