WO1995033063A1 - Composition de microorganismes et procede pour la production de xylitol - Google Patents
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- WO1995033063A1 WO1995033063A1 PCT/FR1995/000681 FR9500681W WO9533063A1 WO 1995033063 A1 WO1995033063 A1 WO 1995033063A1 FR 9500681 W FR9500681 W FR 9500681W WO 9533063 A1 WO9533063 A1 WO 9533063A1
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
- C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
Definitions
- composition of microorganisms and process for the production of xylitol The present application relates to a composition containing a combination of microorganisms for the production of xylitol.
- It also relates to a process for producing xylitol.
- Xylitol is a polyol with five carbon atoms which has a sweetening power close to that of sucrose. Due to its physical properties ⁇ particular chemical, xylitol is used as a substitute sucrose or other sweetening molecules in food to targeted products, pharmaceutical and medical. Indeed, xylitol has a high stability and is inert towards the Maillard reaction. It is not fermentable by many microorganisms and in particular bacteria from dental plaque. Its assimilation is insulin-dependent, which allows its use by diabetics.
- xylitol is naturally present in many fruits and vegetables, but in too small quantities to be extracted profitably.
- xylitol is therefore obtained by chemical reduction of xylose, a monosaccharide with five carbon atoms and major sugar derived from the hemicellulosic fraction of lignocellulosic materials in which it is present in the form of xylans.
- This process for the chemical production of xylitol comprises the following stages:
- the chemical production of xylitol is characterized by a high number of stages, on the one hand that the raw material used is a very complex material from a composition and structure point of view and on the other hand the chemical reduction is non-selective vis-à-vis the substrate, which is composed of a mixture of sugars, mainly comprising xylose.
- This non-specific reduction of xylose leads to the development in the chemical process of heavy separation and purification techniques (chromatography in particular), coupled with recycling operations.
- Candida tropicalis HXP2 (mutant): production of 40 g / 1 of xylitol with a yield of 0.78 g / g and a productivity of 1.6 g / l / h (Gong et al., 1981 Biotechnology Letters, 3 (3), 130-135,).
- Candida tropicalis production of 17 g / 1 of xylitol with a yield of 0.57 g / g and a productivity of 0.35 g / 1.h (Barbosa et al., 1988, The Journal of Industrial Microbiology, 3, 241-251),
- Pachysolen tannophilus production of 4.7 g / 1 of xylitol with a yield of 0.23 g / g and a productivity of 0.1 g / 1.h (Delgenes, 1989, Production ethanol from sugars derived from hemicelluloses by Pichia stipitis. Thesis of Jardin II),
- Candida pelliculosa production of 7.5 g / 1 of xylitol with a yield close to 1 g / g and a productivity of 0.31 g / 1.h (Kitpreechavanich et al., 1984, Biotechnology Letters, 6 (10) , 651-656),
- Candida sp . production of 180 g / 1 of xylitol with a yield of 0.83 g / g and a productivity of 1.6 g / 1.h (Chen and Gong, 1985, Journal of Food Science, 50, 226 -228),
- sorbitol is very difficult to separate from xylitol by chromatographic fractionation.
- the absence of production of this polyol from glucose in the biological process is an advantage.
- L-arabinose is generally converted into arabinitol by yeasts that produce xylitol.
- Candida guilliermondii cultivated on arabinose in microaerobiosis shows a yield of 0.17 g / g (Meyrial et al., 1991).
- Debaryomyces hansenii cultivated under microaerobic conditions, a conversion yield from arabinose to arabinitol close to 100% is obtained (deduced from the results mentioned in WO 91.10.740).
- the applicant therefore set out to implement a microbiological process making it possible to obtain xylitol substantially devoid of arabinitol.
- the subject of the present invention is a composition containing in combination, for simultaneous or separate use over time, at least one first microorganism producing xylitol and at least one second microorganism converting arabinose into metabolites different from arabinitol and not consuming no xylose or xylitol.
- the first microorganism. that is to say that producing xylitol, is a yeast, advantageously of the genus Candida or of the genus Debaryomyces.
- a yeast can be Candida guilliermondii or Candida parapsilosis which constitute the species whose use is preferred in the invention.
- any other yeast having a power to convert xylose to xylitol may be suitable.
- examples of such strains include Candida tropicalis, Candida bo ⁇ dinii, Candida pelliculosa and Debaryomyces hansenii.
- bacteria can be used, in particular of the genus Pediococcus or Propionibacterium or of the genus Lactobacillus, preferably chosen from the species Lactobacillus brevis or Lactobacillus reuteri. But it should be understood that any other microorganism can be suitable as long as it satisfies the following conditions: * inability to metabolize xylose and xylitol,
- the bacterial strain is cultivated on the one hand on a complete liquid medium
- the carbon source is xylose and on the other hand on a complete liquid medium whose carbon source is arabinose.
- HPLC liquid chromatography
- a count under the microscope, after a few days of incubation makes it possible to establish, compared to a count at the initial instant that there has been a multiplication of the two associated strains. All of the above-mentioned experiments were carried out in the laboratory.
- Another possible approach for establishing the criteria required for the bacteria is to carry out the tests on solid medium in petri dishes and to establish the appearance (consumption of arabinose) or not (non consumption of xylose or xylitol) of the bacterial colonies after a few days of incubation.
- arabinosis it is not possible with this approach to easily know whether or not there has been production of arabinitol.
- the invention further relates to a process for producing xylitol, substantially without accumulation of arabinitol, in which the composition of microorganisms described above is cultured in a medium containing at least nutrients and sugars. hemicellulosic origin, in conditions allowing the development of microorganisms.
- nutrients is meant the elements necessary for the growth and metabolic activities of microorganisms, for example yeast extract, peptone and one or more mineral salts.
- mixture of sugars of hemicellulosic origin is meant all the substrates containing xylose and arabinose as major sugars. Such a substrate may be present in the form of a hemicellulose hydrolyzate of plant biomasses.
- Sugars of hemicellulose origin are mainly xylose but may also be other sugars characteristic of hemicelluloses, such as arabinose, glucose, mannose or galactose. It should be noted that they can be replaced, at least partially, by sugars of synthetic origin.
- the present invention therefore makes it possible to solve a problem which has long been posed to a person skilled in the art. It therefore constitutes significant technical progress.
- xylitol has particularly interesting applications in human health and nutrition, as indicated above.
- the method is implemented in a liquid culture medium.
- Partial oxygenation is understood to mean a process in which oxygen is not supplied during part of the process, for example at the start of the process.
- the aeration rate must be sufficient to allow the fermentation of sugars, and in particular xylose, but not excessive, which would decrease the yield of xylitol as a result of increased cell production.
- the optimum value for air flow can be determined by simple tests.
- the oxygen transfer rate it is, for example, from 0.0001 to 500 and preferably between 0.001 and 100 millimoles of oxygen per liter of fermentation medium and per hour. To measure it, it suffices to differentiate between the oxygen introduced into the fermenter and the oxygen leaving the latter, therefore to make the oxygen balance, and to report the result to the volume unit of fermentation medium. and by the hour unit.
- the temperature for carrying out the process is between 15 and 45 "C and preferably between 25 and 35 ° C.
- the pH of the culture medium is, for its part, preferably between 3 and 8 and even more preferably between 5 and 7.
- the culture is generally carried out during 20 to 200 hours in order to obtain an optimal concentration of xylitol.
- the yeast strains producing xylitol are:
- Microbial strains with the inability to metabolize xylose and xylitol and the ability to convert arabinose to metabolites other than arabinitol are Lactobacillus brevis NRRL 3065 and Lactobacillus reuteri NRRL 14171 obtained from the Northern Regional Research Center (Peoria, USA ). These bacterial strains convert arabinose into organic acids (lactic acid, acetic acid). The strains are maintained on agar nutrient media at 4 * C.
- the nutrient medium for yeasts contains 10 g / l of glucose, 5 g / l of pancreatic peptone, 3 g / l of yeast extract, 3 g / l malt extract and 20 g / 1 agar.
- the nutrient medium for bacteria is MRS medium (De Man et al., 1960, J. of Appl. Bact., 23, 130-133) supplemented with 20 g / l of agar.
- Liquid media for the propagation of microorganisms contain:
- the liquid medium comprising 5 g / l of yeast extract, 3 g / l of Yeast Nitrogen Base, 5 g / l of meat peptone-casein, 1.2 g / is introduced into an aerated fermenter.
- the carbon source is a mixture comprising approximately 16.6% glucose, 66.7% xylose and 16.7% arabinose; these proportions simulating a hydrolyzate of hemicelluloses from plant biomasses. Different concentrations of total sugars have been tested: approximately 60 g / 1, 120 g / 1 and 180 g / 1. Yeast and bacteria inocula
- the fermentation is conducted at a pH and a temperature controlled at 6 and 30 ° C respectively.
- the fermenter used has a capacity of 2 liters.
- Xylose, glucose, arabinose, arabinitol and xylitol are quantified by high performance liquid chromatography.
- the total cell development, expressed in g / 1 (dry weight) was measured by gravimetry.
- the duration of the fermentation which is generally between 30 and 200 h, depends on the rate of inoculation of the initial concentration of sugars and the speed of oxygen transfer, the end of the fermentation can be determined by a person skilled in the art by means of regular samples of culture samples.
- P 1F final concentration of xylitol (g / 1)
- P ⁇ Q initial concentration of xylitol (g / 1)
- X 0 initial concentration of xylose (g / 1)
- Xp final concentration of xylose (g / 1) * Yp 2 S yield of arabinitol (g of arabinitol produced per g of arabinose consumed)
- a 0 initial concentration of arabinose (g / 1)
- a F final concentration of arabinose (g / 1) * Purity T in xylitol (%).
- This procedure consists of initial inoculation of the complete liquid medium containing the hemicellulosic sugars as a carbon source, with the bacterial leaven, then when the total consumption of arabinose is obtained, the medium is inoculated with the yeast leaven in order to produce xylitol from xylose:
- anaerobic conditions or microaerobic conditions
- pH regulation at 6
- temperature at 30 ° C, preferably,
- the experiment was carried out in accordance with the general protocol with an aeration flow of 0.005 Volume / Volume per Minute (VVM) and an agitation speed of 800 Rotations Per Minute (RPM) corresponding to an oxygen transfer speed of 1 , 7 ⁇ unole / lh
- VVM Volume / Volume per Minute
- RPM Rotations Per Minute
- the initial sugar concentrations are as follows: xylose: 43.6 g / 1 arabinose: 10 g / 1 glucose: 10 g / 1.
- the process of the invention made it possible to obtain zero production of 1 arabinitol while retaining good parameters for converting xylose to xylitol.
- Analysis of the samples shows that arabinose is converted by Lactobacillus brevis to lactic acid and acetic acid.
- Fermentation is carried out on a mixture of sugars containing (experimental values) xylose (41 g / 1), arabinose (9.7 g / 1) and glucose (11 g / 1) and under the same conditions than in Example 1 except that the bacterium Lactobacillus brevis NRRL 3065 is replaced by the bacterium Lactobacillus reuterii NRRL 14171.
- the fermentation parameters and results are presented in Table 3.
- Lactobacillus reuterii Lactobacillus reuterii.
- Lactobacillus reuterii Parameters Values arabinose conversion rate (%) 100 T (%) 99.5
- the fermentation parameters are presented in Table 4.
- EXAMPLE 6 Fermentation of a hemicellulosic hydrolyzate of wheat straw obtained by acid hydrolysis followed by filtration.
- the hydrolyzate comprising 39 g / l of xylose; 5.9 g / l of glucose and 7.9 g / l of arabinose constitute the carbon source of the fermentation medium.
- the experiment was carried out in accordance with the general protocol using Candida guilliermondii NRC 5578 associated with Lactobacillus reuteri NRRL 14171 and an oxygen transfer rate of 3.9 mmol / lh
- the parameters and the fermentation results are presented in table 8. TABLE 8
Abstract
Composition contenant en combinaison, pour une utilisation simultanée et/ou séparée dans le temps, au moins un premier microorganisme produisant du xylitol et au moins un second microorganisme convertissant l'arabinose en métabolites différents de l'arabinitol, ledit second microorganisme ne consommant substantiellement pas de xylose ou de xylitol. Cette composition peut être utilisée dans un procédé de production de xylitol.
Description
Composition de microorqanismes et procédé pour la production de xylitol La présente demande a pour objet une composition contenant une combinaison de microorganismes pour la production de xylitol.
Elle est en outre relative à un procédé de production de xylitol.
Le xylitol est un polyol à cinq atomes de carbone qui possède un pouvoir sucrant voisin de celui du saccharose. En raison de ses propriétés physico¬ chimiques particulières, le xylitol est utilisé comme substituant du saccharose ou d'autres molécules à pouvoir sucrant dans des produits à visées alimentaires, pharmaceutiques et médicales. En effet, le xylitol possède une haute stabilité et est inerte vis-à-vis de la réaction de Maillard. Il n'est pas fermentescible par de nombreux microorganismes et notamment les bactéries de la plaque dentaire. Son assimilation est insulinodépendante, ce qui permet son utilisation par les diabétiques.
Le xylitol est naturellement présent dans de nombreux fruits et légumes, mais en trop faibles quantités pour en être extrait de façon rentable. A l'échelle industrielle, le xylitol est donc obtenu par réduction chimique du xylose, monosaccharide à cinq atomes de carbone et sucre majeur dérivé de la fraction hémicellulosique des matériaux lignocellulosiques dans lesquels il est présent sous forme de xylanes . Ce procédé de production du xylitol par voie chimique comprend les étapes suivantes:
* hydrolyse de matières premières végétales, telles que bois de bouleau, rafles de maïs, coques
d'amandes,
* purification de l'hydrolysat pour obtenir une solution riche en xylose,
* hydrogénation du xylose en xylitol en conditions élevées de température et de pression et en présence d'un catalyseur métallique comme le nickel de Raney,
* séparation du xylitol des autres polyols par fractionnement chromatographique, * récupération du xylitol par cristallisation.
La production de xylitol par voie chimique est caractérisée par un nombre élevé d'étapes, du fait que d'une part la matière première utilisée est un matériau très complexe d'un point de vue composition et structure et d'autre part la réduction chimique est non sélective vis-à-vis du substrat, lequel est composé d'un mélange de sucres, comprenant majoritairement du xylose. Cette réduction non spécifique du xylose conduit à développer dans le procédé chimique des techniques de séparation et de purification lourdes (chromatographies notamment), couplées à des opérations de recyclage.
Cet état de fait a conduit à rechercher des procédés permettant de rendre la réduction sélective vis-à-vis du xylose. C'est dans ce cadre qu'ont été proposés des procédés biologiques de production du xylitol .
Différents microorganismes ont été testés et étudiés, d'une part pour leur capacité à convertir le xylose en xylitol et d'autre part pour leur propriété à montrer une réduction plus sélective vis-à-vis du xylose ( lorsqu'il est mélangé à d'autres sucres) que la voie chimique.
Plusieurs espèces de levures pouvant produire du xylitol à partir du xylose ont été décrites. En général, l'éthanol est coproduit avec le xylitol, les proportions variant selon la nature des souches et les conditions de culture. On peut rapporter à titre d'illustration, les données expérimentales suivantes ( qui correspondent en général aux performances maximales du matériel biologique testé et qui sont obtenues sur milieu synthétique) : * Candida tropicalis HXP2 (mutant) : production de 40 g/1 de xylitol avec un rendement de 0,78 g/g et une productivité de 1,6 g/l/h (Gong et coll. ,1981 Biotechnology Letters, 3(3), 130-135, ).
* Candida boidinii : production de 35 g/1 de xylitol avec un rendement de 0,43 g/g et une productivité de 0,24 g/1.h (Vongsuvanlert et Tani, 1989, Journal of Fermentation and Bioengineering, 67, 35-39) ,
* Candida guilliermondii : production de 110 g/1 de xylitol avec un rendement de 0,70 g/g et une productivité de 0,46 g/1.h (Meyrial et coll., 1991 Biotechnology Letters, 13(4), 281-286),
* Candida parapsilosis: production de 74 g/1 de xylitol avec un rendement de 0,74 g/g et une productivité de 0,14 g/1.h (Nolleau et coll., 1993, Current Microbiology, 27, 191-197),
* Candida tropicalis: production de 17 g/1 de xylitol avec un rendement de 0,57 g/g et une productivité de 0,35 g/1.h (Barbosa et coll., 1988, The Journal of Industrial Microbiology, 3, 241-251),
* Pachysolen tannophilus : production de 4,7 g/1 de xylitol avec un rendement de 0,23 g/g et une productivité de 0,1 g/1.h (Delgenes, 1989, Production
d'éthanol à partir de sucres dérivés des hémicelluloses par Pichia stipitis. Thèse de Montpellier II),
* Candida pelliculosa: production de 7,5 g/1 de xylitol avec un rendement proche de 1 g/g et une productivité de 0,31 g/1.h (Kitpreechavanich et coll., 1984, Biotechnology Letters, 6(10), 651-656),
* Candida sp.: production de 180 g/1 de xylitol avec un rendement de 0,83 g/g et une productivité de 1,6 g/1.h (Chen et Gong, 1985, Journal of Food Science, 50, 226-228),
* souche recombinée de Saccharomyces cerevisiae: production de 18 g/1 de xylitol avec un rendement de 0,9 g/g et une productivité de 0,19 g/1.h (Hallborn et coll. ,1991, Biotechnology, 9, 1090-1095).
Relativement peu de résultats expérimentaux concernant la production de xylitol par des levures cultivées sur milieux naturels, en particulier des hydrolysats hémicellulosiques de biomasses végétales, sont rapportés dans la littérature.
Une production de xylitol de 95 g/1, avec un rendement de 0,90 g/g et une productivité de 1 g/1.h, a été rapportée par Chen et Gong (1985 précédemment cités) pour Candida sp. B22 cultivée sur un hydrolysat hémicellulosique de bagasse de canne à sucre (hydrolyse acide) . Candida guilliermondii cultivée sur hydrolysat hémicellulosique de bagasse de canne à sucre (hydrolyse acide) produit du xylitol à 34 g/1, avec un rendement de 0,50 g/g et une productivité de 0,26 g/1.h, (Roberto et coll., 1991, Bioresource Technology, 36, 271-275).
Une production de xylitol à 25 g/1 avec un rendement de 0,64 g/g par Debaryomyces hansenii
cultivée sur liqueur sulfitique a été décrite dans WO 91.10.740. Il existe un certain nombre de brevets concernant l'utilisation de levures pour produire le xylitol à partir du même type de substrat que la filière chimique, à savoir le xylose dérivé des hémicelluloses de biomasses végétales. Comme exemples, on peut citer les demandes de brevets W09110740, FR 2 641.545, WO 9008193 et WO 8805467.
Les résultats d'expériences effectuées sur la réduction sélective du xylose montrent que généralement les levures productrices de xylitol ne convertissent pas en leurs polyols respectifs les hexoses, tels que le glucose, le mannose et le galactose. Ces sucres sont en effet convertis en éthanol et la séparation du xylitol de l'éthanol ne pose pas de problèmes majeurs. Ce phénomène a été mis en évidence chez Candida guilliermondii (Meyrial et coll. ,1991, précédemment cités), chez Candida tropicalis (WO 91.10.740), chez un mutant de Candida tropicalis (Gong et coll. ,1981, précédemment cités ) et chez Debaryomyces hansenii (WO 91.10.740).
Cette absence de réduction des hexoses en polyols chez les levures productrices de xylitol est fondamentale dans le cadre de la production de xylitol par voie biologique, car ces hexoses sont obligatoirement présents dans les hydrolysats hémicellulosiques. En effet, la purification du xylitol par rapport aux sorbitol, mannitol et galacticol est évitée dans le procédé biologique. De plus, l'absence de production de galacticol à partir de galactose est importante à considérer dans la mesure où le galacticol peut provoquer la cataracte, d'où la nécessité de l'éliminer dans le procédé de
fabrication de xylitol par voie chimique.
En outre, le sorbitol est très difficile à séparer du xylitol par fractionnement chromatographique. L'absence de production de ce polyol à partir du glucose dans le procédé biologique constitue un avantage.
Mais, contrairement aux hexoses d'origine hémicellulosique, le L-arabinose est en général converti en arabinitol par les levures productrices de xylitol. Ainsi Candida guilliermondii cultivée sur arabinose en microaérobiose montre un rendement de 0,17 g/g (Meyrial et coll., 1991). Avec Debaryomyces hansenii cultivée en conditions microaérobies, un rendement de conversion de l'arabinose en arabinitol proche de 100 % est obtenu (déduit des résultats mentionnés dans WO 91.10.740). Enfin, cultivée sur hydrolysat hémicellulosique de bagasse de canne, une souche de Candida coproduit avec le xylitol, une quantité significative d'arabinitol (Chen et Gong, 1985, précédemment cités). Le rendement de formation déduit de cet article est 0,65 g/g.
D'un point de vue biotechnologique, cette propriété qu'ont les levures productrices de xylitol de réduire l'arabinose en arabinitol peut s'avérer pénalisante dans la mesure où un hydrolysat d'hémicelluloses de biomasses végétales est obligatoirement composé d'un mélange de monomères osidiques, en particulier de xylose et d'arabinose. En conséquence, on obtient lors de fermentations par des levures de milieux synthétiques ou naturels à base de sucres hémicellulosiques, une production de xylitol et d'arabinitol . Ceci peut nécessiter la mise en oeuvre d'un traitement de fractionnement chromatographique
pour purifier le xylitol avant de le récupérer par cristallisation.
La co-production de xylitol et d'arabinitol par des levures cultivées sur mélange de sucres hémicellulosiques est d'ailleurs décrite dans WO 9 110
740 et dans la publication de Chen et Gong (1985, précédemment cités).
Il ressort donc de l'état de la technique que l'on ne disposait pas, à la connaissance du demandeur, de procédés permettant l'obtention de xylitol sans qu'il soit nécessaire de procéder à des étapes de purification du xylitol par rapport à l'arabinitol à partir du milieu de réaction.
Le demandeur s'est donc attaché à la mise en oeuvre d'un procédé microbiologique permettant d'obtenir du xylitol substantiellement dépourvu d'arabinitol .
Il a montré que la combinaison de deux types de microorganismes, l'un produisant du xylitol, et l'autre convertissant l'arabinose en metabolites différents de 1 'arabinitol, permettait d'obtenir des milieux de culture contenant des concentrations importantes en xylitol substantiellement dépourvu d'arabinitol . La présente invention a pour objet une composition contenant en combinaison, pour une utilisation simultanée ou séparée dans le temps, au moins un premier microorganisme produisant du xylitol et au moins un second microorganisme convertissant 1'arabinose en des metabolites différents de l'arabinitol et ne consommant pas de xylose ou de xylitol.
Préférentiellement, le premier microorganisme .
c'est-à-dire celui produisant le xylitol, est une levure, avantageusement du genre Candida ou du genre Debaryomyces. Une telle levure peut être Candida guilliermondii ou Candida parapsilosis qui constituent les espèces dont l'emploi est préféré dans 1 'invention.
Il doit être entendu que toute autre levure ayant un pouvoir de conversion du xylose en xylitol peut convenir. A titre d'exemples de telles souches, on peut mentionner Candida tropicalis, Candida boïdinii, Candida pelliculosa et Debaryomyces hansenii.
Comme second microorganisme, on peut utiliser des bactéries , en particulier du genre Pediococcus ou Propionibactérium ou du genre Lactobacillus, choisies de préférence parmi les espèces Lactobacillus brevis ou Lactobacillus reuteri . Mais il doit être entendu que tout autre microorganisme peut convenir du moment qu'il satisfait aux conditions suivantes: * incapacité de métaboliser le xylose et le xylitol,
* capacité de convertir l'arabinose en metabolites autres que 1 'arabinitol,
* compatibilité de croissance et d'activités fermentaires avec la souche utilisée pour produire le xylitol à partir du xylose,
* capacité réduite de rentrer en compétition vis-à-vis de l'oxygène avec la levure productrice de xylitol, car les levures productrices de xylitol ont besoin d'oxygène pour fermenter le xylose.
Pour s'assurer de la compatibilité des souches bactérienne et de levure, la souche bactérienne est cultivée d'une part sur milieu complet liquide dont la
source carbonée est le xylose et d'autre part sur milieu liquide complet dont la source carbonée est l'arabinose. Après quelques jours d'incubation, l'analyse des prélèvements par chromatographie liquide (HPLC) permet d'établir une consommation de l'arabinose avec une non production d'arabinitol et une non consommation du xylose. Le même test peut être fait en utilisant le xylitol comme source de carbone pour démontrer une non consommation de ce polyol par la souche bactérienne.
Pour établir la capacité réduite de la souche bactérienne à rentrer en compétition vis-à-vis de l'oxygène avec la levure productrice de xylitol, on réalise les cultures (avec la bactérie seule) sur arabinose décrites ci-dessus, d'une part en microaerobiose et d'autre part en anaerobiose. Dans ces deux conditions la bactérie est capable de consommer l'arabinose pour le convertir en acétate et en lactate. La possibilité pour les deux souches (levure et bactérie) d'être cultivées ensemble a été mesurée et réalisée en mettant en oeuvre une culture des deux souches sur milieu liquide complet dont la source carbonée est un mélange xylose + arabinose, en microaerobiose. Un comptage au microscope, après quelques jours d'incubation permet d'établir, par rapport à un comptage à l'instant initial qu'il y a eu multiplication des deux souches associées. L'ensemble des expérimentations mentionnées ci-dessus a été réalisé au laboratoire. Une autre approche possible pour établir les critères requis pour la bactérie est de réaliser les tests sur milieu solide en boîtes de Pétri et d'établir l'apparition (consommation de
l 'arabinose) ou non (non consommation du xylose ou du xylitol) des colonies bactériennes après quelques jours d'incubation. Toutefois, en ce qui concerne l'arabinose, il n'est pas possible avec cette approche de savoir aisément s'il y a eu production ou non d'arabinitol.
La combinaison objet de la présente invention présente un effet inattendu puisqu'il n'était en rien prévisible, au vu de l'état de la technique porté à la connaissance du demandeur, que deux souches de microorganismes puissent d'une part coopérer au sein d'une même culture, et d'autre part que cette coopération puisse conduire à une production industrielle. En effet, on pouvait s'attendre à ce que la croissance de l'une des souches se fasse au détriment de l'autre ou que l'une des souches produise des metabolites difficiles à séparer du xylitol.
L'invention a en outre pour objet un procédé de production de xylitol, substantiellement sans accumulation d'arabinitol, dans lequel la composition de microorganismes décrite ci-dessus est mise en culture dans un milieu contenant au moins des éléments nutritifs et des sucres d'origine hémicellulosique, dans des conditions permettant le développement des microorganismes .
Par "éléments nutritifs", on entend les éléments nécessaires à la croissance et aux activités métaboliques des microorganismes, par exemple l'extrait de levure, la peptone et un ou des sels minéraux.
Par "mélange de sucres d'origine hémicellulosique", on entend tous les substrats
contenant du xylose et de l'arabinose comme sucres majeurs. Un tel substrat peut être présent sous la forme d'un hydrolysat d'hémicelluloses de biomasses végétales . Les sucres d'origine hémicellulose sont principalement le xylose mais peuvent être aussi d'autres sucres caractéristiques des hémicelluloses, tels que l'arabinose, le glucose, le mannose ou le galactose. On notera qu'ils peuvent être remplacés, au moins partiellement, par des sucres d'origine synthétique.
Pour la fabrication des milieux de culture et pour la mise en oeuvre de l'invention de manière générale, on pourra se référer aux manuels généraux suivants :
"Microbiologie Industrielle et Génie Biochimique" par Simon et Meunier (Masson et Cie éditeurs, 1970), " Microbiological Methods" par Collins, Lyne et Grange (Butterworths éd., 6ème édition) et
" Comprehensive Biotechnology " par Moo-Young et al. (Pergamon Press, 1985, volumes 1 à 4) .
Le procédé objet de l'invention permet une production industrielle de xylitol sous une forme substantiellement pure, ce qui n'était possible jusqu'alors qu'en passant par des étapes de séparation lourdes et coûteuses.
La présente invention permet donc de résoudre un problème se posant de longue date à l'homme du métier. Elle constitue donc un progrès technique important.
L'importance de la présente invention est
renforcée par le fait que le xylitol présente des applications particulièrement intéressantes en santé et en nutrition humaines, comme indiqué ci-dessus.
Avantageusement, le procédé est mis en oeuvre dans un milieu de culture liquide.
Préférentiellement il peut être mis en oeuvre, au moins partiellement, en présence d'oxygène.
On entend par oxygénation partielle un procédé dans lequel on ne fournit pas d'oxygène pendant une partie du procédé, par exemple en début de procédé.
Le débit d'aération doit être suffisant pour permettre la fermentation des sucres, et notamment du xylose, mais non excessif, ce qui diminuerait le rendement en xylitol par suite d'une production cellulaire accrue.
La valeur optimale du débit d'air peut être déterminée par des essais simples. Exprimée comme la vitesse de transfert en oxygène, elle est, par exemple, de 0,0001 à 500 et de préférence comprise entre 0,001 et 100 millimoles d'oxygène par litre de milieu de fermentation et par heure. Pour la mesurer, il suffit de faire la différence entre l'oxygène introduit dans le fermenteur et l'oxygène sortant de ce dernier, donc de faire le bilan en oxygène, et de rapporter le résultat à l'unité de volume de milieu de fermentation et à l'unité horaire.
De manière avantageuse, la température de mise en oeuvre du procédé est comprise entre 15 et 45"C et préférentiellement entre 25 et 35'C. Le pH du milieu de culture est, quant à lui, préférentiellement compris entre 3 et 8 et encore plus préférentiellement compris entre 5 et 7.
La culture est généralement effectuée pendant
20 à 200 heures afin d'obtenir une concentration optimale en xylitol.
La présente invention est illustrée sans pour autant être limitée par les exemples qui suivent. EXEMPLES
Protocole expérimental général:
Les souches de levures productrices de xylitol sont:
* Candida guilliermondii NRC 5578 obtenue auprès de The Foundation for Industrial Technology (
Sao Paulo, Brésil) et décrite par Barbosa et coll. (Journal of Industrial Microbiology, 1988, 3, 241).
* Candida parapsilosis ATCC 28474 obtenue auprès de 1*American Type Culture Collection (Rockville, USA) et décrite par Furlan et coll. (Biotechnology Letters, 1991, 13 (3), 203).
Les souches microbiennes ayant l'incapacité de métaboliser le xylose et le xylitol et la capacité de convertir l'arabinose en metabolites autres que 1'arabinitol sont Lactobacillus brevis NRRL 3065 et Lactobacillus reuteri NRRL 14171 obtenues auprès du Northern Régional Research Center (Peoria, USA) . Ces souches bactériennes convertissent l'arabinose en acides organiques (acide lactique, acide acétique) . Les souches sont maintenues sur des milieux nutritifs géloses à 4*C. Le milieu nutritif pour les levures contient 10 g/1 de glucose, 5 g/1 de peptone pancréatique, 3 g/1 d'extrait de levure, 3 g/1 d'extrait de malt et 20 g/1 de gélose. Le milieu nutritif pour les bactéries est le milieu MRS (De Man et coll., 1960, J. of Appl . Bact., 23, 130-133) additionné de 20 g/1 de gélose.
Les milieux liquides pour la propagation des
microorganismes (levains) contiennent:
* pour les levures: xylose 20 g/1, extrait de levure 5 g/1, Yeast Nitrogen Base 3 g/1,
* pour les bactéries: glucose 20 g/1, polypeptone 10 g/1, extrait de levure 5 g/1, extrait de viande 10 g/1, phosphate dipotassique 2 g/1, acétate de sodium 5 g/1, citrate d'ammonium 2 g/1, sulfate de magnésium 0,2 g/1, sulfate de manganèse 0,05 g/1, Tween 80 1/ml. Pour réaliser la fermentation, on introduit dans un fermenteur aéré le milieu liquide comprenant 5 g/1 d'extrait de levure, 3 g/1 de Yeast Nitrogen Base, 5 g/1 de peptone de viande-caséine, 1,2 g/1 de KH2PO4, 0,18 g/1 de Na^HPO^ et la source carbonée. La source carbonée est un mélange comprenant environ 16,6 % de glucose , 66,7 % de xylose et 16,7 % d'arabinose; ces proportions simulant un hydrolysat d'hémicelluloses de biomasses végétales. Différentes concentrations en sucres totaux ont été testées: environ 60 g/1, 120 g/1 et 180 g/1. Les inoculums de levures et de bactéries
•7 sont de 1 à 3.10 cellules par ml de milieu.
La fermentation est menée à un pH et à une température régulée à 6 et 30*C respectivement. Le fermenteur utilisé a une capacité de 2 litres. Le xylose, le glucose, l'arabinose, l'arabinitol et le xylitol sont quantifiés par chromatographie en phase liquide à haute performance. Le développement cellulaire total, exprimé en g/1 (poids sec) a été mesuré par gravimétrie. La durée de la fermentation qui se situe le plus généralement entre 30 et 200 h dépend du taux d'inoculation de la concentration initiale en sucres et de la vitesse de transfert en oxygène, la fin de la
fermentation pouvant être déterminée par l'homme du métier au moyen de prélèvements réguliers d'échantillons de culture.
Dans les études décrites ci-après, les différentes valeurs données dans les tableaux ont été calculées comme suit à partir des dosages effectués sur les prélèvements:
* rendement Y g en xylitol ( g de xylitol produit par g de xylose consommé)
P1F : concentration finale en xylitol (g/1) P^Q : concentration initiale en xylitol (g/1)
X0 : concentration initiale en xylose ( g/1) Xp : concentration finale en xylose ( g/1) * rendement Yp2 S en arabinitol ( g d'arabinitol produit par g d'arabinose consommé)
P^p : concentration finale en arabinitol (g/1) P20 : concentration initiale en arabinitol
(g/i)
A0 : concentration initiale en arabinose (g/1) AF : concentration finale en arabinose (g/1) * Pureté T en xylitol (%).
P1F
P1F + P2F
* Productivité volumétrique moyenne en xylitol ( g de xylitol/1 de milieu/heure) :
P 1F l tF où tp = temps de réaction (h) .
Protocole expérimental dans le cas d'une utilisation séparée dans le temps d'une bactérie puis d'une levure.
Cette procédure consiste en inoculation initiale du milieu complet liquide contenant les sucres hémicellulosiques comme source de carbone, avec le levain bactérien puis lorsque la consommation totale de l'arabinose est obtenue, on inocule le milieu avec le levain levurien afin de produire le xylitol à partir du xylose:
- première phase: conditions d'anaerobiose ( ou de microaerobiose) régulations du pH à 6 et de la température à 30°C, préférentiellement,
- deuxième phase: conditions de microaerobiose , régulation du pH et de la température respectivement à 6 et 30°C préférentiellement. EXEMPLE 1:
Fermentation du mélange de sucres (glucose, xylose , arabinose ) par la levure Candida guilliermondii NRC 5578 seule ou combinée, à Lactobacillus brevis NRRL 3065.
L'expérience a été réalisée conformément au protocole général avec un débit d'aération de 0,005 Volume/Volume par Minute (VVM) et une vitesse d'agitation de 800 Rotations Par Minute (RPM) correspondant à une vitesse de transfert en oxygène de 1,7 πunole/l.h. Les concentrations initiales en sucres (valeurs expérimentales) sont les suivantes:
xylose : 43 , 6 g/1 arabinose : 10 g/1 glucose : 10 g/1.
Les paramètres de fermentation sont indiqués dans le tableau 1.
TABLEAU 1
Fermentation de Candida guilliermondii combinée à Lactobacillus brevis
Paramètres Valeurs xylitol produit (g/1) 26
YP1/S (g/g) 0,60 taux de conversion du xylose (%) 100
Qpl (g/1.h) 0,18 arabinitol produit (g/1) 0 YP2/S (g/g) O taux de conversion de l'arabinose (%) 100
T (%) 100
Comme le montre le tableau 1, le procédé de l'invention a permis d'obtenir une production nulle d1arabinitol tout en conservant de bons paramètres de conversion du xylose en xylitol. L'analyse des échantillons montre que l'arabinose est converti par Lactobacillus brevis en acide lactique et en acide acétique.
L'effet avantageux du procédé est souligné lorsque l'on compare les données expérimentales du tableau 1 avec celles présentées dans le tableau 2, obtenues avec la levure cultivée dans les mêmes conditions, mais seule, sur le même mélange de sucres contenant ( valeurs expérimentales): xylose : 40,2 g/1 arabinose : 9,9 g/1 glucose : 10 g/1.
TABLEAU 2 Fermentation de Candida guilliermondii seule
Paramètres Valeurs xylitol produit (g/1) 28
YP1/S (S/S) °'70 taux de conversion du xylose (%) 100
Qpl (g/1.h) 0,28 arabinitol produit (g/1) 6 γp2/s (5/9) °'60 taux de conversion de l'arabinose (%) 100
T (%) 82
EXEMPLE 2
Fermentation combinée de Candida guilliermondii et Lactobacillus reuterii.
On réalise la fermentation d'un mélange de sucres contenant (valeurs expérimentales) du xylose (41 g/1), de l'arabinose (9,7 g/1) et du glucose ( 11 g/1) et dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1 excepté que la bactérie Lactobacillus brevis NRRL 3065 est remplacée par la bactérie Lactobacillus reuterii NRRL 14171. Les paramètres et résultats de fermentation sont présentés dans le tableau 3.
TABLEAU 3 Fermentation combinée de Candida guilliermondii et
Lactobacillus reuterii.
Paramètres Valeurs xylitol produit (g/1) 22 γpι/s (g/g) °'54 taux de conversion du xylose (%) 100
Qpl (g/1.h) 0,22 arabinitol produit (g/1) 0,1
YP2/S ^/g) °'01
TABLEAU 3 ( suite )
Fermentation combinée de Candida guilliermondii et
Lactobacillus reuterii. Paramètres Valeurs taux de conversion de l'arabinose (%) 100 T (%) 99,5
EXEMPLE 3: Fermentation de Candida parapsilosis seule ou combinée à Lactobacillus reuterii. On réalise la fermentation d'un mélange de sucres contenant ( valeurs expérimentales) du xylose (40,7 g/1), de l'arabinose (9,9 g/1) et du glucose (10,4 g/1), dans les mêmes conditions que dans l'exemple 2 excepté que la levure Candida guilliermondii est remplacée par la levure Candida parapsilosis ATCC 28474. Les paramètres de fermentation sont présentés dans le tableau 4. Les paramètres obtenus avec la levure cultivée dans les mêmes conditions avec des concentrations initiales expérimentales de 41 g/1 de xylose, 10,5 g/1 d'arabinose et de 11 g/1 de glucose, mais seule, sont présentés dans le tableau 5.
TABLEAU 4 Fermentation de Candida parapsilosis combinée à Lactobacillus reuterii.
Paramètres Valeurs xylitol produit (g/1) 17
YP1/S ^/g) °'49 taux de conversion du xylose (%) 87,5 Qpl (g/1.h) 0,14 arabinitol produit (g/1) 0,6
YP2/S (g/g) 0,06 taux de conversion de l'arabinose (%) 98
T (%) 96,6
TABLEAU 5
Fermentation de Candida parapsilosis seule Paramètres Valeurs xylitol produit (g/1) 28,5
YP1/S (g/g) 0,69 taux de conversion du xylose (%) 100
Qpl (g/1.h) 0,36 arabinitol produit (g/1) 10 YP2/S (g/g) 0,95 taux de conversion de l'arabinose (%) 100 T (%) 72
EXEMPLE 4: Influence de l'apport en oxygène sur la fermentation combinée de Candida guilliermondii et Lactobacillus brevis .
On réalise la fermentation d'un mélange de sucres comprenant des concentrations expérimentales initiales en xylose de 41,2 g/1, en arabinose de 10,2 g/1 et en glucose de 10 g/1 dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1, excepté que la vitesse de transfert en oxygène est 3,9 mmoles/l.h. Les paramètres et les résultats de fermentation sont présentés dans le tableau 6. TABLEAU 6
Influence de l'apport en oxygène sur la fermentation combinée de Candida guilliermondii et Lactobacillus brevis . Paramètres Valeurs xylitol produit (g/1) 23,5
YP1/S (g/g) 0,57 taux de conversion du xylose (%) 100 Qpl g/1.h 0,42 arabinitol produit (g/1) 0,2
TABLEAU 6 (suite) Influence de l'apport en oxygène sur la fermentation combinée de Candida guilliermondii et Lactobacillus brevis. Paramètres Valeurs
YP2/S (g/g) °'02 taux de conversion de l'arabinose (%) 100
T (%) 99,1
La comparaison des résultats expérimentaux présentés dans le tableau 6 avec ceux présentés dans le tableau 1 révèle que le procédé selon l'invention est peu dépendant de la vitesse de transfert en oxygène alors que ce facteur a une forte influence sur les paramètres (vitesse et rendement) de conversion du xylose en xylitol par les levures (Nolleau et coll., 1993, précédemment cités). EXEMPLE 5:
Influence de la concentration en sucres sur la fermentation combinée de Candida guilliermondii et Lactobacillus brevis.
On réalise la fermentation du même mélange de sucres et dans les mêmes conditions que dans l'exemple 4, excepté que la concentration initiale et totale en sucres est portée à 133 g/1 (xylose 89 g/1, glucose 23 g/1, arabinose 21 g/1). Les paramètres de fermentation sont présentés dans le tableau 7.
TABLEAU 7 Influence de la concentration en sucres sur la fermentation combinée de Candida guilliermondii et Lactobacillus brevis. Paramètres Valeurs xylitol produit (g/1) 61
YP1/S (g/g) 0,69 taux de conversion du xylose (%) 100
Qpl (g/1. ) 0,76 arabinitol produit (g/1) 1,1
YP2/S (g/g) 0,05 taux de conversion de l'arabinose (%) 100
T (%) 98,2
EXEMPLE 6: Fermentation d'un hydrolysat hémicellulosigue de paille de blé obtenu par hydrolyse acide suivie d'une filtration.
L'hydrolysat comprenant 39 g/1 de xylose; 5,9 g/1 de glucose et 7,9 g/1 d'arabinose constitue la source carbonée du milieu de fermentation. L'expérience a été réalisée conformément au protocole général en utilisant Candida guilliermondii NRC 5578 associée à Lactobacillus reuteri NRRL 14171 et une vitesse de transfert en oxygène de 3,9 mmoles/l.h. Les paramètres et les résultats de fermentation sont présentés dans le tableau 8.
TABLEAU 8
Fermentation d'un hydrolysat hemicellulosigue de paille de blé obtenu par hydrolyse acide suivie d'une filtration.
Paramètres Valeurs xylitol produit (g/1) 21
YP1/S (g/g) 0,55 taux de conversion du xylose (%) 98 Qpl (g/1.h) 0,29 arabinitol produit (g/1) 0,4
YP2/S (g/g) 0,05 taux de conversion de l'arabinose (%) 100
T (%) 98,1
Claims
REVENDICATIONS 1. Composition contenant en combinaison, pour une utilisation simultanée et/ou séparée dans le temps, au moins un premier microorganisme produisant du xylitol et au moins un second microorganisme convertissant 1*arabinose en metabolites différents de 1 'arabinitol, ledit second microorganisme ne consommant substantiellement pas de xylose ou de xylitol .
2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le premier microorganisme est une levure.
3. Composition selon la revendication 2, caractérisée en ce que la levure est du genre Candida ou du genre Debaryomyces .
4. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le second microorganisme est une bactérie.
5. Composition selon la revendication 4, caractérisée en ce que la bactérie est du genre
Lactobacillus, Pediococcus ou Propioniibacterium.
6. Procédé de production de xylitol, substantiellement sans accumulation d'arabinitol, caractérisé en ce que la composition de microorganismes selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 est mise en culture dans un milieu contenant au moins des éléments nutritifs et des sucres d'origine hémicellulosique, dans des conditions permettant le développement des microorganismes.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le milieu de culture est liquide.
8. Procédé selon l'une des revendications 6 et
7, caractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre au moins en partie en présence d'oxygène.
9. Procédé selon l'une des revendications 6 à
8, caractérisé en ce que le milieu contient du glucose, du xylose et/ou de l'arabinose.
10. Procédé selon l'une des revendications 6 a
9, caractérisé en ce que le milieu contient un hydrolysat d'hémicellulose.
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