JPS59135896A - アルコ−ルの発酵生産法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明１ｒｊ、アルコ１−ルの発酵生産法に関し、さら
に詳しくはでん粉類なとの多糖類原Ｔ１奮糖化し／こも
の、並ひに、廃糖蜜、クー　ンジコー・−・ス等の直接
還元糖角をザノカ■〕マイセス層セレヴイジエ融合菌株
の育在ドにアルコール発酵させるアルコールの発酵生産
法に関する。

アル１−ル（エタノ−・ル）生産用酵母に要求される性
質と１〜では、アルコール発酵能をはＩ２めとして、高
７品耐性、アル：１−・ル耐性、アルコ−＝−ル発酵速
度および収率、凝集性、低発泡性、その他多くのもので
ある。特にアルコール生産に商した原料をの富に有する
南方諸国でアルコール発酵を行うには、冷却コスト軽ｌ
威のため、高温−ドでも高収率で生産１１丁能な酵母が
望まれでいる。またアル−１−ル生産速度を向上させる
ためには、菌体［Ｉ］−利用による菌体高濃度仕込、す
なわち、アルコール発酵用酵母を迅速に沈降外囲１して
循環再利用するプ［１セスが屯安視され、このため凝集
沈降性の優れた酵母が望−まれている。

従来、高温でアルコール発酵を行う酵ｆＪについては、
ｔ＋＋Ｊえば生せ藷無蒸煮もろみから３８°Ｃで３〜４
目で９．４係の一アルコールを生成するサノカロマイ１
ニス（・バセレ・１７１）−ｃ、Ｍ菌（朱し・よひ同Ｎ
ｕ　１．　（ｌ菌株が′Ｊ、（１られていイ）か、・ｔ
　ｏ　’ｃでｒｌ、　ｙ”ノに１−　　ノｌ儂度（ｆ、
１．８１Ｉ〜８６係り（壇威少すると１−１３告さＩし
ていろ（上田ら：昭和５６年＋１３１　ｓ−ネルキー竹
別（ｉ、１１究成宋叩告ゝ牛物エネルギー・ハ刊用と開
発″７１．１４３〜１５　（＋　）。

土た４１国の１：川から５）−離され／ζζアル１−／
１．ニ酵酵１υリノカ口マイセス・１〈ヒレ・タイ、・
工Ｔ　Ｊ　Ｉ　［￥ｉ株が、高温下Ｔ“良好な発酵・ｉ
牛と１Ｖ集１牛を／Ｊ＜シフ、例工Ｒ，’　３５　’←
〕−Ｃ１ｏ％の比較的高いアル＝１−ル生ρｒ能を有−
４−ることが報告されでいる（同−Ｉ−文献７）。

１４３）、、 本発明の目的シ」１、上記従来技術に′心力１、さらに
優れた高温発酵ｆｊ：Ｆ、と強い１・疑集１４１．を有
４−るアｌｌ＋コール発酵ｔ■ｌｌ酵ｔ′Ｊをハｊいた
アルコ−・しく７）′尾酵生産法を提供することにある
。

本発明者らは、ｒ）ｆＪ記ザノカロ−マイヒス匡セレウ
イ９−ｒ−”、’ＪＩ菌株とアルコール発酵［−１ψれ
たｔ’ｌ：’Ｐａをもった曲の数種の酵母を１．酬胞副
１音１去を中、１ヒとした方法を用い−Ｃ１４１け合せ
ることにより、優れたアルコール発酵用酵母の遺１ｉ＜
約合（重を試みた結果、本発明に到達しＺとものであノ
ン１、 本発明は、アルコール発酵用酵１４．ｌであるリノカ■
コマイセス・、惧ヒレウイジエ　ＡＭ１２菌株の存在ド
にアルコ　−ル発酵を行うことを特徴と」゛る。

−１，ｒ、　ｉｉ己リすノカロマイセス・−ヒレウイジ
エ　ＡＭ＋２（朱は、ｔ”ｌ！Ｊ　ｉ！己のサッカ１−
ｆｆ−タイセス・セレ・グイジエＴＪ　Ｉｆ朱と、醸造
酒２包盛（アワモリ）のモロミから分離され／こリッツ
１０−マイ上ス・セレウイジ５−Ｎ−１味を細胞融合法
により融合させて得られたものである。

１、　Ｑ＋２．　　リ−ノ　ツノ　ロ　−マ　イ　ヒ　
ス　・　ヒ　し　ウ゛　イ　）毛　　　ＴＪＩ株、同Ｎ
−１株、および同ＡＭＬ２１朱ｄ１、工業技術院微生物
工業技術研究所に次の番号で寄託されている。

微生物の表示　　　　　　　　　機工？ｉＪＩ受託番号
ヅノカ「コマイセス・七しウイジエ　ＴＪＩ　　　　　
　第６７４７　−４回　　　　　　　十　　　　Ｎ・−
・１　　　　　第６７４８　弓同　　　　　　　　＋　
　　　ＡＭＬ２　　　　　、＠６　７　４　９　　リ上
記ＴＪ１味とＮ　−１殊の細胞融合株であるＡＭ１２Ｐ
ｌｅυ；１４、先ずプロトプラストめ、ＴＪＩ株にＵｌ
、−［デルメタンスルフ］イ・−・１・（ＥＭＳ＞処１
１１Ａにより栄養安水性変異をイ」与し、泡盛酵母Ｎ−
１株は、エチジウノ、ブＩＪマイト処理により呼吸欠損
変異株としノコ後、これらのプロトプラスト らに高野らの方法（発酵Ｊ二学、第５７巻、第５号、ｐ
３８０−３９５　（１．９７９）に従いボリゴーチレン
グリコール存在ドで細胞融合させることにより得られる
。

本発明におけるアルコ−、＋１発酵川原（′１としては
、１１藷、馬鈴藷、とうもろこし、キャノーリバ、米、
廃糖蜜、農産廃棄物、およびこれらの加水分解生成物な
どが用いられる。本発明の酵母菌は、後述するように低
いｐ　Ｈでも高い発酵性をイｊするのて、滅菌上程は簡
略化し、例えば無蒸煮物にも適用可能である。

本発明においては、先ず原ｆ１をアミラーセなどの酵素
で糖化し／こ後、本発明のアルコール発酵用酵母で発酵
させてもよいが、原料に本発明の酵母ｊ算独またはアミ
ラ・−ゼ等の他の糖化酵素を同時に添加して発酵させて
もよい。

本発明のアルコールイ己＋’ｆ￥用１繁ｔ−ｔＪ：　Ａ
．　Ｍ　Ｉ　２　（７）使用量，は、原料の種類に３し
り異なるが、全糖量２０〜４５係の回分培養の場合、０
．３〜２　ｓ　／　ｅの植菌叶でよく、斗／ζ連続Ｊ８
算の鳴音０ま５〜８　０　ｆｌ／１の槽内菌体濃度でよ
い。

発酵条件は、一般にｐ　Ｈ　２．　５〜７（好ヰしく　
＆ｊ、３、５〜６．５）、温度５〜４５℃（好ましく　
ｔ．ｔ　２　５〜４　（１　’に　）であるが、本発明
に用いる酵ｔυは特に低いｐ　Ｈおよび３５°Ｃ以トで
も高い発酵能をイｊする。

アルコール発酵方法は、攪拌槽による回分培仰でも連続
培養でもよく、連続培養の場合には酵母の凝（イ冬沈降
性がよいのて、高濃度仕込の発酵を行なうことができ、
まだ沈降槽も特別な分離手段を１没けることなく、コン
パクトなものにすることができる。

以下、本発明を実施列によりさらに詳卸ｌに説明するが
、本発明はこれらに限定されるものではなく、本発明の
特許請求の範囲内で種々の変形を考慮することができる
。

実施例１（１抽胞融合法四二よる優良菌株の育ｐｌｉ）
凝！１８　件了ル：７−ル酵母であるザノノノロマイセ
ス・セシ・′Ｉｆ　（−：）工Ｔ　Ｊ　１　（完全ホ士
タリノク株、２＋＝１′＊＞を胞子形成さ）ｖ１細胞壁
溶解酵素（Ｚｙｒｒｂｏｌｙａｓｃ　５０００　）で胞
子・を露出、分１１交さＩセた後、彦ｊ異誘発削ＥＭＳ
（エチルメタンスルホネ−＋−）で処理した。、これを
完全培地（Ｙ　Ｐ　Ｄグｌノート）トでコ「に−を・形
成せしめ、さらに最少培地にｌ／ブリ力して、両者の１
し較から栄養要求変異株を分離した１、（Ｑられ）、−
、変５゛ら株は、アミノ酸、・核酸などについて、７ツ
ミノ／・３ンテストによ−って要求物′直を決定し、さ
ラニ凝弔沈１守性や７′ノ［−１−ル発酵！ｒＦ等でス
クリ−・−・−ングｒ７、優れプこ栄Ｎ〔要求変−％％
株Ｔ　Ｊ　ｌＡｔ７ｑ株を分離した。

−・）５．．７ｆす盛モロミから分離１７た、高温計１
＋トを有するアル−１−・ルｍｆＪの号ノカロマイ七ス
・セレウイジエＮ−］に、常法１１ＴＩリエヂジウムブ
Ｕｉ　マ（ド（１０ｐｐｍ　）処理を行った後、ＴＴＣ
染色ｌんによって呼吸欠損変異株（ρ−）を分離し／こ
。

上１１１２のようにしで得られた栄養要求変異株Ｔ　Ｊ
　１　　ｋｒ、ｑ−とＮ・−１の呼吸欠損株Ｎ−１ρ株
とをそ）Ｌそれ細胞壁溶屓酵木（Ｚｙｎ、ｏｌｙａ、ｓ
、５　（，１００）てゾ「１ドプラストリエｆＶ７クラ
イコール（ＰＥＧ６０（１０）、ＣＪ／’２存在１・−
ｃ両者を混合して融合させた、、次に融合生成物を、ク
リセロ−ルをｉｌ，−炭素源とし、アルギー・−ンをτ
−ま・ｔい最少寒天培地に埋めこんで融合株のみを選択
した。得られ／（−、融合株Ｖこつき、凝ｑ口沈降性、
アノ１ぺＩ−ル発酵能なとについてスクリーニングを行
ない、本発明の融合株である一すーノカロマイセス・セ
し・ライ／工　ＡＭｌ２株（μ下、ＡＭｌ２と称するこ
とがある）を得た。

実施例２、比較例１および２　（　３　０　’Ｃてのエ
タノール発酵テスト）ＡＭ１２山株を、３１容ジヤー　
ツアー　メンタ−　（実仕込喰１．５　７！　）を用い
、検算温度３０℃、ｐ　ＩＩ５．　Ｏ　〜４．．　５、
緩速１ｖ．（拌（　１　０　０　〜１　５　０　ｒｐｍ
．　）、嫌気条件Ｆで培養し、エタノール発酵を・行っ
た。この場合の１？λ地は、グルコース初期２５係、ｌ
音速１２時間両に１０係分補わＬ　合計：３５％、ポリ
ベゾトン２係、イーストエギス１．　％であった。。

比較の７こめＡＭｌ２の親株であるＴ．ＪＩおよびＮ−
１株も同一条件ＦでＪ−タノール発酵を行わぜ／こ，（
比較１り１１校。■、ひ２）５，これらの結果を第１図
に小す。

図の結果から、親株ＴＪ１は初１υ，］　（　０〜２４
時間）のエタノール生産の速度は速いが、５０〜６０時
間で−に目］もどなり、その降のエタノール生産の伸び
はほとＡ７とＪＱ　＜　、４ｊ終濃度１　’．’＝　〜
Ｉ　：３．　５υｏＩ′！チで終Ｊ”　Ｊ−る。これは
、ＴＪＩＶＪくが高（震度のエタノ・−・ルに１制性が
づりいこと全示唆する。、土メこも１）−　方の親株Ｎ
　−　ＩＣ；Ｊ、、゛茫酵の全期間を西にで毛タノール
生産叱度が小さく、緩慢な伸びを示す。たたし、高濃度
のエタノ−、　＋１・には比較的面ｊ性を・示し、陵時
間（　、１．　０　０〜１３０時間）を′易するものの
、最終エタノールａ　！Ａ’（は１７υｏｔ３　％　ヲ
・越ぐ．る、、ｉ／ζ、１疑東ｌ尤降ｔｌ’ＪＵは有し
ない，、これに対ｌ〜、両者の細胞融合体ＡＭｌ２株は
、υ期エタノー　ル生産叱度に１、７１’　、Ｊ　Ｉを
ｒ；干１−回り、しかもＴＪＩのように１：う係前後で
頭打ｔ）する（−となく車かに沖ひ続け、７２時間−Ｃ
　２　０　ｖｏｗ係を越える。し／と．がー）で、最終
上タ，ノー＝ル濃度もＮ−１株より短時間内（約■／２
）に２５〜４係ト回る。

さらにＡＩＶＩ１２は、Ｔ　Ｊ　ｌ由来の強い凝集Ｉｌ
ｌを有しで粋り．、　、ｌ’ｇｉ　停ｒ１期に１１゛Ｌ
拌を停屯すると直ちに凝集沈降し、２分以内に完全に沈
降分離し、上（＜７は菌体をバー斗ず透明となり、菌体
ばμｍ降圧密されて令容債の１／′５以下となる。この
ｌ’４：　′Ｐｔ　Ｉ／こ」−り、培養後の菌体分離上
程においＣ．、Ｉａ心分離（幾（・セパレーター等の（
表器の使用することなく、、ｒＹｌに静置するだけで、
短時間（例えは数分）Ｃ鴇徨液からの１♀１体分離の旨
丁能とる・す、直ちに上ｌ＜Ｙは蒸ＷＷ　’−ＩＴ。

（′Ｔ１等へ、および濃縮菌体はリーリイクル市使用す
ることもｉｊＪ能である、、 以上のＡＭｌ．２１朱の摩れた・Ｉ′ｌ　’Ｍは、、Ｙ
ＩＢ胞副１合により、両親５の優れた遺伝子（凝も件な
と）が１−ち、Δ寸れ、ｆ／こ直伝ｒ−の絹合すにしり
、両親の欠点が（１目１１しさ！Ｌ　？’発現したもの
と考えられる６、実施例３、比較例：３　、に−よｉ４
（４０”Ｃでの工〃〕−　ル発酵テス］・） 培＃温度のみを４　（１　’Ｃ；とし、能は、実施ｌ＋
１１２と同条件でＡＭｌ２株（実施１＋１　＜ｓ　）　
、４”よひその親株ＴＪ１．（比較例３）、Ｎ−１（朱
（比較例、１）のエタノール発酵を行った。その結果を
・第２図に示す。これによれは、親株ＴＪ＋は高温の影
響を受け、エタノール生産速度および最終エタン−＝ル
儂度（ｇ　、）（２１％）共に３０　’０．に比へ大幅
に低−トし７でいる。１／こ一ノｊの親株Ｎ−１は、比
較的高温１制性を有する菌株であるが、やはり、エタノ
ール生産速度および最終エタノ−ル濃度は低−ド（，２
ている。

（−れにｉｎ、、ＡＭ］２（朱は、令刀１１Ｊ］のエタ
ノール生産１虫度は４０℃に粋いでも：３（璽Ｃとほと
んと変化がなく、光分な高温耐ＶＬを有することが分っ
た。

また、最終−Ｌタノ−ル濃度ｄ１、］、　：３．５〜１
５　ｔアｏＩ４係（５４時間）と、３０°Ｃに比べ低−
トｄ、しているが、４０’Ｃという高６−吉度下で、こ
れほと高濃度のエタノールを１７カ・も短時間で生産す
る菌株の報告はｌく、１）ｆＪ　ｉボの−１Ｆ（ｌｌ′
−１の１ノノカロ−？イはス・−七しウ゛イジ上Ｍ沫や
同１０株の発酵能（４０″゛（−゛、、３〜４、　Ｉ３
でアルコ−・ル儂度８４〜８６ｖｏ６係）を大幅に上回
っている４、な訃、凝イ［沈降性ｉｔ　４０　”Ｃにお
いても保持されることが分った。

実施例４（ＡＭＬ２株の温度特性） Ａ　Ｍ　１．２株について、他の条件は実施例２、：３
と同じで、？ｌＩＩ■度を３０’Ｃ，３５℃、４０’Ｑ
、４２°Ｃでそれぞれエタノール発酵を１１つた結果を
第３図に示す、。

これによれば、ＡＭ１２株の切間の二１Ｌタノ−・ル生
産１１（度は３０〜４０　’Ｃの範囲てＣ７ｊ、はとん
と低下せず、４２℃に到って若干の低トが認めら！しる
に過き゛ない。そして、最終エタノ　ル濃度はさすかに
温度の−Ｌ昇と共に低くなるが、３０’（、；で２（レ
ノｏ１係以ト−を７２時間で、３５℃で１７ｖｏｌ係以
」二を６０時間で、４０　’ｃで１３．５〜１５．５　
ｖｏ１％を５５時間で、さらに４２℃においても１０．
５　ｖｏｌ　％を４８時ｌ’＋、”ｄ　−Ｃ％　という
ように高温度下での優れプζ−アルニ７−ル生産能をイ
Ｔ　Ｌ、でいることが分る６、一般Ｖこ、高濃度のｒル
コール生産（ｆ」、日イぐ酒などに−その例を吃ること
ができ、’ｌ（’Ｊｖｏｅ％以上の例が報告されでいる
が、その場合は、＋　５　’ＣＡｉＪ後の１１（温ｌニ
ーＣ，Ｌかも１１本酒モ［１ミという温和な並行複斧酵
の特殊な条件トで、しかも最低でも１−数日という長期
間に蓄積されるものである。

上タノールの菌体に対する毒性（」、温度の上昇と共に
急速に高まり、さらにｉ　（Ｊ〜１・２係以上の］−タ
ノール濃度では共存するグルコース７が多いと、；９＋
ｆは相・同曲に増加し、菌にとっては伶めてずＲｙ酷な
条件となる。一方、アルコールの■開業生産の観点から
すれは、４却コストの軽減の要請から、発酵温度はでき
るだけ高く、７時に、発酵原料の豊富な熱帯他方での操
業を考え／で２場合、４０℃以−にが望ましい。斗た、
：１（ストの大きな部分を占める蒸溜コストを低下させ
、廃液量を少くシ、プラント全体のスケールを小さくす
るだめにも、高濃度仕込、高濃度アルコールの蓄積が求
められる。

以上の工業生産の観点から、本発明のＡＭ１２閑株は、
卓越しプこ高温面」性、高濃度エタノール耐性を有し、
１〜かも２５係以−４二の高濃度の直接置元塘の下−こ
の培養に耐え、短時間で高濃度のｊ−タノールを生産、
蓄４１ｔする優良な菌株であることが明らかである。

実施例５・（低いｐ　）（条件下での培養）温度を４０
℃とし、７）Ｈのみを変化させ、その他の条件は実施例
２に準拠してアルコール発酵を行った場合の結果を第４
図に示す。

これによれば、ＡＭ１２菌株は、中性イづ近からｐ　Ｈ
３，５程度までの広いｐ　Ｈ領域に渡って安定したアル
コール発酵能を示し、やや発酵能は低ドするがｐ　Ｈ２
，５〜３の強酸性トにおいても増殖、発酵能を保持しで
いることが分る。

ＡＭｉ２菌株の１このような性質は、実際の工業生産を
行なう場合、低いｐＨ士も発酵がｔｊＪ能であることを
意味し、原料の雑菌汚染の可能が低減するため、生産管
理が容易になり、また原料の減閑王程を省略し、例えは
無蒸煮アルコール発酵も可能になる。このだめ、生産コ
ストの大幅な低減が「１丁能になる。

実施例６（凝集沈降テスト） ＡＭ］２菌株を温度３０　°Ｃ，３５°Ｃおよび４０゛
０てそれぞれ嫌気条件、撹拌トーで培養したとき、該）
’ｉ２拌時および撹拌終ｆ後静１６２分後の液の濁度（
０７）ｔｉ、ｃａｌｌ　Ｄｅｎ、９ｉｔｙ　）を測定し
た結果を第１表にコン１−ｒｌ−ダレ（ノッククフヮ／
トフ　（Ｊ２第１表の結果か”）、Ａ　Ｍ　、１２菌株
の懸濁液ケート１静匿２分後しく二はとＡ７どの菌株が
沈降シ５、短時間で透明な」−ｌ（テがイ！＋　’−れ
ることが分る。；ｔ／ζこの優れた、凝集べ一降件は高
ｌ晶（４０”Ｃ）　ｆもほとんと変らないことが分る。

３ 以−１１、本発明υこよＪしば、訴硯なアルコ−ル生産
用ＲｆＮＪザノカロマイにス・セレウイシ−ｃ　　ＡＭ
］２菌株を用いることにより、例えば４０〜４２　’Ｃ
の高温度ドで短詩１川（４０〜６０時間）に高濃度のエ
タノ−・ル（例えば１．２〜ｉ　５　ｚＩｏｌ　％　：
　４０℃、１０〜１１　ＵＯＩ　％　：　４２’（ｌを
生産するＣ二とかでる。またＡＭ　１．２は、３（１〜
４ｏ’ｃで高い」−タ７ノール生産速度を有し、かつ顕
岩な７胃集ｌＡ−降１′ｉヒをｈするので、菌体全循環
さげて１繰収し利ｊ月−１−る一７′ロセスに好適に使
用することができ、さらに広１１屯囲のｐ　ＩＩ　ｌｔ
ｅ　（時に低いｐ）、Ｉ　）で高いＪ−タ５ノール生産
１１ヒ（例えば、？１　Ｈ：３−ｒ　８０係、ｐ　、１
１．２．５−Ｃ４０係）を有するので、原１１の滅菌工
程を簡略化し、無蒸煮発酵等７を容易に行々うことがで
きる。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は、１Φ／ｚ　ＩＩ）リッツノロ−
ｚ　ｆｌ＝ス・セし・つ・ｆ７′工菌（宋のそ−れぞれ
ｑ＜　ｏ　’ｃ記・よひ４０＝Ｃにおけるアル′：ｆｆ
　　ル牛産能に’　示”’Ｊ〜グラフ、第：３図←Ｌ１
　本発明に二係るＡＭ＋２菌（１、の種々の温１埃にお
けるアルコール生産１１ヒを示１−クラノ、第４図Ｑ、
１、本発明に係るＡＭ１２菌株の発酵能とｌ用■との関
１系を示すグラフである。 代理人　′ｔｔ−［’Ｐ七　　川　北　弐　艮第　１　
図 Ｔｉｍｅ（ｈｒ） 第２図 Ｔｉｍｅ（ｈｒ） 第３図 第４図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）アルコ−・ル光酵用酵ＲＪ：Ｔあるザノカロマイ
   セス（５ａｃｃ）＋、ａ、　　　ｅｓＩ属セレウ゛イジ
   エ（ｃｅｒｅｖｉ、ｓｉａ、ｃ）７’０１ノＩｙＣ ＡＭｌ、２菌株のイＩｒ１下に一アルコー、＋１発酵を
   行なうことを特徴とするアルコ−ルの発酵生産法７、（
   ２）　４！許請求の範囲第１１ｎにおいて、−リ゛ツカ
   Ｌ１マイセス属セレウ・イジエＡＭ１２菌１朱ｉｄ１、
   −リノカ「７マイセス（帆セレウ゛イジエＴＪｌｔ眉１
   朱とり−ｙカｔ’、ｌ　−’７　イセス属セレヴイ／５
   −Ｎ−１菌株をｒＹｔｎ胞融合さ−（，４−で得られた
   ものであることを！１寺徴とする一ｆル〕１−ルの発酵
   生産法。 （：３）特許請求の範囲第１項においで、ノールコール
   発酵条件がｐ　、Ｌｌ　２．５〜７、温度５〜４５　”
   Ｇの範囲Ｃあることを４＋ｉ微とするアルコールの・ｉ
   色耐生産法。