"Nouvelles souches de levure de panification, procédé pour les obtenir et levures obtenues à partir de ces souches" Nouvelles souches de levure de panification, procédé pour les obtenir et levures obtenues à partir de ces souches.
L'invention a pour objet deux nouvelles souches de levure du genre de celles qui sont adaptées au maltose, osmotolérantes et résistantes au séchage. Elle vise également les levures obtenues à partir de ces souches et notamment les levures de panification en tant que produit nouveau.
Des souches de levure du genre en question et les levures sèches correspondantes sont connues par le brevet belge N[deg.] 862.191 et le brevet de perfectionnement belge N[deg.] 878.070 auxquels correspondent les deux brevets américains N[deg.] 4.318.929 et 4.318.930 délivrés le 9 mars
1982.
Poursuivant ses travaux en vue de fournir à l'utilisateur des levures du genre en question de plus en plus performantes et au meilleur coût, la Société Demanderesse, mettant en oeuvre le procédé d'obtention de nouvelles souches décrit dans le susdit brevet belge N[deg.] 862.191 correspondant au brevet français N[deg.] 77 39149 et au brevet américain N[deg.] 4.318.929, a réussi à obtenir de nouvelles souches qui sont particulièrement avantageuses du fait notamment de leur rendement d'obtention après culture sur mélasse.
Ces deux nouvelles souches selon l'invention, inscrites dans les cahiers de laboratoire de la Demande-
<EMI ID=1.1>
déposées au National Collection of Yeast Cultures, Agricultural Research Council, Food Research Institute, Colney Lane, Norwich NR4 7UA, Royaume-Uni de Grande-Bretagne, respectivement sous les numéros de collection NCYC 995 et NCYC 996.
A l'aide de ces souches, on a préparé des levu-res fraîches (à environ 30 % de matières sèches) performantes avec des rendements :
matière sèche, levure récoltée
quantité de mélasses mise en oeuvre
supérieurs de plusieurs pour cent aux rendements obtenus avec les souches, objet des susdits brevets. Grâce à leur résistance au séchage, on a préparé, à partir de ces levures fraîches, des levures sèches à au moins 92 % de matières sèches conformes à l'invention.
Les levures sèches conformes à l'invention sont caractérisées par le fait que, dans les tests A' décrits dans les susdits brevets et rappelés ci-après, elles présentent la caractéristique de donner des résultats équivalents, que la réhydratation de la levure sèche ait lieu à 38[deg.]C, comme cela est normalement recommandé et pratiqué dans les tests habituels, ou qu'elle ait lieu à
20[deg.]C.
Les tests A utilisés par la Demanderesse pour caractériser les levures obtenues sont réalisés à l'aide du fermentomètre de Burrows et Harrison décrit dans le "Journal of the Institute of Brewing", vol. LXV, n[deg.] 1, January-February 1959 et sont définis de la manière suivante :
- Test A (levures comprimées fraîches)
A 20 g de farine incubée à 30[deg.]C, on ajoute un poids de levure comprimée correspondant à 160 mg de matières sèches, cette levure étant délayée dans 15 ml d'eau
<EMI ID=2.1>
par litre ; on malaxe à l'aide d'une spatule pendant
40 secondes, de manière à obtenir une pâte que l'on place au bain-marie réglé à 30[deg.]C ; treize minutes après le début du malaxage, le récipient contenant la pâte est fermé hermétiquement ; la quantité totale de gaz produit est mesurée après 60, puis 120 minutes ;
cette quantité est exprimée en ml à 30[deg.]C et sous
760 mm de Hg, <EMI ID=3.1>
xage, on réhydrate la levure sèche dans de l'eau distillée, à 38[deg.]C ; on utilise à cet effet 40 % du volume d'eau d'hydratation mis en oeuvre ; le complément en eau, additionné de 405 mg de NaCl, est ajouté à l'issue des 15 minutes de réhydratation,
- Test A2 (levures comprimées fraîches)
<EMI ID=4.1>
rine 100 mg de saccharose ; la quantité totale de gaz produit est mesurée après 60 minutes ; <EMI ID=5.1>
farine 100 mg de saccharose ; la quantité totale de gaz produit est mesurée après 60 minutes, <EMI ID=6.1>
rine 2 g de saccharose ; la quantité totale de gaz produit est mesurée après 60 minutes.
- Test A'3 (levures sèches)
<EMI ID=7.1>
farine 2 g de saccharose ; la quantité totale de gaz produit est mesurée après 60 minutes,
- Test A4 (levures comprimées fraîches)
<EMI ID=8.1>
rine 5,5 g de saccharose ; la quantité totale de gaz produit est mesurée après 60 minutes, <EMI ID=9.1>
farine 5,5 g de saccharose, la quantité totale de gaz produit est mesurée après 60 minutes.
Ceci étant, on a obtenu les souches conformes à l'invention de la manière suivante :
Dans le but d'obtenir de nouveaux hybrides de levure qui soient osmotolérants, rapides, résistants au séchage et qui donnent des levures sèches plus faciles à utiliser et des rendements maximaux en culture sur mélasses, on a poursuivi le travail de recherche décrit dans le brevet français 77 39149 ou dans les brevets américains 4 318 929 et 4 318 930, en utilisant comme matériel de départ les souches disponibles dans des centres publics de collection comme le N.C.Y.C. (National Collection of Yeast Cultures) et notamment les souches décrites dans les deux brevets américains 4 318 929 et 4 318 930.
Les ségrégeants obtenus dans un premier temps
(c'est-à-dire les souches "haploïdes") furent croisés selon les techniques décrites dans le chapitre 7 :
"Sporulation and Hybridization of Yeasts" écrit par R.R. FOWELL du livre "The Yeasts", volume 1, édité par A.H. Rose and J.S. Harrison, 1969 - Academic Press, London and New-York. De manière générale, on a croisé par mise en oeuvre de la technique du mass-mating, des ségrégeants ayant des caractéristiques de fermentation rapide du maltose et provenant de la sporulation d'hybrides existants avec d'autres ségrégeants ayant des caractéristiques d'osmotolérance et d'une basse teneur en invertase, provenant de la sporulation soit d'isolats, soit d'hybrides (c'est-à-dire de souches créées auparavant par la main de l'homme à l'aide de techniques similaires).
Les nouveaux hybrides ainsi créés furent étudiés à l'aide des tests de screening décrits dans le brevet français 77 39149, auquel correspondent le brevet belge N[deg.] 862.191 et le brevet américain 4 318 929, et notamment à l'aide des premier, troisième et quatrième tests de screening décrits dans cette famille de brevets. Les hybrides sélectionnés par les résultats de ces tests de screening furent ensuite étudiés en les cultivant dans des fermenteurs de type White (Yeast Technology, J. White, 1954) puis dans des fermenteurs de type NBS (New Brunswick Scientific Company) et en sé-chant les levures ainsi obtenues par application des méthodes décrites dans la susdite famille de brevets, issue de la demande de brevet français 77 39149 ou dans la famille de brevets, issue de la demande ayant conduit au brevet américain N[deg.] 4 318 930.
Le travail de recherche ici décrit conduisit à la création de quelques milliers de nouveaux hybrides et à la sélection de plusieurs hybrides ayant des propriétés équivalentes à celles des meilleurs hybrides de levure décrits dans les deux susdites familles de brevets. Ces nouveaux hybrides de levures furent ensuite comparés à ceux obtenus antérieurement et objet des deux susdites familes de brevets, les critères retenus étant les suivants :
a) le rendement de la culture sur mélasses de betteraves, c'est-à-dire le nombre de kilogrammes de "matière sèche levure" produits en mettant en oeuvre
100 kg de mélasses toujours prélevées d'un même lot, la culture étant effectuée selon un procédé conventionnel de propagation de la levure sur mélasses, b) l'activité fermentative des levures sèches obtenues, au cours des essais dans les tests A', menés après réhydratation des levures sèches à 38[deg.]C comme normalement pratiqué et à 20[deg.]C. Les levures étaient séchées à environ 95 % de matières sèches après ajout d'un émulsifiant de manière à avoir le meilleur effet protecteur lors du séchage et être dans les meilleures conditions de réhydratation.
Ces comparaisons et notamment le critère de rendement sur mélasses permirent la sélection de deux nouveaux hybrides de levure, entièrement créés par la main de l'homme. Ces deux nouveaux hybrides furent déposés sous la forme de souches biologiquement pures de levure à la National Collection of Yeast Cultures, Agricultural Research Council, Food Research Institute, Colney Lane, Norwich NR4 7UA, sous les numéros NCYC 995 et NCYC 996.
La souche NCYC 995 est la souche désignée dans les cahiers de laboratoire de la demanderesse sous le numéro a alpha 5900, la souche NCYC 996 celle désignée sous le numéro a alpha 1112. Les tests d'identification menés sur ces deux souches par le N.C.Y.C. montrent qu'elles appartiennent toutes les deux à l'espèce Saccharomyces Cerevisiae.
Dans les tests d'identification menés par le N.C.Y.C., la souche NCYC 995 a donné, après 48 heures, des cellules de dimension (5,0 - 6,0) x (5,0 - 10,0) microns tandis que la souche NCYC 996 a donné des cellules ovales un peu plus petites (3,0 - 5,0) x (5,0 - 7,0) microns en milieu liquide YM, (3,0 - 3,5) x (4,5 - 5,5) microns en milieu solide YM. En sporulation, la souche NCYC 995 a donné 2 à 3 spores par asque sur Corn Meal Agar et Gorodkowa's agar, par contre elle n'a pas donné d'ascopores sur le milieu à l'acétate de potassium lors de l'essai fait par le N.C.Y.C. La souche NCYC 996 a sporulé sur milieu à l'acétate de potassium et sur Gorodkowa's agar en donnant 1 à 4 spores par asque. Les deux souches fermentent le dextrose, le galactose, le maltose, le saccharose, le raffinose, le tréhalose, le mélézitose et l'alphaméthylglucoside.
Les deux nouveaux hybrides NCYC 995 et NCYC 996 assimilent le glucose, le galactose, le saccharose, le maltose, le tréhalose, le raffinose, le mélézitose, l'éthanol, l'alphaméthylglucoside, le sulfate d'ammonium. Seule la souche NCYC 996 a montré une lente formation d'acide sur chalk agar (milieu au carbonate de chaux) dans les tests parallèles menés par le N.C.Y.C. Les deux souches n'ont assimilé ni l'inuline, ni le D-mannitol. La plupart de ces caractères déterminés dans les tests de Lodder, sont des caractères secondaires, sans signification technologique. Leur reproductibilité dans le cadre des tests pratiqués n'est pas bonne ; elle dépend des impuretés que peuvent contenir certains sucres et de l'état physiologique des cultures au moment des tests.
On peut noter que la souche NCYC 995 est très comparable à la souche NCYC 890 décrite dans le brevet américain 4 318 930 en ce qui concerne les performances des levures sèches que ces deux souches permettent d'obtenir. La souche NCYC 995 a en plus les avantages suivants quand on la compare avec cette souche NCYC 890 : <EMI ID=10.1> rieur sur mélasse de betteraves contenant 50 % de sucres exprimés en saccharose, c'est-à-dire que pour la même quantité de mélasses (et de saccharose), elle permet d'obtenir 3 % de plus de matières sèches levure. Un accroissement de rendement similaire est observé quand la souche NCYC 995 est comparée à la souche NCYC 848 décrite dans le brevet américain 4 318 929,
- la souche NCYC 995 permet la préparation de levures fraîches, (c'est-à-dire de levures ayant entre <EMI ID=11.1>
rapides et beaucoup mieux adaptées au maltose que celles pouvant être obtenues avec la souche NCYC 890, à teneur en azote égale. La souche NCYC 995 permet d'obtenir des levures fraîches dépassant des valeurs de l'ordre de
180 ml dans le test A en 2 heures.
On peut noter que la souche NCYC 996 est assez comparable à la souche NCYC 878 décrite dans le brevet américain 4 318 929 en ce qui concerne les levures sèches particulièrement performantes sur pâtes sucrées qu'elle permet d'obtenir. La souche NCYC 996 a l'avantage de donner un rendement en culture sur mélasses de betteraves, de 2 à 4 % supérieur à celui donné par les souches NCYC R 30, NCYC 878, NCYC 879 utilisées pour l'obtention de levures sèches particulièrement performantes sur pâtes sucrées.
Les deux souches NCYC 995 et NCYC 996 ont la propriété de permettre d'obtenir des levures sèches
<EMI ID=12.1> préférence, entre 94 et 97 % de matières sèches qui supportent bien la réhydratation à 20[deg.]C dans les tests A' décrits ci-dessus, aux lieu et place d'une réhydratation avec de l'eau distillée à 38[deg.]C. Les levures sèches préférées selon l'invention sont séchées, après
<EMI ID=13.1>
sèches, de préférence à 95-96 % de matières sèches ; ces levures sèches se conservent très longtemps dans leurs emballages étanches sous vide ou sous atmosphère inerte.
Si on récapitule les résultats obtenus avec ces deux nouveaux hybrides, biologiquement purs, créés par ce travail de recherche et déposés au N.C.Y.C. sous les numéros 995 et 996, on obtient les principaux résultats suivants :
1. Résultats enregistrés pour la levure fraîche obtenue
par une culture sur des fermenteurs, tels que ceux décrits par J. White.
Dans les essais sur fermenteurs de 3 litres tels que décrits dans Yeast Technology, J. White (1954), pages
103 à 106, où le milieu de culture a un volume total de 1100 ml, où le sucre est apporté sous forme de mélasse, où l'air est filtré sur membrane du type Millipore à raison de 1 m<3>/heure et où l'ensemencement est réalisé par 300 mg de levure obtenue par culture anaérobie en ballons, ces deux souches ont donné les résultats suivants :
<EMI ID=14.1>
2. Résultats enregistrés pour la levure fraîche obtenue
par culture en fermenteurs pilotes NBS.
Ces souches ont été testées sur batterie de fermenteurs NBS (New Brunswick Scientific Co., Inc.) de volume total 5 litres et de volume utile 3 à 3,5 litres permettant une alimentation continue en les diffé-
<EMI ID=15.1> Ces essais sont conduits selon les règles habituelles en matière de propagation des levures telles que décrites par exemple dans l'ouvrage "Yeast Technology" de Gerald Reed and Henry J. Peppler, 1973 _ The Avi Publishing Company Inc. Tous les nutriments nécessaires en petites quantités à la levure, comme par exemple le magnésium ou les facteurs de croissance habituellement employés (biotine, vitamines du groupe B) sont apportés en début de culture. Le facteur de multiplication de la levure est de l'ordre de 4 à 5 en
10 heures. Les essais ont donné les résultats moyens suivants mesurés sur la levure fraîche obtenue à environ 30 % de matières sèches.
<EMI ID=16.1>
3. Résultats enregistrés pour des levures fraîches destinées au séchage et obtenues après des tests usine
<EMI ID=17.1>
lume donnant approximativement 25 tonnes de levure fraîche.
Le protocole d'essais est le suivant : à l'exception de l'emploi des procédés et matériels spécifiés ciaprès, les souches sont propagées en usine en plusieurs stades de multiplication, la levure fraîche est récoltée à l'aide de matériels classiques employés en levurerie et selon des procédés de fabrication usuels, comme les matériels et les procédés qui sont décrits par exemple dans le livre "Yeast Technology",
1973, déjà cité.
Le dernier stade de multiplication de la levure conduisant à la levure récoltée en vue d'être séchée est mené de manière à obtenir une levure stable au séchage en respectant la règle suivante :
La culture de chaque souche est conduite de manière à
<EMI ID=18.1>
ches présentant : <EMI ID=19.1> . une teneur en protéines correspondant à l'optimum d'activité de la souche cultivée, compte tenu de la perte d'activité au séchage, . une composition répondant aux inégalités suivantes:
<EMI ID=20.1>
. un abaissement cryoscopique de l'eau externe de la levure inférieur à 0,3[deg.]C (cet abaissement cryoscopique étant mesuré de la manière suivante : on réalise une crème avec 100 g de la levure fraîche pressée sur laquelle on veut effectuer cette mesure et 30 g d'eau déminéralisée, on centrifuge cette crème et on mesure l'abaissement cryoscopique du surnageant obtenu).
Les résultats obtenus dans ce protocole d'essais ont été les suivants :
<EMI ID=21.1>
4. Résultats enregistrés pour les levures sèches après
séchage .jusqu'à une valeur comprise entre 95 % et
96 % de matières sèches, des levures obtenues lors des essais "usine" décrits ci-dessus.
Le protocole d'essais est le suivant :
A la levure stable au séchage, obtenue de préférence
<EMI ID=22.1>
fine émulsion constituée d'un émulsifiant comme les esters de sorbitol ou de polyglycérol à raison de 1 à 2 % des matières sèches levure et éventuellement un agent épaississant. On l'extrude à travers une grille de largeur de maille 0,5 mm à 2 mm, de préférence
<EMI ID=23.1>
tières sèches par un séchage particulièrement ménageant, c'est-à-dire un séchage relativement court de moins de 4 heures et où la température de la levure
<EMI ID=24.1>
fin de séchage.
En pratique, à la levure fraîche stable au séchage obtenue, on a ajouté une fine émulsion constituée d'ester de sorbitol et de gomme arabique à raison
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sèche levure. On l'a extrudée en vermicelles de 0,6mm de diamètre. On l'a séchée en laboratoire sur un fluidiseur discontinu de laboratoire. On a porté une attention particulière à ce que le début de séchage soit rapide et homogène. La durée totale du séchage a été inférieure à 1 heure, la température de la levure a été maintenue en dessous de 30[deg.]C en début de séchage et en dessous de 35[deg.]C en fin de séchage. Dans ces essais, la levure a été portée à plus de 94 % de matières sèches pour obtenir une bonne conservation de ses propriétés.
Les résultats moyens obtenus avec les deux nouveaux hybrides NCYC 995 et NCYC 996 sont les suivants :
<EMI ID=26.1>
5. Comparaison des rendements :
Rendement = quantité de matière sèche levure récoltée
quantité de mélasses mise en oeuvre Ces comparaisons ont été menées avec les appareils et en -suivant le protocole d'essais décrits dans l'exemple 2 du brevet français ? 75 20943 (n[deg.] de publication : 2.316.328) auquel correspond le brevet belge N[deg.] 843.792.
Les essais ont été répétés plusieurs fois pour chaque souche, en utilisant un lot de mélasses de betteraves contenant 42 % de sucres totaux exprimés en saccharose et mesurés par la méthode de Clerget. Les résultats suivants ont été calculés en assignant le nombre
100 au rendement de la souche donnant le meilleur résultat dans les séries d'essais. Cette souche donnant le meilleur résultat est la souche NCYC 995.
<EMI ID=27.1>
L'accroissement de rendement, c'est-à-dire l'augmentation de la quantité de levure récoltée pour la même quantité de mélasses mise en oeuvre, résultant de l'emploi des souches NCYC 995 et NCYC 996, a été confirmé lors de plusieurs essais menés avec différents lots de mélasses de betteraves ayant des caractéristiques différentes.
6. Comportement des levures sèches en réhydratation à
20[deg.]C, en comparaison avec la réhydratation à 38[deg.]C.
Les résultats obtenus en réhydratation à 20[deg.]C dans les tests A', exprimés sous la forme d'un pourcentage des résultats obtenus en réhydratation à 38[deg.]C dans les mêmes tests dépendent essentiellement des conditions de séchage employées. Cependant, les nombreux tests qui ont été menés montrent que la différence entre les deux résultats est généralement plus faible lorsque les levures sèches ont été obtenues dans les mêmes conditions d'essais avec les souches NCYC 995 et 996. Par l'emploi de conditions de séchage relativement rapides et surtout ménageantes (où la levure ne dépasse jamais 35[deg.]C) permettant d'obtenir des levures sèches poreuses et finement divisées, des résultats identiques peuvent être obtenus avec les deux nouveaux hybrides NCYC 995 et NCYC 996 dans les tests A' en faisant la réhydratation à 38[deg.]C ou à 20[deg.]C.
En conclusion, on voit que le nouveau travail de recherche a permis d'obtenir les nouvelles souches hybrides de levure NCYC 995 et NCYC 996, ayant les propriétés nouvelles suivantes, conduisant aux nouvelles levures de panification décrites ci-dessus et ci-dessous a) le nouvel hybride de levure NCYC 995 permet d'obtenir des levures fraîches entre 28 et 35 % de matières sèches et, de préférence, entre 30 - 35 % de matières sèches, stables au séchage et qui ont une haute <EMI ID=28.1>
tout en ayant des teneurs en azote calculées sur matières sèches, relativement faibles, c'est-à-dire infé-
<EMI ID=29.1>
permet d'obtenir des levures fraîches extrêmement rapides quand on les cultive avec des hautes teneurs en azote sur matières sèches ; b) le nouvel hybride de levure NCYC 995 permet d'obtenir des levures sèches actives en petits granules fins et poreux, (c'est-à-dire ayant de préférence un diamètre compris entre environ 0,5 et 1 mm et une longueur de l'ordre de 1 à 3 mm environ et présentant une surface poreuse et alvéolée); ayant entre 94 % et 97 % de matières sèches et contenant un émulsifiant choisi pour son rôle protecteur lors du séchage, caractérisées par le fait que simultanément : <EMI ID=30.1> gement de C02 compris entre 125 ml et 140 ml, si les
160 mg de matières sèches de levure utilisées dans ce
test A' sont réhydratés avec de l'eau distillée à
38[deg.]C et également si ces 160 mg de matières sèches de levure sont réhydratés avec de l'eau distillée à 20[deg.]C, <EMI ID=31.1> levure sèche est réhydratée à 38[deg.]C ou si elle est réhydratée à 20[deg.]C ; c) le nouvel hybride de levure NCYC 996 permet d'obtenir des levures sèches actives en petits granules <EMI ID=32.1>
ches et contenant un émulsifiant choisi pour son rôle protecteur lors du séchage (comme par exemple du monostéarate de sorbitan à une dose comprise entre 1 et 2 %) caractérisées par le fait qu'elles donnent dans le test
<EMI ID=33.1>
quand la levure sèche est réhydratée à 38[deg.]C ou à 20[deg.]C ; d) les deux nouveaux hybrides de levure NCYC 995 et NCYC 996 permettent d'obtenir des levures de panification au moins aussi performantes dans les tests classiques que celles qui peuvent être obtenues avec les souches connues auparavant, ces levures présentant également des caractéristiques nouvelles très intéressantes. L'emploi de ces deux nouveaux hybrides de levure permet surtout un gain de rendement de production sur mélasses de l'ordre de plusieurs pour cent par rapport aux hybrides de levures créés auparavant pour obtenir à la fois des levures rapides bien adaptées au maltose et osmotolérantes. La consommation de mélasses est le principal poste du prix de revient fabrication des levures et, en conséquence, une économie de quelques pour cent sur ce poste représente un gain économique important.
L'invention vise les nouvelles souches obtenues, les nouvelles levures obtenues avec ces deux souches et notamment l'utilisation des nouvelles levures sèches conformes à l'invention.
L'invention vise également un procédé de produc-tion de biomasse de levure caractérisé par l'application des deux nouvelles souches NCYC 995 et NCYC 996 permettant de produire des levures fraîches ou sèches pour la panification, mais aussi pour la distillerie, l'oenologie et la fermentation de tous les jus sucrés en général. La souche NCYC 996 est notamment très intéressante pour la production des levures sèches pour la vinification et l'invention vise en particulier les levures sèches pour vinification obtenues avec cette souche.
Comme il va de soi et comme il résulte déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement aux modes de réalisation et d'adaptation qui ont été plus spécialement envisagés ; elle en embrasse, au contraire, toutes les variantes. Par exemple, l'invention n'est en aucun cas limitée à la propagataion des nouvelles souches obtenues sur mélasses de betteraves, au contraire elle comprend également la multiplication des nouvelles souches sur tout substrat apportant du carbone assimilable et notamment les mélasses de canne, les mélasses de raffineries, les sirops de saccharose inverti et notamment les mélasses high test, tous les dérivés, produits et sous-produits de l'industrie du mais et, d'une manière générale, tous les produits provenant de plantes riches en sucres simples (comme le saccharose)
ou complexes mais facilement hydrolysables comme l'amidon ou l'inuline.
REVENDICATIONS
1. Nouvel hybride de levure Saccharomyces Cerevisiae déposé au N.C.Y.C. sous le N[deg.] 995.
2. Nouvel hybride de levure Saccharomyces Cerevisiae déposé au N.C.Y.C. sous le N[deg.] 996.
3. Procédé de production de levures vivantes sous forme de levures comprimées fraîches à 28 - 35 % de
<EMI ID=34.1>
matières sèches destinées à la panification, la distillation, l'oenologie, la fermentation des jus sucrés, caractérisé par le fait qu'il comprend la mise en oeuvre