"Procédé de fabrication d'alcool éthylique à partir
d'algues vertes unicellulaires" <EMI ID=1.1>
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te à un procédé de fabrication d'alcool éthylique par l'uti- lisation d'amidon produit intracellulairement et/ou extra- cellulairement au départ d'algues vertes unicellulaires.
Plus spécifiquement,l'invention concerne des per- fectionnements apportés à la préparation d'alcool éthylique en se basant sur la découverte d'espèces particulières d'algues vertes unicellulaires qui produisent de l'amidon et qui l'emmagasinent et le conservent. Dans le présent mémoire,
ces espèces sont désignées par les expressions Chlorella vulgaris Al-ly-3(ll), Chlamydomonas sp. Al-5 et Scenedesmus basilensis IAM C-66 et sont toutes des substances aérobies adaptées à la culture hétérotrophique dans un milieu liquide foncé contenant du carbone, de l'azote et des sels inorganiques. Ces souches sont trouvées et recueillies dans des boues et eaux d'égout près de Tokyo. Japon, et sont isolées d'une manière cellulairement simple.
Il est connu dans la technique de fabriquer l'alcool éthylique par distillation de l'amidon fermenté provenant de plantes plus grandes, telles que le mais, le blé, les pommes de terre douces. Toutefois, la croissance de ces plantes est influencée par les intempéries et leurs rendements dépendent fortement des conditions climatiques. En particulier, en raison de la menace actuelle de pénurie d'aliments,
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éthylique à partir de ces produits agricoles.
La présente invention est basée sur la préparation d'alcool éthylique sans devoir utiliser ces plantes et son but est de rendre disponible un procédé de fabrication d'alcool éthylique en mettant en oeuvre des algues vertes unicellulaires qui fournissent de l'alcool éthylique, ces
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dustriels.
L'invention est décrite en particulier ci-après par la voie d'exemples:
1. Chlorella vulgaris Al-ly-3(ll):
La cellule est sphérique et ses dimensions sont de 3,3 à 5,0 x 3,3 à 5,2 microns de long; elle se multiplie normalement en se divisant en quatre autospores. La couleur de sa colonie est initialement verte, mais lorsqu'elle croît, elle perd son éclat et devient jaunâtre. Cette es-
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optimale est de 37[deg.]C au pH de 5 à 9, de préférence de 7 ou
8. Une caractéristique de cette espèce est qu'elle produit et accumule l'amidon tant à l'intérieur qu'à l'extérieur de la cellule, la quantité d'amidon atteignant les 70 à 80% de son poids à sec, c'est-à-dire autant que la teneur en amidon des céréales. Un autre avantage est qu'elle se décharge des deux tiers ou moins de l'amidon interne à partir de la cellule.
La souche de cette espèce peut être cultivée soit dans le noir, soit à la lumière. Dans le noir, le glucose, le maltose et l'acide acétique sont utilisés préférablement comme sources de carbone, tandis que le nitrate de potassium, la polypeptone et les sels d'ammonium (notamment l'urée, le sulfate d'ammonium, l'acétate d'ammonium, le nitrate d'ammonium) servent de préférence de sources d'azote.
2. Chlamydomonas sp. Al-5:
La cellule est sphérique ou ellipsoïdale et ses dimensions sont de 5,5 à 8,3 x 6,1 à 9,5 microns de long; elle se reproduit normalement, en ce sens qu'elle se développe en quatre autospores. La couleur de sa colonie est vert foncé, indépendamment du fait qu'elle soit dans le noir ou à la lumière. L'espèce croît à une température
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est une température de 28[deg.]C au pH 7 ou 8. A l'intérieur du corps, l'accumulation d'amidon atteint les 45 à 60% de son poids à sec, mais aucun amidon extra-cellulaire n'est produit.
La souche de cette espèce peut être cultivée soit dans le noir, soit à la lumière. Le glucose, le galactose et le maltose sont utilisés préférablement dans le noir.
3. Scenedesmus basilensis, IAM C-66 :
La cellule a la forme d'un citron et ses dimensions sont de 4,2 à 8,4 x 7,7 à 11,2 microns de long. L'espèce croît à une température de 25 à 37[deg.]C au pH 5 à 9, mais la condition optimale est 30[deg.]C au pH de 7 ou 8. La couleur de sa colonie est verte tant dans le noir qu'à la lumière. A l'intérieur de la cellule, une quantité d'amidon atteignant 40 à 60% de son poids à sec est produite, emmagasinée et conservée. La souche peut être cultivée dans le noir ou à la lumière. Dans le noir, du glucose, du fructose, du maltose, etc., sont de préférence utilisés comme sources de carbone.
En commun avec les espèces décrites ci-dessus,
il est préférable d'employer, comme lit de culture, un lot de déchets agricoles contenant du sucre et/ou des déchets industriels renfermant de l'acétate. Ceci répond à un but économique. Comme sources de carbone, on utilise préférablement du glucose, du maltose et de l'acide acétique et
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l'acétate d'ammonium, de l'urée, etc. Comme sels inorganiques, une petite fraction da phosphate, tel que du K2HP04, du Na2HP04, du KH2P04, et une petite fraction de sels
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FeS0.7H20, peut être ajoutée au lit de culture. De préfé- rence, une souche est cultivée à une température de 30 à
35[deg.]C au pH de 7 à 8. Une culture du type à secousses peut être effectué à une échelle réduite et une culture sous agita-
tion et aération peut être réalisée à grande échelle. Une culture discontinue ou une culture continue est aussi pos- sible. En ce qui concerne la culture discontinue, le volume
de croissance atteint son maximum en deux ou quatre jours. Normalement, le carbohydrate contenu dans une algue unicellulaire atteint les 25% ou moins de son poids sec, mais
le Chlorella vulgaris Al-ly-3(ll) a la propriété avantageuse d'emmagasiner une quantité d'amidon atteignant les 70 à 80%
de son poids à sec tant à l'intérieur qu'à l'extérieur de
la cellule.
Lorsqu'une souche est cultivée en discontinu, l'amidon commence à s'accumuler après la phase logarithmique qui se produit 24 à 48 heures après le démarrage de la culture, et l'accumulation atteint son maximum pendant la phase stationnaire.
Les algues vertes mentionnées ci-dessus sont adaptées à une culture dans le noir et peuvent être cultivées
dans une cuve pour la production en série.
Une caractéristique de la présente invention réside dans l'utilisation de l'amidon emmagasiné et conservé dans
les algues unicellulaires, de façon à obtenir de l'alcool éthylique par saccharification et fermentation alcoolique
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une pratique classique, mais ce procédé ne peut pas être appliqué à la fabrication d'alcool éthylique en utilisant l'amidon produit par des algues vertes, en raieon des caractéristiques de leurs parois cellulaires. Dès que l'ami- don est prélevé des cellules, sa saccharification et fermen- tation ne sont pas différentes de celles des procédés clas- siques.
1. Prétraitement:
Un milieu de culture est soumis à l'action centri- fuge de 3000 tours par minute pendant 10 minutes et le précipité tassé est mis en solution par l'addition d'une
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à 20 minutes, en vue de détruire les cellules des algues. Ce traitement augmente le rendement en amidon et facilite sa saccharification.
2. Saccharification et fermentation alcoolique: a) Saccharification acide et fermentation alcoolique:
Une solution d'acide sulfurique, contenant une fraction d'eau de deux à cinq fois sa quantité, est ajoutée
au milieu prétraité et la concentration en acide sulfurique
est réglée à 25% au maximum et à 5% au minimum par rapport à
la quantité d'amidon à traiter. Ensuite, le milieu est
chauffé dans de l'eau bouillante pendant 30 minutes et,
par l'addition d'une fraction d'eau de deux à cinq fois
sa quantité, une opération de saccharification est réalisée
à 120[deg.]C sous pression (2 kg/cm2) pendant 30 minutes. La liqueur saccharifiée obtenue est neutralisée à la valeur pH
de 5,0 avec un lait de chaux, puis est additionnée, après
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KH2P04 et d'urée. En outre, un germe est ajouté à raison de
10% à cette liqueur neutralisée. La liqueur est ensuite laissée telle quelle au repos pendant 3 à 4 jours pour assu- rer la fermentation. Par conséquent, la liqueur contient une teneur en alcool d'environ 6%. Finalement, le bouillon obtenu est distillé d'une manière connue pour produire l'alcool.
b) Saccharification enzymatique et fermentation alcoolique:
De l'acide chlorhydrique dilué est ajouté au
milieu prétraité qui est chauffé à 120[deg.]C sous pression
(2 kg/cm2) pendant 30 minutes. Puis le liquide est neutralisé convenablement avec de la soude caustique et laissé
tel quel au repos à 55[deg.]C pendant 1,30 heure . Le liquide
est saccharifié par l'addition d'une enzyme pour obtenir
une liqueur saccharifiée qui est soumise à une fermentation de la même façon que dans le cas de la saccharification acide. Exemple 1 - Culture par du glucose
Le tableau 1 donne les constituants d'un liquide
de rebut industriel provenant d'un fabricant de glucose et mis en oeuvre dans la saccharification enzymatique de l'amidon pour produire un glucose inverti.
Tableau 1 (mg/ml)
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0,2 g de KH2P04 sont dissous dans 1000 ml de liquide de
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dans des flacons à secousses de 500 ml. Le liquide de chaque
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que de 1,5 pendant 15 minutes et 10 à 20 mg en poids à sec
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germe à chaque flacon. Ces flacons sont ensuite soumis à
une agitation de 130 secousses par minute. Après une culture de 3 jours, la croissance du Chlorella atteint sa condition maximale et à partir d'un litre de milieu de culture, on obtient des algues, ainsi que de l'amidon extracellulaire en <EMI ID=19.1>
une quantité s'élevant au total à 9,5 g en poids à sec, dont 7,1 g sont de l'amidon intracellulaire et de l' amidon extracellulaire.
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basilensis IAM C-66 sont cultivés de la même façon. La croissance de ceux-ci atteint sa condition maximale après
3 jours et à partir d'un litre de liquide respectif, on obtient 10,3 g en poids à sec de Chlamydomonas sp. Al-S
et 9,8 g en poids à sec de Scenedesmus IAM C-66 respectivement Exemple 2 - Culture par de l'acide acétique
Le milieu est cultivé avec de l'acide acétique
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de carbone. Le milieu aqueux contient 1 g d'extrait de levure, 2 g de NaN03, 0,2 g de MgS047H20, 0,05 g de CaC12.2H20,
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lots de 100 ml chacun dans des flacons à secousses de 500 ml. Le pH initial du milieu a la valeur 7,2. Le milieu de
chaque flacon est stérilisé à 120[deg.]C sous une pression atmosphérique de 1,5 pendant 15 minutes et 10 à 20 ml en poids
à sec de Chlorella vulgaris Al-ly-3(ll) sont introduits
dans chaque flacon de manière à assurer une culture du type secousses à 30[deg.]C. Pendant la culture, la valeur pH est
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la croissance du Chlorella atteint sa condition maximale
et à partir d'un litre de milieu, on obtient 12,3 g en poids à sec d'algues et d'amidon extracellulaire, dont 8,7 g sont de l'amidon intracellulaire et extracellulaire. Pendant la période entière de 4 jours, 460 ml/1 d'acide acétique IN
(acide acétique glacial = 27,6 g) sont utilisés pour régler
la valeur pH.
Exemple 3 - Saccharification acide
Le Chlorella vulgaris Al-ly-3(ll), le Chlamydomo- nas sp. Al-5 et le Scenedesmus basilensis IAM C-66, dont
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tement sonore dans un oscillateur de 10 kHz pendant 10 à
30 minutes, de façon à détruire les cellules de leurs algues.
10 grammes en poids à sec de chaque milieu sont introduits dans un flacon conique de 200 ml et le milieu de chaque
i flacon est chauffé dans de l'eau bouillante pendant 30 minu- tes en présence de 2 g d'acide sulfurique et de 25 mg de
H20. Ensuite, par l'addition de 25 ml d'eau, le milieu est saccharifié sous pression (2 kg/cm2) pendant 30 minutes.
Par consé quent, le taux de saccharification est de 90 à 95%.
Le liquide saccharifié est versé dans une cuve de neutralisation où, après refroidissement, il est neutralisé
à la valeur pH 5,0 avec un lait de chaux. Dès que le liquide neutralisé est filtré, on ajoute à ce dernier du MgS04.7H20 à 0,02%, du K2HPO4 à 0,2% et de l'urée à 0,1% de façon à obtenir une liqueur saccharifiée. Puis une levure de fer- mentation alcoolique (Brennereihefe Rasse II, XII) est additionnée par inoculation, à raison de 10% en poids de liqueur, à 50 ml de la liqueur saccharifiée (concentration
en sucre = 14,8%).
Exemple 4 - Saccharification enzymatique
Chaque espèce est transformée en une pâte et sou- i mise à un traitement sonore de la même façon qu'à l'exemple
3. 10 g en poids à sec de chaque milieu sont introduits dans
un flacon triangulaire de 200 ml, où le milieu est chauffé
sous pression (2 kg/cm2) pendant 30 minutes en présence de
0,01 g de HC1 et de 25 ml de H20. En outre, 25 ml de H20
i sont ajoutés et une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium est additionnée pour neutraliser le liquide qui est ensuite conservé dans un bain-marie d'une température constante
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saccharif ication (Glucenzyme AF-3 préparée par Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) est ajoutée à raison de 0,09% en po ids. L'opération de saccharification est poursuivie à
55[deg.]C pendant 20 heures. Par conséquent, le taux de sacchari-
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pour obtenir une liqueur saccharifiée.
Exemple 5 - Fermentation alcoolique
Dès qu'une levure de fermentation alcoolique a été inoculée à la liqueur saccharifiée, celle-ci est soumise à
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liqueur est bien secouée immédiatement après l'inoculation, mais après cette opération, une agitation à raison d'une fois par jour est suffisante. Le tableau 2 donne les résultats de l'analyse après 4 jours de fermentation.
Tableau 2
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REVENDICATIONS
1.- Procédé de fabrication d'alcool éthylique, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver par la voie aérobie des algues vertes unicellulaires, produisant de
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organique fournissant une source de carbone assimilable, une source d'azote assimilable, ainsi que des sels inorganiques et d'autres substances nécessaires à la croissance des algues; à rompre la matière cellulaire pour libérer l'amidon intracellulaire; à saccharifier l'amidon produit; à faire fermenter l'amidon saccharifié en présence d'un micro-organisme produisant de l'alcool éthylique et utilisant l'amidon saccharifié; et à récupérer l'alcool éthylique produit à partir du milieu de fermentation.