CN103180451A - 使用重组酵母的乙醇的制造方法 - Google Patents

使用重组酵母的乙醇的制造方法 Download PDF

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Abstract

提高具有木糖代谢能力的酵母中的木糖代谢能力。具有以下工序：将具有木糖代谢能力的酵母浸渍在含乙酸的溶液中的工序，和然后用含木糖的培养基培养该酵母从而进行乙醇发酵的工序。

Description

使用重组酵母的乙醇的制造方法
技术领域
本发明涉及使用具有木糖代谢能力的重组酵母的乙醇的制造方法。
背景技术
纤维素系生物质，一般作为乙醇等有用的醇和/或有机酸的原料被有效利用。在利用了纤维素系生物质的乙醇制造中，为了提高乙醇的产量，开发了能利用五碳糖木糖作为底物的酵母。例如，专利文献1公开了染色体中插入有来自树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的木糖还原酶基因和木糖醇脱氢酶基因、以及来自酿酒酵母(S.cerevisiae)的木酮糖激酶基因的酵母。
此外，非专利文献1和2也记载了在含有乙酸的发酵培养基中培养赋予了木糖代谢能力的酵母时，木糖的发酵速度会降低。并且，非专利文献3还记载了被赋予了木糖发酵能力的酵母和木糖发酵速度提高了的变异株。
然而，针对具有木糖代谢能力的酵母提高木糖代谢能力这样的技术还不为人们所知。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2009-195220号公报
非专利文献
非专利文献1：FEMS Yeast Research,vol.9,2009,358-364
非专利文献2：Enzyme and Microbial Technology33,2003,786-792
非专利文献3：Appl.Microbiol.Biotechnol.2009,84:37-53
发明内容
发明要解决的课题
因此本发明鉴于上述实际情况，目的在于提供通过提高具有木糖代谢能力的酵母中的木糖代谢能力来提高乙醇生产性的技术。
用于解决课题的方法
为实现上述目的，本发明者们进行了深入研究，结果发现，通过进行使具有木糖代谢能力的酵母与含乙酸的溶液接触的处理，从而该酵母的木糖代谢能力飞跃性地提高，从而完成了本发明。
本发明包括以下(1)～(5)。
(1)一种乙醇的制造方法，具有以下工序：使具有木糖代谢能力的酵母与含乙酸的溶液接触的工序，和然后用含木糖的培养基培养该酵母从而进行乙醇发酵工序。
(2)根据(1)所述的乙醇的制造方法，其特征在于，上述酵母是被导入了木糖代谢相关基因的重组酵母。
(3)根据(2)所述的乙醇的制造方法，其特征在于，上述木糖代谢相关基因是木糖还原酶基因、木糖醇脱氢酶基因和木酮糖激酶基因。
(4)根据(1)所述的乙醇的制造方法，其特征在于，使上述酵母与含乙酸的溶液接触时，在需氧条件下进行。
(5)根据(1)所述的乙醇的制造方法，其特征在于，上述含乙酸的溶液是在酵母用培养基中添加有乙酸的组成。
发明的效果
根据本发明所涉及的乙醇的制造方法，能够提高具有木糖代谢能力的酵母中的木糖代谢能力，其结果是乙醇的生产性大幅提高。通过利用本发明所涉及的乙醇的制造方法，可以使用例如木质系生物质以低成本的方式生产乙醇。
附图说明
图1是显示使用了XYL1、XYL2、XKS1基因过表达·GRE3基因缺失用DNA片段的重组的示意图。
图2是显示发酵实验后分析乙醇浓度的结果的特性图。
图3是显示发酵实验后分析木糖浓度的结果的特性图。
具体实施方式
下面用附图和实施例更详细地说明本发明。
本发明所涉及的乙醇的制造方法是利用具有木糖代谢能力的重组酵母由培养基中含有的木糖合成乙醇的方法，包括使该重组酵母与含乙酸的溶液接触的处理工序。经过该工序，重组酵母中的木糖代谢能力大幅提高，从而乙醇的生产性大幅提高。
<重组酵母>
本发明所涉及的乙醇的制造方法中所使用的重组酵母，至少在基因组中导入了木糖代谢相关基因。该重组酵母能将培养基中包含的木糖同化而生产乙醇。此外，培养基中包含的木糖可以是通过将以木糖作为构成糖的木聚糖和/或半纤维素等糖化的工艺而得到的，也可以是培养基中含有的木聚糖和/或半纤维素等被糖化酶糖化而供给到培养基中的。后者的情况下，是指所谓同时糖化发酵的体系。
木糖代谢相关基因是包含编码将木糖转换为木糖醇的木糖还原酶的木糖还原酶基因、编码将木糖醇转换为木酮糖的木糖醇脱氢酶的木糖醇脱氢酶基因、和编码将木酮糖磷酸化而生成木酮糖-5-磷酸的木酮糖激酶的木酮糖激酶基因的含义。此外，通过木酮糖激酶而生成的木酮糖-5-磷酸进入戊糖磷酸途径而被代谢。
作为被导入酵母基因组的木糖代谢相关基因，不特别限定，可列举来自树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的木糖还原酶基因和木糖醇脱氢酶基因、来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的木酮糖激酶基因(参考Eliasson A.et al.,Appl.Environ.Microbiol,66:3381-3386及Toivari MN et al.,Metab.Eng.3:236-249)。此外，作为木糖还原酶基因，可以利用来自热带假丝酵母(Candida tropicalis)、近平滑假丝酵母(Candida prapsilosis)的木糖还原酶基因。作为木糖醇脱氢酶基因，可以利用来自热带假丝酵母(Candidatropicalis)、近平滑假丝酵母(Candida prapsilosis)的木糖醇脱氢酶基因。作为木酮糖激酶基因，还可以利用来自树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的木酮糖激酶基因。此外，还可利用来自ストレプトマイセスムリナスクラスター(Streptomyces murinus cluster)的木酮糖异构酶基因等。
此外，在本发明所涉及的乙醇的制造方法中使用的重组酵母中，除上述木糖代谢相关基因之外，还可导入与葡萄糖等的糖代谢相关的基因。作为一例，重组酵母优选是通过导入β-葡萄糖苷酶基因而具有β-葡萄糖苷酶活性的酵母。
这里β-葡萄糖苷酶活性是指催化糖的β-糖苷键的水解反应的活性。即β-葡萄糖苷酶可将纤维二糖等纤维寡糖分解为葡萄糖。β-葡萄糖苷酶基因优选作为细胞表面呈递型基因被导入。这里，细胞表面呈递型基因是指被改变成由该基因所编码的蛋白质以被展示在细胞的表层的方式表达那样的基因。例如细胞表面呈递型β-葡萄糖苷酶基因是融合有β-葡萄糖苷酶基因和细胞表层定位蛋白质基因的基因。细胞表层定位蛋白质是指被固定在酵母的细胞表层，存在于细胞表层的蛋白质。例如作为凝集性蛋白质的α-或a-凝集素、FLO蛋白质等。通常细胞表层定位蛋白质在N-末端侧具有分泌信序列号并在C-末端侧具有GPI锚附着识别信号。虽然在具有分泌信号方面与分泌性蛋白质相同，但细胞表层定位蛋白质在介由GPI锚被固定输送到细胞膜上这方面与分泌性蛋白质不同。细胞表层定位蛋白质在通过细胞膜时GPI锚附着识别序列信号被选择性地切断，在新突出的C末端部分与GPI锚结合从而被固定在细胞膜上。之后GPI锚的根部被磷脂酰肌醇依赖性磷脂酶C(PI-PLC)切断。接着，从细胞膜被切下的蛋白质插入细胞壁并被固定在细胞表层，从而定位于细胞表层(例如，参照日本特开2006-174767号公报)。
作为β-葡萄糖苷酶基因，不特别限定，可列举例如来自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的β-葡萄糖苷酶基因(Murai et al.,Appl.Environ.Microbiol.64:4857-4861)。此外，作为β-葡萄糖苷酶基因，还可利用来自米曲霉(Aspergillus oryzae)的β-葡萄糖苷酶基因、来自噬纤维梭菌(Clostridium cellulovorans)的β-葡萄糖苷酶基因和来自扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibligera)的β-葡萄糖苷酶基因等。
<重组酵母的制作>
通过将上述木糖代谢相关基因导入成为宿主的酵母基因组中，从而可以制作能用于本发明的重组酵母。作为能用作宿主的酵母，不特别限定，可列举休哈塔假丝酵母(Candida Shehatae)、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)、嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccaromyces pombe)等酵母，特别优选为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。此外，作为酵母，可以是为了实验方面的方便性而使用的实验株，也可以是为了使用方面的有用性而使用的工业株(实用株)。作为工业株，可列举例如用于葡萄酒、清酒和/或烧酎制作的酵母株。
此外，作为成为宿主的酵母，优选使用具有雌雄同株性的酵母。根据日本特开2009-34036号公报所公开的方法，通过使用具有雌雄同株性的酵母，可以简便地向基因组中导入多拷贝基因。具有雌雄同株性的酵母和雌雄同株的酵母为同义。作为具有雌雄同株性的酵母，不特别限定，可使用任何酵母株。作为具有雌雄同株性的酵母，可列举酿酒酵母OC-2株(NBRC2260)，但不限于此。此外，作为具有雌雄同株性的酵母，可列举醇酵母(台研396号、NBRC0216)(出处：“アルコール酵母の諸特性(醇酵母的诸特性)”酒研会报、No37、p18-22(1998.8))、在巴西和冲绳分离出的乙醇生产酵母(出处：“ブラジルと沖縄で分離したSaccharomycescerevisiae野生株の遺伝学的性質(在巴西和冲绳分离的酿酒酵母野生株的遗传学性质)”日本农艺化学会志、Vol.65、No.4、p759-762(1991.4))和180(出处：“アルコール発酵力の強い酵母のスクリーニング(醇发酵能力强的酵母的筛选)”日本酿造协会志、Vol.82、No.6、p439-443(1987.6))等。另外，即使是显示雌雄异株的表型的酵母，也可通过以可表达的方式导入HO基因而制成具有雌雄同株性的酵母来使用。因此，在本发明中，具有雌雄同株性的酵母是也包含以可表达的方式导入了HO基因的酵母的含义。
其中，酿酒酵母OC-2株是一直以来在葡萄酒酿酒的现场被利用的被确认了安全性的菌株，因而优选。此外酿酒酵母OC-2株如后述实施例所述的那样，是在高糖浓度的条件下启动子活性优异的菌株，因而优选。特别是酿酒酵母OC-2株在高糖浓度条件下丙酮酸脱羧酶基因(PDC1)的启动子活性优异，因而优选。
另外，作为导入的基因的启动子，不特别限定，可利用例如甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(TDH3)的启动子、3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)的启动子、高渗透压应答7基因(HOR7)的启动子等。其中，丙酮酸脱羧酶基因(PDC1)的启动子高表达下游的目的基因的能力高，因而优选。
即，上述基因可以与调控表达的启动子和/或其他表达调控区一起导入酵母的基因组中。或者，上述基因也可以以被成为宿主的酵母的基因组中本来存在基因的启动子和/或其他表达调控区进行表达调控的方式导入。
作为导入上述基因的方法，可以应用已知作为酵母的转化方法现有公知的任何方法。具体来说，例如，可以以电穿孔法“Meth.Enzym.,194,p182(1990)”、原生质球法“Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75p1929(1978)”、乙酸锂法“J.Bacteriology,153,p163(1983)”、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75p1929(1978)、Methods in yeast genetics,2000Edition:A Cold Spring HarborLaboratory Course Manual等记载的方法实施，但不限于此。
<乙醇制造>
使用以上所说明的重组酵母制造乙醇时，在使用含木糖的培养基进行乙醇发酵培养之前，进行使该重组酵母与含乙酸的溶液接触的处理。这里，含乙酸的溶液可以是乙酸水溶液、含有乙酸成分的液体培养基的任一者。乙酸水溶液可以通过将乙酸溶于水而制得。另外，含有乙酸成分的液体培养基可以通过向SD培养基、YPD培养基、YPAD培养基、YM培养基等酵母用培养基中添加乙酸来调制。这里，对含乙酸的溶液中包含的乙酸浓度不特别限定，例如为1～20g/l，优选为2～10g/l，更优选为3～5g/l。含乙酸的溶液中所含的乙酸浓度如果低于上述范围，则可能无法显著提高上述重组酵母中的木糖代谢能力。另外，含乙酸的溶液中所含的乙酸浓度如果高于上述范围，则可能阻碍上述重组酵母的生长。
另外，对使重组酵母与含乙酸的溶液接触的处理，不特别限定。可列举例如1小时以上，优选为3小时以上，更优选为10小时以上。重组酵母与含乙酸的溶液的接触时间如果短于上述范围，则可能无法显著提高上述重组酵母中的木糖代谢能力。
进而，使重组酵母与含乙酸的溶液接触的处理，可以在含乙酸的溶液中加入了重组酵母的状态下搅拌，也可以震荡。此外，重组酵母与含乙酸的溶液接触时，溶液温度例如为20～40℃，优选为25～37℃，更优选为28～35℃。
特别地，使重组酵母与含乙酸的溶液接触的处理，优选使用含有乙酸的液体培养基作为含乙酸的溶液，在需氧条件下进行。这种情况下，在重组酵母通过与含乙酸的溶液接触而木糖代谢能力提高的同时，可以通过增殖而确保适于乙醇发酵的菌体量。
使重组酵母与含乙酸的溶液接触后，从含乙酸的溶液中回收该重组酵母，用含木糖的培养基进行乙醇发酵。从含乙酸的溶液中回收重组酵母时，不特别限定，可应用例如离心分离法、过滤等方法。从含乙酸的溶液中回收重组酵母时，优选尽量去除含乙酸的溶液。这是为了防止由于含乙酸的溶液混入乙醇发酵中使用的含木糖的培养基中而造成的重组酵母的生长抑制、利用重组酵母的乙醇生产抑制。换句话说，在重组酵母的生长抑制、以及利用重组酵母的乙醇生产抑制十分微小，从乙醇生产性的观点出发可以允许的情况下，即使规定量的含乙酸的溶液混入含木糖的培养基中也没关系。此外，在从含乙酸的溶液中回收该重组酵母之后，为了除去含乙酸的溶液，可以对重组酵母进行洗净处理。
进行乙醇发酵的含木糖的培养基，作为碳源至少含有木糖即可，也可以是含有葡萄糖等其他碳源的培养基。此外，用于乙醇发酵的培养基也可使用添加了将纤维素系生物质进行糖化处理后的糖化液的培养基。这种情况下，糖化液中包含来自纤维素系生物质中所含的半纤维素的木糖。
另一方面，作为用于乙醇发酵的培养基，也可以使用包含纤维素系生物质的培养基。这种情况下，利用上述重组酵母进行的乙醇发酵成为所谓同时糖化发酵处理。这里，同时糖化发酵处理是指将糖化纤维素系生物质的工序和乙醇发酵工序不区分地同时实施的处理。此外，在同时糖化发酵处理之前，可以对纤维素系生物质实施现有公知的前处理。作为前处理，不特别限定，可列举例如利用微生物分解木质素的处理、和/或纤维素系生物质的粉碎处理等。
在使用任一培养基的情况下，该重组酵母都能够同化培养基中含有的木糖而生成乙醇。此外，作为糖化方法没有特别限制，可列举利用纤维素酶和/或半纤维素酶等纤维素酶制剂的酶法等。纤维素酶制剂含有与纤维素链和半纤维素链的分解相关的酶，显示内切葡聚糖酶活性、内切木聚糖酶活性、纤维二糖水解酶活性、葡萄糖苷酶活性和木糖苷酶活性等多种活性。作为纤维素酶制剂，没有特别限制，可列举例如由里氏木霉(Trichodermareesei)、解纤维顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)等所生产的纤维素酶。作为纤维素酶制剂，也可以使用市售品。
在同时糖化发酵处理中，向含有纤维素系生物质(可以是前处理后)的培养基中加入纤维素酶制剂和上述重组微生物，在规定的温度范围内培养该重组酵母。作为培养温度没有特别限制，考虑乙醇发酵的效率可以为25～45℃，优选为30～40℃。此外培养液的pH值优选为4～6。此外，培养时也可以进行搅拌和/或震荡。
在本发明所涉及的利用重组酵母的乙醇的制造方法中，在乙醇发酵之后从培养基中回收乙醇。对乙醇的回收方法没有特别限制，可采用现有公知的任意方法。例如，在上述乙醇发酵结束后，通过固液分离操作将含有乙醇的液层、与含有重组酵母和固体成分的固层分离。然后将液层中含有的乙醇用蒸馏法进行分离、纯化，从而可以回收纯度高的乙醇。此外，乙醇的纯化度可以根据乙醇的使用目的而适宜调整。
实施例
以下使用实施例更详细地说明本发明，但本发明的技术范围并不限制于以下实施例。
[实施例1]
本实施例中为了制作木糖同化酵母，将二倍体酵母OC2-T株(Saitoh,S.等、J.Ferment.Bioeng.1996年、81卷、98-103页)的GRE3基因进行单拷贝缺失，导入XYL1、XYL2及XKS1基因。
XYL1、XYL2、XKS1基因过表达·GRE3基因缺失用DNA片段的 制成
以酵母BY4742株(Open Biosystems)的基因组DNA为模板，用PCR扩增包含GRE3基因及其5’上游和3’下游非翻译区的DNA片段。PCR用的引物分别使用TB2358(5’-TGGGAATATTACCGCTCGAAG-3’：序列号1)和TB2359(5’-AAGGGGGAAGGTGTGGAATC-3’：序列号2)。此外，用于酵母BY4742株的DNA序列扩增的PCR引物的设计参考了Saccharomyces Genome Database(酵母基因组数据库)的DNA序列数据。以质粒pUC19为模板，用PCR扩增包含在pUC19的多克隆位点切断那样的pUC19全长的直链DNA片段。PCR用的引物分别使用TB2373(5’-CACACCTTCCCCCTTGATCCTCTAGAGTCGACC-3’：序列号3)和TB2374(5’-GCGGTAATATTCCCAGATCCCCGGGTACCGAGCTC-3’：序列号4)。将上述两种DNA片段使用In-FusionTM Advantage PCRCloning Kit(タカラバイオ)进行克隆化，命名为pUC19-5U_GRE3-GRE3-3U_GRE3。
以pUC19-5U_GRE3-GRE3-3U_GRE3为模板，用PCR扩增包含GRE3基因的5’上游及3’下游非翻译区和pUC19的区域的DNA片段，以酵母BY4742株的基因组DNA为模板，用PCR扩增包含TEF1启动子区的DNA片段、XKS1基因、包含HIS3终止子区的DNA片段。PCR用引物分别使用TB3018(5’-AACGAGGCGCGCTCTTCCAGCCAGTAAAATCCA-3’：序列号5)与TB3017(5’-GCTATGGTGTGTGGGCTTTAAAAAATTTCCAATTTTCCTTTACG-3’：序列号6)、TB2210(5’-CCCACACACCATAGCTTCAAAATG-3’：序列号7)与TB2269(5’-TCTTTAGATTAGATTGCTATGCTTTCTTTCTAATGAGCAAG-3’：序列号8)、TB2345(5’-AATCTAATCTAAAGAATGTTGTGTTCAGTAATTCAGAGAC-3’：序列号9)与TB2346(5’-CTGCGGCCGGCCGCATTAGATGAGAGTCTTTTCCAGTTC-3’：10序列号)、TB1401(5’-TGCGGCCGGCCGCAGC-3’：序列号11)和TB2683(5’-GCGCCTCGTTCAGAATGA-3’：序列号12)。将上述四种DNA片段使用In-FusionTM Advantage PCR Cloning Kit进行克隆化，命名为pUC19-5U_GRE3-P_TEF1-XKS1-T_HIS3-3U_GRE3。
以pUC19-5U_GRE3-P_TEF1-XKS1-T_HIS3-3U_GRE3为模板，用PCR扩增包含在HIS3终止子区与GRE3基因的3’下游非翻译区之间切断那样的质粒全长的直链DNA片段，以酵母BY4742株的基因组DNA为模板，用PCR扩增包含TDH2启动子区的DNA片段、包含ILV3终止子区的DNA片段，以树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的基因组DNA为模板，用PCR扩增XYL1基因。PCR用引物分别使用TB9020(5’-TCCAGCCAGTAAAATCCATAC-3’：序列号13)与TB2457(5’-CCGTCAAGAGAGCGCGCCTCGTTCAG-3’：序列号14)、TB2844(5’-GCGCTCTCTTGACGGGTATTCTGAGCATCTTAC-3’：序列号15)与TB2595(5’-TTTGTTTTGTTTGTTTGTGTGATGAATTTAATTTG-3’：序列号16)、TB2314(5’-AACAAACAAAACAAAATGCCTTCTATTAAGTTGAAC-3’：序列号17)与TB2455(5’-GGGGCCTATAATGCATTAGACGAAGATAGGAATCTTG-3’：序列号18)、TB2456(5’-AACAAACAAAACAAAATGCCTTCTATTAAGTTGAAC-3’：19序列号)与TB3019(5’-ATTTTACTGGCTGGAATTTCGTAGATTATAATTAAGGCGAC-3’：20序列号)。此外，用于XYL1基因序列扩增的PCR引物设计参考了在GeneBank中登录的树干毕赤酵母XYL1基因(登录号XM_001385144)。将上述四种DNA片段使用In-FusionTM Advantage PCR Cloning Kit进行克隆化，命名为pUC19-5U_GRE3-P_TEF1-XKS1-T_HIS3-P_TDH2-XYL1-T_ILV3-3U_GRE3。
以pUC19-5U_GRE3-P_TEF1-XKS1-T_HIS3-P_TDH2-XYL1-T_ILV3-3U_GRE3为模板，用PCR扩增包含在ILV3终止子区与GRE3基因的3’下游非翻译区之间切断那样的质粒全长的直链DNA片段，以酵母BY4742株的基因组DNA为模板，用PCR扩增含有PDC1启动子区的DNA片段和含有ILV6终止子区的DNA片段，以树干毕赤酵母的基因组DNA作为模板，用PCR扩增XYL2基因。PCR用引物分别使用TB2375(5’-AGTTGCTTGACACGGTGGAAGAAGGTCCAGCCAGTAAAATCCATA-3’：序列号21)与TB3021(5’-ATTTCGTAGATTATAATTAAGGCGAC-3’：序列号22)、TB2010(5’-TTTGATTGATTTGACTGTGTTATTTTGC-3’：序列号23)与TB2261(5’-CCGTGTCAAGCAACTATGGG-3’：序列号24)、TB3022(5’-TATAATCTACGAAATTAATAAGAAAGGTGACCGTG-3’：序列号25)与TB2347(5’-GTTAGTCTCTCGGCCTTGCG-3’：序列号26)、TB2351(5’-GGCCGAGAGACTAACTTACTCAGGGCCGTCAAT-3’：序列号27)与TB2352(5’-GTCAAATCAATCAAAATGACTGCTAACCCTTCC-3’：序列号28)。此外，用于XYL2基因序列扩增的PCR引物设计参考了在GeneBank中登录的树干毕赤酵母XYL2基因(登录号AF127801或X55392)。将上述四种DNA片段使用In-FusionTM AdvantagePCR Cloning Kit进行克隆化，命名为pUC19-5U_GRE3-P_TEF1-XKS1-T_HIS3-P_TDH2-XYL1-T_ILV3-ILV6_T-XYL2-PDC1_P-3U_GRE3。
以pUC19-5U_GRE3-P_TEF1-XKS1-T_HIS3-P_TDH2-XYL1-T_ILV3-ILV6_T-XYL2-PDC1_P-3U_GRE3为模板，用PCR扩增GRE3基因的从5’上游非翻译区至3’下游非翻译区的DNA片段。将本片段(图1)用于制成XYL1、XYL2、XKS1基因过表达·GRE3基因缺失株。
XYL1、XYL2、XKS1基因过表达·GRE3基因异缺失株的制作
使用XYL1、XYL2、XKS1基因过表达·GRE3基因缺失用DNA片段，将OC2-T株用Frozen-EZ Yeast Transformation II试剂盒(ZYMORESEARCH)按照试剂盒附带的方案进行转化。转化后，接种在以木糖为单独碳源的平板中，在30℃下培养7天，获得转化体。由转化体制备基因组DNA，通过PCR法，使用作为插入DNA片段的外侧和载体内侧的引物的TB2356(5’-TGGGGCTAAACGAGATTTGG-3’：序列号29)和TB592(5’-GAAATTTAGTATGCTGTGCTTGGG-3’：序列号30)，确认了在染色体正常地单拷贝插入。
发酵试验
将获得的转化体接种于YPD培养基(酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L)或者YPD乙酸培养基(酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L、乙酸1～5g/L，用氨水调整至pH值5)，在30℃进行24小时的震荡培养。培养结束后通过离心分离(2000g、3分钟)回收菌体。
向50ml容量的烧瓶中各自加入50ml的木糖培养基(木糖60g/L、酵母提取物10g/L)、葡萄糖/木糖培养基(葡萄糖90g/L、木糖60g/L、酵母提取物10g/L)或者葡萄糖培养基(葡萄糖90g/L、酵母提取物10g/L)，按菌体浓度为菌体干重0.3g/l的比例接菌，在80转/分钟(震幅35mm)、34℃条件下进行48小时发酵，使用HPLC(LC-10A；岛津制作所)测定乙醇和木糖的浓度。测定条件为，柱使用AminexHPX-87H(BIO-RAD)，检测器使用示差折射率检测器RID-10A(岛津制作所)，在流动相为0.01N的H2SO4、流量为0.6ml/分钟、温度为30℃的条件下进行分析。
乙醇的浓度分析结果示于图2。如图2所示，发酵实验的结果表明，在木糖培养基中，与无乙酸处理区相比，在培养液中添加了3g/L以上的乙酸的处理区，乙醇生产速度提高。另一方面，在葡萄糖培养基的培养中，乙醇生产速度无差异。
木糖浓度的分析结果示于图3。如图3所示，使用木糖培养基/葡萄糖培养基的情况下，虽然木糖的消耗速度在添加3g/L以上的乙酸的处理区著提高，但葡萄糖的消耗量则与对照没有差异。
以上的结果表明，通过在乙醇发酵工序之前使具有木糖代谢能力的重组酵母与含乙酸的溶液(本实施例中为含乙酸的液体培养基)接触，该重组酵母中的木糖代谢能力大幅提高。此外，即使使具有木糖代谢能力的重组酵母与含乙酸的溶液接触，该重组酵母所具有的葡萄糖代谢能力也没有较大的改善。由此明确了，在使具有木糖代谢能力的重组酵母与含乙酸的溶液接触的情况下，在该重组酵母中的碳源同化能力中，可以特异性地改善木糖代谢能力。
Figure IDA00003080487500011
Figure IDA00003080487500031
Figure IDA00003080487500041
Figure IDA00003080487500051
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Figure IDA00003080487500081
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Claims (5)

1.一种乙醇的制造方法，具有以下工序：使具有木糖代谢能力的酵母与含乙酸的溶液接触的工序，和然后用含木糖的培养基培养该酵母从而进行乙醇发酵工序。
2.根据权利要求1所述的乙醇的制造方法，其特征在于，上述酵母是被导入了木糖代谢相关基因的重组酵母。
3.根据权利要求2所述的乙醇的制造方法，其特征在于，上述木糖代谢相关基因是木糖还原酶基因、木糖醇脱氢酶基因和木酮糖激酶基因。
4.根据权利要求1所述的乙醇的制造方法，其特征在于，使上述酵母与含乙酸的溶液接触时，在需氧条件下进行。
5.根据权利要求1所述的乙醇的制造方法，其特征在于，上述含乙酸的溶液是在酵母用培养基中添加有乙酸的组成。
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