FR2692908A1 - Procédé de cofermentation du glucose et du xylose en éthanol par culture mixte de microorganismes. - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un procédé de production d'éthanol par mise en fermentation en présence d'oxygène d'un milieu de culture alimenté en éléments nutritifs et en un mélange de sucres contenant du glucose et du xylose comme sucres majeurs, constituant la source essentielle de carbone pour la fermentation, et en présence simultanée d'au moins une première levure capable de convertir le glucose en éthanol et d'au moins une seconde levure n'appartenant pas au même genre que la première levure, capable de convertir le xylose en éthanol, dans des conditions de culture permettant le développement desdites levures, caractérisé en ce que la première levure est un mutant déficient respiratoire de ladite première levure capable de convertir le glucose en éthanol.

Description

La présente invention concerne un procédé de production d'éthanol par cofermentation du glucose et du xylose par un couple de microorganismes comprenant un microorganisme fermentant le glucose et un microorganisme fermentant le xylose . Le but de la présente invention est de fournir un procédé pour transformer , par voie biologique , le glucose et le xylose en éthanol, de façon simultanée dans une seule zone de réaction
La biomasse issue des produits et/ou coproduits agricoles ou agro-alimentaires constitue un réservoir considérable pour la production de molécules d'intérêt industriel . Ce gisement à caractère renouvelable est en effet estimé à 107 tonnes équivalent charbon par an à l'échelle mondiale . Parmi ces molécules , l'éthanol occupe une place très intéressante .Cette molécule peut d'une part offrir des débouchés massifs et diversifiés à l'agriculture et d'autre part constituer un substitut aux produits pétroliers dont le marché est fragile ( prix , offre ) . L'éthanol peut être utilisé dans le domaine énergétique ( carburants ou additifs aux carburants fossiles comme donneurs d'octane ) et dans le domaine alimentaire . Par ailleurs, il peut constituer une molécule de base pour la carbochimie et peut donc avoir des débouchés dans les plastiques , peintures, caoutchoucs fibres , films .Concernant l'utilisation de l'éthanol dans le domaine énergétique , le marché est estimé à 12 millions d'hectolitres par an au niveau français . il faut souligner que les biocarburants sont favorables à la qualité de l'environnement , en limitant les émissions toxiques (monoxyde de carbone , composés azotés
La transformation du carbone agricole en éthanol (notamment les hexoses ) par voie fermentaire peut être considérée comme techniquement maîtrisée . Néanmoins une limitation importante subsiste au niveau des coûts de production, compte tenu du fait que le prix de la matière première entre pour 40 à 70 % dans le coût du produit final.

Il est donc impératif d'un point de vue économique d'utiliser du carbone fermentescible à faible coût . Dans ce cadre, l'utilisation des sucres dérivés des lignocelluloses apparaît favorable pour lever cette limitation . De plus , parmi les sources de carbone fermentescible , les lignocelluloses sont bien placées pour leur teneur en sucres par rapport à la matière sèche et au niveau de disponibilité . L'utilisation des lignocelluloses pour la production d'éthanol peut d'une part concerner les coproduits ( rafles , pailles, bagasse dans le cas d'une production d'éthanol à partir de produits agricoles comme les céréales ou les mélasses de canne et d'autre part concerner exclusivement certains produits agricoles ( taillis à courte rotation).Le schéma est dépendant de la conversion alcoolique du xylose , sucre dérivé des hémicelluloses et représentant le second sucre en termes quantitatifs, après le glucose d'origine cellulosique , des matériaux lignocellulosiques
Des procédés de production d'éthanol à partir d'une substance contenant du xylose , comprenant la fermentation de cette substance avec une levure ont été décrits , notamment dans les brevets US-A-4.359.534 et 4.368.268 dans lesquels la fermentation utilise les levures appartenant aux espèces
Pachysolen tannophilus ou Pichia stipitis ou Pichia segobrensis ou Candida shehatae ou des mutants de levures de la souche Candida sp. La description de ces procédés a suscité un regain d'intérêt pour la conversion des lignocelluloses en éthanol .En effet, la conversion du sucre majeur dérivé de la fraction hémicellulosique ( xylose ) en plus de celle du sucre majeur dérivé de la fraction cellulosique ( glucose permettrait d'augmenter le rendement global de conversion des lignocelluloses en éthanol.

Le procédé de conversion alcoolique du glucose par des microorganismes du genre Saccharomyces ou Zymomonas ainsi que le procédé de conversion alcoolique du xylose par les levures décrites ci-dessus ont été largement étudiés individuellement aux points de vue cinétique, stoechiométrique et physiologique. Maintenant , il s'agit de développer des schémas de production d'éthanol par fermentation des lignocelluloses qui utilisent à la fois le glucose dérivé de la cellulose et le xylose dérivé des hémicelluloses.

Bien que les levures fermentant le xylose puissent également convertir le glucose en éthanol, il est préférable de réaliser cette conversion avec un microorganisme à haut potentiel fermentaire du glucose du genre Saccharomyces ou
Zymomonas, dont les rendements alcooliques et les productivités à partir de ce sucre sont plus élevés que ceux obtenus à partir du glucose avec des levures comme Pichia stipitis, Candida shehatae ou Pachysolen tannophilus . En utilisant des microorganismes spécifiques de chacun des deux sucres , il est possible de concevoir deux types de procédés de conversion du glucose et du xylose en éthanol:
a) Procédés de fermentations parallèles du glucose et du xylose faisant suite à une séparation de ces deux sucres au stade de l'hydrolyse ( hydrolysats hémicellulosique et cellulosique respectivement ).

b) Procédés de fermentation simultanée du glucose et du xylose par coculture de deux microorganismes, l'un fermentant le glucose , l'autre le xylose ( hydrolysat lignocellulosique total ).

Les procédés de fermentation simultanée du glucose et du xylose utilisant un microorganisme fermentant le glucose associé à un microorganisme fermentant le xylose doivent prendre en compte la nécessité d'un apport d'oxygène pour l'obtention d'une conversion accrue efficace du xylose en éthanol par des levures telles que Pichia stipitis, Candida shehatae ou Pachysolen tannophilus . L'impératif pour ces levures de maintenir un équilibre entre la production et la consommation des cofacteurs d'oxydoréduction ainsi que les caractéristiques métaboliques de la conversion du xylose en éthanol sont à l'origine de la nécessité d'un système générateur de NARD+ comme la chaîne respiratoire pour une fermentation rapide du xylose en éthanol ( Prior B.A., Kilian
S.G., Du Preez J.C., Process Biochemistry, 24 (1) , 21-32, (1989).

De préférence aussi , on s'efforcera de lever ou réduire la répression catabolique exercée par le glucose sur l'utilisation du xylose chez les levures telles que Pichia stipitis, Candida shehatae et Pachysolen tannophilus lorsqu'elles sont cultivées sur un mélange glucose/xylose.

Des essais de cofermentation du glucose et du xylose avec des cellules immobilisées de Pichia stipitis CBS 5573 et de Saccharomyces cerevisiae CBS 8066 ont été décrits par
Grootjen D.R.J. Meijlink L.H.H.M., Vleesenbeek R. Van der Lans
R.G.J.M., Luyben K.Ch.M., Enzyme and Microbial Technology, 13, 530-536 (1991). Avec ces souches de levures co-immobilisées dans un même réacteur et en utilisant des conditions de culture continue et aérobie , un faible taux de conversion du xylose est obtenu en dépit de l'utilisation d'une forte concentration cellulaire de Pichia stipitis . Ces auteurs rapportent que le phénomène observé est dû au fait que Pichia stipitis est privée d'oxygène , celui-ci étant consommé par la levure Saccharomyces cerevisiae qui fermente le glucose du mélange de sucre étudié . Le même phénomène a été observé en utilisant ces deux souches de levures dans deux réacteurs en série ( voir : Grootjen D.R.J. Jansen M.L., Van der Lans
R.G.J.M. and Luyben K.Ch.M., Enzyme and Microbial Technology, 13, 828-833,(1991).

D'autres essais de cofermentation du glucose et du xylose par Saccharomyces cerevisiae associée à Pachysolen tannophilus cultivées en système discontinu et en microaérobiose ont été décrits par Beck M.J. Johnson R.D.,
Baker C.S., Applied Biochemistry and Biotechnology, 24/25, 415-424 , 1990. Dans ces essais, les auteurs observent , à défaut d'une cofermentation des deux sucres , une utilisation séquentielle du glucose et du xylose.

Ainsi les essais réalisés jusqu'à ce jour en laboratoire n'ont pas permis la mise au point d'un procédé efficace pour la cofermentation alcoolique du glucose et du xylose dans une même zone de réaction, l'obstacle majeur étant la non disponibilité de l'oxygène transféré à la culture pour la levure utilisée pour la fermentation du xylose en éthanol.

Le but de la présente invention est de fournir un procédé qui permet en cocultivant un microorganisme fermentant le glucose avec un microorganisme fermentant le xylose d'obtenir la cofermentation efficace du glucose et du xylose en éthanol.

Les microorganismes utilisables dans l'invention sont des levures appartenant à des espèces fermentant efficacement le glucose en éthanol et par exemple l'espèce Saccharomyces cerevisiae pour la fermentation du glucose et des levures autres que les précédentes capables de convertir le xylose en éthanol, et par exemple des espèces Pichia stipitis et Candida shehatae pour la fermentation du xylose.

L'invention a pour objet un procédé de production d'éthanol par mise en fermentation, en présence d'oxygène, d'un milieu de culture alimenté en éléments nutritifs et en un mélange de sucres contenant du glucose et du xylose comme sucres majeurs , constituant la source essentielle de carbone pour la fermentation, et en présence simultanée d'au moins une première levure capable de convertir le glucose en éthanol et d'au moins une seconde levure n'appartenant pas au même genre que la première levure capable de convertir le xylose en éthanol , dans des conditions de culture permettant le développement desdites levures, caractérisé en ce que la premiere levure est un mutant déficient respiratoire de ladite première levure capable de convertir le glucose en éthanol
On opère de préférence avec des additions continues ou périodiques dudit mélange des sucres, avec si nécessaire des éléments nutritifs additionnels , lesdites additions n'étant effectuées que lorsque au moins 80% et de préférence au moins 98% du glucose précédemment introduit a déjà été converti.

Par "éléments nutritifs" , on entend les éléments bien connus nécessaires à la croissance des levures , et par exemple de l'extrait de levure, de l'extrait de malt et un ou plusieurs sels minéraux , notamment du sulfate d'ammonium. Ces éléments ne constituent pas la source essentielle de carbone, celle-ci étant constituée par l'apport en sucres précité.

On peut opérer avec les cellules dispersées en continu ou semi-continu ( fed-batch) comme décrit en détail ci-après.

On peut aussi opérer en culture à haute densité cellulaire
Dans ce cas les cellules de levures sont retenues dans le fermenteur , et cela par exemple avec des cellules immobilisées, avec des cellules floculées ou avec des cellules recyclées par une technique utilisant une membrane
Le fait d'opérer à taux élevé de conversion du glucose se traduit par le maintien d'une faible valeur de la concentration en glucose dans le milieu de fermentation; cela est rendu possible , malgré l'alimentation continue ou périodique en mélange de glucose et xylose, par le fait que la vitesse de conversion du glucose par la première levure est élevée .On parvient ainsi à lever ou réduire l'inhibition exercée par le glucose sur la levure de conversion du xylose
Par ailleurs , le fait d'utiliser une première souche à besoin nul ou négligeable en oxygène rend celui-ci disponible pour la levure convertissant le xylose
Dans ce qui suit , on décrira l'invention dans le cas où la première levure est Saccharomyces cerevisiae ou
Saccharomyces diastaticus , qui constituent les espèces dont l'emploi est préféré dans l'invention.Mais il doit être entendu que toute autre levure à bon pouvoir de conversion du glucose en éthanol pourra convenir après avoir subi un traitement pour la transformer en mutant déficient respiratoire
A titre d'exemples de telles souches , on peut mentionner
Saccharomyces ellipsoïdeus
Saccharomyces carlberqensis
Saccharomyces uvarum
Saccharomyces fragilis
Schizosaccharomyces pombe
Schizosaccharomyces species
Kluyveromyces marxianus
Zygosaccharomyces rouxii
Saccharomyces bayanus.

On opère de préférence avec alimentation et soutirage continus ou périodiques, de manière à maintenir un volume réactionnel sensiblement constant . De préférence, en marche continue , on maintient un taux d'alimentation en mélange des sucres tel que le dosage du glucose par HPLC ou chromatographie liquide à haute performance dans l'effluent du fermenteur donne une valeur nulle, c'est-à-dire une concentration inférieure à la limite de précision du dosage estimée à 0,1 g de glucose/litre . On est ainsi assuré qu'à chaque instant plus de 80% du glucose a été converti.

On peut aussi opérer avec une alimentation continue ou périodique sans soutirage (fed-batch) bien que ce soit moins avantageux . Dans ce cas également on ne procédera à une nouvelle addition du mélange de sucres que lorsque au moins 80% ( ou au moins 98%) du glucose précédemment introduit aura déjà été converti.

En pratique si les taux de conversion tombent audessous de la valeur désirée, on réduira le taux d'alimentation en sucres ; inversement on pourra accroître ce taux d'alimentation si les taux de conversion très élevés le permettent
Par mutant déficient-respiratoire d'une certaine levure
on entend un mutant qui est essentiellement incapable d'assimiler le glycérol ou qui ne l'assimile que faiblement
Ainsi, par exemple un mutant déficient respiratoire de
Saccharomyces cerevisiae n'assimile pas ou pratiquement pas le glycérol, contrairement aux souches conventionnelles telles que CBS 1200 ou NCYC 625
Un test simple permettant de déterminer si une souche est capable ou non d'assimiler le glycérol consiste à cultiver la souche en boîtes de Pétri sur milieu solide à 30 C pendant 48 heures
La culture sur boîte de Pétri à 20 g/l de glucose sert de culture de référence . Sur cette boîte après 48 heures d'incubation à 30"C les colonies ont un diamètre de 2mm environ . Les boîtes contenant lg/l de glucose et celles contenant lg/l de glucose + 20 g/l de glycérol permettent de révéler le caractère déficient respiratoire . En effet , le glycérol est un substrat dont le métabolisme est uniquement respiratoire . En conséquence , les mutants déficients respiratoires sont incapables d'utiliser le glycérol pour leur croissance . Cela se traduit sur la boîte contenant du glucose 1 g/l + glycérol 20 g/l par de petites colonies de O,lmm de diamètre qui ne diffèrent pas sensiblement des colonies observées sur la bote renfermant seulement lg/l de glucose.

Au contraire, une souche non-mutée telle que CBS 1200 ou NCYC 625 , cultivée sur glucose lg/l + glycérol 20 g/l, donne des colonies d'un diamètre d'environ 2 mm , indiquant l'utilisation du glycérol
La mutation de Saccharomyces cerevisiae en mutant déficient respiratoire peut être réalisée selon la méthode dérivée de celle décrite par Slonimski et al. ( Biochemical and Biophysical Research Communications, 1968, vo1.30,N"3, pages 232-239) par exemple comme suit
On cultive les cellules en boîte de Pétri sur un milieu gélosé complet . On dépose une goutte de bromure d'éthydium à 10 mg/l au centre de la boîte . On constate que les cellules situees au centre de la boîte ont été tuées (aucun développement ) .On prélève des colonies à la limite de la zone où les cellules ont été tuées par le bromure d'éthydium
On procède ensuite à un test de croissance de la biomasse sur milieu différentiel ( absence d'assimilation du glycérol ).

Comme levure convertissant le xylose en éthanol, on peut utiliser , par exemple , une levure du genre Pichia ou du genre Candida , choisies de préférence parmi les espèces
Pichia stipitis , Candida shehatae , Pachysolen tannophilus,
Candida utilis, Candida tropicalis, Candida tenuis ou Pichia segobiensis
La levure utilisée pour convertir le xylose en éthanol doit présenter une compatibilité de croissance avec la souche utilisée pour fermenter le glucose, notamment - les mutants déficients respiratoires de Saccharomyces cerevisiae, par exemple ceux obtenus à partir de Saccharomyces cerevisiae CBS 1200 ou NCYC 625 . Cette compatibilité peut être aisément déterminée par un essai préalable simple .Toutes les souches de Pichia stipitis essayées - NRRL Y7124, NRRL Y 11543, NRRL Y 11544, NRRL Y11545 - et toutes les souches de Candida shehatae essayées - NRRL Y12857, NRRL Y 17024, NRRL Y 12 858, NRRL Y 12856, ATCC 22984 - présentent cette caractéristique vis-à-vis de l'une au moins des souches de Saccharomyces cerevisiae précitées . L'utilisation de toutes ces souches à titre nonlimitatif est donc envisagée dans le procédé décrit
Tous les substrats contenant du D-glucose et du Dxylose comme sucres majeurs conviennent dans le procédé décrit pourvu qu'ils ne contiennent aucun constituant qui soit un inhibiteur puissant pour le processus .N'importe quelle matière ligno-cellulosique contenant de la cellulose et de l'hemicellulose telle que bois, paille , bagasse , rafles de maïs peut servir de matière première pour fournir les hydrolysats sucrés utilisables dans le procédé auxquels on peut apporter les éléments nutritifs additionnels nécessaires à la fermentation et qui ont été définis plus haut
Le procédé décrit met en jeu la fermentation alcoolique en milieu aqueux du D-glucose et du D-xylose .Les conditions chimiques et physiques du milieu doivent par ailleurs être telles que la viabilité des deux microorganismes associés soit maintenue
La fermentation est entretenue dans l'intervalle de température de 15-40"C , l'intervalle de 26-34 C étant optimum pour la vitesse de production d'éthanol
Le développement des levures s'effectue dans l'intervalle de pH de 3 à 7 , un développement optimal étant observé au pH de 5.

Comme on l'a vu plus haut, un élément important dans la forme de réalisation préférée du procédé consiste à n'effectuer, en continu ou périodiquement, des ajouts du mélange de sucres que lorsque l'on a vérifié que 80% ( ou de préférence 98 % ) au moins du glucose précédemment introduit a été converti .On pourra utiliser un mélange des sucres glucose et xylose composé par exemple de 10 à 90% de glucose et 90 à 10% de xylose , en poids , et de préférence de 50 à 80% de glucose et 50 à 20 % de xylose , en poids
Si la concentration totale en ce mélange des sucres dans la solution aqueuse sucrée d'alimentation est comprise entre , par exemple , 5g/l et la saturation , et de préférence entre 10 et 150 g/l, on adoptera avantageusement un taux de dilution D, à savoir un rapport du débit volumique horaire de la solution d'alimentation au volume réactionnel de 0,0001 à 2 h 1 et de préférence de 0,001 à 1 h 1 .

I1 est entendu que les autres éléments nutritifs peuvent être apportés en mélange avec les sucres ou séparément.

Les valeurs ci-dessus ne sont toutefois données qu'à titre d'indication, du fait qu'un simple dosage de glucose dans l'effluent du fermenteur permettra de déterminer le taux de conversion du glucose et donc de savoir s'il satisfait les exigences ci-dessus
La culture continue des espèces définies plus haut se fait en présence d'oxygène dans un milieu de culture renfermant les éléments nutritifs classiques bien connus des biochimistes et qu'il est donc inutile d'indiquer en détail ici .Ce milieu renferme entre autres des sels minéraux essentiels , des vitamines et des oligo-éléments
Le débit d'aération doit etre suffisant pour permettre la fermentation des sucres, et notamment du xylose , mais non excessif, ce qui diminuerait le rendement en éthanol par suite d'une production cellulaire accrue et d'une oxydation de l'éthanol produit . La valeur optimale du débit d'air peut être déterminée par des essais simples . Exprimée comme la vitesse de transfert en oxygène, elle est par exemple de 0,0001 à 500 et de préférence 0,001 à 100 millimoles d'oxygène par litre de milieu de fermentation et par heure .Pour la mesurer, il suffit de faire la différence entre l'oxygène introduit dans le fermenteur et l'oxygène déchargé de ce dernier, donc de faire le bilan en oxygène, et de rapporter le résultat à l'unité de volume de milieu de fermentation et à l'unité horaire.

Les exemples suivants sont destinés à décrire plus complètement le procédé de l'invention mais ne doivent pas être considérés comme limitant le domaine de l'invention défini par les revendications.

Procédure expérimentale générale
Par traitement au bromure d'éthydium on a préparé tout d'abord un mutant déficient respiratoire de chacune des deux souches suivantes : Saccharomyces cerevisiae : souches CBS 1200 ( décrite par Hoppe et Coll., Biotechnology. Lettes, 1982, vol.4 ( l ) page 39 et Maiorella et Coll., Biotechnology and Bioengineering, 1984, 26, page 1155), obtenue auprès du
Central Bureau Voor Schimmelculture, Delft ; souche NCYC 625 (décrite par Spencer et Coll., Current Genetics, 1983, 7, page 159 et Kleinman M.J. et Coll., Biochem J, 1988, 249, page 163) obtenue auprès du National Council Yeast Collection, Norwich
Grande-Bretagne
Des cultures inclinées sur gélose de Pichia stipitis ; souches NRRL Y7124 ( décrite par Dellweg et Coll,
Biotechnology Lettes, 1984, 6, page 395 , et Delgenes et
Coll., Biotechnology Bioengineering, 1989, 34, page 398
NRRL Y11543 ( décrite par Dellweg et Colt., Biotechnology Lettes, 1984 , 6, page 695) , NRRL Y11544 (décrite par
Toivola et Coll., Applied Environmental Microbiology, 1984, 47, page 1221) , NRRL Y 11545 ( décrite par Toivola et Coll.,
Applied Environmental Microbioloby, 1984 , 47, page 1221 ) et de Candida shehatae souches NRRL Y 12857 (décrite par
Slininger et Coll., Biotechnology Lettes, 1985, 7, page 431),
NRRL Y 12858 ( décrite par Bruinenberg et Coll., Applied
Microbiology Biotechnology , 1984, 19, page 256) , NRRL Y 12856 ( décrite par Slininger et Coll., Biotechnology Lettes, 1985, 7, page 431 ) , NRRL Y 17024 ( décrite par Kurtzman,
Antonie Van Leeuwenhoek, 1990, 57, page 215 ) ont été obtenues auprès du Northern Regional Research Center, Peoria Illinois.

Une culture inclinée de Candida shehatae ATCC 22984 ( décrite par Dupreez J.C. et Coll., Biotechnology Lettes, 1985, 7, page 241 et Laplace J.M. et Coll., Applied Microbiology and
Biotechnology, 1991, 36, page 158 ) a été obtenue auprès de l'American Type Culture Collection Rockville, Midland
Les souches ont été maintenues sur des cultures inclinées de glucose à 30 C . Le milieu de culture incliné contenait 10 g/l de glucose , 5 g/l de peptone pancréatique 3 g/l d'extrait de levure , 3 g/l d'extrait de malt et 20 g/l de gélose . Les milieux liquides pour la propagation des levures contenaient 5 g/l de sulfate d'ammonium, 3 g/l d'extrait de malt , 3 g/l d'extrait de levure pendant le temps nécessaire à une consommation significative du substrat .La source carbonée consistait en du glucose seul pour
Saccharomyces et du xylose seul pour les levures du genre
Pichia et Candida à la concentration de 50 g/l . La composition du milieu de fermentation ne différait que par la source carbonée qui consistait en un mélange de glucose/xylose aux concentrations respectives de 35 g/l et 15 g/l, proportions qui simulent un hydrolysat total de lignocelluloses . Pour le milieu naturel , la source carbonée est apportée par un hydrolysat total de bois de peuplier obtenu par voie enzymatique et dilué de façon à avoir une concentration globale en sucres de 50 g/l.

Pour réaliser la fermentation, on a introduit dans un fermenteur aéré le milieu liquide à 5 g/l de sulfate d'ammonium, 3 g/l d'extrait de malt et 3 g/l d'extrait de levure et on a alimenté en mélange des sucres ( solution à 50 g/l du mélange des sucres apportant en outre 5 g/l de sulfate d'ammonium, 3 g/l d'extrait de malt et 3 g/l d'extrait de levure ) à un débit positif mais limité de façon à avoir en permanence une conversion de glucose dans le fermenteur supérieure à 90% et de préférence voisine de 100%, ceci en cas d'opération en continu
Dans ces conditions on a pu obtenir une conversion du xylose supérieure à 40% et pouvant même atteindre 100%.

La solution à 50 g/l du mélange des sucres était réalisée dans un milieu liquide de même composition que celui introduit initialement dans le fermenteur ( sulfate d'ammonium + extraits de malt et de levure), l'ensemble apportant tous les éléments nécessaires à la croissance des levures, en quantités non-limitantes Sauf indication contraire , on a opéré à 30 C, pH= régulé à 5 et à un débit d'aération de 0,005 vol/vol/mn.

L'éthanol produit était mesuré par chromatographie en phase gazeuse . Le D-glucose et le D-xylose ont été quantifiés par HPLC (chromatographie en phase liquide à haute performance). Le développement cellulaire total exprimé en g/l ( poids sec ) a été mesuré par gravimétrie . Les proportions cellulaires respectives de la levure utilisée pour fermenter le glucose et de la levure utilisée pour fermenter le xylose exprimées en pourcentage du nombre total de cellules présentes dans le fermenteur ont été déterminées en boîtes de Pétri sur la base de l'inaptitude du mutant déficient respiratoire à utiliser le glycérol comme source de carbone pour sa croissance
Dans les études décrites ci-après les différentes valeurs données dans les tableaux ont été calculées comme suit à partir des dosages effectués sur les prélèvements * Rendement alcoolique , Yp/s ( g d'éthanol produit par g de sucre consommé

Où Ef = concentration en éthanol en sortie SO = concentration en sucres en entrée et Sf = concentration en sucres en sortie * Taux de dilution,

en h 1 * Productivité volumétrique en éthanol , Qp ( g d'éthanol produit par litre de volume réactionnel par heure ).

Qp = Ef.D où D est le taux de dilution tel que défini ci-avant
Dans les exemples qui suivent , on a utilisé des mutants déficients respiratoires de Saccharomyces cerevisiae
CBS 1200 N I-1216 et de Saccharomyces diastaticus (cerevisiae) NCYC 625 N I-1217 qui ont été préparés à partir des souches mères par le procédé du bromure d'éthydium décrit plus haut . On a constaté ensuite que ces mutants n'assimilaient pas le glycérol en procédant selon le test décrit plus haut
EXEMPLE 1:
Cofermentation du mélange modèle de sucres ( 35 g/l de glucose + 15 g/l de xylose) par le mutant déficient respiratoire de Saccharomyces cerevisiae CBS 1200 et Candida shehatae ATCC 22984.L'expérience a été effectuée conformément à la procédure expérimentale générale avec un débit d'aération de 0,01 vvm et une vitesse d'agitation de 800 tours/mn, correspondant à une vitesse de transfert en oxygène de 3,9 mmoles/l/h. Les parametres de fermentation calculés au cours de l'état stationnaire sont reportés dans le tableau 1.

TABLEAU 1
D h-l 0,008 paramètres
Taux de conversion du glucose 100
Taux de conversion du xylose 76
Ethanol produit 12,5
(g/l)
Yp/s (g/g) 0,27
Qp (g/l h) 0,10 % du Candida shehatae 55 % de Saccharomyces cerevisiae 45
Concentration de glucose dans le fermenteur : non-détectable ( < 0,1 g/I
Comme le montre le tableau 1 , le procédé de l'invention a permis d'obtenir la fermentation simultanée du glucose et du xylose en éthanol dans un même réacteur par le couple de levures comprenant le mutant déficient respiratoire de Saccharomyces cerevisiae associé à Candida shehatae
EXEMPLE 2:
Cofermentation du même mélange des sucres que dans l'exemple 1 par le mutant déficient respiratoire de
Saccharomyces cerevisiae NCYC 625 et Pichia stipitis NRRL Y 7124 avec un réacteur du type gazosiphon .On a opéré à haute densité cellulaire en utilisant la floculation comme outil de rétention cellulaire
L'expérience a été effectuée conformément à la procédure expérimentale générale . Trois taux de dilution ont été testés . Pour chaque taux de dilution , les paramètres de fermentation ont été calculés au cours de l'état stationnaire.

Ils sont présentés dans le tableau 2.

TABLEAU 2
D h1 0,076 0,10 paramètres
Taux de conversion du glucose % 100 100 100
Taux de conversion du xylose % 100 100 100
Ethanol produit (g/l) 20,0 20,4 20,75 " (g/g) 0,40 0,41 0,41
Qp (g/l/h) 1,50 2,04 3,10 % de Pichia stipitis 80 85 85 % de Saccharomyces 20 15 15 cerevisiae
Concentration en glucose : indétectable
Pour les trois taux de dilution testés, la totalité du glucose et du xylose est consommée . Le rendement alcoolique de 0,41 g/g correspond à 80% du rendement théorique . Le meilleur rendement alcoolique obtenu avec le couple mutant déficient respiratoire de Saccharomyces cerevisiae NCYC 625 et
Pichia stipitis NRRL Y 7124 par rapport au couple testé dans l'exemple 1 est relatif à une production moindre de xylitol par Pichia stipitis par rapport à Candida shehatae.

EXEMPLE 3
Cofermentation du même mélange de sucres que dans l'exemple 1 par le mutant déficient respiratoire de
Saccharomyces cerevisiae CBS 1200 et Pichia stipitis NRRL Y 11545. L'expérience a été effectuée conformément à la procédure expérimentale générale . Les paramètres rassemblés dans le tableau 3 sont calculés au cours de l'état stationnaire . Le débit d'aération était de 0,005 v/v/m avec agitation de 800 tours/mn soit une vitesse de transfert d'oxygène de 1,7 mmoles/l/h.

TABLEAU 3
D h-l 0,02 paramètres
Taux de conversion du glucose % 100
Taux de conversion du xylose % 69
Ethanol produit ( g/l) 19
Yp/s ( g/g) 0,42
Qp (g/l/h) 0,40 96 de Pichia stipitis 80 % Saccharomyces cerevisiae 20
Concentration en glucose : indétectable
EXEMPLE 4:
Cofermentation du mélange modèle de sucres par le mutant déficient respiratoire de Saccharomyces cerevisiae CBS 1200 et Candida shehatae ATCC 22984 selon le procédé fed-batch c'est-à-dire sans soutirage et avec apports successifs de sucres ( 5 g à la fois ) . Chaque apport était effectué lorsque 90% au moins du glucose de l'apport précédent avait disparu .Ces apports se faisaient sous la forme d'une solution à 150 g/l ( 112,5 g/l de glucose et 37,5 g/l de xylose) apportant en outre le sulfate d'ammonium et les extraits de levure et de malt aux concentrations indiquées plus haut ( respectivement 5g/l, 3 g/l et 3g/l) . Le réacteur était aéré au débit de 0,01 vvm . L'agitation se faisait à 800 tours/mn . Les résultats obtenus figurent au Tableau 4.

TABLEAU 4
D h
Paramètres
Taux de conversion du glucose % 1QO
Taux de conversion du xylose % 55
Ethanol produit ( g/l) 26,8
Yp/s (g/g) 0,26 % de Candida shehatae 16 % de Saccharomyces cerevisiae 84
Les résultats expérimentaux ( exemples 1, 2 et 3 ) ont montré que la mise en oeuvre de conditions de culture continue permet de lever l'effet glucose et par extension conduit à la cofermentation du glucose et du xylose par le couple de levures retenu . Le procédé fed-batch peut également créer ce type de conditions comme le montrent les résultats présentés dans le tableau 4 avec le mutant déficient respiratoire de
Saccharomyces cerevisiae CBS 1200 et Candida shehatae ATCC 22984.

EXEMPLE 5
Cofermentation d'un hydrolysat total de bois de peuplier par le mutant déficient respiratoire de Saccharomyces cerevisiae NCYC 625 et Pichia stipitis NRRL Y7124.

L'hydrolysat total avait la composition suivante
Cellobiose 11 g/kg
Glucose 329 g/kg
Xylose 72 g/kg
Sucres totaux 412 g/kg
Cet hydrolysat a été dilué à l'eau pour obtenir une concentration initiale en sucres de 50 g/l ( 41 g/l de glucose et 9 g/l de xylose ).

L'expérience a été effectuée conformément à la procédure expérimentale générale , avec un réacteur gazosiphon. Le tableau 5 donne les résultats obtenus
TABLEAU 5
D h 1 0,075 0,125
Paramètres
Taux de conversion du glucose % 100 100
Taux de conversion du xylose % 100 100
Ethanol produit (g/l) 12,4 12,5
Yp/s (g/g) 0,25 0,25
Qp (g/l/h) 0,95 1,6 % de Pichia stipitis 60 60 % de Saccharomyces cerevisiae 40 40
Concentration en glucose : indétectable
Il est à noter que dans l'exemple 5 on a utilisé un hydrolysat brut et que des rendements plus élevés en éthanol peuvent être obtenus si l'on soumet l'hydrolysat brut à un traitement préalable de purification , par exemple par résine échangeuse d'ions ou par extraction liquide - liquide avec un solvant
Il convient aussi de noter que , dans les essais précédents , on peut remplacer Candida shehatae ATCC 22984 par
Candida shehatae CSIR 599, remplacer Pichia stipitis NRRL 7124 par Pichia stipitis ATCC 58376 ou CBS 577 et Pichia stipitis
NRRL 11545 par Pichia stipitis ATCC 58785 ou CBS 6054 afin d'obtenir des résultats sensiblement équivalents . De même on peut remplacer les mutants déficients respiratoires de
Saccharomyces cerevisiae CBS 1200 et NCYC 625 par des mutants déficients respiratoires de ATCC 4126 et IFO 1958.

Le mutant déficient respiratoire obtenu à partir de
Saccharomyces cerevisiae CBS 1200 et portant la référence interne CD 2304 a été déposé dans les Collections de l'institut Pasteur sous le n I-1216.

Le mutant déficient respiratoire obtenu à partir de
Saccharomyces diastaticus ( = Saccharomyces cerevisiae ) NCY 625 et portant la référence interne TN 1809 a été déposé dans les Collections de l'institut Pasteur sous le ne I-1217.

Ces nouvelles souches de mutants de Saccharomyces cerevisiae, respectivement inscrites dans la Collection de
Cultures CNCM de l'institut Pasteur à Paris sous les n I-1216 et I-1217, ont permis d'obtenir de bons résultats lorsqu'elles sont mises en oeuvre dans le procédé de l'invention.

Claims (15)

REVENDICATIONS

1. Procédé de production d'éthanol par mise en fermentation en présence d'oxygène d'un milieu de culture alimenté en éléments nutritifs et en un mélange de sucres contenant du glucose et du xylose comme sucres majeurs, constituant la source essentielle de carbone pour la fermentation, et en présence simultanée d'au moins une première levure capable de convertir le glucose en éthanol et d'au moins une seconde levure n'appartenant pas au même genre que la première levure, capable de convertir le xylose en éthanol , dans des conditions de culture permettant le développement desdites levures caractérisé en ce que la première levure est un mutant déficient respiratoire de ladite première levure capable de convertir le glucose en éthanol.

2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel on opère avec des additions continues ou périodiques dudit mélange de sucres, avec si nécessaire des éléments nutritifs additionnels , lesdites additions n'étant effectuées que lorsque au moins 80% du glucose précédemment introduit a déjà été converti.

3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel lesdites additions ne sont effectuées que lorsque au moins 98% du glucose précédemment introduit a déjà été converti.

4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel en outre on soutire de manière continue ou périodique une partie du mélange présent dans la zone de fermentation de manière à maintenir un volume de milieu de fermentation sensiblement constant

5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 dans lequel on alimente de façon continue ou périodique sans soutirer de milieu de fermentation.

6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 , dans lequel le mutant déficient respiratoire capable de convertir le glucose en éthanol est un mutant déficient respiratoire de Saccharomyces cerevisiae ou Saccharomyces diastaticus et la levure capable de convertir le xylose en éthanol est du genre Pichia ou du genre Candida.

7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 , dans lequel le mutant déficient respiratoire capable de convertir le glucose en éthanol est un mutant respiratoire de l'une des souches

Saccharomyces ellipsoïdeus

Saccharomyces carlberqensis

Saccharomyces uvarum

Saccharomyces fragilis

Schizosaccharomyces pombe

Schizosaccharomyces species

Kluyveromyces marxianus

Zygosaccharomyces rouxii

Saccharomyces bayanus et la levure capable de convertir le xylose en éthanol est du genre Pichia du genre Candida ou du genre Pachysolen

8. Procédé selon la revendication 6 ou la revendication 7 , dans lequel la levure capable de convertir le xylose en éthanol est de l'espèce Pichia stipitis ou Candida shehatae

Pachysolen tannophilus, Candida utilis , Cndida tropicalis

Candida tenuis, ou Pichia segobiensis

9.Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 , dans lequel la levure convertissant le xylose en éthanol est choisie parmi les souches Pichia stipitis NRRL Y 7124,

NRRL Y 11 543, NRRL Y 11544, NRRL Y 11545, ATCC 58376, CBS 577, ATCC 58785 ou CBS 6054 et les souches Candida shehatae

NRRL Y 12857, NRRL Y 17024, NRRL Y 12858, NRRRL Y 12856, ATCC 22984 et CSIR 599.

10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 , dans lequel le mélange des sucres renferme de 10 à 90 % en poids de glucose et 90 à 10% en poids de xylose , et de préférence de 50 à 80% en poids de glucose et 50 à 20% en poids de xylose

11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 , dans lequel l'alimentation en mélange des sucres se fait sous forme d'une solution desdits sucres d'une concentration de 5 g/l jusqu'à la saturation et de préférence 10 à 150 g/l en mélange des sucres

12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 , dans lequel le taux de dilution, exprimé comme rapport du débit volumique horaire d'alimentation au volume réactionnel, est de 0,0001 à 2 h-l et de préférence de 0,001 à 1h

13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 , dans lequel le débit d'air fournissant l'oxygène nécessaire à la levure convertissant le xylose exprimé comme la vitesse de transfert en oxygène , est de 0,0001 à 500 et de préférence de 0,001 à 100 millimoles d'oxygène par litre de milieu de fermentation et par heure

14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 , dans lequel on opère avec les levures dispersées dans le milieu de culture ou avec des cultures à haute densité cellulaire

15. Souche(s) de mutants de Saccharomyces cerevisiae respectivement déposées sous les numéros I-1216 et I-1217 dans la Collection CNCM.