FR2630455A1 - Souche de levure ayant un pouvoir eleve de production d'alcool par fermentation et procede pour la production d'alcool par fermentation utilisant cette souche de levure - Google Patents
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Abstract
Une souche de levure possédant un pouvoir élevé de production d'alcool par fermentation est produite par un procédé comprenant la conjugaison directe de l'haplode de la souche ndegre(s) 909-1 avec chaque tétrade des ascospores de la souche ndegre(s) 180 par appariement spore-avec-cellule, l'acclimatation du zygote obtenu dans un milieu de résidu de fermentation alcoolique et l'acclimatation des cellules survivantes du zygote dans un milieu de mélasses de betteraves contenant du 2-désoxyglucose. La souche de levure produite est désignée sous le nom de souche M-9 (FERM BP 1481) du genre Saccharomyces cerevisiae. De l'alcool est produit par culture de la souche M-9 dans un milieu de mélasses de betteraves.
Description
souche de levure avant un pouvoir élevé de production
d'alcool par fermentation et procédé pour la production
d'alcool par fermentation utilisant cette souche de levure"
La présente invention concerne une souche de levure
présentant une forte capacité de production d'alcool par
fermentation de mélasse de betteraves comme matière
première, par exemple, et un procédé de production d'un
alcool par fermentation utilisant cette souche-de levure.
d'alcool par fermentation et procédé pour la production
d'alcool par fermentation utilisant cette souche de levure"
La présente invention concerne une souche de levure
présentant une forte capacité de production d'alcool par
fermentation de mélasse de betteraves comme matière
première, par exemple, et un procédé de production d'un
alcool par fermentation utilisant cette souche-de levure.
La mélasse de canne a trouvé une utilité dans de
nombreuses applications telles que par exemple la
fourniture de matière première pour la production d'alcool
par fermentation et la culture de la levure de
boulangerie.
nombreuses applications telles que par exemple la
fourniture de matière première pour la production d'alcool
par fermentation et la culture de la levure de
boulangerie.
Au contraire, la mélasse de betteraves qui reste
après séparation du saccharose des betteraves n'est
utilisable que comme additif i l'alimentation animale et
n'a pratiquement aucune autre utilité.
après séparation du saccharose des betteraves n'est
utilisable que comme additif i l'alimentation animale et
n'a pratiquement aucune autre utilité.
Une manière concevable d'étendre les utilisations
des mélasses de betteraves est de les utiliser pour la
production de boissons alcooliques, par fermentation de
celles-ld en alcool. Les inventeurs ont passé en revue des
levures, i la recherche de souches de levure qui
conviennent pour cette fermentation.C'est ainsi qu'ils
ont trouvé que deux souches de levure, & savoir une souche
de levure floculante NRIB n" 180 (numéro de série attribué
par le National Research Institute of Brewing, Tax
Administration Agency of Japan) et une souche de levure
tueuse n 909-1 (numéro de série attribué par la Tax
Administration Agency of Japan), appartenant au genre
Saccharomyces cerevisiae, présentent une aptitude extrêmement intéressante i la fermentation et produisent de l'alcool i partir de mélasses de betteraves par fermentation.
des mélasses de betteraves est de les utiliser pour la
production de boissons alcooliques, par fermentation de
celles-ld en alcool. Les inventeurs ont passé en revue des
levures, i la recherche de souches de levure qui
conviennent pour cette fermentation.C'est ainsi qu'ils
ont trouvé que deux souches de levure, & savoir une souche
de levure floculante NRIB n" 180 (numéro de série attribué
par le National Research Institute of Brewing, Tax
Administration Agency of Japan) et une souche de levure
tueuse n 909-1 (numéro de série attribué par la Tax
Administration Agency of Japan), appartenant au genre
Saccharomyces cerevisiae, présentent une aptitude extrêmement intéressante i la fermentation et produisent de l'alcool i partir de mélasses de betteraves par fermentation.
Dans la production industrielle d'alcool par fermentation utilisant une souche de levure, comme l'opération de fermentation est habituellement effectuée dans un réservoir ouvert, il existe indéniablement une possibilité qu'une levure sauvage parvienne å pénétrer dans le réservoir de fermentation et exerce un effet nuisible. La levure utilisée pour la fermentation doit donc posséder un phénotype tueur contre d'autres levures sauvages nuisibles envahissantes. En outre, comme la levure est utilisée de façon répétée, il est nécessaire qu'elle possède également des propriétés floculantes pour être efficacement séparée de la pâte de fermentation. Les deux souches de levure mentionnées ci-dessus possèdent seulement l'une ou l'autre de ces deux propriétés, i savoir e phénotype tueur et les propriétés floculantes.
Aucune de ces souches de levure n'est donc capable de produire efficacement de l'alcool 9 l'échelle industrielle.
Un des buts de l'invention est de fournir une souche de levure qui présente l'association du phénotype tueur et des propriétés de floculation et qui, dans la production d'alcool au moyen de mélasses de betteraves, effectue la fermentation avec un rendement élevé et produise de l'alcool i une concentration élevée.
Un autre but de l'invention est de fournir un procédé qui permette i la production d'alcool avec la souche delevure ci-dessus d'être effectuée efficacement i l'échelle industrielle.
Pour atteindre les objectifs ci-dessus, l'invention obtient, avec une reproductibilité élevée, une souche de levure possédant le phénotype -tueur et les propriétés de floculation et effectuant la production d'alcool avec un rendement élevé, par un procédé qui consiste à conjuguer directement deux souches de levure appartenant à
Saccharomyces cerevisiae, l'une capable de présenter le pouvoir hautement souhaitable de production d'alcool å partir des mélasses de betteraves et possédant en même temps des propriétés de floculation, et l'autre capable de présenter un phénotype tueur, à cultiver la souche conjuguée dans de l'eau résiduaire distillée après une opération de fermentation pour la production d'alcool, et å soumettre la souche acclimatée obtenue à une autre mutation de dérépression catabolique, sur des mélasses de betteraves contenant un analogue du glucose non métabolisable, le 2-désoxyglucose.
Saccharomyces cerevisiae, l'une capable de présenter le pouvoir hautement souhaitable de production d'alcool å partir des mélasses de betteraves et possédant en même temps des propriétés de floculation, et l'autre capable de présenter un phénotype tueur, à cultiver la souche conjuguée dans de l'eau résiduaire distillée après une opération de fermentation pour la production d'alcool, et å soumettre la souche acclimatée obtenue à une autre mutation de dérépression catabolique, sur des mélasses de betteraves contenant un analogue du glucose non métabolisable, le 2-désoxyglucose.
La souche de levure décrite ci-dessus possède le phénotype tueur et d'excellentes propriétés floculantes.
Lorsque la production d'alcool avec cette souche de levure est effectuée & l'échelle industrielle, la fermentation peut être effectuée dans un réservoir à réaction ouvert, avec des mélasses de betteraves dans un état non bouilli, car la souche de levure présente le phénotype tueur contre une autre levure sauvage nuisible envahissante. En outre, comme la souche de levure possède d'excellentes propriétés floculantes, elle peut aisément être séparée du bouillon de fermentation et réutilisée plusieurs fois. Ainsi, cette souche de levure permet d'effectuer la production d'alcool d'une manière efficace å l'échelle industrielle par un procédé discontinu ou continu, sans exiger aucun moyen spécial de séparation.
Les objectifs et caractéristiques de l'invention ci-dessus ainsi que d'autres ressortiront mieux de la lecture de la description détaillée ci-après, se référant aux dessins annexés.
La figure 1 est un graphique montrant la modification au cours du temps de la production d'éthanol conformément & la présente invention.
La figure 2 est un graphique montrant les quantités d'alcool produites lot par lot dans cinq lots de fermentation.
Les inventeurs ont cherché une souche de levure qui possède à la fois le phénotype tueur et les propriétés de floculation et qui produise efficacement la fermentation alcoolique. A la suite de ces recherches, ils ont réussi à obtenir une souche de levure, désignée sous le nom de souche n" H-l, du genre Saccharomyces cerevisiae et possédant d'excellentes propriétés floculantes et le phénotype tueur, en conjuguant la souche n* 180 qui possède de très bonnes propriétés floculantes avec la souche n' 909-l possédant le phénotype tueur.
Pour être plus précis, la souche n' 909-1 (diploide) est hétérothallique et possède le phénotype tueur et la souche nb 180 (diploide) du genre Saccharomyces cerevisiae est homothallique et floculante. Tout d'abord, on fait former des spores i la souche n 909-1 dans ses cellules.
Puis on traite les cellules par une enzyme qui lyse les parois cellulaires et on disperse les spores sur plusieurs milieux en plaques (milieu de gélose contenant de l'extrait de levure, de la peptone et du dextrose) pour cultiver des colonies. Les souches des colonies cultivées sur les milieux de gélose sont utilisées séparément pour effectuer la production d'alcool avec des mélasses de betteraves. Les haploides (type d'appariement a) sont enlevés de la souche par criblage des colonies présentes sur les milieux qui présentent un rapport de survie et une productivité d'alcool élevés & la fin de la fermentation.
Séparément, on fait de même former des spores i la souche n" 180 (diploide homothallique) du genre
Saccharomyces cerevisiae, qui est une levure floculante, dans sea asques. Avec i chaque fois quatre spores de la -souche n 909-1 formés, on effectue la conjugaison directe avec l'haploide de la souche n 180 par appariement sporeavec-cellule. Cette conjugaison est établie avec une probabilité d'environ 1/2. La formation d'un zygote étant confirmée, le zygote est cultivé successivement dans un certain nombre de milieux en plaques, dans le but d'obtenir plusieurs colonies. Puis les souches formées i partir de ces colonies sont utilisées séparément pour effectuer la production d'alcool.A partir des bouillons de fermentation, la souche particulière qui a donné des cellules de levure avec un rapport de survie élevé après la fermentation est sélectionnée parmi les colonies présentes sur les milieux en plaques.
Saccharomyces cerevisiae, qui est une levure floculante, dans sea asques. Avec i chaque fois quatre spores de la -souche n 909-1 formés, on effectue la conjugaison directe avec l'haploide de la souche n 180 par appariement sporeavec-cellule. Cette conjugaison est établie avec une probabilité d'environ 1/2. La formation d'un zygote étant confirmée, le zygote est cultivé successivement dans un certain nombre de milieux en plaques, dans le but d'obtenir plusieurs colonies. Puis les souches formées i partir de ces colonies sont utilisées séparément pour effectuer la production d'alcool.A partir des bouillons de fermentation, la souche particulière qui a donné des cellules de levure avec un rapport de survie élevé après la fermentation est sélectionnée parmi les colonies présentes sur les milieux en plaques.
La souche sélectionnée dans le mode opératoire decrit ci-dessus est désignée sous le nom de souche H-l et elle a été soumise le 31 juillet 1986 au Fermentation
Research Institute, Tsukuba, Japon et déposée sous le numéro FERM P-8885.
Research Institute, Tsukuba, Japon et déposée sous le numéro FERM P-8885.
Les essais taxonomiques ("The Yeast", a taxonomic study, 3eme éd., édité par N.J.W. Kreger van Rij) effectués sur la souche H-l donnent les résultats suivants.
Formation de spores : positive
Fermentation des sucres : positive invariablement avec le glucose, le galactose, le saccharose, le maltose et le raffinose.
Fermentation des sucres : positive invariablement avec le glucose, le galactose, le saccharose, le maltose et le raffinose.
Assimilation des sources de carbone : positive invariablement avec le glucose, le galactose, le sucrose, le maltose, le tréhalose, le raffinose et l'oc-méthyl-D- glucoside et faiblement positive avec le mélézitose et l'acide DL-lactique.
Assimilation des nitrates : négative.
Demande en vitamines : négative.
Croissance à 37 C : positive.
Croissance dans un milieu NaCl & 10 % : positive.
Sur la base de ces résultats la souche a été identifiée comme appartenant au genre Saccharomyces cerevisiae.
Bien que la souche H-l ait un phénotype tueur et des propriétés de floculation, on a observé qu'elle est dans une large mesure détruite lorsqu'elle est cultivée dans de l'eau résiduaire distillée provenant d'une opération de fermentation pour la production d'alcool utilisant des mélasses de betteraves. Ce phénomène peut être dû au fait que l'eau résiduaire contient certains inhibiteurs de développement. En conséquence, on en conclut que lorsqu'un variant résistant aux inhibiteurs de développement sera obtenu i partir de la souche H-l, il présentera un pouvoir élevé de production d'alcool par fermentation.
On a cultivé la souche H-l dans de l'eau résiduaire distillée après fermentation alcoolique utilisant des mélasses de betteraves. Les levures viables après incubation ont été inoculées plusieurs fois dans les mélasses de betteraves. Puis les cellules de levure viables après dix opérations de culture ont été inoculées A plusieurs milieux de gélose, contenant de l'eau résiduaire distillée, et elles y ont été cultivées pour faire croitre des colonies. Les colonies cultivées sur les milieux en plaques ont été utilisées pour effectuer la production d'alcool avec des mélasses de betteraves. A partir des bouillons de fermentation obtenus, les souches qui ont produit des cellules de levure avec un rapport de survie élevé après fermentation ont été sélectionnées.
Ensuite, les souches sélectionnées ont été cultivées en plusieurs -cycles successifs, ide de mélasses de betteraves contenant du 2-desoxyglucose (2DOG). La souche provenant du dernier cycle de culture a été inoculée i plusieurs milieux de gélose-mélasses de betteraves contenant du 2DOG et cultivée pour faire croitre des colonies. Par ce traitement, on a obtenu des colonies qui n'étaient plus sujettes & la répression par les catabolites. Les souches provenant des colonies ont été utilisées pour effectuer la production d'alcool å partir de mélasses de betteraves.La souche particulière qui a produit des cellules de levure avec un rapport de survie élevé après fermentation a été sélectionnée. La souche ainsi sélectionnée par le mode opératoire décrit ci-dessus a été désignée sous le nom de souche M-9 et déposée le 6 juin 1987 au Fermentation Research Institute of Tsukuda,
Japon, sous le numéro FERM P-9401. Le 24 septembre 1987, une demande pour la modification du statut de dépôt a été déposée conformément i la Convention de Budapest et la souche a reçu le numéro de dépôt FERM BP-1481.
Japon, sous le numéro FERM P-9401. Le 24 septembre 1987, une demande pour la modification du statut de dépôt a été déposée conformément i la Convention de Budapest et la souche a reçu le numéro de dépôt FERM BP-1481.
Lorsqu'on a effectué sur cette souche M-9 les mêmes essais taxonomiques quek sur la souche H-1 mentionnée ci-dessus, les résultats ont été les mêmes que ceux obtenus avec la souche H-l. La description des caractéristiques de la souche M-9 sera donc omise.
Sur la base de ces résultats d'essais, la souche a été identifiée comme un variant de la souche H-l du genre
Saccharomyces cerevisiae.
Saccharomyces cerevisiae.
La souche M-9 présente un pouvoir extrêmement intéressant de production d'alcool par fermentation i partir de substrats tels que des mélasses de betteraves, et elle possède en même temps des qualités exceptionnelles en ce qui concerne le pouvoir floculant, le phénotype tueur, l'aptitude à une utilisation continue dans des cycles successifs de fermentation et la reproductibilité du pouvoir de fermentation.
Comme exemples de la matière première pour la production d'alcool utilisant la souche ci-dessus, on peut citer, en plus des mélasses de betteraves, les mélasses de cannes, la patate douce, la pomme de terre, le melon de
Cassaba, le riz, les déchets agricoles et leurs hydrolysats. Comme la souche de la présente invention possède le phénotype tueur, le. stade de stérilisation peut être simplifié, par exemple en utilisant la matière première dansl'état non bouilli. La quantité de la souche å utiliser pour la production d'alcool varie avec la nature de la matière première adoptée. Dans le cas d'une fermentation discontinue utilisant des mélasses de betteraves, par exemple, une concentration en cellules de la souche, suffisante pour la fermentation, se situe dans l'intervalle de 105 à 108 cellules/ml.Dans le cas d'une fermentation continue, la quantité de souche suffisante pour la fermentation se situe dans l'intervalle de 105 i 109 cellules/ml, comme concentration des cellules dans le réservoir.
Cassaba, le riz, les déchets agricoles et leurs hydrolysats. Comme la souche de la présente invention possède le phénotype tueur, le. stade de stérilisation peut être simplifié, par exemple en utilisant la matière première dansl'état non bouilli. La quantité de la souche å utiliser pour la production d'alcool varie avec la nature de la matière première adoptée. Dans le cas d'une fermentation discontinue utilisant des mélasses de betteraves, par exemple, une concentration en cellules de la souche, suffisante pour la fermentation, se situe dans l'intervalle de 105 à 108 cellules/ml.Dans le cas d'une fermentation continue, la quantité de souche suffisante pour la fermentation se situe dans l'intervalle de 105 i 109 cellules/ml, comme concentration des cellules dans le réservoir.
La fermentation pour la production d'alcool est généralement .effectuée en modeaslaérobie,.a un pH.de 4 & 6..
et d une température de 25 9 370C (de préférence au voisinage de 30'C). Les mélasses de betteraves utilisées présentent de préférence une teneur totale en sucre de 24%.
La fermentation peut être effectuée en discontinu dans un réservoir agité, ou en continu. La fermentation discontinue convient principalement pour la production de boissons alcooliques et la fermentation continue principalement pour la production d'alcool pour carburant.
En outre, comme la souche M-9 de la présente invention présente une aptitude nette à floculer et à sédimenter dans une pâte de fermentation, elle permet d'effectuer la fermentation continue avec une concentration de chargement élevée, sans exiger que le réservoir de sédimentation soit muni d'un moyen spécial de séparation. Ainsi, la souche présente l'avantage que le système de fermentation continu peut être conçu en une structure compacte.
La présente invention sera décrite & présent plus précisément ci-dessous, avec référence aux exemples. Il est & noter cependant que l'invention n'est pas limitée aux exemples suivants.
Exemple 1
Dans un milieu contenant 1 % d'acétate de potassium, 0,2 % d'extrait de levure, 0,2 % de glucose et 2 % de gélose, la souche 909-1 du genre Saccharomyces cerevisiae a été cultivée pour former des ascospores. Les ascospores formés ont été mis i nu et dispersés A l'aide d'un enzyme lysant les parois cellulaires (Zymolyase lOOT) et chaque tétrade des ascospores a ensuite été disséquée avec un micro-manipulateur. Les spores respectifs ont été inoculés i des milieux de gélose contenant 1 % d'extrait de levure, 2 % de peptone, 2 % de glucose et 2 % de gélose, et cultivés. Les 32 colonies qui se sont développées sur les milieux ont été soumises séparément à un traitement de sélection dans les conditions suivantes.
Dans un milieu contenant 1 % d'acétate de potassium, 0,2 % d'extrait de levure, 0,2 % de glucose et 2 % de gélose, la souche 909-1 du genre Saccharomyces cerevisiae a été cultivée pour former des ascospores. Les ascospores formés ont été mis i nu et dispersés A l'aide d'un enzyme lysant les parois cellulaires (Zymolyase lOOT) et chaque tétrade des ascospores a ensuite été disséquée avec un micro-manipulateur. Les spores respectifs ont été inoculés i des milieux de gélose contenant 1 % d'extrait de levure, 2 % de peptone, 2 % de glucose et 2 % de gélose, et cultivés. Les 32 colonies qui se sont développées sur les milieux ont été soumises séparément à un traitement de sélection dans les conditions suivantes.
On a utilisé comme milieu de culture des mélasses de betteraves contenant 10 % de sucre total. Ce milieu de culture a été complété avec 700 ppm de KH2Po4, ajusté à pH 5,0 et stérilisé en autoclave. Au milieu traité comme il a été décrit ci-dessus, on a inoculé les souches prélevées chacune au moyen d'une anse dans les 32 colonies haploides mentionnées ci-dessus et on les a cultivées sous agitation à 30'C pendant deux jours. On a obtenu ainsi 32 suspensions de levures.
Puis on a préparé 32 milieux de culture de mélasses de betteraves ayant une teneur totale en sucre ajustée à 24 %, on les a ajustés à pH 5,0 et on les a stérilisés dans un autoclave. Puis on a ajouté, & un volume fixe de 250 ml de chacun des milieux stérilisés, les suspensions de levure cultivées mentionnées ci-dessus, dans des quantités calculées pour donner une concentration fixe de 4x107 cellules/ml. Les mélanges de culture obtenus ont été soumis i une fermentation de cinq jours i 30'C. Après fermentation, la souche particulière qui produisait une teneur élevée en alcool dans le bouillon de culture par comparaison avec la souche parentale a été sélectionnée.
Dans un milieu formant des spores de la même composition que dans le traitement précédent, on a cultivé séparément la souche 180 du genre Saccharomyces cerevisiae. La souche sélectionnée ci-dessus a été conjuguée directement avec chaque tétrade d'ascospores formés sur le milieu, par appariement spore-avec-cellule.
La souche conjuguée a été cultivée sur un milieu en plaques à une température d'environ 30"C et examinée sous un microscope en vue de confirmer la formation progressive de zygotes. La souche conjuguée dont on a trouvé qu'elle formait un zygote a été choisie comme souche d'appariement.
Les 32 souches choisies ont été cultivées en culture agitée & 30"C pendant deux jours, sur un milieu stérilisé de mélasses de betteraves ayant une teneur totale en sucre ajustée å 10 %, contenant 700 ppm de KH2PO4 ét ajusté à pH 5,0. Puis, chacune des cellules cultivées ci-dessus a été inoculée i l'un des 32 milieux stérilisés de mélasses de betteraves ayant une teneur totale en sucre et un pH ajustés respectivement i 24 % et 5,0, et elle y a provoqué une fermentation. La souche particulière qui produisait l'alcool avec la concentration la plus élevée dans le bouillon de culture par comparaison avec les souches parentales a été sélectionnée.Cette souche était la souche H-l mentionnée ci-dessus, et le rapport dans lequel une souche possédant le même pouvoir de production d'alcool serait produite par le mode opératoire mentionné ci-dessus.était de plus de 70 %.
Ensuite, la souche H-l ainsi obtenue a été inoculée i un milieu d'eau résiduaire distillée contenant 50.000 ppm de TOC (carbone organique total) et soumise & une culture agitée de deux jours & 30il. Les cellules viables après culture ont été cultivées plusieurs fois dans le même milieu d'eau résiduaire distillée dans les mêmes conditions que ci-dessus. Ce mode opératoire a été répété dix fois. Les cellules viables après le dixième cycle de culture ont été inoculées. i un milieu d'eau résiduaire distillée contenant 2 % de gélose, et y ont été cultivées pendant deux jours & 30"C. 32 souches ont été prélevées sur les colonies qui s'étaient ensuite développées sur le milieu.Un total de 32 milieux de mélasses de betteraves contenant 10 % de sucre total et 700 ppm de KR2PO4 ont été ajustés i pH 5,0 et stérilisés en autoclave. A chacun des 32 milieux ainsi traités, on a inoculé une souche avec une anse et on l'y a soumise i une culture agitée de deux jours i 30 e C. De cette manière, on a obtenu des suspensions de levure (bouillons de culture)
Un milieu de culture de mélasses de betteraves contenant 24 % de sucre total a été préparé, ajusté à pH 5,0 et stérilise en autoclave. Le milieu de culture stérilisé a été divisé en 32 milieux ayant chacun un volume de 250 ml.Dans chacun de ces milieux, les suspensions de levure mentionnées ci-dessus ont été ajoutées dans des quantités calculées pour donner une concentration fixe de 4,0x107 cellules/ml et soumises à la fermentation alcoolique. La souche particulière qui produisait des cellules de levure présentant, après fermentation, un rapport de survie et une productivité d'éthanol élevés par comparaison avec les souches parentales, était sélectionnée.
Un milieu de culture de mélasses de betteraves contenant 24 % de sucre total a été préparé, ajusté à pH 5,0 et stérilise en autoclave. Le milieu de culture stérilisé a été divisé en 32 milieux ayant chacun un volume de 250 ml.Dans chacun de ces milieux, les suspensions de levure mentionnées ci-dessus ont été ajoutées dans des quantités calculées pour donner une concentration fixe de 4,0x107 cellules/ml et soumises à la fermentation alcoolique. La souche particulière qui produisait des cellules de levure présentant, après fermentation, un rapport de survie et une productivité d'éthanol élevés par comparaison avec les souches parentales, était sélectionnée.
Un milieu de culture de mélasses de betteraves (contenant 10 % de sucre total et 700 ppm de KH2PO4, pH 5,0, a été préparé et du 2-desoxyglucose (2DOG) y a été ajouté & une concentration de 150 ppm. Dans le milieu de culture formé, la souche sélectionnée ci-dessus a été cultivée i 30 C pendant 2 jours. La souche cultivée a été inoculée et cultivée sur un milieu de culture gélose mélasse de betteraves contenant du 2DOG (teneur en gélose 2 %). La colonie formée sur le milieu a été choisie et inoculée à un nouveau milieu de même composition. Le mode opératoire décrit ci-dessus a été répété sur un total de trois cycles.Les grandes colonies isolées qui se sont développées sur le milieu de gélose contenant du 2DOG ont été cultivées sur le milieu de culture de mélasses de betteraves mentionné ci-dessus, i & pendant deux jours.
Les cellules cultivées sur le milieu de mélasses de betteraves ont été inoculées sur 32 milieux de mélasses de betteraves, contenant 24 % de sucre total et ajustés à pH 5,0, puis elles ont été soumises à la fermentation alcoolique à 30*C pendant 5 jours. Seules les souches qui produisaient une concentration d'alcool dépassant 13,5 % ont été sélectionnées. On obtenu ainsi les souches M-9.
Exemple 2
Comme milieu de culture, on utilise 250 ml de mélasse de betteraves ayant une teneur totale en sucre de 10 % et complétés avec 700-ppm de KH2PO4, ajustés à pH 5,0 et stérilisés en autoclave. Dans le milieu de culture ainsi traité, on inocule une anse de la souche M-9 obtenue dans l'exemple 1 et on la soumet à une culture agitée de 2 jours & 30 C.
Comme milieu de culture, on utilise 250 ml de mélasse de betteraves ayant une teneur totale en sucre de 10 % et complétés avec 700-ppm de KH2PO4, ajustés à pH 5,0 et stérilisés en autoclave. Dans le milieu de culture ainsi traité, on inocule une anse de la souche M-9 obtenue dans l'exemple 1 et on la soumet à une culture agitée de 2 jours & 30 C.
On ajuste à pH 5,0 500 ml de milieu de culture de mélasses de betteraves contenant 24 % de sucre total et 700 ppm de KH2PO4. On place ce milieu de culture dans un bocal de fermentation ayant un volume intérieur de 1000 ml et on inocule la souche M-9 cultivée mentionnée ci-dessus au milieu de culture, à une concentration de 1x108 cellules/ml. Puis on agite le contenu du bocal (100 à 200 tours/min. > en mode anaérobie à 30 C pendant 5 jours pour la production d'éthanol.
A titre de comparaison, on effectue la production d'éthanol en suivant le mode opératoire décrit ci-dessus, excepté que l'on utilise la souche correspondant à la souche H-1 obtenue dans l'exemple 1, qui est une souche parentale de la souche M-9. Les résultats sont données dans la figure 1.
I1 ressort clairement des résultats que dans le cas de la souche H-l, la vitesse de fermentation éthanolique est relativement élevée, mais la production d'éthanol se stabilise i 12,8 % V/V au cinquième jour de fermentation.
Au contraire, dans le cas de la souche N-9, la vitesse initiale de production d'éthanol dépasse celle obtenue avec la souche H-l, et, qui plus est, la production d'éthanol atteint environ 13,5 % V/V au quatrième jour de fermentation. I1 en résulte que la concentration finale en éthanol dépasse 1 % V/V en un laps de temps plus court que pour la souche H-i. Les nombres de cellules viables dans les solutions de fermentation (cellules/ml) au cinquième jour de la fermentation sont donnés dans le tableau 1.
Tableau 1
Souche H-l Souche M-9
(cellules/ml)
1x107 x
I1 ressort clairement des résultats que le nombre de cellules de la souche M-9 est 7 fois plus élevé que celui de la souche H-l même lorsque la fermentation est terminée, et que ce nombre est proche du nombre de cellules existant au moment de l'inoculation.
Souche H-l Souche M-9
(cellules/ml)
1x107 x
I1 ressort clairement des résultats que le nombre de cellules de la souche M-9 est 7 fois plus élevé que celui de la souche H-l même lorsque la fermentation est terminée, et que ce nombre est proche du nombre de cellules existant au moment de l'inoculation.
Exemple 3
On stérilise en autoclave un milieu de culture YM à 2 % (produit de la -Difco Corp., vendu sous la marque commerciale "YX Broth"). Dans le milieu de culture stérilisé, on inocule une anse d'une culture inclinée de la souche M-9 obtenue dans l'exemple 1 et on la cultive sous agitation i 30"C pendant 2 jours. On ajuste ensuite à pH 5,0 un milieu de culture de mélasses de canne contenant 24 % de sucre total, 0,1 % de (NH4)2SO4 et 0,1 % de KH2PO4 et on le stérilise en autoclave.Dans 250 ml du milieu ainsi traité, on inocule la suspension de levure de la culture mentionnée ci-dessus, en quantité calculée pour que la souche M-9 y soit contenue à une concentration de 4,0x107 cellules/ml, et on soumet le tout à une fermentation pour la production d'éthanol pendant quatre jours.
On stérilise en autoclave un milieu de culture YM à 2 % (produit de la -Difco Corp., vendu sous la marque commerciale "YX Broth"). Dans le milieu de culture stérilisé, on inocule une anse d'une culture inclinée de la souche M-9 obtenue dans l'exemple 1 et on la cultive sous agitation i 30"C pendant 2 jours. On ajuste ensuite à pH 5,0 un milieu de culture de mélasses de canne contenant 24 % de sucre total, 0,1 % de (NH4)2SO4 et 0,1 % de KH2PO4 et on le stérilise en autoclave.Dans 250 ml du milieu ainsi traité, on inocule la suspension de levure de la culture mentionnée ci-dessus, en quantité calculée pour que la souche M-9 y soit contenue à une concentration de 4,0x107 cellules/ml, et on soumet le tout à une fermentation pour la production d'éthanol pendant quatre jours.
Les résultats sont donnés dans le tableau 2 ci-dessous.
Tableau 2
Temps (jours) Quantité d'éthanol produite (V/V t)
1 11,9
2 13,50
3 - 13,75
4 13,8
Exemple 4
On ajuste à pH 5,0 250 ml de milieu de culture de mélasses de betteraves contenant 10% de sucre total et 700 ppm de KH2PO4, et-on les stérilise en autoclave. Dans le milieu de culture, on inocule une anse de la souche M-9 obtenue dans l'exemple 1 et on la cultive sous agitation à 30C pendant 2 jours.
Temps (jours) Quantité d'éthanol produite (V/V t)
1 11,9
2 13,50
3 - 13,75
4 13,8
Exemple 4
On ajuste à pH 5,0 250 ml de milieu de culture de mélasses de betteraves contenant 10% de sucre total et 700 ppm de KH2PO4, et-on les stérilise en autoclave. Dans le milieu de culture, on inocule une anse de la souche M-9 obtenue dans l'exemple 1 et on la cultive sous agitation à 30C pendant 2 jours.
On inocule ensuite dans 250 ml de mélasses de betteraves, ajustes à une teneur totale en sucre de 15 % et à pH 5,0, la souche cultivée M-9 dans une quantité cal culée pour correspondre à un nombre de cellules initial de 1x108 cellules/ml et on agite en mode anaérobie avec un agitateur magnétique à la vitesse d'environ 100 tours/min.
à 30 C pendant 2 jours, pour effectuer la fermentation.
Lorsque la fermentation est terminée, on laisse reposer la solution de fermentation pendant 10 min. Les cellules sédimentent et se tassent jusqu'à constituer moins de 1/10 du volume total de la solution de fermentation. On élimine le liquide surnageant qui se forme dans la solution de fermentation lorsque la production d'éthanol est terminée et on recharge la solution de fermentation restante avec des mélasses de betteraves franches, à la concentration mentionnée ci-dessus, pour remplacer le volume perdu par élimination. On soumet la solution de fermentation ainsi préparée à une fermentation dans les mêmes conditions. On répète le mode opératoire décrit ci-dessus jusqu'à un total de cinq cycles. Les quantités d'éthanol produites et les nombres de cellules viables formées dans chacun des cinq cycles sont indiqués respectivement dans la figure 2 et le tableau 3.
Tableau 3
Cycle de fermen- Nombre initial de Nombre final de
tation en discon- cellules cellules
tinu (par ml) (par ml)
Premier 1 x 108 9 x
Second 9 x 107 9 x
Troisième 9 x 107 9 x
Quatrième 9 x 107 8 x 107
Cinquième 8 x 107 7 x
I1 ressort clairement de la figure 2 que la production d'alcool par utilisation continue de la souche est stable lorsque la concentration en sucre est de 15 %.
Cycle de fermen- Nombre initial de Nombre final de
tation en discon- cellules cellules
tinu (par ml) (par ml)
Premier 1 x 108 9 x
Second 9 x 107 9 x
Troisième 9 x 107 9 x
Quatrième 9 x 107 8 x 107
Cinquième 8 x 107 7 x
I1 ressort clairement de la figure 2 que la production d'alcool par utilisation continue de la souche est stable lorsque la concentration en sucre est de 15 %.
On note également dans le tableau ci-dessus que le nombre de cellules de levure viables après fermentation est le même que celui existant au moment de l'inoculation.
Lorsque la fermentation est terminée, les cellules de levure sédimentent aisément en un cours laps de temps lorsqu'on laisse simplement reposer la solution de fermentation, en donnant naissance h une bouillie de haute densitê et donnent ainsi une solution limpide de fermentation.
Exemple 5
On cultive en mode anaérobie, sous agitation et à 30'cula souche N-9 de l'exemple 1 et la souche 909-1 comme témoin. On prélève des échantillons des solutions de fermentation au cours de l'agitation et au bout d'une minute de repos après la fin de l'agitation, et on soumet les échantillons i une mesure de turbidité (D.O.
On cultive en mode anaérobie, sous agitation et à 30'cula souche N-9 de l'exemple 1 et la souche 909-1 comme témoin. On prélève des échantillons des solutions de fermentation au cours de l'agitation et au bout d'une minute de repos après la fin de l'agitation, et on soumet les échantillons i une mesure de turbidité (D.O.
absorbance mesurée avec une cellule de 10 mm i une longueur d'onde de 660 nm) et du pourcentage du volume occupé par les cellules dans la solution de fermentation.
Les résultats sont donnés dans le tableau 4.
Tableau 4
Turbidité (D.O.)
Souche Au cours de l'agitation Après une min. de repos
(D.O.) (D.O.)
M-9 8,0 0,10
909-1 8,44 7,50
Pourcentage volumique occupé par
les cellules dans la solution de fermentation
Souche Au cours de l'agitation Après une min. de repos
(%) (%)
N-9 100 % 5 % (95 % de liquide
surnageant)
909-1 100 % 99 % (1 % de liquide
surnageant)
I1 ressort clairement des résultats ci-dessus que la solution de fermentation de la souche 909-1 reste i l'état de suspension même au bout d'une minute de repos après la fin de l'agitation, tandis que la solution de fermentation de la souche M-9 subit la floculation et la sédimentation {médiatenent après l'arrêt de l'agitation, la sédimentation et la séparation étant terminées en une minute.
Turbidité (D.O.)
Souche Au cours de l'agitation Après une min. de repos
(D.O.) (D.O.)
M-9 8,0 0,10
909-1 8,44 7,50
Pourcentage volumique occupé par
les cellules dans la solution de fermentation
Souche Au cours de l'agitation Après une min. de repos
(%) (%)
N-9 100 % 5 % (95 % de liquide
surnageant)
909-1 100 % 99 % (1 % de liquide
surnageant)
I1 ressort clairement des résultats ci-dessus que la solution de fermentation de la souche 909-1 reste i l'état de suspension même au bout d'une minute de repos après la fin de l'agitation, tandis que la solution de fermentation de la souche M-9 subit la floculation et la sédimentation {médiatenent après l'arrêt de l'agitation, la sédimentation et la séparation étant terminées en une minute.
Dans ce cas, les cellules de levure sédimentent et se tassent jusqu' constituer moins de 1/10 du volume total de la solution de fermentation. Le liquide surnageant est une solution limpide contenant des cellules de levure peu nombreuses.
En raison de la nature de la souche M-9 décrite ci-dessus, la séparation des cellules de levure lorsque la fermentation est terminée pourrait être effectuée par un simple repos de la solution de fermentation, sans exiger l'utilisation d'aucun dispositif mécanique tel qu'un séparateur centrifuge ou un séparateur ordinaire. Ainsi, la séparation des cellules de levure d'avec la solution de fermentation est obtenue en quelques minutes. Le liquide surnageant peut être envoyé aussitôt au stade de distillation et les cellules de levure sédimentées peuvent être recyclées pour leur réutilisation.
Exemple 6
Dans un milieu de culture de mélasses de betteraves ajusté i une teneur totale en sucre de 24 % et à pH 5,0, on inocule Saccharomyces cerevisiae Kyokai n" 701 (numéro de série assigné par la Society of Brewing, Japon) et la souche M-9 i raison de 5x108 cellules/ml et de 5x107 cellules/ml respectivement, et on les agite à 30"C pour une culture mélangée pendant une journée. A la fin de la culture; on détermine dans la solution de culture le nombre de cellules viables de la souche M-9 et de la souche Kyokai nO 701 en utilisant un milieu gélose alanine (the Society of Brewing, Japon).
Dans un milieu de culture de mélasses de betteraves ajusté i une teneur totale en sucre de 24 % et à pH 5,0, on inocule Saccharomyces cerevisiae Kyokai n" 701 (numéro de série assigné par la Society of Brewing, Japon) et la souche M-9 i raison de 5x108 cellules/ml et de 5x107 cellules/ml respectivement, et on les agite à 30"C pour une culture mélangée pendant une journée. A la fin de la culture; on détermine dans la solution de culture le nombre de cellules viables de la souche M-9 et de la souche Kyokai nO 701 en utilisant un milieu gélose alanine (the Society of Brewing, Japon).
Comme témoin, on inocule séparément la souche Kyokai n 701 et la souche N-9, on les cultive dans les mêmes conditions et on détermine dans chacune des solutions de culture le nombre de cellules viables. Les résultats sont donnés dans le tableau 5 ci-dessous.
Tableau 5
Souche Nombre initial de Nombre final de
cellules cellules
(par ml) (par ml)
Culture M-9 5 x 107 1 x 108 mélangée Kyokai 701 5 x 108 8 x 104
Témoin Kyokai 701 5 x 1Q8 8 x 108
(culture M-9 5 x 107 1 x 108
unique)
On constate d'après les résultats ci-dessus que le nombre de cellules dea la souche Kyokai n 701, qui existait dans une proportion 10 fois supérieure à celle de la souche M-9 au moment de l'inoculation, s'est abaissé à environ 1/1000 de sa valeur initiale au bout d'un jour de culture, ce qui indique une extinction progressive au cours de la culture. Au contraire, le nombre ae cellules de la souche M-9 est resté inchangé, ce qui indique que la souche M-9 possède un phénotype tueur contre d'autres levures.
Souche Nombre initial de Nombre final de
cellules cellules
(par ml) (par ml)
Culture M-9 5 x 107 1 x 108 mélangée Kyokai 701 5 x 108 8 x 104
Témoin Kyokai 701 5 x 1Q8 8 x 108
(culture M-9 5 x 107 1 x 108
unique)
On constate d'après les résultats ci-dessus que le nombre de cellules dea la souche Kyokai n 701, qui existait dans une proportion 10 fois supérieure à celle de la souche M-9 au moment de l'inoculation, s'est abaissé à environ 1/1000 de sa valeur initiale au bout d'un jour de culture, ce qui indique une extinction progressive au cours de la culture. Au contraire, le nombre ae cellules de la souche M-9 est resté inchangé, ce qui indique que la souche M-9 possède un phénotype tueur contre d'autres levures.
Claims (6)
1. Souche de levure douée d'une forte capacité de production de l'alcool par fermentation, désignée sous le nom de Souche M-9 (FERN BP 1481) du genre Saccharomyces cerevisiae.
2. Procédé pour la production d'une souche de levure M-9 (FERM BP 1481) douée d'une forte capacité de production de l'alcool par fermentation, caractérisé par la conjugaison directe de l'haploide de la souche Ne 909-1 avec chaque tétrade des ascopores de la souche N" 180 par appariement spore-avec-cellule, l'acclimatation du zygote obtenu dans un milieu de résidu de fermentation alcoolique et l'acclimatation des cellules survivantes du. zygote dans un milieu de mélasses de betteraves contenant du 2 -désoxyglucose.
3. Procédé pour la production d'alcool, caractérisé par la conjugaison- directe de l'haploide de. la souche n" 909-1 avec chaque tétrade des ascopores de la souche N" 180 pal appariement spore-avec-cellule7 l'acclimatation du zygote obtenu dans. un milieu de résidu de fermentation alcoolique, l'acclimatation des cellules du zygote survivantes dans un milieu de mélasses de betteraves contenant du 2-désoxyglucose, et la culture de la souche de levure acclimatée obtenue dans un milieu de mêlasses de betteraves, ce qui aboutit i une production d'alcool.
4. Procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce que la souche de levure acclimatée est la Souche M-9 (FERM BP-1481).
5. Procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce que les mélasses de betteraves utilisées pour effectuer la production d'alcool ont une teneur totale en sucre de 24 %.
6. Procédé de la revendication 3, caractérisé en ce que la production d'alcool est effectuée de façon anaérobie à 300C.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR888805247A FR2630455B1 (fr) | 1988-04-20 | 1988-04-20 | Souche de levure ayant un pouvoir eleve de production d'alcool par fermentation et procede pour la production d'alcool par fermentation utilisant cette souche de levure |
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Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2630455A1 true FR2630455A1 (fr) | 1989-10-27 |
| FR2630455B1 FR2630455B1 (fr) | 1994-07-29 |
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Cited By (2)
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| WO1995014774A2 (fr) * | 1993-11-24 | 1995-06-01 | Centre National De La Recherche Scientifique | Gene de resistance a la toxicite de la melasse, produits relies et leur utilisation pour analyser et ameliorer les microorganismes et les melasses |
| WO2011048238A2 (fr) * | 2009-10-15 | 2011-04-28 | Bodegas Dagón S.L.N.E. | Procédé permettant de cultiver des vignobles et obtention de levures pour la fermentation dans des teneurs élevées en sucre et en alcool |
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| JPS59135896A (ja) * | 1982-12-17 | 1984-08-04 | Mitsui Eng & Shipbuild Co Ltd | アルコ−ルの発酵生産法 |
| JPS6034179A (ja) * | 1983-08-03 | 1985-02-21 | Tax Adm Agency | キラ−アルコ−ル酵母 |
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| FR2616445A1 (fr) * | 1987-06-15 | 1988-12-16 | Enea | Procede pour la production d'ethanol au moyen de souches de microorganisme a haute resistance |
-
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- 1988-04-20 FR FR888805247A patent/FR2630455B1/fr not_active Expired - Fee Related
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| WO1995014774A3 (fr) * | 1993-11-24 | 1996-09-19 | Centre Nat Rech Scient | Gene de resistance a la toxicite de la melasse, produits relies et leur utilisation pour analyser et ameliorer les microorganismes et les melasses |
| WO2011048238A2 (fr) * | 2009-10-15 | 2011-04-28 | Bodegas Dagón S.L.N.E. | Procédé permettant de cultiver des vignobles et obtention de levures pour la fermentation dans des teneurs élevées en sucre et en alcool |
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| WO2011048238A3 (fr) * | 2009-10-15 | 2011-06-09 | Bodegas Dagón S.L.N.E. | Procédé permettant de cultiver des vignobles et obtention de levures pour la fermentation dans des teneurs élevées en sucre et en alcool |
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| FR2630455B1 (fr) | 1994-07-29 |
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