WO2022028929A1 - Procédé de production d'alcool par hydrolyse enzymatique et fermentation de biomasse lignocellulosique - Google Patents

Procédé de production d'alcool par hydrolyse enzymatique et fermentation de biomasse lignocellulosique Download PDF

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WO2022028929A1
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enzymatic
strain
glucosidase
activity
fermentation
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PCT/EP2021/070771
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Lionel Rousseau
Fahdel BEN CHAABANE
Antoine Margeot
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IFP Energies Nouvelles
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Definitions

  • the present invention falls within the field of processes for the production of alcohols or solvents useful as biofuels (for example ethanol), or for the synthesis of bio-sourced molecules, from cellulosic or lignocellulosic biomasses, by hydrolysis enzymes and fermentation.
  • the process according to the invention can also integrate a pretreatment by steam explosion or acid cooking of the lignocellulosic biomass.
  • the biomass substrates of interest to the invention can be very varied, since they may be, in particular, ligneous substrates (hardwood and softwood), agricultural by-products (wheat and rice straw, bagasse, roundup of corn, etc. or dedicated crops (miscanthus).
  • Lignocellulosic biomass is composed of three main constituents: cellulose (35 to 50%), hemicellulose (23 to 32%) which is a polysaccharide essentially made up of pentoses and hexoses, and lignin (15 to 25%). which is a macromolecule of complex structure and high molecular weight, resulting from the copolymerization of phenylpropenoic alcohols. These different molecules are responsible for the intrinsic properties of the plant cell wall and are organized into a complex entanglement.
  • Cellulose the majority in this biomass, is thus the most abundant polymer on Earth and the one with the greatest potential for forming materials and biofuels.
  • the potential of cellulose and its derivatives could not, for the moment, be fully exploited, mainly due to the difficulty of extracting cellulose from lignocellulosic biomass. Indeed, this step is made difficult by the very structure of the plants.
  • the technological locks identified in the extraction and transformation of cellulose are in particular its accessibility, its crystallinity, its degree of polymerization, the presence of hemicellulose and lignin.
  • the principle of the process for converting lignocellulosic biomass by biotechnological processes uses a step of enzymatic hydrolysis of the cellulose contained in plant materials to produce sugars, more particularly glucose.
  • the glucose obtained can then be fermented into different products such as alcohols (ethanol, 1,3-propanediol, 1-butanol, 1,4-butanediol, etc.) or acids (acetic acid, lactic acid, 3- hydroxypropionic acid, fumaric acid, succinic acid, etc.).
  • alcohols ethanol, 1,3-propanediol, 1-butanol, 1,4-butanediol, etc.
  • acids acetic acid, lactic acid, 3- hydroxypropionic acid, fumaric acid, succinic acid, etc.
  • Cellulose and possibly hemicelluloses are the targets of enzymatic hydrolysis, but they are not directly accessible to enzymes. This is the reason why these substrates must generally undergo a pretreatment preceding the enzymatic hydrolysis step.
  • the pretreatment aims to modify the physical and physico-chemical properties of the lignocellulosic material, with a view to improving the accessibility of the cellulose trapped within the lignin and hemicellulose matrix.
  • One of the most effective pre-treatments is steam explosion, which allows almost total hydrolysis of hemicellulose and a significant improvement in the accessibility and reactivity of cellulose to enzymes. This pre-treatment may be preceded by other treatment(s) such as grinding and acid impregnation.
  • the biomass impregnated with an aqueous solution, with or without acid is continuously treated with steam in a reactor under pressure and temperature, in order to mainly destructure the hemicellulose, and to make the cellulose accessible to enzymatic hydrolysis.
  • Enzymatic hydrolysis aims to convert the pretreated substrate into monomeric sugars.
  • the enzymatic cocktail used for this step is a mixture of cellulolytic and/or hemicellulolytic enzymes capable of breaking down cellulose into a solution of sugars, notably containing glucose.
  • the enzymes of the enzymatic cocktail are at least partly of the cellulolytic type such as cellulases or hemicellulases. They generally contain three major types of enzymes classified according to their activities: endoglucanases, exoglucanases and cellobiases.
  • the microorganism most used on an industrial scale for the production of the enzymatic cocktail is the filamentous fungus Trichoderma reesei.
  • the process for producing the enzymatic cocktail begins with a propagation phase, the purpose of which is to multiply the filamentous fungus T. reesei. Once the fungus concentration is sufficient to produce a fairly concentrated enzymatic cocktail, an enzymatic cocktail production phase is induced by a change in the carbonaceous substrate.
  • a must containing a mixture of enzymes and the filamentous fungus T. reesei This must can be used directly in enzymatic hydrolysis, or the enzymes can be separated from the mushroom and then optionally concentrated before being used for hydrolysis.
  • These methods for producing alcohol to produce in particular biofuel (ethanol) by fermentation therefore generally comprise, in a known manner, the following succession of steps: conditioning of the biomass (grinding, cleaning, etc. of the biomass, possibly impregnation of the biomass, then pre-treatment by steam explosion or cooking under acidic (or basic or oxidizing) conditions, enzymatic hydrolysis to produce sugars or bio-sourced molecules and alcoholic fermentation to produce biofuel alcohols such as than ethanol, or another type of fermentation to produce bio-sourced molecules, the fermentation product(s) then being separated, for example, with a distillation step optionally preceded by a solid/liquid separation step.
  • a first variant consists of separate hydrolysis and fermentation (variant known by the Anglo-Saxon acronym SH F for “Separate Hydrolysis and Fermentation”).
  • SH F Separatate Hydrolysis and Fermentation
  • This variant makes it possible to optimize each of the two stages by choosing the optimal operating conditions, in particular in terms of temperature, for each of them. To do this, it generally uses two dedicated reactors (therefore involving a higher investment cost), one for hydrolysis and the next for fermentation, at a higher temperature for hydrolysis than for fermentation. fermentation.
  • the sugars released by hydrolysis are present in high concentration at the end of the reaction and can lead to enzyme inhibition, slowing down hydrolysis.
  • Another variant makes it possible to circumvent this drawback, it is the variant known as simultaneous saccharification and fermentation, or SSF (for the Anglo-Saxon acronym of “Simultaneous Saccharification and Fermentation”).
  • SSF simultaneous saccharification and fermentation
  • the two stages take place at the same time avoids an accumulation of sugars up to concentrations that inhibit the enzymes: the yield is higher, because the sugars released by hydrolysis can be fermented as the and as they are released.
  • Industrial operation is also simpler, in particular by using only one reactor, with operating conditions that are easier to control.
  • B-glucosidases represent a small proportion of the total extracellular proteins produced by Trichoderma reesei (approximately 1%) and to supplement them, to add B-glucosidases from Aspergilus niger on an industrial scale (W Chulalaksananukul (2014) - "p-glucosidase from Trichoderma to improve the activity of cellulase cocktails. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Pages 281-290. Elsevier).
  • patent EP 2 342 329 relates to the optimization of a B-glucosidase obtained by L-Shuffling which makes it possible to obtain a very effective cocktail in enzymatic hydrolysis while lowering the dose of enzymes to be used.
  • patent EP 3 158 071 relates to the improvement of the exoglucanase activities of the enzymatic cocktails of Trichoderma reesei, making it possible to improve the processes of degradation of cellulose and production of biofuel.
  • Each of the routes is interesting, in particular the one implementing a more efficient strain of microorganism, or the one consisting in supplementing an enzymatic composition produced by a microorganism with an enzyme which it lacks or which it contains in too low a quantity. But they can be further improved, especially with regard to the quantity of enzymes to be used, which, as previously indicated, weighs heavily in economic terms in the biomass conversion process.
  • the aim of the invention is therefore to improve the performance of enzymatic compositions aimed at the enzymatic hydrolysis of lignocellulosic biomass, and/or to maintain the performance thereof by reducing the quantity of enzymes necessary for a given quantity of biomass to be hydrolyzed.
  • the subject of the invention is therefore a process for the production of alcohol, or solvents or bio-sourced molecules, in particular ethanol, by enzymatic hydrolysis and fermentation of lignocellulosic biomass, a process such as said operations of enzymatic hydrolysis and fermentation are carried out by simultaneous saccharification and co-fermentation of the biomass in a reaction medium, and such that the supply of enzymes to said reaction medium comprises: - a first enzymatic composition produced by a first strain of filamentous fungus, in particular belonging to the genus Trichoderma reesei, said composition exhibiting a p-glucosidase A1 activity,
  • a second enzymatic composition produced by a second strain of filamentous fungus, in particular belonging to the genus Trichoderma reesei, different from the first strain, said second composition having a ⁇ -glucosidase A2 activity, with the ⁇ -glucosidase A2 activity of the second composition at least 10 times, in particular at least 15 times greater than the ⁇ -glucosidase A1 activity of the first composition.
  • the invention has brought to light the advantage of combining two enzymatic cocktails of two different strains of microorganisms, one being clearly more efficient than the other in ⁇ -glucosidase activity, namely a reduction in the amount of enzymes to be used, reduction which, by weight, is in particular at least 10 to 15% by weight of enzymes, all other things being equal.
  • the ⁇ -glucosidase A1 activity of the first enzymatic composition is at most 1 ⁇ l/mg, in particular between 0.5 ⁇ l/mg and 1 ⁇ l/mg.
  • the ⁇ -glucosidase A2 activity is at least 12 or 15 ⁇ l/mg, in particular at least 20 to 30 ⁇ l/mg.
  • the first strain of filamentous fungus is obtained by random mutagenesis. It is therefore not a genetically modified organism here. It is recalled that random mutagenesis consists in inducing mutations anywhere in the DNA, in order to obtain a large number of mutants, which can subsequently be selected. These mutations can be obtained by modifying the properties of the medium (concentration of ions, enzymes, etc.), by the action of chemical mutagenic compounds or even by irradiation.
  • the second strain of filamentous fungus is obtained by site-directed mutagenesis, in particular with the addition of an improved gene by site-directed evolution. It is a genetically modified organism. It is recalled that site-directed mutagenesis consists in causing the induction of one or more mutations in a genome, in a precise and voluntary manner. This method is used to modify the structures of DNA, RNA and proteins.
  • the second strain of filamentous fungus is obtained by modifying a strain to express a gene encoding a cellulase having an improved ⁇ -glucosidase activity.
  • the second enzymatic composition may preferably comprise at least one isolated or purified polypeptide having an improved activity compared to the ⁇ -glucosidase activity of the wild-type BGL1 protein (SEQ ID No: 2), and comprising an acid sequence amino acids in which at least one amino acid is altered with respect to the amino acid sequence SEQ ID No. 2, said altered amino acid being chosen from positions 225, 238,240 and 241 of the amino acid sequence SEQ ID No. 2.
  • SEQ ID No: 2 wild-type BGL1 protein
  • the second strain of filamentous fungus is obtained by modifying a strain to express a gene(s) encoding a cellulase(s) possessing an improved p-glucosidase activity and also a enhanced exoglucanase activity.
  • the second enzymatic composition may preferably comprise at least one isolated or purified polypeptide having an improved activity relative to the exoglucanase activity of the reference protein CBH1 (SEQ ID No: 2). It is described in patent WO 2015/193587 to which reference may be made. Several ways of carrying out the enzymatic hydrolysis according to the invention are possible:
  • At least one of the enzymatic compositions is introduced into the reaction medium containing the biomass to be treated in the form of complete mushroom mash(s).
  • the two enzymatic compositions can advantageously be introduced in the form of complete musts, which has the industrial advantage of avoiding any additional operation of separation between the microorganism and the enzymes which it has produced.
  • a complete must is understood as all the microorganisms and enzymes they have produced, therefore without separation.
  • At least one of the enzymatic compositions is isolated before introduction into the reaction medium, in particular the two compositions: the enzymes are separated from the fungi in order to introduce only the enzymes into the reaction medium.
  • the relative proportion of the first enzymatic composition and of the second enzymatic composition is defined by prior compositional analyses.
  • the composition of the mixture and the quantity of the different enzymes can then be adjusted as best as possible to maximize the desired effect, namely the reduction of the quantity of enzymes to be used for a given quantity of biomass to be converted.
  • the relative proportion between the first enzymatic composition and the second enzymatic composition is between 20/80 and 80/20, preferably between 30/70 and 70/30, by weight (of enzymes).
  • the ⁇ -glucosidase activity of the mixture of the first and of the second enzymatic composition is at least 3 IU/rng, in particular at least 10 IU/rng, in particular at most 15 or 25 IU/rng, preferably between 11 and 14 IU/rng.
  • the concentration of enzymes in one and/or the other of the enzymatic compositions can be between 20 and 100 g/l.
  • the enzymatic hydrolysis and fermentation operations are carried out by simultaneous saccharification and fermentation of the lignocellulosic biomass in a medium reaction with a DM content of said biomass of between 12 and 24% by weight, in particular between 15 and 22% by weight.
  • the fermentation can be carried out with a yeast fermenting the C5 and C6 sugars such as that described in the article by: dos Santos, L, Carazzolle, M., Nagamatsu, S. et al. “Unraveling the genetic basis of xylose consumption in engineered Saccharomyces cerevisiae strains”. Sci Rep 6, 38676 (2016). (https://doi.org/10.1038/srep38676) or by using a yeast commercially available from LESAFFRE under the name CELLUX.
  • Such a yeast has proven to be very advantageous, by fermenting both the C5 sugars and the C6 sugars, whereas, conventionally, yeasts that act only on the C6 sugars were rather chosen before (by counteracting possible inhibitory effects encountered when using yeasts acting only on C6 sugars).
  • a preferred implementation of the method according to the invention provides for a stage of treatment of the lignocellulosic biomass prior to the enzymatic hydrolysis and fermentation operations, in the form of a pretreatment comprising impregnation of the biomass with an acid, basic or oxidizing, then cooking or steam explosion of the impregnated biomass.
  • FIG. 1 represents a graph of the evolution over time of the concentrations of ethanol produced in SSF according to the invention of the tests of Example 3, with the abscissa the time expressed in hours and the ordinate the ethanol produced in mg /g of juice.
  • Juice is to be understood throughout this text as the fermentation juice resulting from the reaction medium.
  • FIG. 2 represents a graph of the evolution over time of the concentrations of ethanol produced in SSF according to the invention of the tests of Example 4, with the abscissa the time expressed in hours and the ordinate the ethanol produced in g /kg of juice.
  • FIG. 3 represents a graph of the evolution over time of the concentrations of ethanol produced in SSF according to the invention of the tests of example 5, with the abscissa the time expressed in hours and the ordinate the quantity of ethanol produced in mg/g of juice.
  • FIG. 4 represents a graph of the progress over time of the percentages of cellulose converted from comparative example 7 in enzymatic hydrolysis within the framework of an SH F process. Description of embodiments
  • - type 1 strain a CL847 strain derived from Trichoderma Reesei, mentioned above and described in patent FR 2 555 803. This strain produces an enzymatic cocktail Enz1 whose p-glucosidase activity is not overexpressed, which has p -glucosidase of 1 IU/rng.
  • - type 2 strain a TR3012 strain of Trichoderma Reesei which expresses a gene encoding a p-glucosidase having an improved specific activity, which is described in patent WO 2010/029259: This is the 100B11 gene, an improved version of the p-glucosidase bgl1 from Trichoderma reesei which was introduced into the genome of strain CL847 as described in this patent WO 2010/029259, in particular in its example 5.
  • the Enz2 cocktail from this strain has a p-glucosidase activity of 29 .8 IU/rng.
  • - type 3 strain a TR3155 strain derived from Trichoderma Reesei which produces an enzymatic cocktail Enz3 possessing an improved cellobiohydrolase (CBH 1) compared to the enzymatic cocktail produced by the type 2 strain.
  • CBH 1 cellobiohydrolase
  • the enzymatic cocktail produced has p-glucosidase activity of 26.1 IU/mg.
  • the strain is described in patent WO 2015/193587, it is more particularly the 130G9 clone mentioned in table 1 of the patent in question.
  • the microorganisms used are advantageously commercial yeasts of the Saccharomyces cerevisiae or Kluyveromyces marxianus type, a yeast phylogenetically related to S. cerevisiae and also fermenting C5 and C6 sugars, in particular those of the CELLUX type mentioned above.
  • the determination of p-glucosidase activities is carried out by hydrolysis of an analogue of cellobiose (natural substrate of this enzyme), para-nitrophenyl-p-D-glucopyranoside.
  • the p-glucosidase enzymes recognize para-nitrophenyl-p-D-glucopyranoside and hydrolyze it into para-nitrophenol, which is yellow in color.
  • the color intensity is measured by measuring the absorbance of the reaction medium at 410 nm.
  • a known concentration range of para-nitrophenol makes it possible to determine the number of moles of para-nitrophenol released into the medium and to deduce the p-glucosidase activity therefrom; as described in the article “Cellulase activity mapping of Trichoderma reesei cultivated in sugar mixtures under fedbatch conditions” cited above.
  • the "DM” corresponds to the dry matter content of the biomass considered, which includes the solid part of a liquid (water)/solid (biomass) mixture which is soluble in the liquid and also the solid part insoluble in the liquid in question. It is measured using a Mettler-Toledo HB43-S halogen humidity analyzer in which a mass of biomass preferably comprised between 0.9 and 1.1 g is deposited, brought to 150°C in steps of 1°C and maintained at this temperature the time necessary to obtain a constant weight.
  • the overall enzymatic activity is measured using filter paper and is expressed in filter paper units (FPu) and is standardized by IUPAC.
  • This method uses the reducing properties of sugars and mainly of glucose by DNS (dinitrosalicylic acid) assay of hydrolyzed Whatman No. 1 paper.
  • DNS dinitrosalicylic acid
  • This example relates to the conversion by SSF of wheat straw previously pretreated by acid impregnation then steam explosion, in a known manner.
  • the wheat straw thus pretreated has a dry matter content in particular of at least 40 to 45% by weight.
  • the mixture (the whole musts or the separated enzymes) can be made out of the reactor, then introduced together into the reactor,
  • C5-C6 yeast of the CELLIIX 4 type marketed by the company Lesaffre is added to the reaction medium, in a content of 0.5 grams per kg of medium.
  • the SSF is carried out between 30 and 35° C., the aqueous reaction medium being adjusted to a pH of between 5 and 5.5.
  • Table 1 below is a table of Ethanol/MS yields at 100 hours of SSF expressed in % weight for example 1 according to the invention, at different doses of enzymes expressed in g Pn/kg of cellulose (“Pn » for proteins):
  • the yield in Ethanol/MS of biomass is expressed there in % by weight after 100 hours, at a concentration of dry matter MS in the reaction medium of 18% by weight, at different doses of the two cocktails of enzymes, with in addition the two extreme cases without mixtures of cocktails, that is to say with 100% of the cocktail produced by the strain of type 1 (Enz1) - test a - and 100% of the cocktail produced by the strain of type 2 (Enz2) more efficient - tests b,c,d -:
  • the pretreatment and SSF conditions are identical to those of example 1, but with a pretreatment tool making it possible to improve the reactivity of the biomass to the enzymes: A 10% increase in the yields is observed for the same enzyme and the same biomass load with example 2 compared to the yields of example 1.
  • a first series of tests concerns wheat straw, a second series of Miscanthus.
  • Table 2 is a table of Ethanol/MS yields at 100 hours of SSF expressed in % weight of Example 2 according to the invention, at different doses of enzymes expressed in g Pn/kg of cellulose, with the same conventions and units as in Table 1.
  • Example 11 uses wheat straw pretreated as in Example 1, at 18% DM, to convert it into ethanol by SSF under the same conditions as Example 1, except for the choice of the enzyme cocktail mixture used .
  • the mixture used at 15 g of Pn/kg of cellulose consists of 65.5% v/v of an enzymatic cocktail with 42.8 g/L of proteins produced by the type 1 strain (Enz1), and 34, 5% v/v of an enzymatic cocktail produced by the type 2 strain (Enz2) at 40 g/L of proteins. It is prepared separately from the reaction medium.
  • Figure 1 shows that the mixture at 15g/kg of cellulose (curve with the diamonds) makes it possible to obtain the same performance as the type 2 enzyme at 20 g/kg of cellulose (curve with circles), i.e. a saving of enzymes in the order of 25%.
  • the invention thus makes it possible to substantially reduce the dose of enzymes, with a reduction of the order of 25% by weight.
  • Table 3 below is a table that reads in the same way as table 1: it indicates Ethanol/MS yields at 100 hours of SSF expressed in % weight of Example 6 according to the invention at different doses of enzymes expressed in g Pn/kg of cellulose.
  • Example 2 We start with a wheat straw substrate pretreated as in Example 1 at a dry matter concentration of 15% by weight.
  • the enzymatic hydrolysis is carried out at 50° C. at a pH of approximately 5, with a mixture of enzymatic cocktails identical to that of example 6 prepared separately from the reaction medium (Mel).
  • the fermentation is then carried out in a conventional manner after a possible intermediate solid-liquid separation as described in patent EP 2 774 992 in a fermenter, at a temperature lower than that of the enzymatic hydrolysis, of the order of 30 to 35° C, and at a higher pH, with the same yeast as in Example 1 (yeast of CELLUX 4 type), which is added to the reaction medium in a content of 0.5 grams per kg of medium.
  • FIG. 4 represents the graph corresponding to this example with the abscissa the duration of the enzymatic hydrolysis measured in hours, and the ordinate the cellulose conversion rate in % during the hydrolysis.
  • the mixture of cocktails gives the same conversion rate (curve with the diamonds) as with the single cocktail from the type 2 strain ( Enz2), at iso-dose of enzymes (curve with triangles), and that it is less efficient than 20 g/kg of cellulose of the single cocktail from this type 2 strain (curve with circles): unlike which has been observed in the context of an SSF process, the mixture of cocktails according to the invention does not make it possible to reduce the quantity of enzymes to be used at conversion iso-performance when the process is of the SH F type.

Abstract

La présente invention concerne un procédé de production d'alcool ou de solvant ou de molécules bio-sourcées, par hydrolyse enzymatique et fermentation de biomasse lignocellulosique, tel que lesdites opérations sont opérées par saccharification et fermentation simultanées de la biomasse lignocellulosique dans un milieu réactionnel, et tel que l'apport d'enzymes audit milieu réactionnel comprend : - une première composition enzymatique produite par une première souche de champignon filamenteux, ladite composition présentant une activité β-glucosidase A1, - une deuxième composition enzymatique produite par une deuxième souche de champignon filamenteux, ladite deuxième composition présentant une activité β-glucosidase A2, avec l'activité β-glucosidase A2 de la deuxième composition au moins 10 fois supérieure à l'activité β-glucosidase A1 de la première composition.

Description

Procédé de production d’alcool par hydrolyse enzymatique et fermentation de biomasse lignocellulosique
Domaine technique
La présente invention s’inscrit dans le domaine des procédés de production d'alcools ou de solvants utiles comme biocarburants (par exemple l'éthanol), ou pour la synthèse de molécules bio-sourcées, à partir de biomasses cellulosiques ou lignocellulosiques, par hydrolyse enzymatique et fermentation. Le procédé selon l'invention peut aussi intégrer un prétraitement par explosion à la vapeur ou cuisson acide de la biomasse lignocellulosique. Les substrats de biomasse intéressant l’invention peuvent être très variés, puisqu’il peut s’agir, notamment, de substrats ligneux (feuillus et résineux), de sous-produits de l’agriculture (paille de blé et de riz, bagasse, rafle de mais ...) ou de cultures dédiées (miscanthus).
Technique antérieure
La biomasse lignocellulosique est composée de trois principaux constituants : la cellulose (35 à 50%), l'hémicellulose (23 à 32%) qui est un polysaccharide essentiellement constitué de pentoses et d'hexoses, et la lignine (15 à 25%) qui est une macromolécule de structure complexe et de haut poids moléculaire, provenant de la copolymérisation d'alcools phénylpropénoïques. Ces différentes molécules sont responsables des propriétés intrinsèques de la paroi végétale et s'organisent en un enchevêtrement complexe.
La cellulose, majoritaire dans cette biomasse, est ainsi le polymère le plus abondant sur Terre et celui qui présente le plus grand potentiel pour former des matériaux et des biocarburants. Cependant, le potentiel de la cellulose et de ses dérivés n'a pas pu, pour le moment, être complètement exploité, majoritairement en raison de la difficulté d'extraction de la cellulose de la biomasse lignocellulosique. En effet, cette étape est rendue difficile par la structure même des plantes. Les verrous technologiques identifiés à l'extraction et à la transformation de la cellulose sont notamment son accessibilité, sa cristallinité, son degré de polymérisation, la présence de l'hémicellulose et de la lignine.
Le principe du procédé de conversion de la biomasse lignocellulosique par des procédés biotechnologiques utilise une étape d'hydrolyse enzymatique de la cellulose contenue dans les matières végétales pour produire des sucres, plus particulièrement, du glucose.
Le glucose obtenu peut ensuite être fermenté en différents produits tels que des alcools (éthanol, 1 ,3-propanediol, 1-butanol, 1 ,4-butanediol, ...) ou des acides (acide acétique, acide lactique, acide 3-hydroxypropionique, acide fumarique, acide succinique, ...). L’invention s’intéresse plus particulièrement, mais non limitativement, à la production d’éthanol.
La cellulose et éventuellement les hémicelluloses sont les cibles de l’hydrolyse enzymatique, mais elles ne sont pas directement accessibles aux enzymes. C’est la raison pour laquelle ces substrats doivent généralement subir un prétraitement précédant l’étape d’hydrolyse enzymatique. Le prétraitement vise à modifier les propriétés physiques et physico-chimiques du matériau lignocellulosique, en vue d'améliorer l'accessibilité de la cellulose emprisonnée au sein de la matrice de lignine et d'hémicellulose. Un des prétraitements les plus efficaces est l’explosion à la vapeur, qui permet une hydrolyse presque totale de l’hémicellulose et une amélioration importante de l’accessibilité et la réactivité de la cellulose aux enzymes. Ce prétraitement peut être précédé d’autre(s) traitement(s) tels qu’un broyage, et d’une imprégnation acide. Avec une explosion à la vapeur, la biomasse imprégnée d’une solution aqueuse, avec ou sans acide, est traitée en continu avec de la vapeur dans un réacteur sous pression et en température, afin de déstructurer principalement l’hémicellulose, et de rendre la cellulose accessible à l'hydrolyse enzymatique.
L’hydrolyse enzymatique vise à convertir le substrat prétraité en sucres monomériques. Le cocktail enzymatique utilisé pour cette étape est un mélange d’enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques capables de décomposer la cellulose en solution de sucres, contenant notamment du glucose. Les enzymes du cocktail enzymatique sont au moins en partie de type cellulolytiques telles que des cellulases ou hémicellulases. Elles contiennent généralement trois grands types d'enzymes classées selon leurs activités : les endoglucanases, les exoglucanases et les cellobiases. Le microorganisme le plus utilisé à l’échelle industrielle pour la production du cocktail enzymatique est le champignon filamenteux Trichoderma reesei. Le procédé de production du cocktail enzymatique débute par une phase de propagation dont le but est de multiplier le champignon filamenteux T. reesei. Une fois la concentration en champignon suffisante pour produire un cocktail enzymatique assez concentré, une phase de production de cocktail enzymatique est induite par un changement de substrat carboné. A l’issue de ce procédé fermentaire, on obtient un moût contenant un mélange d’enzymes et de champignon filamenteux T. reesei. Ce moût peut être utilisé directement en hydrolyse enzymatique, ou bien les enzymes peuvent être séparées du champignon puis éventuellement concentrées avant d’être utilisées pour l’hydrolyse.
La fermentation des sucres issus de l’hydrolyse enzymatique en différents produits, tels que des alcools, des solvants ou des acides, nécessite l’utilisation de biocatalyseurs (bactéries ou levures). Ainsi, on peut opérer la fermentation du glucose en éthanol par la levure Saccharomyces cerevisiae. Les brevets WO 2014/091109 et WO 2018/015227 décrivent des exemples de procédés impliquant un prétraitement de la biomasse, puis son hydrolyse enzymatique et la fermentation des sucres qui en sont issus.
Ces procédés de production d’alcool pour produire notamment du biocarburant (éthanol) par voie fermentaire comprennent donc, de façon connue, généralement, la succession d’étapes suivante : conditionnement de la biomasse (broyage, nettoyage...) de la biomasse, éventuellement une imprégnation de la biomasse, puis un prétraitement par explosion à la vapeur ou cuisson en conditions acides (ou basiques ou oxydantes), une hydrolyse enzymatique pour produire des sucres ou des molécules bio-sourcées et une fermentation alcoolique pour produire des alcools biocarburants tel que l’éthanol, ou autre type de fermentation pour produire des molécules bio-sourcées, le ou les produits de la fermentation étant ensuite séparés, par exemple, avec une étape de distillation éventuellement précédée d’une étape de séparation solide/liquide.
L’hydrolyse enzymatique et la fermentation peuvent être réalisées suivant différents schémas. Une première variante consiste en une hydrolyse et une fermentation séparées (variante connue sous l’acronyme anglo-saxon SH F pour « Separate Hydrolysis and Fermentation »). Cette variante permet d’optimiser chacune des deux étapes par le choix des conditions opératoires optimales, notamment en termes de température, pour chacune d’elles. Elle a généralement, pour ce faire, recours à deux réacteurs dédiés (donc impliquant un coût d’investissement plus élevé) l’un à l’hydrolyse et le suivant à la fermentation, à une température plus élevée pour l’hydrolyse que pour la fermentation. Cependant, les sucres libérés par l’hydrolyse sont présents à forte concentration en fin de réaction et peuvent entraîner une inhibition des enzymes, ralentissant l’hydrolyse.
Une autre variante permet de contourner cet inconvénient, il s’agit de la variante dite à saccharification et fermentation simultanées, ou SSF (pour l’acronyme anglo-saxon de « Simultaneous Saccharification and Fermentation »). Dans cette autre variante, le fait que les deux étapes aient lieu en même temps évite une accumulation de sucres jusqu’à des concentrations inhibitrices pour les enzymes : le rendement est plus élevé, car les sucres libérés par l’hydrolyse peuvent être fermentés au fur et à mesure de leur libération. La conduite industrielle est également plus simple, notamment en n’utilisant qu’un seul réacteur, avec des conditions opératoires plus simples à piloter.
Dans les procédés de conversion de biomasse lignocellulosique faisant intervenir une hydrolyse enzymatique, le coût associé à la consommation d’enzymes est significatif au regard du coût de production total du procédé, et les travaux visant à augmenter la production d’enzymes, ou la performance de celles-ci, par des micro-organismes de type champignon filamenteux sont nombreux. Comme souligné précédemment, la biomasse végétale ne peut généralement pas être hydrolysée sous sa forme native, et des prétraitements physico-chimiques sont nécessaires pour la déstructurer et rendre la cellulose qui la compose plus accessible aux enzymes. Ces prétraitements générant des coproduits inhibiteurs de l'activité enzymatique, et afin d’optimiser les rendements de production sur le plus grand nombre de variétés de biomasse, on cherche à améliorer l’efficacité des cocktails d'enzymes (c’est-à-dire des compositions/mélanges d’enzymes de différents types/de différentes natures, produites naturellement par un microorganisme), pour les rendre plus performants et diminuer les quantités nécessaires pour opérer l’hydrolyse.
Actuellement, les cellulases industrielles sont principalement produites par un champignon filamenteux, appartenant au genre Trichoderma reesei, en raison de son fort pouvoir de sécrétion. D’autres microorganismes comme les cellulosomes produisent des complexes multi-enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, xylanases ...) qui peuvent s’avérer plus riches et plus efficaces pour l'hydrolyse de la cellulose que les enzymes produites par Trichoderma reesei, mais ils proviennent pour la plupart de bactéries anaérobies. Cette voie présente des inconvénients, dont des coûts de production élevés et des concentrations peu élevées de protéines produites.
De multiples solutions ont été décrites pour améliorer l’efficacité des cocktails enzymatiques.
Une d’elles a consisté à augmenter l’activité B-glucosidase des cocktails enzymatiques de la souche Trichoderma reesei RUT C30 (souche faisant l’objet de la publication « Preparation of mutants of Trichoderma reesei with enhanced cellulase production », Montenecourt, B. S. et Eveleigh, D.E, Appl. Environ. Microbiol.1977, 34(6), 777-782).
Augmenter l’activité B-glucosidase des cocktails enzymatiques de Trichoderma reesei RUT C30, pauvres à l’origine en cette activité, a été travaillé par différentes voies.
Une voie a consisté à introduire une séquence codant pour une B-glucosidase améliorée dans le génome de la souche RUT C30 de Trichoderma reesei (comme décrit dans la publication Liang Ma, Jun Zhang, Gen Zou, Chengshu Wang, Zhihua Zhou (2011). Improvement of cellulase activity in Trichoderma reesei by heterologous expression of a p-glucosidase gene from Pénicillium decumbens. Enzyme and Microbial Technology, Volume 49, Issue 4, 10 September 2011 , Pages 366-371. Elsevier).
Une autre voie encore a consisté à amplifier le gène exprimant la B-glucosidase de Trichoderma reesei (comme décrit dans la demande de brevet WO 1992/010581 A1 « Improved saccharification of cellulose by cloning and amplification of the p-glucosidase gene of Trichoderma reesei »). Une autre voie a consisté, sachant que les B-glucosidases représentent une petite proportion du total des protéines extracellulaires produites par Trichoderma reesei (environ 1 %) et pour les compléter, à ajouter des B-glucosidases dAspergilus niger à l’échelle industrielle (W Chulalaksananukul (2014) - « p-glucosidase from Trichoderma to improve the activity of cellulase cocktails ». Biotechnology and Biology of Trichoderma. Pages 281-290. Elsevier).
Une autre voie encore a consisté à entreprendre de l’ingénierie des enzymes par évolution dirigée des gènes pour une activité spécifique à améliorer (B-glucosidase, exoglucanases...). Par exemple, le brevet EP 2 342 329 porte sur l’optimisation d’une B-glucosidase obtenue par L-Shuffling qui permet d’obtenir un cocktail très performant en hydrolyse enzymatique tout en abaissant la dose d’enzymes à utiliser. Et le brevet EP 3 158 071 porte sur l’amélioration des activités exoglucanases des cocktails enzymatiques de Trichoderma reesei, permettant d’améliorer les procédés de dégradation de la cellulose et de production de biocarburant.
Enfin, une autre voie décrite dans le brevet WO 2015/091079 a consisté à associer des enzymes produites par un champignon non génétiquement modifié avec des enzymes produites par un champignon génétiquement modifié et préalablement séparées de leur champignon producteur, permettant de montrer qu’on pouvait utiliser un micro-organisme non modifié sans le séparer du moût.
Chacune des voies est intéressante, notamment celle mettant en œuvre une souche de microorganisme plus performante, ou encore celle consistant à complémenter une composition enzymatique produite par un micro-organisme avec une enzyme dont elle est dépourvue ou qu’elle contient en trop faible quantité. Mais elles peuvent être encore améliorées, notamment en ce qui concerne la quantité d’enzymes à utiliser, qui, comme précédemment indiqué, pèse lourd en termes économiques dans le procédé de conversion de biomasse.
L’invention a alors pour but d’améliorer les performances des compositions enzymatiques visant l’hydrolyse enzymatique de biomasse lignocellulosique, et/ou d’en maintenir les performances en réduisant la quantité d’enzymes nécessaire pour une quantité de biomasse à hydrolyser donnée.
Résumé de l’invention
L’invention a alors pour objet un procédé de production d’alcool, ou de solvants ou de molécules bio-sourcées, notamment d’éthanol, par hydrolyse enzymatique et fermentation de biomasse lignocellulosique, procédé tel que lesdites opérations d’hydrolyse enzymatique et de fermentation sont opérées par saccharification et co-fermentation simultanées de la biomasse dans un milieu réactionnel, et tel que l’apport d’enzymes audit milieu réactionnel comprend : - une première composition enzymatique produite par une première souche de champignon filamenteux, notamment appartenant au genre Trichoderma reesei, ladite composition présentant une activité p-glucosidase A1 ,
- une deuxième composition enzymatique produite par une deuxième souche de champignon filamenteux, notamment appartenant au genre Trichoderma reesei, différente de la première souche, ladite deuxième composition présentant une activité p-glucosidase A2, avec l’activité P-glucosidase A2 de la deuxième composition au moins 10 fois, notamment au moins 15 fois supérieure à l’activité p-glucosidase A1 de la première composition.
L’invention a mis en lumière l’intérêt de combiner deux cocktails enzymatiques de deux souches de micro-organismes différentes, l’une étant nettement plus performante que l’autre en activité p-glucosidase, à savoir une réduction de la quantité d’enzymes à utiliser, réduction qui, en poids, est notamment d’au moins 10 à 15% en poids d’enzymes, toutes choses égales par ailleurs.
Et cette solution s’est avérée bien plus simple à mettre en œuvre, et tout aussi efficace - voire plus efficace - que celle qui aurait consisté à modifier des souches de microorganismes, nécessitant d’identifier l’enzyme limitante, de faire tout un travail de génétique et d’optimisation qui est long et lourd à réaliser.
Tout se passe comme si les deux cocktails enzymatiques se complémentaient l’un l’autre avec un effet de synergie, sans avoir à trier/purifier/séparer les constituants des mélanges d’enzymes produits par les deux micro-organismes différents, ce qui s’est avéré nettement plus efficace et nettement plus simple que de chercher uniquement à améliorer le cocktail enzymatique produit par une souche. Or rien ne permettait d’anticiper le fait que d’associer deux cocktails dont un est nettement moins performant que l’autre aurait un tel effet de synergie.
Et ce qui est étonnant, c’est que cet effet très avantageux et surprenant n’est obtenu que dans le cas d’un procédé de type SSF, c’est-à-dire quand l’hydrolyse et la fermentation sont opérées simultanément, et pas, ou pas de façon significative, dans le cas d’un procédé de type SH F où l’hydrolyse et la fermentation sont opérées séparément.
De préférence selon l’invention, l’activité p-glucosidase A1 de la première composition enzymatique est d’au plus 1 lll/mg, notamment comprise entre 0,5 lll/mg et 1 lll/mg.
De préférence selon l’invention, l’activité p-glucosidase A2 est d’au moins 12 ou 15 lll/mg, notamment au moins 20 à 30 lll/mg. Avantageusement, la première souche de champignon filamenteux est obtenue par mutagenèse aléatoire. Il ne s’agit donc pas d’un organisme génétiquement modifié ici. On rappelle que la mutagenèse aléatoire consiste à induire des mutations n'importe où dans l’ADN, afin d'obtenir un grand nombre de mutants, pouvant être par la suite sélectionnés. Ces mutations peuvent être obtenues en modifiant les propriétés du milieu (concentration en ions, enzymes...), par l'action de composés mutagènes chimiques ou encore par irradiation.
Avantageusement, la deuxième souche de champignon filamenteux est obtenue par mutagenèse dirigée, notamment avec l’ajout d’un gène amélioré par évolution dirigée. Il s’agit d’un organisme génétiquement modifié. On rappelle que la mutagenèse dirigée consiste à provoquer l'induction d'une ou plusieurs mutations dans un génome, de façon précise et volontaire. Cette méthode est employée pour modifier les structures de l'ADN, l'ARN et des protéines.
Il s’est avéré que c’est l’association de cocktails enzymatiques provenant d’une part d’une souche modifiée aléatoirement, d’autre part d’une souche modifiée de façon dirigée, qui donnait les meilleurs résultats en termes de réduction de quantité d’enzymes.
Selon un mode de réalisation, la deuxième souche de champignon filamenteux est obtenue par modification d’une souche pour exprimer un gène codant une cellulase possédant une activité p-glucosidase améliorée.
La deuxième composition enzymatique peut comprendre, de préférence, au moins un polypeptide isolé ou purifié ayant une activité améliorée par rapport à l’activité p-glucosidase de la protéine sauvage BGL1 (SEQ ID No :2), et comprenant une séquence d’acides aminés dans laquelle au moins un acide aminé est altéré par rapport à la séquence d’acides aminés SEQ ID n° 2, ledit acide aminé altéré étant choisi parmi les positions 225, 238,240 et 241 de la séquence d’acides aminés SEQ ID N°2. Une description détaillée en est donnée dans le brevet WO 2010/029259 auquel on pourra se reporter.
Selon un autre mode de réalisation, compatible avec le précédent, la deuxième souche de champignon filamenteux est obtenue par modification d’une souche pour exprimer un/des gènes codant une/des cellulase(s) possédant une activité p-glucosidase améliorée et également une activité exoglucanase améliorée.
La deuxième composition enzymatique peut comprendre, de préférence, au moins un polypeptide isolé ou purifié ayant une activité améliorée par rapport à l’activité exoglucanase de la protéine de référence CBH1 (SEQ ID No :2). Elle est décrite dans le brevet WO 2015/193587 auquel on pourra se reporter. Plusieurs façons d’opérer l’hydrolyse enzymatique selon l’invention sont possibles :
Selon une première variante, l’une au moins des compositions enzymatiques est introduite dans le milieu réactionnel contenant la biomasse à traiter sous forme de moût(s) complet(s) de champignon. Les deux compositions enzymatiques peuvent avantageusement être introduites sous forme de moûts complets, ce qui présente l’avantage industriel d’éviter toute opération supplémentaire de séparation entre le micro-organisme et les enzymes qu’il a produites. On rappelle qu’un moût complet se comprend comme l’ensemble des microorganismes et des enzymes qu’ils ont produit, sans séparation donc.
Selon une autre variante, l’une au moins des compositions enzymatiques est isolée avant introduction dans le milieu réactionnel, notamment les deux compositions : on vient séparer les enzymes des champignons pour n’introduire dans le milieu réactionnel que les enzymes.
On peut aussi choisir de réaliser le mélange des compositions enzymatiques directement dans le milieu réactionnel, ou préalablement à leur introduction dans le milieu réactionnel.
Avantageusement selon l’invention, on définit la proportion relative de la première composition enzymatique et de la deuxième composition enzymatique par des analyses compositionnelles préalables. On peut alors ajuster au mieux la composition du mélange et la quantité des différentes enzymes pour maximiser l’effet voulu, à savoir la réduction de la quantité d’enzymes à utiliser pour une quantité de biomasse donnée à convertir.
Avantageusement, la proportion relative entre la première composition enzymatique et la deuxième composition enzymatique est comprise entre 20/80 et 80/20, de préférence entre 30/70 et 70/30, en poids (d’enzymes).
Selon l’invention, l’activité p-glucosidase du mélange de la première et de la deuxième composition enzymatique est d’au moins 3 Ul/rng, notamment d’au moins 10 Ul/rng, notamment d’au plus 15 ou 25 Ul/rng, de préférence comprise entre 11 et 14 Ul/rng.
La méthode pour mesurer l’activité enzymatique p-glucosidase est décrite dans l’article « Cellulase activity mapping of Trichoderma reesei cultivated in sugar mixtures under fedbatch conditions », de Jourdier, E., Cohen, C., Poughon, L, Larroche, C., Monot, F., et Ben Chaabane, F. Biotechnol. Biofuels 2013, 6, 79.
Avantageusement, la concentration en enzymes dans l’une et/ou l’autre des compositions enzymatiques peut être comprise entre 20 et 100 g/l.
De préférence, les opérations d’hydrolyse enzymatique et de fermentation sont opérées par saccharification et fermentation simultanées de la biomasse lignocellulosique dans un milieu réactionnel avec un taux de MS de ladite biomasse compris entre 12 et 24%poids, notamment entre 15 et 22%poids.
La fermentation peut être réalisée avec une levure fermentant les sucres en C5 et en C6 telle que celle décrite dans l’article de : dos Santos, L, Carazzolle, M., Nagamatsu, S. et al. « Unraveling the genetic basis of xylose consumption in engineered Saccharomyces cerevisiae strains”. Sci Rep 6, 38676 (2016). (https://doi.org/10.1038/srep38676) ou en utilisant une levure disponible commercialement auprès de la société LESAFFRE sous la dénomination CELLUX. Un telle levure s’est avérée très avantageuse, en fermentant à la fois les sucres en C5 et les sucres en C6, alors que, de façon conventionnelle, on choisissait plutôt auparavant des levures n’agissant que sur des sucres en C6 (en contrecarrant d’éventuels effets inhibiteurs rencontrés en n’utilisant des levures n’agissant que sur les sucres en C6).
Une mise en œuvre préférée du procédé selon l’invention prévoit une étape de traitement de la biomasse lignocellulosique préalable aux opérations d’hydrolyse enzymatique et de fermentation, sous forme d’un prétraitement comportant une imprégnation de la biomasse avec une liqueur acide, basique ou oxydante, puis une cuisson ou une explosion à la vapeur de la biomasse imprégnée.
Liste des figures
La figure 1 représente un graphe de l’évolution au cours du temps des concentrations en éthanol produites en SSF selon l’invention des essais de l’exemple 3, avec en abscisse le temps exprimé en heure et en ordonné l’éthanol produit en mg/g de jus. Le terme Jus est à comprendre dans l’ensemble de ce texte comme le jus de fermentation issu du milieu réactionnel.
La figure 2 représente un graphe de l’évolution au cours du temps des concentrations en éthanol produites en SSF selon l’invention des essais de l’exemple 4, avec en abscisse le temps exprimé en heure et en ordonné l’éthanol produit en g/kg de jus.
La figure 3 représente un graphe de l’évolution au cours du temps des concentrations en éthanol produites en SSF selon l’invention des essais de l’exemple 5, avec en abscisse le temps exprimé en heure et en ordonné la quantité d’éthanol produite en mg/g de jus.
La figure 4 représente un graphe de l’avancement au cours du temps des pourcentages de cellulose convertie de l’exemple 7 comparatif en hydrolyse enzymatique dans le cadre d’un procédé SH F. Description des modes de réalisation
On décrit tout d’abord les micro-organismes qui sont utilisés pour réaliser la mise en œuvre de l’invention dans les exemples non limitatifs suivants :
- tout d’abord pour l’hydrolyse enzymatique :
- souche de type 1 : une souche CL847 issue de Trichoderma Reesei, précitée et décrite dans le brevet FR 2 555 803. Cette souche produit un cocktail enzymatique Enz1 dont l’activité p- glucosidase n’est pas surexprimée, qui présente une activité p-glucosidase de 1 Ul/rng.
- souche de type 2 : une souche TR3012 de Trichoderma Reesei qui exprime un gène codant une p-glucosidase possédant une activité spécifique améliorée, qui est décrite dans le brevet WO 2010/029259 : Il s’agit du gène 100B11 , version améliorée de la p-glucosidase bgl1 de Trichoderma reesei qui a été introduite dans le génome de la souche CL847 comme décrit dans ce brevet WO 2010/029259, en particulier dans son exemple 5. Le cocktail Enz2 issu de cette souche présente une activité p-glucosidase de 29,8 Ul/rng.
- souche de type 3 : une souche TR3155 issue de Trichoderma Reesei qui produit un cocktail enzymatique Enz3 possédant une cellobiohydrolase améliorée (CBH 1) par rapport au cocktail enzymatique produit par la souche de type 2. Le cocktail enzymatique produit présente une activité p-glucosidase de 26,1 Ul/mg. La souche est décrite dans le brevet WO 2015/193587, il s’agit plus particulièrement du clone 130G9 cité dans le tableau 1 du brevet en question.
- Pour la fermentation, les micro-organismes utilisés sont avantageusement des levures commerciales de type Saccharomyces cerevisiae ou Kluyveromyces marxianus, une levure phylogénétiquement apparentée à S. cerevisiae et fermentant aussi les sucres en C5 et C6, notamment celles de type CELLUX citées plus haut.
La mesure de détermination des activités p-glucosidase est réalisée par hydrolyse d'un analogue du cellobiose (substrat naturel de cette enzyme), le para-nitrophényl-p-D- glucopyranoside. Les enzymes p-glucosidase reconnaissent le para-nitrophényl-p-D- glucopyranoside et l'hydrolysent en para-nitrophénol, de couleur jaune. L'intensité de coloration est mesurée par mesure de l'absorbance du milieu réactionnel à 410 nm. Une gamme de concentration connue de para-nitrophénol permet de déterminer le nombre de moles de para-nitrophénol libérées dans le milieu et d'en déduire l'activité p-glucosidase ; comme décrit dans l’article l’article « Cellulase activity mapping of Trichoderma reesei cultivated in sugar mixtures under fedbatch conditions » précité.
La « MS » correspond au taux de matière sèche de la biomasse considérée, qui comprend la partie solide d’un mélange liquide (eau)/solide (biomasse) qui est soluble dans le liquide et également la partie solide insoluble dans le liquide en question. Elle est mesurée à l’aide d’un analyseur d’humidité halogène Mettler-Toledo HB43-S dans lequel on dépose une masse de biomasse comprise de préférence entre 0.9 et 1.1 g portée à 150°C par pas de 1 °C et maintenue à cette température le temps nécessaire pour obtenir un poids constant.
L’activité enzymatique globale est mesurée à l’aide de papier filtre et s’exprime en unité papier filtre (FPu) et est standardisé par l’IUPAC. Cette méthode utilise les propriétés réductrices des sucres et principalement du glucose par dosage DNS (acide dinitrosalicylique) d’un papier Whatman n°1 hydrolysé. Il y a réduction à chaud et en milieu alcalin du DNS en acide 3-amino- 2-hydroxy-5-nitrobenzolique qui est un composé rouge dont l’intensité est proportionnelle à la concentration de l’ose. Cette mesure exprimée en FPu, ou lll/mL, ou lll/mg de protéines (abréviation Pn pour protéine), ramenée au pourcentage de cellulose contenue dans la biomasse, exprime une concentration en enzymes dans les milieux réactionnels en g de protéine par kg de cellulose (g Pn/kg de cellulose).
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Cet exemple concerne la conversion par SSF de paille de blé préalablement prétraitée par imprégnation acide puis explosion à la vapeur, de façon connue.
Le prétraitement a été conduit de la façon suivante, conformément à l’enseignement du brevet WO 2018/015227 auquel on se rapportera pour plus de détails, notamment pour la description de l’installation :
- imprégnation de la paille broyée sous forme de particules de taille moyenne de 50 mm par une solution aqueuse d’acide sulfurique à pH compris entre 0,5 et 2, à une température entre 10 et 95°C sous pression atmosphérique, dans un imprégnateur,
- puis explosion à la vapeur dans un autre réacteur, par mise en contact, dans une zone de cuisson, de la paille imprégnée puis égouttée et pressée, avec de la vapeur à une température de 150°C à 250°C et à une pression entre 0,5 et 4 MPa, pour une durée d’au plus 30 minutes, puis transfert de la biomasse dans une zone de détente puis de séparation de la vapeur de la biomasse
La paille de blé ainsi prétraitée présente un taux de matière sèche MS notamment d’au moins 40 à 45% en poids.
Elle est ensuite soumise à une hydrolyse et fermentation simultanées SSF dans un même réacteur, avec mise en contact, dans le milieu réactionnel, de la biomasse avec : - un mélange de deux cocktails enzymatiques : le premier produit par la souche de type 1 à 43 g/L en protéines, le deuxième par la souche de type 2 à 40 g/L en protéines, le mélange des deux cocktails a été réalisé par introduction des deux cocktails directement dans le réacteur.
Alternativement, le mélange (les moûts entiers ou les enzymes séparées) peut être fait hors du réacteur, puis introduit conjointement dans le réacteur,
- une levure dite C5-C6 de type CELLIIX 4 commercialisée par la société Lesaffre est ajoutée au milieu réactionnel, dans une teneur de 0,5 grammes par kg de milieu.
La SSF est opérée entre 30 et 35°C, le milieu réactionnel aqueux étant réglé à un pH compris entre 5 et 5,5.
La table 1 ci-dessous est un tableau des rendements Ethanol/MS à 100 heures de SSF exprimés en % poids pour l’exemple 1 selon l’invention, à différentes doses d’enzymes exprimées en g Pn/kg de cellulose (« Pn » pour protéines) : Le rendement en Ethanol/MS de biomasse y est exprimé en % en poids au bout de 100 heures, à une concentration en matière sèche MS dans le milieu réactionnel de 18 % poids, à différentes doses des deux cocktails d’enzymes, avec en outre les deux cas extrêmes sans mélanges de cocktails, c’est-à-dire avec 100% du cocktail produit par la souche de type 1 (Enz1) - essai a - et 100% du cocktail produit par la souche de type 2 (Enz2) plus performante - essais b,c,d - :
Tableau 1
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On voit de ce tableau que le mélange des deux cocktails constitué d’une part de 10 grammes de protéines (abréviation Pn) par kg de cellulose de cocktail issu de la souche de type 2 (Enz2) et de 2 à 3 grammes de Pn par kg de cellulose de cocktail issu de la souche de type 1 (Enz1) (les essais f et g) donne des rendements Ethanol/MS respectifs de 21 ,9 % poids et 22,7 % poids. Ces rendements sont équivalents à celui obtenu avec 15 g de Pn/kg de cellulose (essai c) du cocktail issu de la souche de type 2 (22,8 % poids) : à performances égales, l’invention permet donc de réduire la quantité globale d’enzymes de 13 à 20% en poids.
On peut voir également qu’avec le mélange avec 10 g de Pn/kg de cellulose du cocktail issu de la souche de type 2 et 4 ou 5 g de Pn/kg de cellulose du cocktail issu de la souche de type 1 (les essais h et j), on retrouve sensiblement les rendements obtenus avec 20 g de Pn/kg de cellulose du seul cocktail issu de la souche de type 2 (l’essai d) (23,8 % poids et 25,1 % poids contre 24,2 % poids) : à performances égales, l’invention permet dans ce cas de figure aussi de réduire la quantité globale d’enzymes, et cette fois de 25 à 30% en poids.
Exemple 2
Les conditions de prétraitement et de SSF sont identiques à celles de l’exemple 1 , mais avec un outil de prétraitement permettant d’améliorer la réactivité de la biomasse aux enzymes : On observe 10 % d’augmentation sur les rendements pour une même enzyme et la même charge de biomasse avec l’exemple 2 par rapport aux rendements de l’exemple 1.
Une première série d’essais concerne de la paille de blé, une deuxième série du Miscanthus.
L’autre différence réside dans les proportions entre les deux cocktails, qui ont été inversées par rapport à celles de l’exemple 1 : ici la proportion dans le mélange de la souche la moins performante est plus élevée (Enz1).
La table 2 est un tableau des rendements Ethanol/MS à 100 heures de SSF exprimés en % poids de l’exemple 2 selon l’invention, à différentes doses d’enzymes exprimées en g Pn/kg de cellulose, avec les mêmes conventions et unités que dans le tableau 1.
Tableau 2
Figure imgf000015_0001
On voit de ce tableau que les mélanges d’un cocktail issu de la souche de type 1 (Enz1) de
10 g Pn/kg de cellulose et d’un cocktail issu de la souche de type 2 (Enz2) de 5 à 7 g Pn/Kg de cellulose (respectivement les essais d1 et e1 pour la paille de blé, et les essais c2 et d2 pour le miscanthus) donnent des rendements éthanol/MS de l’ordre de 40%. Ces rendements sont équivalents à celui obtenu avec 20 g Pn/kg de cellulose du seul cocktail issu de la souche de type 2 (respectivement l’essai c1 pour la paille de blé et l’essai b2 pour le miscanthus) : l’invention permet là encore une réduction de la quantité globale d’enzymes à utiliser d’au moins 25% en poids.
Cela a également été vérifié avec des essais similaires à une concentration en matière sèche dans le milieu réactionnel de 18 % poids sur du peuplier.
Exemple 3
11 utilise de la paille de blé prétraitée comme dans l’exemple 1 , à 18% de MS, pour la convertir en éthanol par SSF dans les mêmes conditions que l’exemple 1 , à l’exception du choix du mélange de cocktails enzymatiques utilisé.
Le mélange utilisé à 15 g de Pn/kg de cellulose est constitué de 65,5 % v/v d’un cocktail enzymatique à 42,8 g/L de protéines produit par la souche de type 1 (Enz1), et 34,5 % v/v d’un cocktail enzymatique produit par la souche de type 2 (Enz2) à 40 g/L de protéines. Il est préparé à part du milieu réactionnel.
La figure 1 montre que le mélange à 15g/kg de cellulose (courbe avec les losanges) permet d’obtenir la même performance que l’enzyme de type 2 à 20 g/kg de cellulose (courbe avec des ronds), soit une économie d’enzymes de l’ordre de 25%.
Il est identique à l’exemple 3, sauf en ce que la paille de blé est remplacée par du Miscanthus à 18% MS. La figure 2, avec les mêmes conventions que la figure 1 , montre des performances très proches, quasi-identiques, entre le mélange à 15 g/kg (courbe avec des losanges) et l’enzyme de type 2 à 20 mg/kg de cellulose (courbe avec des ronds), ce qui représente une économie d’enzymes de 25%.
Il est identique à l’exemple 3, sauf en ce que la paille de blé est remplacée par du peuplier. La figure 3 se rapportant à cet exemple corrobore les résultats des exemples précédents. Des figures 1 ,2,3 se rapportant aux exemples 3,4,5, on voit donc que les productions d’éthanol et/ou les concentrations finales en éthanol obtenues avec 15 g de Pn/kg de cellulose du mélange (Mel) sont
- très supérieures à celles obtenues à 15 g Pn/kg de cellulose de Enz1 ,
- supérieures à celles obtenues à 15 g Pn/kg de cellulose de Enz2, et
- équivalentes à celles obtenues à 20 g de Pn/kg de cellulose de Enz2.
L’invention permet ainsi de diminuer de façon substantielle la dose d’enzymes, avec une diminution de l’ordre de 25% en poids.
Exemple 6
Il est identique à l’exemple 1 , à la différence du mélange de cocktails enzymatiques pour opérer l’hydrolyse : dans cet exemple 6, on mélange un premier cocktail issu de la souche de type 1 (Enz1) à 42,8 g/l à un deuxième cocktail produit par la souche de type 3 (Enz3) à 29 g/l, à part du milieu réactionnel, avant introduction dans le réacteur.
La table 3 ci-dessous est un tableau se lisant de la même manière que la table 1 : il indique des rendements Ethanol/MS à 100 heures de SSF exprimés en % poids de l’exemple 6 selon l’invention à différentes doses d’enzymes exprimées en g Pn/kg de cellulose.
Tableau 3
Figure imgf000017_0001
On voit de ce tableau que les mélanges d’un cocktail issu de la souche de type 1 (Enz1) de 3 à 5 g Pn/kg de cellulose et d’un cocktail issu de la souche de type 3 (Enz3) à 10 g Pn/Kg de cellulose (essais g3, h3, i3) donnent des rendements Ethanol/MS compris entre 24 et 27%. Ces rendements sont supérieurs ou égaux à ceux obtenus avec 15 et 20 g Pn/kg de cellulose du seul cocktail issu de la souche de type 3 (essais c3 et d3) (24,4 % et 25,5 % respectivement). L’invention permet là encore une réduction de la quantité globale d’enzymes à utiliser :
- d’au moins 13% en poids par rapport à 15 g Pn/kg de cellulose de Enz3, tout en améliorant les performances de la conversion de la biomasse prétraitée en éthanol, avec des gains en éthanol compris entre 4 et 9% en poids
- et d’au moins 35% en poids par rapport à 20 g Pn/kg de cellulose de Enz3.
Figure imgf000018_0001
C’est un exemple comparatif, dans la mesure où il opère en hydrolyse dans le cadre d’un procédé SH F, c’est-à-dire en faisant en deux étapes distinctes et dans deux réacteurs différents l’hydrolyse enzymatique puis la fermentation.
On part d’un substrat de paille de blé prétraité comme dans l’exemple 1 à une concentration en matière sèche de 15% poids.
L’hydrolyse enzymatique est opérée à 50°C à un pH d’environ 5, avec un mélange de cocktails enzymatiques identique à celui de l’exemple 6 préparé à part du milieu réactionnel (Mel).
La fermentation est ensuite opérée de façon conventionnelle après une séparation solide- liquide intermédiaire éventuelle comme décrit dans le brevet EP 2 774 992 dans un fermenteur, à une température inférieure à celle de l’hydrolyse enzymatique, de l’ordre de 30 à 35°C, et à un pH plus élevé, avec la même levure qu’à l’exemple 1 (levure de type CELLUX 4), qui est ajoutée au milieu réactionnel dans une teneur de 0,5 grammes par kg de milieu.
La figure 4 représente le graphe correspondant à cet exemple avec en abscisse la durée de l’hydrolyse enzymatique mesurée en heure, et en ordonnée le taux de conversion de cellulose en % au cours de l’hydrolyse. On y voit que le mélange de cocktails (issus de la souche de type 1 et de la souche de type 2) donne le même taux de conversion (courbe avec les losanges) qu’avec le seul cocktail issu de la souche de type 2 (Enz2), à iso-dose d’enzymes (courbe avec des triangles), et qu’il est moins performant que 20 g/kg de cellulose du seul cocktail issu de cette souche de type 2 (courbe avec des ronds) : contrairement à ce qui a été observé dans le cadre d’un procédé SSF, le mélange de cocktails selon l’invention ne permet pas de réduire la quantité d’enzymes à utiliser à iso-performance de conversion quand le procédé est de type SH F.
De ces différents exemples, on vérifie que le mélange de deux cocktails enzymatiques, dont un est nettement moins performant que l’autre, notamment en termes d’activité p-glucosidase, permet de réduire la consommation d’enzymes d’au moins 10 % en poids, et même d’au moins 20% ou 25% en poids, ce qui est très significatif (en maintenant le même rendement et/ou production d’éthanol). Ce résultat est obtenu avec des types de biomasse très différents (paille de blé, miscanthus, peuplier ...), et est reproductible. Il va à l’encontre de la démarche qui aurait plutôt consisté à optimiser la composition du cocktail le plus performant en la supplémentant par une enzyme spécifique, ou à en augmenter la quantité. Il démontre la complémentarité et la synergie des cocktails entre eux, et l’intérêt à associer des cocktails « natifs » plutôt que de chercher à séparer / trier les composants de ces cocktails.
Plus surprenant encore, ce résultat n’est obtenu qu’en SSF, et pas en SH F, comme vu de la comparaison des exemples 6 et 7. II est également dans le cadre de l’invention de mélanger plus de deux cocktails enzymatiques de souches différentes, par exemple trois ou quatre, afin d’augmenter cet effet de complémentarité.

Claims

Revendications
1. Procédé de production d’alcool ou de solvant ou de molécules bio-sourcées, notamment d’éthanol, par hydrolyse enzymatique et fermentation de biomasse lignocellulosique, caractérisé en ce que lesdites opérations d’hydrolyse enzymatique et de fermentation sont opérées par saccharification et fermentation simultanées de la biomasse lignocellulosique dans un milieu réactionnel, et en ce que l’apport d’enzymes audit milieu réactionnel comprend :
- une première composition enzymatique produite par une première souche de champignon filamenteux, notamment appartenant au genre Trichoderma reesei, ladite composition présentant une activité p-glucosidase A1 ,
- une deuxième composition enzymatique produite par une deuxième souche de champignon filamenteux, notamment appartenant au genre Trichoderma reesei, différente de la première souche, ladite deuxième composition présentant une activité p-glucosidase A2, avec l’activité P-glucosidase A2 de la deuxième composition au moins 10 fois, notamment au moins 15 fois supérieure à l’activité p-glucosidase A1 de la première composition.
2. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que l’activité p-glucosidase A1 de la première composition enzymatique est d’au plus 1 lll/mg, et de préférence entre 0,5 lll/mg et 1 lll/mg.
3. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l’activité p- glucosidase A2 est d’au moins 12 ou 15 lll/mg, notamment au moins 20 à 30 lll/mg.
4. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la première souche de champignon filamenteux est obtenue par mutagenèse aléatoire.
5. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la deuxième souche de champignon filamenteux est obtenue par mutagenèse dirigée avec l’ajout d’un gène amélioré par évolution dirigée.
6. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la deuxième souche de champignon filamenteux est obtenue par modification d’une souche pour exprimer un gène codant une cellulase possédant une activité p-glucosidase améliorée.
7. Procédé selon l’une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la deuxième souche de champignon filamenteux est obtenue par modification d’une souche pour exprimer un/des gènes codant une/des cellulase(s) possédant une activité p-glucosidase améliorée et une activité exoglucanase améliorée.
8. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l’une au moins des compositions enzymatiques est introduite dans le milieu réactionnel sous forme de moût(s) complet(s) de champignon.
9. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l’une au moins des compositions enzymatiques est isolée avant introduction dans le milieu réactionnel.
10. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le mélange des compositions enzymatiques est réalisé directement dans le milieu réactionnel ou préalablement à leur introduction dans le milieu réactionnel.
11. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la proportion relative de la première composition enzymatique par rapport à la deuxième composition enzymatique est comprise entre 20/80 et 80/20, de préférence entre 30/70 et 70/30, en poids.
12. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l’activité p- glucosidase du mélange de la première et de la deuxième composition enzymatique est d’au moins 7 Ul/rng, notamment d’au moins 10 Ul/rng, notamment d’au plus 25 Ul/rng, de préférence comprise entre 11 et 14 Ul/rng.
13. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la fermentation est réalisée avec une levure fermentant les sucres en C5 et en C6.
14. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’il comprend une étape de traitement de la biomasse lignocellulosique préalable aux opérations d’hydrolyse enzymatique et de fermentation, sous forme d’un prétraitement comportant un broyage et une imprégnation de ladite biomasse avec une liqueur acide, basique ou oxydante, puis une cuisson ou une explosion à la vapeur de la biomasse imprégnée.
15. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que lesdites opérations d’hydrolyse enzymatique et de fermentation sont opérées par saccharification et fermentation simultanées de la biomasse lignocellulosique dans un milieu réactionnel avec un taux de matière sèche MS de ladite biomasse compris entre 12 et 24%poids, notamment entre 15 et 22%poids.
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