JPS5857154B2 - 発酵によるエタノ−ルの製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、発酵によるエタノールの製造方法に関する。

さらに詳しくは、本発明は、α−アミラーゼ及びグルコ
アミラーゼの存在下において粒状澱粉の水懸液をエタノ
ール生産菌で発酵せしめることによるエタノールの製造
方法に関する。

エタノール含有溶液を製造するための従来の発酵は、エ
タノール生産菌、たとえば、麦酒酵母菌（Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） を培養す
るのに必要な条件下において操作しなげればならない。

たとえば、ｐＨを約３乃至７に保持し、温度を約２５乃
至３８℃に保持し、約２０重量饅の以下のグルコースを
含む麦芽汁で発酵を開始し且つ培養液巾約１０重置板を
超えるアルコール濃度を回避しながら、操作しなげれば
ならない。

澱粉またはひき割りとうもろこしのような澱粉含有物質
が発酵で消費されるグリコース源である非常に多くの場
合において、方法は一連の澱粉液化及び加水分解を伴い
、（固体の）澱粉を、二部弁は少なくとも酵母菌の生育
培地となる、グルコース溶液に転化する。

発酵を目的とする、グルコース及びマルトースへの澱粉
の転化はこれまで長い量大規模に商業的に実施されてき
たが、先行技術において用いられる方法はかなりの量の
非発酵性炭水化物を含む麦芽汁を常に生ずるものであっ
た。

さらに、これまで知られている全ての澱粉液化及び加水
分解法には、相当量の熱エネルギーを必要とするという
特徴がある。

さらに、澱粉から導かれるグルコースシロンフの発酵の
場合、そのシロップが高純度であってもなくても、発酵
開始時には極めて過剰のグルコース養分が存在し且つ発
酵終了時にはグルコース養分がほとんど存在しないとい
う状況に微生物がおかれること、ならびにこの発酵はそ
の他の点では、２０％を越える量の炭水化物を溶解して
いるシロップでの発酵の開始を回避するための要求に従
うことに留意されたい。

澱粉液化及び糖化のための大きい熱エネルギー要求を回
避しようとする試みは別として、完全に糖化された澱粉
の発酵に伴う不都合は比較的にほとんど当業界の注意を
ひいていなかった（米国特許第４，０９２，４３４号参
照） 明らかに、約２５多を越える固形分を含む肉汁を発酵さ
せてさらに水とエネルギーのコストを下げる可能性と共
に、発酵方法における改良（たとえば、改良された熱効
率）を達成するために、澱粉の低温酵素的液化と発酵の
実施とを組み合わせようとする努力はこれまではなされ
ていなかった。

本発明の主目的は、粒状澱粉のエタノールへの発酵によ
る転化に適した、改良された熱効率を有する発酵方法を
提供することにある。

本発明の別の目的は、エタノールに転化可能な２５重重
量上越える量の炭水化物を含む肉汁を発酵させる発酵方
法を提供することにある。

本発明のその他の目的及び利点は、以下の記載から明ら
かになるであろう。

本発明の原理は、α−アミラーゼ及びグルコアミラーゼ
を混合した固体の粒状澱粉のスラリー上で発酵を実施す
ると、澱粉は酵素的に液化しそして糖化して発酵性糖に
なり、同時に糖は発酵してエタノールになるという発見
に基づくものである。

発酵速度は、澱粉をあらかじめ調整してスラリー中の澱
粉濃度を変化させることにより、またスラリー中のα−
アミラーゼ及びグルコアミラーゼの濃度及びそれらの比
率を変化させることにより、調節することができる。

α−アミラーゼ及びグルコアミラーゼの存在下において
粒状澱粉の水懸濁液をエタノール生産菌によって発酵せ
しめ（それによって、溶解した全糖濃度が発酵の主過程
において概ねゼロである）、次いで場合によってはさら
に、粒状澱粉の発酵に再利用するために酵素を回収する
ことを特徴とする、発酵によるエタノールの製造方法を
提供スル。

場合によっては、本発明の方法は、粒状澱粉の初期ゲル
化点以下の温度において澱粉スジＩＪ−をα−アミラー
ゼ及び場合によってはさらにグルコアミラーゼで処理す
る前処理工程を実施しようとするものである（前記温度
はこれまでコーンスターチについては６２℃以上である
と記されている）。

この前処理により、スラリー中に低比率の発酵性物質を
生じるので、微生物は発酵の開始のために栄養素を直ち
に利用できることになる。

本明細書中において、「粒状澱粉」なる用語は、商業的
に広く入手可能な比較的純粋な形態の澱粉（たとえば、
コーンスターチ、じゃがいも澱粉）のみを指すものでは
ない。

これまで発酵の実施に用いられてきた他の形態の澱粉、
たとえば、ひき割りとうもろこし、発芽が除去された穀
粒、砕いた穀粒は、また全粒の穀粒さえも、本発明の上
記実施に従って直接発酵させることができるので、本明
細書中の特許請求の範囲において用いた「粒状澱粉」な
る用語はあらゆる澱粉をその範囲を含むものとする。

本発明の理解を深めるために、ここで添付図面に言及す
る。

添付図面中、第１図は、α−アミラーゼ及びグルコアミ
ラーゼの存在下、３４℃において実施された発酵におけ
る粒状澱粉の経時的消失を示すグラフ図であり（実施例
１２参照）： 第２図は、第１図で説明された発酵の過程における発酵
肉汁中のアミラーゼ及びグルコアミラーゼ活性を示すグ
ラフ図であり： 第３図は、発酵の結果に対する、異なる澱粉濃度の影響
を示すグラフ図であり（実施例１８乃至２２参照）； 第４図は、粒状澱粉の発酵とアルコール蒸留とが組み合
わせられたー態様を示す工程図であり：そして 第５図は、粒状澱粉の発酵とアルコール蒸留との組み合
わせの別の態様を示す工程図である。

本発明の実施に係る発酵は、アルコール生産菌、たとえ
ば、酵母菌属の菌類の培養に適した条件下において、す
なわち、温度２５〜３８℃及びｐＨ３〜７において、粒
状澱粉のエタノールへの転化に関連する全ての連続反応
を実施することによる。

この反応は次のように表わすことができる：澱粉→可溶
化デキストリン→グルコース／マルトース／マルトトリ
オース→エタノール。

本方法の過程全体は第１図のグラフ図に示す。

第１図は、α−アミラーゼ及びグルコアミラーゼの存在
下で発酵を行なうと２１６時間の間に２０多のスラリー
から粒状澱粉の約９０％が除去されたことを示している
（実施例１２参照）。

ＣＯ２の逃散による減量は、生成されたエタノールのお
およその重量の便利な尺度である。

酵素の濃度及び割合ならびに澱粉の濃度は自由に変化さ
せることができるので、本発明の実施に関しては大きい
工業的融通性がある。

液化と発酵の同時実施は、これまで最も多く用いられて
きた系である、３つの別々の工程による同一反応の実施
に優る極めて多くの利点を有する。

たとえば、澱粉の（熱）デキストリン溶液への液化は、
熱デキストリン中で澱粉の劣化反応が起こるために、こ
れまで長い間生成物の減少と加工の困難さという問題に
直面していた。

ところが、本発明を実施すれば、澱粉の液化とデキスト
リンの糖化とが同時に進行するため、澱粉の劣化反応を
引き起こす条件を回避することができる。

発酵温度における全反応の同時実施により、相当量の熱
エネルギーが節約される。

これは、澱粉を液化するのにこれまで用いられていた高
温にまで澱粉スラリーを昇温しなくてよいからである。

たとえば、１４０℃において煮沸する従来の澱粉煮沸法
を排除することにより、エタノール生成物に７あたり約
７００ ＫＪの節約になるとみられる。

この節約は約７０００ Ｋｙ／Ｋｙのエタノールの燃焼
エネルギーに比べてひげをとらないものである。

別の利点は、発酵完了時に残存する（溶解していない）
粒状澱粉は、分解していないしまたはゲル化さえしてい
ない（熱処理によって）点にある。

このような澱粉は容易に回収し、次いで新しい粒状澱粉
であるかのように再懸濁せしめそして本方法に再循環さ
せることができる。

本発明の実施のためには粒状澱粉の再循環が意図される
。

デキストリンのグルコースへの転化は、固形分の多いシ
ロップについて微生物のグルコアミラーゼ（ＡＭＧ）に
よって実施する場合には、酵素によって触媒される逆反
応を伴うため、グルコースは重合して、酵母によって代
謝されることのできない糖であるインマルトースのよう
な少糖類になる。

逆反応の反応速度はシロップ中のグルコース濃度のある
関数である。

従って、グルコースの生成と発酵によるシロップからの
グルコースの除去とを同時に行なうことにより、グルコ
ースの逆もどり反応による発酵性物質の減量は少量であ
っても防ぐべきである。

通常の糖化テキストリン溶液を発酵によってアルコール
に転化する場合には、酵母は、発酵の初期の段階におい
ては炭水化物栄養素（すなわち、グルコース及びマルト
ース）が充分以上ありそして発酵の後期の段階において
は炭水化物栄養素が不足するという状況におかれる。

本発明を実施することにより、初期の段階において、利
用可能な炭化水素栄養素の過剰が回避され、後期の段階
において、発酵性糖を酵母が利用できるようになる。

最終の発酵肉汁中のデキストリン量は、少すくとも潜在
的には系の損失を表わしている。

従って、溶解した全糖の濃度が発酵の間じゆう低レベル
に、好ましくは１多以下に保持されるように、はとんど
完全に且つ急速にデキストリンを発酵性糖に糖化するた
めの、酵素の澱粉に対する比率が本発明の好ましい実施
に包含される。

酵母によって実施される代謝的転換は発酵性糖の急速な
消失を保証するので、発酵媒体はグルコース及びデキス
トリンを常にほとんど含まず、発酵の過程の全体にわた
ってかなりの粒状澱粉が絶えず減少し且つエタノールが
絶えず増加する。

本発明の実施がエタノール生成菌に最適な温度及びｐＨ
における。

すなわちｐＨ３〜７，２５〜３８℃における発酵をどの
ように包含するかに関してはすでに示唆した。

発酵の環境は、商業的に入手可能な公知のα−アミラー
ゼ及びグルコアミラーゼに対しては最適温度及びｐＨで
はないが、このような酵素は経済上の見地から実際的な
酵素濃度において本発明の実施のために有効である。

その結果、グルコアミラーゼは非常に有効に用いられる
ので、経済的に実行可能な用量レベルのグルコアミラー
ゼ（ＡＭＧ）を、すなわち、澱粉２あたり０．０５−１
０．ＯＡＧＵ 、好ましくは０．２−２．０ＡＧＵのグ
ルコアミラーゼ用量を本発明の実施に用いることができ
る。

ＬＡＧ単位（ＡＧＵ）は、温度２５℃且つｐＨ４，３に
おいて毎分１ミクロモルのマルトースを分離スる酵素の
量である。

商業的に入手可能な液体の形態のグルコアミラーゼ（Ａ
ＭＧ Ｎ０ＶＯ１５０）は１５０ ＡＧＵ／−の活性を
有する〔フォード（Ｆｏｒｄ）ら、ＢｉｏｃｈｅｍＶｏ
ｌ、５４（１９７３）１２０参照〕。

アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉ ｌ １ｕ
ｓｃｒｙｚａｅ ）からのα−アミラーゼ〔たとえば、
ファンガミ／Ｌ＠（Ｆｕｎｇａｍｙｌ■）〕を醸造産業
に使用することは示唆されている。

この酵素はデキストリンを糖化してマルトトリオース及
びマルトースにする。

従って、α−アミラーゼの目的は澱粉を液化することに
あるが、その糖化傾向によってα−アミラーゼはまた多
少は糖化酵素としても働く。

他方、溶液中において糖化反応を触媒するに当り、粒状
澱粉スラリーに添加されたグルコアミラーゼ用量は決し
て全てが活性なわけではない。

グルコアミラーゼは澱粉固形分と液体との間に分配され
る。

２０重量置板澱粉懸濁液の発酵過程において１組の測定
を実施すると、発酵開始の６時間後には約７０％のグル
コアミラーゼが液相に存在し、７２時間後には約８５条
が存在することがわかった。

結果を第２図に示す。第２図の結果はまた、発酵の２１
６時間後には溶解した酵素の減少はたとえあったとして
もほとんどごくわずかしかおこらないことを示している
。

従って、グルコアミラーゼ酵素を不活性化する温度に発
酵肉汁を暴露することのない回収方法によって、たとえ
ば、減圧蒸留によって発酵肉汁からエタノール生成物を
除去すると、微粒澱粉の発酵に新たに用いるために、溶
解したグルコアミラーゼを回収することが可能になる。

本発明の実施に重要な別の問題は、商業的に入手可能な
グルコアミラーゼがα−アミラーゼ活性を若干有し、そ
して実際は、実用的ではないが、グルコアミラーゼのみ
の存在下においても微粒澱粉を発酵させることが可能で
ある点である。

本発明の実施のために用いる菌類α−アミラーゼ（ｆｕ
ｎｇａｌ ａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅｓ ）に関す
るα−アミラーゼの用量範囲は、澱粉グあたり０．０２
ＦＡＵ〔菌類アミラーゼ単位（Ｆｕｎｇａｌ Ａｍ
ｙｌａｓｅＵｎｉｔｓ））乃至２．０ＦＡＵ、好ましく
は、０．０５−０．６ＦＡＵである。

ＩＦＡＵは、標準条件下において毎時５２６０′Ｉｎｌ
１の澱粉を分解する酵素の量である。

Ｉ ＦＡＵは概ね２５ ＳＫＢ単位に相当するＣＣｅｒ
ｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ、１６．（１９３
９）。

７１２〜７２３ページ参照）。

バルチス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌類のσ−アミラー
ゼに関しては、この範囲は０．０１乃至０．６ ＫＮＵ
／ｆ 、好ましくは０．０５乃至０．１５ＫＮＵ／ｆで
ある。

ＮＵＩすなわち、Ｎ０ＶＯＵｎｉｔ ）は標準条件下に
おいて毎時５．２６１ｎＩｊの澱粉を分解する酵素の量
である。

ＩＫＮＵは１００ＯＮＵである。

最適α−アミラーゼ用量は、澱粉を液化するのにこれま
で好ましいとされていた用量をおそらく越えるであろう
し、また最適グルコアミラーゼ用量もダキストリンを糖
化するのにこれまで好ましいとされていた用量をおそら
く越えるであろう。

しかしながら、９０多を超える酵素活性が発酵の７２時
間後に残存するので、澱粉スラリー中に加えた酵素は、
粒状澱粉の発酵に再使用するために発酵肉汁から回収す
ることができる。

Ｂ、リケニフオルミス（ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ
）のα−アミラーゼ〔たとえば、ターマミル■（Ｔｅｒ
ｍａ−ｍｙｌ■）〕は充分に安定性であるので蒸留がま
温度への短時間の暴露に耐え得る。

従って、アルコール蒸留廃液の再循環は、α−アミラー
ゼの再循環に好ましい方法である。

しかしながら、概して、酵素を不活性化するエタノール
ストリッピング温度に発酵肉汁を暴露することを回避す
るために、再循環されたアルコール蒸留廃液中の酵素の
回収には注意が必要であろう。

たとえば、アルコールを発酵肉汁から減圧ストリッピン
グしそしてこのようなアルコール蒸留廃液を酵素の回収
のために再循環してもよい。

本発明の好ましい一態様においては、発酵を停止させた
時に発酵肉汁中に粒状澱粉を残すように発酵を実施する
。

第２図に示すように、α−アミラーゼ自体が粒状澱粉固
体との間に分配され、α−アミラーゼ用量の約２５俤だ
けが液体中に見い出される〔セス力（Ｃｅｓｋａ）らに
よりＣｌ１ｎ 。

Ｃｈｉｍ、 Ａｃｔａ 、Ｖｏｌ、 ２６（１９６９）
ｐ、 ４３７に述べられた方法の変法であるファデバ
ス■アミラ−ゼ試験（Ｐｈａｄｅｂａｓ■Ａｍｙｌａｓ
ｅ ｔｅ ｓｔ ）を用いて〕。

従って、新たな発酵のために残留粒状澱粉を回収すると
、大量のα−アミラーゼと小量のグルコアミラーゼが再
循環される。

当然のことながら、前述のα−アミラーゼ及びグルコア
ミラーゼの用量範囲は、回収された酵素と新たに添加さ
れた酵素との総量を意味するものと理解されたい。

すでに指摘したように、粒状澱粉スラリーの発酵はシロ
ップの発酵とは全く異なる特徴を有する。

一般に溶液中約２０俤の固形分が発酵媒体中の最大糖含
量と考えられ、これより高濃度は発酵の開始時及び終了
時において困難を生ずる。

澱粉スラリーの発酵に関してはこのような制限はない。

スラリー中の澱粉濃度は１０乃至４５多の範囲で変化さ
せることができ、発酵の開始時において結果は区別でき
ない。

澱粉濃度は本発明の実施のための主な方法パラメーター
である。

澱粉濃度（酵素用量一定）を、たとえば、ＩＯ乃至４５
俤から増加させると発酵速度が速められる。

すなわち、必要酵素用量を低下させるにもかかわらず、
所定発酵速度を達成できる。

発酵技術において一般に行なわれているように肉汁が７
〜１０％のアルコールを含むまで発酵させた後、過剰量
の（残留）粒状澱粉を相当量の酵素と共に回収し新たな
発酵に再循環することができる。

本発明の好ましい→態様は、澱粉を２５〜４０重量多含
む置板澱粉スラリーの発酵である。

所望のアルコール含量となるまで、たとえば、使用微生
物に応じて７−１０％となるまで発酵を進める場合、２
５〜４０％の澱粉スラリーを普通のパン酵母で発酵させ
ると常に残留澱粉が生じるであろう。

しかしながら、ｌＯ〜２５多の澱粉スラリーを発酵させ
る場合であっても、本発明の好ましい実施は、新たの発
酵のために、粒状澱粉が完全に消失する前に発酵を停止
させることにある。

澱粉の再循環は、再利用のために酵素を回収する簡易な
方法である。

本発明の好ましい一態様によれば、澱粉及び酵母は、た
とえば、遠心分離によって一緒に除去され、そしてそれ
らは新たな粒状澱粉及び調製用酵素と共に発酵装入材料
を構成する。

粒状澱粉の存在下においては粒状澱粉の液化が律速反応
であり、これが、第１図及び第３図に見られるように主
発酵が概ね直線的な速度である理由である。

主発酵は約７俤のアルコール含量レベルで完了すると考
えることができ、その場合、普通のパン酵母は、酵素が
発酵性糖を生成する場合はど急速には発酵性糖を消費す
ることができない。

従って、発酵速度（ＣＯ２生成によって測定可能）は減
少し、直線性は失われる。

その後、発酵肉汁中のアルコール含量が所望の量となる
まで発酵を（非直線的速度で）継続させてもよく、それ
も本発明の実施において意図される。

発酵の終わりに典型的なことであるが、発酵速度の直線
性がなくなった場合には、次のようないくつかの予防措
置を取らないと、溶解した炭水化物が沈着し、その結果
、溶解炭水化物の減量がおこる： １）（主発酵の後に）澱粉を除去し、次いで引き続いて
澱粉を含まない肉汁を発酵させる；２）微生物がより有
効に機能できるように発酵肉汁を減圧ストリッピングし
てアルコール含量全低減せしめる； ３）栄養素を含有する蒸留残液を新たな発酵に再循環す
る。

３０乃至６０℃において２０時間以下の時間いずれか一
方もしくは両方の酵素で澱粉スラリーを前処置する操作
は、発酵量中において発酵によるエタノール生成の開始
を速めるのに役立つであろう。

酵素による前処理は微生物を導入する前にスラリー中に
炭水化物栄養素を生成するのに役立つ。

本発明の好ましい二態様を第４図に示す。

第４図から理解されるように、α−アミラーゼ、グルコ
アミラーゼ、必須栄養素を含有する水、粒状澱粉及びエ
タノール生産菌、たとえば、ビール酵母を全てバンチ発
酵器１０中に加える。

全成分はほぼ同時に添加するものとする。

然る後に、エタノール生成のための通常の温度及びｐＨ
条件下において、たとえば、ｐＨ５，３８℃において適
当な時間、たとえば、１６０時間発酵を実施する。

次いで、発酵混合物を遠心分離機１２中で遠心分離して
、酵母と発酵肉汁からの未転化澱粉粒子とを分離する。

次いで、管路１４によって発酵肉汁を蒸留器１６に直接
移し、蒸留器１６中でアルコール分をストリンピングし
て上部から管路１８中に除去する。

アルコール蒸留廃液を蒸留残液とじて管路２０から除（
。

アルコール蒸留廃液の一部は熱交換器２４によって再循
環して発酵）ための給水の一部とし、アルコール蒸留廃
液の残りはパージ流として管路２２を通して廃棄する。

第４図に示した系は特に、１２〜２０多の澱粉スラリー
を発酵させる場合のように、単路（シングルパス）方式
の粒状澱粉の完全な転化が望ましい場合に適している。

熱安定性α−アミラーゼ〔たとえば、ターマミ”’ （
Ｔｅｒｍａｒｇｌ ）■〕は蒸留がま温度への短時間の
暴露に耐え得るので、第４図の態様はまた特に熱安定性
α−アミラーゼの使用に適している。

酵素、特に熱安定性α−アミラーゼは水の再循環におい
て発酵器１０にもどされる。

第４図の態様は連続的発酵として操作でき、その場合に
は発酵器１０は、たとえば、発酵させるスラリーが入口
から出口まで（栓流で）移動できるような長い通路を具
備するように修正できる。

第５図は、未転化粒状澱粉がまだ発酵肉汁中に残存して
いる時に発酵を停止させる一部様を示す。

新しい粒状澱粉、酵素及び場合によってはさらに酵母を
、再循環された酵母及び粒状澱粉と共に発酵器１１０に
装入する。

発酵せしめられた肉汁を遠心分離器１２０に移し、遠心
分離器１２０中で酵母及び未転化粒状澱粉を沈澱せしめ
、再循環のために管路１３０によって発酵器１１０にも
どす。

酵母及び澱粉の一部はパージ管路１２５へ除去する。

遠心分離した肉汁は管路１４０によって蒸留器１６０に
移し、その上部でアルコールを分離して管１８０から除
去し、そして蒸留残液を管路２００によって除去する。

アルコール蒸留廃液の二部を管路２２０を通してパージ
し、残りは熱交換器２４０中で冷却してから発酵器１１
０にもどす。

第５図の態様は連続的操作のために組みたてることがで
きる。

第５図の態様は、澱粉濃度の高いスラリーを発酵せしめ
ようとするものであり、好ましい濃度範囲は２５〜４０
％である。

都合のよいことには、湿式コーン磨砕操作からの澱粉ス
ラリーは本発明の実施に適した発酵系、たとえば、第５
図の態様に直接供給することができる。

湿式磨砕された澱粉スラリー〇固形分は、澱粉４０重量
優に近い。

発酵バットに最初に装入する酵母の量は、先行技術によ
るエタノール発酵の実施と一致させることができ、発酵
過程において酵母細肪は増殖するのでその量は広範囲に
変化させることができる。

通常、酵母の再循環は不要である。

残留澱粉粒子からの酵母の除去は残留澱粉の再循環より
前に行なうものとする。

本発明の理解を深めるために本発明を以下の実施例につ
いて説明する。

実施例１乃至１１ これらの実施例は、前処置を伴う及び伴わない発酵にお
ける高澱粉量の使用を説明する。

粒状コーンスターチ（乾燥固形分９１．３％）３Ｏｆま
たは６０ｒの水中スラリー（全量１４０グ）（各々、最
終澱粉含量２０％及び４０％に対応する）をＣａ ＋Ｆ
７１１１ｆｌ／を及びｐＨ５に調整する。

α−アミラーゼ〔ファンガミル（Ｆ ｕｎｇａｍｙｌ
’Ｅ） ）８００Ｌ〕を第１表中に記載した量で添加す
る。

実施例１０及び１１においては、スラリーを５５℃にお
いて４％時間前処理し、そして周囲温度乃至３０℃の温
度まで冷却する。

各フラスコに以下の成分を添加する： 酵母エキス溶液（蒸留水１００−中ＤＩＦＣＯ酵母エキ
ス２０グ）２ｆｎｌ；抗生物質（蒸留水１５〇−中ヘニ
ジリン１．２５ ｆ＋ストレプトマイシン１．２５１
） ２−；酵母懸濁液（蒸留水１００７中に懸濁された
パン酵母６り）５ｒｒｌｌ：及び第１表中に記載した量
のグルコアミラーゼ〔スピリットアミラーゼ（Ｓｐｉｒ
ｉｔａｍｙｌａｓｅ ） −１５ＯＬ ］。

フラスコに電磁撹拌棒を装着し、そして９８φ硫酸を含
む発酵トラップを取り付ける。

最初の秤量後、３０℃において発酵を実施し、そしてＣ
Ｏ２の減量を経時的に測定することによって発酵の進行
を追跡する。

発酵の間、減量の他に、溶液中のグルコース、溶液中の
全糖（テキストリン及びグルコース）を分析する。

全糖の定量にはミネソタ（Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ ）法を
用いる〔フイストラー（Ｗｈｉｓｔｌｅｒ）及びウオル
フロム（Ｗｏｌｆｒｏｍ ） ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＣｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｉ
、１９６２．ｐ、３８８ 、：］。

グルコースは、ペーリンガーーマンハイムＧＯＤ−ペリ
ト［相］法（Ｂｏｅｈｒｉｎａｇｅｒ −Ｍａｎｎｈｅ
ｉｍ ＧＯＤ −Ｐｅｒｉｄ■ｍｅｔｈｏｄ ）によっ
て酵素的に測定する。

水相のデキストリン及びグルコースは、発酵肉汁を濾過
した後、すなわち、粒状澱粉からの寄与を排除した後、
測定する。

澱粉乾燥固形分、酵素用量（投与量）及び前処理条件を
以下の第１表に示す。

得られた分析データを以下の第２表にボテ。

約２０多より高い濃度の澱粉の発酵可能性が証明される
。

また、発酵過程において低レベルのグルコース及びデキ
ストリン（全糖）が証明される。

懸濁液−あたりの酵素用量が一定の場合にはスラリー中
の澱粉量が増加すると発酵速度が増加することがわかる
。

グルコアミラーゼ含量が一定の場合にはα−アミラーゼ
含量が増加すると発酵速度が増加する。

α−アミラーゼ濃度が一定の場合にもグルコアミラーゼ
含量が増加すると発酵速度の増加が観察される。

グルコアミラーゼＡＭＣ−１５０Ｌが発酵において唯一
の酵素として働くことができることがわかる。

これは、ＡＭＣ−１５０Ｌが主なグルコアミラーゼ活性
の他にα−アミラーゼ活性を含むという事実による。

前処理の影響はより急激な初期発酵である。

α−アミラーゼ及びグルコアミラーゼの用量の初Ｍの急
激な上昇が等しくなった時、発酵曲線（ＣＯ２対時間は
平行な勾配を示す。

実施例 １２ 澱粉はアミラーゼで前処置しない。

加水分解及び発酵は共に３４℃において行なう。

この実験において澱粉含量は２０多であるが、スラリー
は実施例１乃至１１の３倍量で用いた。

急速な発酵を行なうために、酵母含量は実施例１乃至１
１の含量の５倍にし、初期ｐＨは４．５にする。

この実験の目的は発酵過程における酵素の挙動を証明す
ることにある。

２つの同一の実験において、α−アミラーゼ（Ｆｕｎｇ
ａｍｙｌ■８００Ｌ、）及びグルコアミラーゼ（ＡＭＧ
−１５ＯＬ）の量は各々１２０μを及び３００ ｌｔｔ
であり、これらは各々澱粉１あたり１．２ＦＡＵ及び０
．２５ ＡＧＵに対応する。

第１の実験においては、発酵は、ＣＯ２減量（非破壊的
試験）を経時的に測定することによって追跡する。

以下の結果が得られた。添付図面の第１図にグラフ図を
示す。

未分解澱粉の量を、発生するＣＯ２の化学量論量に基づ
いて計算する。

第２の実験において、エタノール含量、水相中のα−ア
ミラーゼ及びグルコアミラーゼ活性を分析するためにサ
ンプルを取る。

後者は添付図面の第２図に示す。

グルコアミラーゼは主に水相に存在するのに対し、α−
アミラーゼは適用した量の約２５多しか水相にないので
澱粉に結合しているにちがいないということがわかる。

アルコールの経時的生成は以下の通りである。

実施例１３乃至１７ これらの実施例は、水相から澱粉と酵母とを分離した後
に未反応の粒状澱粉を新たな発酵に用いることのできる
可能性を示す。

４０多澱粉スラリー（最終重量１５０ｆｉ、ｐＨ４，５
）をファンガミル■８００Ｌ ４０μｔＸＡＭＧ１５
０Ｌ １００μｔ１酵母及び実施例１〜９に記載の酵
母エキス３０℃において発酵する。

４８時間後に、未反応の澱粉及び酵母を沈降させ、水相
をデカントする。

各発酵フラスコに、ＣＯ２減量の約２倍量の澱粉を加え
る（これにより、澱粉スラリー濃度は最初の値までもど
る。

ファンガミノ顎１０μｔを加え（水相と共に消失する２
５多のα−アミラーゼを補うため）、且つＡＭＧ１５０
Ｌ １００μｔを加える（グルコアミラーゼは大部分
が水相と共に消失するため）。

フラスコを水で１５Ｏｒにする。

新たな酵母を添加せずに発酵を続ける（酵母は粒状澱粉
と共に沈降する）。

発酵は、ＣＯ２秤量分析により追跡する。

実施例１８乃至２２ これらの実験の目的は、粒状澱粉スラリーの乾燥固形分
の発酵速度に対する影響を明らかにするＸ黄ことにある
。

各フ２スコは全量１ 母エキスは実施例１２ ５０ｆを含む。

酵母及び酵と同様である。

結果は、添付図面の第３図に示す。

前記結果は以下のように説明できる： 最初は、澱粉６１’が存在した（乾燥固形分９０％）。

これは澱粉５４１（乾燥固形分に基づく）に相当する。

第１の発酵で消費された澱粉は２２．７５ｆ（グルコー
ス）Ｘｏ、９＝２０．５Ｆである。

ＣＯ２約１Ｏｆが発生しそして放出された後に発酵肉汁
中に残された１４０ｒ中には、約３３．５１の乾燥澱粉
が残されている。

混合物中の液相中の水−アルコールは約１１０−であろ
う。

従って、約７０１の水相をデカントして除去した後、ア
ルコール公約１０％の水相約４０ｆが残される。

（第２の）発酵に水を補充するために約５Ｏｆの水を加
える。

１０多のアルコールは発酵の毒性限界に近いので、予期
できたのは第２の発酵のＣＯ２減量が第１の発酵のＣＯ
２減量の丁であることだけであり、実際、４５時間の発
酵の間にこれ以上は得られなかった。

発酵の最初の２４時間には、両方の発酵において概ね同
一の速度でＣＯ２が発生した。

このことは発酵スラリー中の酵素活性レベルが同様であ
ることを示している。

【図面の簡単な説明】

第１図は、α−アミラーゼ及びゲルコアミラー七の存在
下、３４℃において実施された発酵における粒状澱粉の
経時的消失を示すグラフ図であり、第２図は、第１図で
説明された発酵の過程における発酵肉汁中のアミラーゼ
及びグルコアミラーゼ活性を示すグラフ図であり、第３
図は、異なる澱粉濃度の、発酵の結果に対する影響を示
すグラフ図であり、第４図は、粒状澱粉の発酵とアルコ
ール蒸留とが組み合わせられた一部様を示す工程図であ
り、そして第５図は、粒状澱粉の発酵とアルコール蒸留
との組み合わせの別の態様を示す工程図である。 Ａ、Ａ’・・・・・・α−アミラーゼ、グルコアミラー
ゼ及び栄養素（酵母）、Ｂ、Ｂ’・・・・・牡状澱粉ま
たは粒状澱粉スラリー、Ｃ２Ｃ′・・・・・・アルコー
ル、Ｄ。 Ｄ’−・・・・・水再循環、Ｅ・・・・・・酵母、Ｅ′
・・・・・・酵母及び澱粉再循環、１０，１１０・・・
・・・発酵器、１２，１２０・・・・・・遠心分離器、
１４．１８，２０，２２，１３０゜１４０．１８０．２
００．２２０・・・・・・管路、１６゜１６０・・・・
・・蒸留器、１２５・・・・・・パージ管路、２４゜２
４０・・・・・・熱交換器。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ α−アミラーゼ及びグルコアミラーゼの存在下にお
   いて粒状澱粉の水懸濁液をエタノール生産菌によって発
   酵せしめるととならびに溶解した全糖の濃度が発酵の主
   過程において概ねゼロであることを特徴とする、発酵に
   よるエタノールの製造方法。 ２ 粒状澱粉が消失する前に前記発酵を停止せしめ且つ
   該粒状澱粉と共にα−アミラーゼ及びグルコアミラーゼ
   を回収して再循環せしめる特許請求の範囲第１項記載の
   製造方法。 ３ 前記懸濁液の澱粉含量が１０乃至４５重量％の範囲
   にある特許請求の範囲第１項記載の製造方法。 ４ 前記澱粉含量が２５乃至４０重量％の範囲にある特
   許請求の範囲第３項記載の製造方法。 ５ グルコアミラーゼの使用量が澱粉ｌあたり０．０５
   乃至１０．０グラコアミラ一ゼ単位の範囲にある特許請
   求の範囲第１項記載の製造方法。 ６ 前記α−アミラーゼが菌類のα−アミラーゼまたは
   バチルス属（Ｂ ａｃｉ １ｌｕｓ ）細菌類のα−ア
   ミラーゼである特許請求の範囲第１項記載の製造方法。 ７ 菌類のα−アミラーゼまたはバチルス属細菌類のα
   −アミラーゼの用量が各々澱粉ｌあたり０．０２乃至２
   ．０または１０乃至６００α−アミラーゼ単位の範囲に
   ある特許請求の範囲第６項記載の製造方法。 ８ 発酵を行なう前に澱粉の初期ゲル化温度以下の温度
   において粒状澱粉を前記酵素の少なくとも１つで処理す
   る特許請求の範囲第１項記載の製造方法。