WO2012063344A1 - 組換え酵母を用いたエタノールの製造方法 - Google Patents

組換え酵母を用いたエタノールの製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2012063344A1
WO2012063344A1 PCT/JP2010/070076 JP2010070076W WO2012063344A1 WO 2012063344 A1 WO2012063344 A1 WO 2012063344A1 JP 2010070076 W JP2010070076 W JP 2010070076W WO 2012063344 A1 WO2012063344 A1 WO 2012063344A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
yeast
xylose
gene
acetic acid
ethanol
Prior art date
Application number
PCT/JP2010/070076
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
大西徹
富永詠美子
保谷典子
Original Assignee
トヨタ自動車株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by トヨタ自動車株式会社 filed Critical トヨタ自動車株式会社
Priority to CA2819315A priority Critical patent/CA2819315C/en
Priority to JP2012542764A priority patent/JP5590140B2/ja
Priority to US13/883,670 priority patent/US8859248B2/en
Priority to CN201080069741.5A priority patent/CN103180451B/zh
Priority to BR112013011473-8A priority patent/BR112013011473B1/pt
Priority to PCT/JP2010/070076 priority patent/WO2012063344A1/ja
Publication of WO2012063344A1 publication Critical patent/WO2012063344A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/08—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate
    • C12P7/10—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate substrate containing cellulosic material
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing ethanol using recombinant yeast having xylose metabolism ability.
  • Patent Document 1 discloses a yeast in which a xylose reductase gene and a xylitol dehydrogenase gene derived from Pichia stipitis and a xylulokinase gene derived from S. cerevisiae are integrated into a chromosome.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 describe that xylose fermentation rate is reduced when yeast imparted with xylose metabolic ability is cultured in a fermentation medium containing acetic acid. Furthermore, Non-Patent Document 3 describes yeasts imparted with xylose fermentation ability and mutants with improved xylose fermentation rate.
  • the present invention aims to provide a technique for improving ethanol productivity by improving xylose metabolism in yeast having xylose metabolism.
  • the present invention includes the following.
  • a method for producing ethanol comprising immersing a yeast having xylose-metabolizing ability in an acetic acid-containing solution, and then culturing the yeast in a xylose-containing medium and performing ethanol fermentation.
  • xylose metabolism in yeast having xylose metabolism can be improved, and as a result, ethanol productivity is significantly improved.
  • ethanol production method according to the present invention ethanol can be produced at low cost, for example, using woody biomass.
  • the method for producing ethanol according to the present invention is a method of synthesizing ethanol from xylose contained in a medium by a recombinant yeast having xylose metabolizing ability, and includes a treatment step of bringing the recombinant yeast into contact with an acetic acid-containing solution. Through this step, the xylose metabolic capacity in the recombinant yeast is greatly improved, and the productivity of ethanol is greatly improved.
  • ⁇ Recombinant yeast> In the recombinant yeast used in the method for producing ethanol according to the present invention, at least a xylose metabolism-related gene is introduced into the genome.
  • This recombinant yeast can assimilate xylose contained in the medium to produce ethanol.
  • the xylose contained in the medium may be obtained by a process of saccharifying xylan, hemicellulose or the like containing xylose as a constituent sugar, or xylan or hemicellulose or the like contained in the medium is saccharified by a saccharifying enzyme. May be supplied to the medium. In the latter case, it means a so-called simultaneous saccharification and fermentation system.
  • Genes related to xylose metabolism are xylose reductase gene encoding xylose reductase that converts xylose to xylitol, xylitol dehydrogenase gene encoding xylitol dehydrogenase that converts xylitol to xylulose, and xylulose is phosphorylated to produce xylulose 5-phosphate It is meant to include a xylulokinase gene encoding xylulokinase. Xylulose 5-phosphate produced by xylulokinase enters the pentose phosphate pathway and is metabolized.
  • the xylose metabolism-related gene introduced into the yeast genome is not particularly limited, and examples thereof include a xylose reductase gene and a xylitol dehydrogenase gene derived from Pichia stipitis, and a xylulokinase gene derived from Saccharomyces cerevisiae (Eliasson A. et al. Appl. Environ. Microbiol, 66: 3381-3386 and Toivari MN et al., Metab. Eng. 3: 236-249).
  • a xylose reductase gene derived from Candida ⁇ ⁇ ⁇ tropicalis or Candida prapsilosis can be used as the xylose reductase gene.
  • a xylitol dehydrogenase gene a xylitol dehydrogenase gene derived from Candida tropicalis or Candida prapsilosis can be used.
  • a xylulokinase gene a xylulokinase gene derived from Pichia stipitis can also be used.
  • a xylose isomerase gene derived from Streptomyces murinus cluster or the like can also be used.
  • the recombinant yeast used in the method for producing ethanol according to the present invention may be a product into which a gene involved in sugar metabolism such as glucose is introduced in addition to the above-mentioned xylose metabolism-related gene.
  • the recombinant yeast is preferably a yeast having ⁇ -glucosidase activity by introducing a ⁇ -glucosidase gene.
  • ⁇ -glucosidase activity means an activity catalyzing a reaction of hydrolyzing a ⁇ -glycoside bond of a sugar. That is, ⁇ -glucosidase can decompose cellooligosaccharides such as cellobiose into glucose.
  • the ⁇ -glucosidase gene is preferably introduced as a cell surface display type gene.
  • the cell surface display type gene is a gene modified so that a protein encoded by the gene is expressed so as to be displayed on the surface layer of the cell.
  • the cell surface-presenting ⁇ -glucosidase gene is a gene obtained by fusing a ⁇ -glucosidase gene and a cell surface localized protein gene.
  • the cell surface localized protein refers to a protein that is fixed on the cell surface of yeast and is present on the cell surface.
  • ⁇ - or a-agglutinin which is an aggregating protein, FLO protein and the like can be mentioned.
  • a cell surface localized protein has a secretory signal sequence on the N-terminal side and a GPI anchor attachment recognition signal on the C-terminal side. Although it has the same secretory protein in that it has a secretion signal, the cell surface localized protein is different from the secreted protein in that it is transported by being fixed to the cell membrane via the GPI anchor.
  • the GPI anchor attachment recognition signal sequence is selectively cleaved, and is bound to the GPI anchor at the newly protruding C-terminal portion and fixed to the cell membrane. Thereafter, the base of the GPI anchor is cleaved by phosphatidylinositol-dependent phospholipase C (PI-PLC).
  • PI-PLC phosphatidylinositol-dependent phospholipase C
  • the ⁇ -glucosidase gene is not particularly limited, and examples thereof include ⁇ -glucosidase genes derived from Aspergillus aculeatus (Murai et al., Appl. Environ. Microbiol. 64: 4857-4861).
  • a ⁇ -glucosidase gene a ⁇ -glucosidase gene derived from Aspergillus oryzae, a ⁇ -glucosidase gene derived from Clostridium cellulovorans, a ⁇ -glucosidase gene derived from Saccharomycopsis fibligera, and the like can be used.
  • yeasts such as Candida Shehatae, Pichia stipitis, Pachysolen tannophilus, Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccaromyces pombe, and Saccharomyces cerevisiae is particularly preferable.
  • the yeast may be an experimental strain used for experimental convenience, or an industrial strain (practical strain) used for practical utility. Examples of industrial strains include yeast strains used for wine, sake and shochu making.
  • yeast having homothallic properties it is preferable to use as the host yeast. According to the technique disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2009-34036, it is possible to easily introduce a multicopy gene into a genome by using a yeast having homothallic properties.
  • Yeast having homothallic properties is synonymous with homothallic yeast.
  • the yeast having homothallic properties is not particularly limited, and any yeast can be used. Examples of yeast having homothallic properties include, but are not limited to, Saccharomyces cerevisiae OC-2 strain (NBRC2260).
  • yeasts with homothallic properties include alcoholic yeasts (Taken 396, NBRC0216) (Source: “Characteristics of alcoholic yeasts”, Sakekenkaiho, No37, p18-22 (1998.8)), isolated in Brazil and Okinawa Ethanol producing yeast (Source: “Genetic properties of wild strains of Saccharomyces cerevisiae isolated in Brazil and Okinawa” Journal of Japanese Agricultural Chemistry, Vol. 65, No. 4, p759-762 (1991.4)) and 180 (Source: Alcohol The screening of yeast with strong fermenting ability ”, Journal of Japan Brewing Association, Vol.82, No.6, p439-443 (1987.6)).
  • yeast having homothallic properties can be used as a yeast having homothallic properties by introducing the HO gene so that it can be expressed. That is, in the present invention, the yeast having homothallic properties is meant to include yeast into which the HO gene has been introduced so as to be expressed.
  • the Saccharomyces cerevisiae OC-2 strain is preferable because it is a strain that has been confirmed to be safe and has been used in the winemaking scene. Further, the Saccharomyces cerevisiae OC-2 strain is preferable because it has excellent promoter activity under high sugar concentration conditions, as shown in the Examples described later. In particular, the Saccharomyces cerevisiae OC-2 strain is preferable because of its excellent promoter activity of the pyruvate decarboxylase gene (PDC1) under high sugar concentration conditions.
  • PDC1 pyruvate decarboxylase gene
  • the promoter of the gene to be introduced is not particularly limited.
  • the promoter of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase gene (TDH3), the promoter of 3-phosphoglycerate kinase gene (PGK1), the hyperosmotic response 7 gene ( HOR7) promoters can be used.
  • the pyruvate decarboxylase gene (PDC1) promoter is preferred because of its high ability to highly express a downstream target gene.
  • the above-described gene may be introduced into the yeast genome together with a promoter controlling expression and other expression control regions.
  • the above-described gene may be introduced so that the expression is controlled by a promoter of a gene originally present in the genome of yeast as a host or other expression control regions.
  • any conventionally known method known as a yeast transformation method can be applied. Specifically, for example, electroporation method “Meth. Enzym., 194, p182 (1990)”, spheroplast method “Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978)”, acetic acid Lithium Method “J. Bacteriology, 153, p163 (1983)”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978), Methods in yeast genetics, 2000 Edition: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual The method can be implemented, but is not limited thereto.
  • acetic acid-containing solution may be either an acetic acid aqueous solution or a liquid medium containing acetic acid.
  • the aqueous acetic acid solution can be obtained by dissolving acetic acid in water.
  • the liquid medium containing acetic acid can be prepared by adding acetic acid to a medium for yeast such as SD medium, YPD medium, YPAD medium, and YM medium.
  • the concentration of acetic acid contained in the acetic acid-containing solution is not particularly limited, but is, for example, 1 to 20 g / l, preferably 2 to 10 g / l, more preferably 3 to 5 g / l. If the concentration of acetic acid contained in the acetic acid-containing solution is below the above range, the xylose metabolic capacity in the recombinant yeast may not be significantly improved. Moreover, when the acetic acid concentration contained in an acetic acid containing solution exceeds the said range, there exists a possibility of inhibiting the growth of the said recombinant yeast.
  • the treatment for bringing the recombinant yeast into contact with the acetic acid-containing solution is not particularly limited, but for example, 1 hour or longer, preferably 3 hours or longer, more preferably 10 hours or longer.
  • the contact time between the recombinant yeast and the acetic acid-containing solution is less than the above range, the xylose metabolic capacity in the recombinant yeast may not be significantly improved.
  • the treatment for bringing the recombinant yeast into contact with the acetic acid-containing solution may be stirred or shaken in a state where the recombinant yeast is added to the acetic acid-containing solution.
  • the solution temperature is, for example, 20 to 40 ° C., preferably 25 to 37 ° C., more preferably 28 to 35 ° C.
  • the treatment of bringing the recombinant yeast into contact with the acetic acid-containing solution is preferably performed under aerobic conditions using a liquid medium containing acetic acid as the acetic acid-containing solution.
  • a liquid medium containing acetic acid as the acetic acid-containing solution.
  • the recombinant yeast After bringing the recombinant yeast into contact with the acetic acid-containing solution, the recombinant yeast is recovered from the acetic acid-containing solution and subjected to ethanol fermentation in a xylose-containing medium.
  • a technique such as centrifugation or filtration can be applied.
  • it is desirable to remove the acetic acid-containing solution as much as possible.
  • a predetermined amount of acetic acid-containing solution may be brought into the xylose-containing medium.
  • the xylose-containing medium for ethanol fermentation may be a medium containing at least xylose as a carbon source, and may be a medium containing other carbon sources such as glucose.
  • the saccharified liquid after saccharifying-processing cellulose-type biomass can be used for the culture medium utilized for ethanol fermentation.
  • the saccharified solution contains xylose derived from hemicellulose contained in the cellulosic biomass.
  • the medium used for ethanol fermentation may be a medium containing cellulosic biomass.
  • ethanol fermentation by the recombinant yeast is a so-called simultaneous saccharification and fermentation process.
  • the simultaneous saccharification and fermentation treatment means a treatment that is carried out simultaneously without distinguishing between the step of saccharifying cellulosic biomass and the ethanol fermentation step.
  • a conventionally known pretreatment may be applied to the cellulosic biomass.
  • pre-processing For example, the process which decomposes
  • the recombinant yeast can assimilate xylose contained in the medium to produce ethanol.
  • the saccharification method is not particularly limited, and examples thereof include an enzyme method using a cellulase preparation such as cellulase or hemicellulase.
  • the cellulase preparation contains a plurality of enzymes involved in the degradation of cellulose chains and hemicellulose chains, and exhibits a plurality of activities such as endoglucanase activity, endoxylanase activity, cellobiohydrolase activity, glucosidase activity, and xylosidase activity.
  • the cellulase preparation is not particularly limited, and examples thereof include cellulase produced by Trichoderma reesei, Acremonium cerulolyticus, and the like.
  • As the cellulase preparation a commercially available product may be used.
  • a cellulase preparation and the above-described recombinant microorganism are added to a medium containing cellulosic biomass (which may be after pretreatment), and the recombinant yeast is cultured in a predetermined temperature range.
  • the culture temperature is not particularly limited, but can be 25 to 45 ° C., preferably 30 to 40 ° C. in consideration of the efficiency of ethanol fermentation.
  • the pH of the culture solution is preferably 4-6. Moreover, you may stir and shake in the case of culture
  • ethanol is recovered from the medium after ethanol fermentation.
  • the method for recovering ethanol is not particularly limited, and any conventionally known method can be applied.
  • a liquid layer containing ethanol and a solid layer containing recombinant yeast and solid components are separated by solid-liquid separation operation.
  • ethanol contained in the liquid layer is separated and purified by a distillation method, whereby high purity ethanol can be recovered.
  • the purity of ethanol can be adjusted as appropriate according to the intended use of ethanol.
  • Example 1 GRE3 of the diploid yeast OC2-T strain (Saitoh, S. et al., J. Ferment. Bioeng. 1996, 81, 98-103) was used for the production of xylose-utilizing yeast. One copy was disrupted and XYL1, XYL2 and XKS1 genes were introduced.
  • XYL1, XYL2, XKS1 gene overexpression / GRE3 gene disruption DNA fragment preparation DNA fragment containing the GRE3 gene and its 5 'upstream and 3' downstream untranslated region using genomic DNA of yeast BY4742 (Open Biosystems) as a template was amplified by PCR.
  • TB2358 (5′-TGGGAATATTACCGCTCGAAG-3 ′: SEQ ID NO: 1) and TB2359 (5′-AAGGGGGAAGGTGTGGAATC-3 ′: SEQ ID NO: 2) were used as PCR primers, respectively.
  • the PCR primer design for the DNA sequence amplification of yeast BY4742 strain was referred to the DNA sequence data of Saccharomyces Genome Database.
  • a linear DNA fragment containing the full length of pUC19 that was cleaved at the multicloning site of pUC19 was amplified by PCR.
  • TB2373 (5′-CACACCTTCCCCCTTGATCCTCTAGAGTCGACC-3 ′: SEQ ID NO: 3) and TB2374 (5′-GCGGTAATATTCCCAGATCCCCGGGTACCGAGCTC-3 ′: SEQ ID NO: 4) were used as PCR primers, respectively.
  • the above two DNA fragments were cloned using In-Fusion TM Advantage PCR Cloning Kit (Takara Bio) and named pUC19-5U_GRE3-GRE3-3U_GRE3.
  • the primers for PCR are TB3018 (5'-AACGAGGCGCGCTCTTCCAGCCAGTAAAATCCA-3 ': SEQ ID NO: 5) and TB3017 (5'-GCTATGGTGTGTGGGCTTTAAAAAATTTCCAATTTTCCTTTACG-3': SEQ ID NO: 6), TB2210 (5'-CCCACACACCATAGCTTCAAAATG-3 ': SEQ ID NO: 7) TB2269 (5'-TCTTTAGATTAGATTGCTATGCTTTCTTTCTAATGAGCAAG-3 ': SEQ ID NO: 8), TB2345 (5'-AATCTAATCTAAAGAATGTTGTGTTCAGTAATTCAGAGAC-3': SEQ ID NO: 9) and TB2346 (5'-CTGCGGCCGGCCGCATTAGATGAGAGTCT1TCCAGTTC-3 ': 1 TGCGGCCGGCCGCAGC-3 ′: SEQ ID NO: 11) and TB2683 (5′-GCGCCTCGTTCAGAAT
  • a linear DNA fragment containing the entire length of the plasmid as cleaved between the HIS3 terminator region and the 3 ′ downstream untranslated region of the GRE3 gene, and the yeast BY4742 strain was amplified by PCR using a DNA fragment containing the TDH2 promoter region, a DNA fragment containing the ILV3 terminator region, and a genomic DNA of Pichia stipitis as a template.
  • the primers for PCR are TB9020 (5'-TCCAGCCAGTAAAATCCATAC-3 ': SEQ ID NO: 13), TB2457 (5'-CCGTCAAGAGAGCGCGCCTCGTTCAG-3': SEQ ID NO: 14), TB2844 (5'-GCGCTCTCTTGACGGGTATTCTGAGCATCTTAC-3 ': SEQ ID NO: 15).
  • TB2595 (5'-TTTGTTTTGTTTGTTTGTGTGATGAATTTAATTTG-3 ': SEQ ID NO: 16), TB2314 (5'-AACAAACAAAACAAAATGCCTTCTATTAAGTTGAAC-3': SEQ ID NO: 17) and TB2455 (5'-GGGGCCTATAATGCATTAGACGAAGATAGGAATCTTG-3 ': SEQ ID NO: 18, TB4 AACAAACAAAACAAAATGCCTTCTATTAAGTTGAAC-3 ′: SEQ ID NO: 19) and TB3019 (5′-ATTTTACTGGCTGGAATTTCGTAGATTATAATTAAGGCGAC-3 ′: SEQ ID NO: 20) were used.
  • PCR primer design for XYL1 gene sequence amplification referred to the Pichia stipitis XYL1 gene (registration number XM_001385144) registered in GeneBank.
  • the above four DNA fragments were cloned using In-Fusion TM Advantage PCR Cloning Kit and named pUC19-5U_GRE3-P_TEF1-XKS1-T_HIS3-P_TDH2-XYL1-T_ILV3-3U_GRE3.
  • pUC19-5U_GRE3-P_TEF1-XKS1-T_HIS3-P_TDH2-XYL1-T_ILV3-3U_GRE3 as a template, linear DNA containing the entire length of the plasmid as cleaved between the ILV3 terminator region and the 3 'downstream untranslated region of the GRE3 gene
  • the XYL2 gene was amplified by PCR using the fragment, genomic DNA of yeast BY4742 strain as a template, DNA fragment containing PDC1 promoter region and DNA fragment containing ILV6 terminator region, and genomic DNA of Pichia stipitis.
  • the primers for PCR were TB2375 (5'-AGTTGCTTGACACGGTGGAAGAAGGTCCAGCCAGTAAAATCCATA-3 ': SEQ ID NO: 21) and TB3021 (5'-ATTTCGTAGATTATAATTAAGGCGAC-3': SEQ ID NO: 22), TB2010 (5'-TTTGATTGATTTGACTGTGTTATTTTGC-3 ': SEQ ID NO: 23), respectively.
  • TB2261 (5'-CCGTGTCAAGCAACTATGGG-3 ': SEQ ID NO: 24), TB3022 (5'-TATAATCTACGAAATTAATAAGAAAGGTGACCGTG-3': SEQ ID NO: 25) and TB2347 (5'-GTTAGTCTCTCGGCCTTGCG-3 ': SEQ ID NO: 26), TB2351 (5'- GGCCGAGAGACTAACTTACTCAGGGCCGTCAAT-3 ′: SEQ ID NO: 27) and TB2352 (5′-GTCAAATCAATCAAAATGACTGCTAACCCTTCC-3 ′: SEQ ID NO: 28) were used.
  • the PCR primer design for XYL2 gene sequence amplification was based on the Pichia stipitis XYL2 gene (registration number AF127801 or X55392) registered in GeneBank.
  • the above four DNA fragments were cloned using In-Fusion TM Advantage PCR Cloning Kit and named pUC19-5U_GRE3-P_TEF1-XKS1-T_HIS3-P_TDH2-XYL1-T_ILV3-ILV6_T-XYL2-PDC1_P-3U_GRE3.
  • XYL1, XYL2, XKS1 gene overexpression / GRE3 gene hetero- disruption strain preparation Using XYL1, XYL2, XKS1 gene over-expression / GRE3 gene disruption DNA fragment, the OC2-T strain was frozen using the Frozen-EZ Yeast Transformation II kit (ZYMO RESEARCH ) Was used and transformed according to the protocol attached to the kit. After transformation, it was spread on a plate using xylose as a sole carbon source and cultured at 30 ° C. for 7 days to obtain a transformant.
  • ZYMO RESEARCH Frozen-EZ Yeast Transformation II kit
  • Genomic DNA was prepared from the transformant, and TB2356 (5'-TGGGGCTAAACGAGATTTGG-3 ': SEQ ID NO: 29) and TB592 (5'-GAAATTTAGTATGCTGTGCTTGGG-3': primers outside the inserted DNA fragment and inside the vector were prepared by PCR. Using SEQ ID NO: 30), it was confirmed that one copy was normally integrated into the chromosome.
  • YPD medium yeast extract 10 g / L, peptone 20 g / L glucose 20 g / L
  • YPD acetate medium yeast extract 10 g / L, peptone 20 g / L glucose 20 g / L, Acetic acid 1-5 g / L; adjusted to pH 5 with ammonia
  • the cells were collected by centrifugation (2000 g, 3 minutes).
  • Xylose medium (xylose 60 g / L, yeast extract 10 g / L), glucose / xylose medium (glucose 90 g / L, xylose 60 g / L, yeast extract 10 g / L) or glucose medium (glucose 90 g / L, yeast extract 10 g / L) L)
  • glucose medium (glucose 90 g / L, yeast extract 10 g / L) L)
  • concentrations of ethanol and xylose were measured with (LC-10A; Shimadzu Corporation).
  • the column uses AminexHPX-87H (Bio-Rad), the detector uses a differential refractive index detector RID-10A (Shimadzu Corporation), mobile phase 0.01N H 2 SO 4 , flow rate 0.6 ml / min, temperature Analyzed at 30 ° C.
  • the analysis result of ethanol concentration is shown in FIG. As shown in FIG. 2, as a result of the fermentation test, it is clear that in the xylose medium, the ethanol production rate is improved in the treated group added with 3 g / L or more of acetic acid to the culture solution compared to the non-acetic acid-treated group. became. On the other hand, in the glucose medium, there was no difference in the ethanol production rate.
  • the analysis result of the xylose concentration is shown in FIG. As shown in FIG. 3, when the glucose / xylose medium was used, the consumption rate of xylose was improved in the treatment group added with 3 g / L or more of acetic acid, but the glucose consumption was not different from the control.
  • the recombinant yeast having the ability to metabolize xylose is brought into contact with an acetic acid-containing solution (in this example, a liquid medium containing acetic acid), so that the xylose-metabolizing ability in the recombinant yeast can be obtained. It became clear that improved significantly. In addition, even when a recombinant yeast having xylose metabolic ability was brought into contact with an acetic acid-containing solution, the glucose metabolic ability of the recombinant yeast was not greatly improved.
  • an acetic acid-containing solution in this example, a liquid medium containing acetic acid

Abstract

　キシロース代謝能を有する酵母おけるキシロース代謝能を向上させる。　キシロース代謝能を有する酵母を酢酸含有溶液に浸漬する工程と、その後、キシロース含有培地にて当該酵母を培養してエタノール発酵を行う工程とを有する。

Description

組換え酵母を用いたエタノールの製造方法
　本発明は、キシロース代謝能を有する組換え酵母を用いたエタノールの製造方法に関する。
　セルロース系バイオマスは、エタノール等の有用なアルコールや有機酸の原料として有効に利用されている。セルロース系バイオマスを利用したエタノール製造において、エタノール生産量を向上させるため、基質として５単糖のキシロースを利用できる酵母が開発されている。例えば、特許文献１は、Pichia stipitis由来のキシロースリダクターゼ遺伝子及びキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子とS. cerevisiae由来のキシルロキナーゼ遺伝子を染色体に組み込んだ酵母を開示している。
　また、非特許文献１及び２には、酢酸を含有する発酵培地でキシロース代謝能を付与した酵母を培養すると、キシロース発酵速度が低下することが記載されている。さらに、非特許文献３には、キシロース発酵能を付与された酵母及びキシロース発酵速度が向上した変異株が記載されている。
　しかしながら、キシロース代謝能を有する酵母に対して、キシロース代謝能を向上させるような技術は知られていない。
特開２００９－１９５２２０号公報
FEMS Yeast Research, vol. 9, 2009, 358-364 Enzyme and Microbial Technology 33, 2003, 786-792 Appl. Microbiol. Biotechnol. 2009, 84:37-53
　そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、特に、キシロース代謝能を有する酵母おけるキシロース代謝能を向上させることで、エタノールの生産性を向上させる技術を提供することを目的とする。
　上記目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、キシロース代謝能を有する酵母を酢酸含有溶液に接触させる処理を行うことで、当該酵母のキシロース代謝能が飛躍的に向上することを見いだし、本発明を完成するに至った。
　本発明は以下を包含する。
（１）キシロース代謝能を有する酵母を酢酸含有溶液に浸漬する工程と、その後、キシロース含有培地にて当該酵母を培養してエタノール発酵を行う工程とを有するエタノールの製造方法。
（２）上記酵母は、キシロース代謝関連遺伝子が導入された組換え酵母であることを特徴とする（１）記載のエタノールの製造方法。
（３）上記キシロース代謝関連遺伝子は、キシロースリダクターゼ遺伝子、キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子及びキシルロキナーゼ遺伝子であることを特徴とする（２）記載のエタノールの製造方法。
（４）上記酵母を酢酸含有溶液に浸漬する際、好気条件とすることを特徴とする（１）記載のエタノールの製造方法。
（５）上記酢酸含有溶液は、酵母用培地に酢酸を添加した組成であることを特徴とする（１）記載のエタノールの製造方法。
　本発明に係るエタノールの製造方法によれば、キシロース代謝能を有する酵母におけるキシロース代謝能を向上させることができ、その結果、エタノールの生産性が大幅に向上する。本発明に係るエタノールの製造方法を利用することにより、例えば木質系バイオマスを利用して、エタノールを低コストに生産することができる。
XYL1、XYL2、XKS1遺伝子過剰発現・GRE3遺伝子破壊用DNA断片を用いた組換えを模式的に示す図である。 発酵試験後、エタノール濃度を分析した結果を示す特性図である。 発酵試験後、キシロース濃度を分析した結果を示す特性図である。
　以下、本発明を図面及び実施例を用いてより詳細に説明する。
　本発明に係るエタノールの製造方法は、キシロース代謝能を有する組換え酵母により培地に含まれるキシロースからエタノールを合成する方法であり、当該組換え酵母を酢酸含有溶液に接触させる処理工程を含む。当該工程を経ることにより組換え酵母におけるキシロース代謝能が大幅に向上することになり、エタノールの生産性が大幅に向上する。
＜組換え酵母＞
　本発明に係るエタノールの製造方法に使用される組換え酵母は、少なくともキシロース代謝関連遺伝子がゲノムに導入されている。この組換え酵母は、培地中に含まれるキシロースを資化してエタノールを生産することができる。なお、培地中に含まれるキシロースとは、キシロースを構成糖とするキシランやヘミセルロース等を糖化するプロセスによって得られたものでも良いし、培地に含まれるキシランやヘミセルロース等が糖化酵素により糖化されることで培地に供給されるものであってもよい。後者の場合は、所謂、同時糖化発酵の系を意味する。
　キシロース代謝関連遺伝子とは、キシロースをキシリトールに変換するキシロースリダクターゼをコードするキシロースリダクターゼ遺伝子、キシリトールをキシルロースに変換するキシリトールデヒドロゲナーゼをコードするキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子及びキシルロースをリン酸化してキシルロース5-リン酸を生成するキシルロキナーゼをコードするキシルロキナーゼ遺伝子を含む意味である。なお、キシルロキナーゼにより生成されたキシルロース5-リン酸は、ペントースリン酸経路に入り代謝されることとなる。
　酵母ゲノムに導入されるキシロース代謝関連遺伝子としては、特に限定されないが、Pichia stipitis由来のキシロースリダクターゼ遺伝子及びキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子、Saccharomyces cerevisiae由来のキシルロキナーゼ遺伝子を挙げることができる（Eliasson A. et al., Appl. Environ. Microbiol, 66:3381-3386及びToivari MN et al., Metab. Eng. 3:236-249参照）。その他にも、キシロースリダクターゼ遺伝子としては、Candida tropicalisやCandida prapsilosis由来のキシロースリダクターゼ遺伝子を利用することができる。キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子としては、Candida tropicalisやCandida prapsilosis由来のキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を利用することができる。キシルロキナーゼ遺伝子としては、Pichia stipitis由来のキシルロキナーゼ遺伝子を利用することもできる。なお、ストレプトマイセスムリナスクラスター由来のキシロースイソメラーゼ遺伝子等を利用することもできる。
　また、本発明に係るエタノールの製造方法に使用される組換え酵母は、上述したキシロース代謝関連遺伝子の他に、グルコース等の糖代謝に関与する遺伝子を導入した物であっても良い。一例として組換え酵母は、β－グルコシダーゼ遺伝子を導入することでβ－グルコシダーゼ活性を有する酵母であることが好ましい。
　ここでβ－グルコシダーゼ活性とは、糖のβ-グリコシド結合を加水分解する反応を触媒する活性を意味する。すなわち、β－グルコシダーゼは、セロビオース等のセロオリゴ糖をグルコースに分解することができる。β－グルコシダーゼ遺伝子は、細胞表層提示型遺伝子として導入されることが好ましい。ここで、細胞表層提示型遺伝子とは、当該遺伝子がコードするタンパク質が細胞の表層にディスプレイされるように発現するように改変された遺伝子である。例えば、細胞表層提示型βグルコシダーゼ遺伝子とは、βグルコシダーゼ遺伝子と細胞表層局在タンパク質遺伝子とを融合した遺伝子である。細胞表層局在タンパク質とは、酵母の細胞表層に固定され、細胞表層に存在するタンパク質をいう。例えば、凝集性タンパク質であるα-またはａ-アグルチニン、ＦＬＯタンパク質などが挙げられる。一般に細胞表層局在タンパク質は、N末端側に分泌シグナル配列及びC末端側にGPIアンカー付着認識シグナルを有している。分泌シグナルを有する点では分泌性タンパク質と共通しているが、細胞表層局在タンパク質はGPIアンカーを介して細胞膜に固定されて輸送される点が分泌性タンパク質と異なる。細胞表層局在タンパク質は、細胞膜通過の際、GPIアンカー付着認識シグナル配列が選択的に切断され、新たに突出したC末端部分でGPIアンカーと結合して細胞膜に固定される。その後ホスファチジルイノシトール依存性ホスホリパーゼC（PI-PLC）によりGPIアンカーの根元部分が切断される。ついで、細胞膜から切り離されたタンパク質は細胞壁に組み込まれて細胞表層に固定され、細胞表層に局在する（例えば、特開２００６－１７４７６７号公報参照）。
　βグルコシダーゼ遺伝子としては、特に限定されないが、例えば、Aspergillus aculeatus由来のβグルコシダーゼ遺伝子（Murai et al., Appl. Environ. Microbiol. 64:4857-4861）を挙げることができる。その他にも、βグルコシダーゼ遺伝子としては、Aspergillus oryzae由来のβグルコシダーゼ遺伝子、Clostridium cellulovorans由来のβグルコシダーゼ遺伝子及びSaccharomycopsis fibligera由来のβグルコシダーゼ遺伝子等を利用することができる。
＜組換え酵母の作製＞
　上述したキシロース代謝関連遺伝子を宿主となる酵母ゲノムに導入することにより、本発明に使用できる組換え酵母を作製することができる。宿主として用いることができる酵母としては、特に限定するものではないがCandida Shehatae、Pichia stipitis、Pachysolen tannophilus、Saccharomyces cerevisiae及びSchizosaccaromyces pombeなどの酵母が挙げられ、特にSaccharomyces cerevisiaeが好ましい。また、酵母としては、実験面での利便性のために使われる実験株でも良いし、実用面での有用性のために使われている工業株（実用株）でも良い。工業株としては、例えば、ワイン、清酒や焼酎作りに用いられる酵母株を挙げることができる。
　また、宿主となる酵母としては、ホモタリック性を有する酵母を使用することが好ましい。特開２００９－３４０３６号公報に開示される手法によれば、ホモタリック性を有する酵母を利用することで、簡便にゲノムへの多コピー遺伝子導入が可能となる。ホモタリック性を有する酵母とは、ホモタリックな酵母と同義である。ホモタリック性を有する酵母としては、特に限定されず、如何なる酵母をも使用することができる。ホモタリック性を有する酵母としては、Saccharomyces cerevisiae OC-2株（NBRC2260）を挙げることができるが、これに限定されるものではない。その他にもホモタリック性を有する酵母としては、アルコール酵母（台研396号、NBRC0216）（出典：「アルコール酵母の諸特性」酒研会報、No37、p18-22(1998.8)）、ブラジルと沖縄で分離したエタノール生産酵母（出典：「ブラジルと沖縄で分離したSaccharomyces cerevisiae野生株の遺伝学的性質」日本農芸化学会誌、Vol.65、No.4、p759-762(1991.4)）及び180（出典「アルコール発酵力の強い酵母のスクリーニング」日本醸造協会誌、Vol.82、No.6、p439-443(1987.6)）を挙げることができる。また、ヘテロタリックな表現型を示す酵母においても、HO遺伝子を発現可能に導入することによってホモタリック性を有する酵母として使用することができる。すなわち、本発明において、ホモタリック性を有する酵母とは、HO遺伝子を発現可能に導入された酵母も含む意味である。
　なかでも、Saccharomyces cerevisiae OC-2株は、従来ワイン醸造の場面で利用されてきた安全性を確認されている菌株であるため好ましい。また、Saccharomyces cerevisiae OC-2株は、後述する実施例で示したように、高糖濃度の条件下におけるプロモーター活性が優れた菌株であるため好ましい。特にSaccharomyces cerevisiae OC-2株は、高糖濃度条件においてピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子（PDC1）のプロモーター活性が優れているため好ましい。
　また、導入する遺伝子のプロモーターとしては、特に限定されないが、例えばグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（TDH3）のプロモーター、3-ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（PGK1）のプロモーター、高浸透圧応答７遺伝子（HOR7）のプロモーターなどが利用可能である。なかでもピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子（PDC1）のプロモーターが下流の目的遺伝子を高発現させる能力が高いために好ましい。
　すなわち、上述した遺伝子は、発現を制御するプロモーターやその他の発現制御領域とともに酵母のゲノムに導入してもよい。または、上述した遺伝子は、宿主となる酵母のゲノムに本来的に存在する遺伝子のプロモーターやその他の発現制御領域により発現制御されるように導入してもよい。
　また、上述した遺伝子を導入する方法としては、酵母の形質転換方法として知られている従来公知のいかなる手法をも適用することができる。具体的には、例えば、例えば、エレクトロポレーション法“Meth. Enzym., 194, p182 (1990)”、スフェロプラスト法“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929(1978)”、酢酸リチウム法“J.Bacteriology, 153, p163(1983)”、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978)、Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manualなどに記載の方法で実施可能であるが、これに限定されない。
＜エタノール製造＞
　以上で説明した組換え酵母を使用してエタノールを製造する際には、キシロース含有培地にてエタノール発酵培養を行う前に、当該組換え酵母を酢酸含有溶液に接触させる処理を行う。ここで、酢酸含有溶液は、酢酸水溶液、酢酸を含有する液体培地のいずれでも良い。酢酸水溶液は、酢酸を水に溶解することでして得られる。また、酢酸を含有する液体培地は、SD培地、YPD培地、YPAD培地、YM培地といった酵母用の培地に酢酸を添加することで調整できる。ここで、酢酸含有溶液に含まれる酢酸濃度は、特に限定されないが、例えば１～２０g/l、好ましくは２～１０g/l、より好ましくは３～５g/lである。酢酸含有溶液に含まれる酢酸濃度が上記範囲を下回る場合、上記組換え酵母におけるキシロース代謝能を顕著に向上できない虞がある。また、酢酸含有溶液に含まれる酢酸濃度が上記範囲を上回る場合、上記組換え酵母の生育を阻害する虞がある。
　また、組換え酵母を酢酸含有溶液に接触させる処理は、特に限定されないが、例えば１時間以上、好ましくは３時間以上、より好ましくは１０時間以上とする。組換え酵母と酢酸含有溶液との接触時間が上記範囲を下回る場合、上記組換え酵母におけるキシロース代謝能を顕著に向上できない虞がある。
　さらに、組換え酵母を酢酸含有溶液に接触させる処理は、酢酸含有溶液に組換え酵母を投入した状態で撹拌しても良いし、振盪しても良い。また、組換え酵母を酢酸含有溶液に接触させる際、溶液温度を例えば２０～４０℃、好ましくは２５～３７℃、より好ましくは２８～３５℃とする。
　特に、組換え酵母を酢酸含有溶液に接触させる処理は、酢酸含有溶液として酢酸を含有する液体培地を使用し、好気条件下で行うことが好ましい。この場合、組換え酵母が酢酸含有溶液に接触することでキシロース代謝能が向上すると共に、増殖によりエタノール発酵に適した菌体量を確保することができる。
　酢酸含有溶液に組換え酵母を接触させた後、当該組換え酵母を酢酸含有溶液から回収し、キシロース含有培地にてエタノール発酵を行う。組換え酵母を酢酸含有溶液から回収する際には、特に限定されず、例えば遠心分離やろ過といった手法を適用することができる。組換え酵母を酢酸含有溶液から回収する際には、酢酸含有溶液を極力除去することが望ましい。エタノール発酵に使用するキシロース含有培地への酢酸含有溶液の持ち込みによる、組換え酵母の生育阻害、組換え酵母によるエタノール生産阻害を防止するためである。換言すると、組換え酵母の生育阻害、組換え酵母によるエタノール生産阻害が僅少であり、エタノール生産効率の観点から許容できる場合、所定量の酢酸含有溶液がキシロース含有培地に持ち込まれても構わない。なお、当該組換え酵母を酢酸含有溶液から回収した後、酢酸含有溶液を除去するために組換え酵母を洗浄する処理を行っても良い。
　エタノール発酵を行うキシロース含有培地とは、炭素源として少なくともキシロースを含有していれば良く、グルコース等の他の炭素源が含まれている培地であっても良い。また、エタノール発酵に利用する培地は、セルロース系バイオマスを糖化処理した後の糖化液を添加したものを使用することができる。この場合、糖化液には、セルロース系バイオマスに含まれるヘミセルロースに由来するキシロースが含まれる。
　一方、エタノール発酵に利用する培地としては、セルロース系バイオマスを含む培地であっても良い。この場合、上記組換え酵母によるエタノール発酵は、いわゆる同時糖化発酵処理となる。ここで、同時糖化発酵処理とは、セルロース系バイオマスを糖化する工程とエタノール発酵工程とを区別せずに同時に実施する処理を意味する。なお、同時糖化発酵処理に先立って、セルロース系バイオマスに対して従来公知の前処理を施しても良い。前処理としては、特に限定されないが、例えば、リグニンを微生物によって分解する処理や、セルロース系バイオマスの粉砕処理等を挙げることができる。
　いずれの培地を使用する場合でも、当該組換え酵母は、培地に含まれるキシロースを資化してエタノールを生成することができる。なお、糖化方法としては、特に限定されないが、セルラーゼやヘミセルラーゼ等のセルラーゼ製剤を利用する酵素法等を挙げることができる。セルラーゼ製剤は、セルロース鎖及びヘミセルロース鎖の分解に関与する複数の酵素を含んでおり、エンドグルカナーゼ活性、エンドキシラナーゼ活性、セロビオヒドロラーゼ活性、グルコシダーゼ活性及びキシロシダーゼ活性等の複数の活性を示す。セルラーゼ製剤としては、特に限定されないが、例えば、Trichoderma reeseiや、Acremonium cellulolyticusなどが生産するセルラーゼを挙げることができる。セルラーゼ製剤としては、市販されているものを使用しても良い。
　同時糖化発酵処理では、セルロース系バイオマス（前処理後であってもよい）を含む培地にセルラーゼ製剤と上述した組換え微生物とを加え、所定の温度範囲で当該組換え酵母を培養する。培養温度としては特に限定されないが、エタノール発酵の効率を考慮して25～45℃とすることができ、30～40℃とすることが好ましい。また、培養液のpHを4～6とすることが好ましい。また、培養に際して、攪拌や振とうしてもよい。
　本発明に係る組換え酵母を利用したエタノールの製造方法では、エタノール発酵の後、培地からエタノールを回収する。エタノールの回収方法は、特に限定されず、従来公知のいかなる方法も適用することができる。例えば、上述したエタノール発酵が終了した後、固液分離操作によってエタノールを含む液層と、組換え酵母や固形成分を含有する固層とを分離する。その後、液層に含まれるエタノールを蒸留法によって分離・精製することで、純度の高いエタノールを回収することができる。なお、エタノールの精製度は、エタノールの使用目的にあわせて適宜調整することができる。
　以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
　本実施例では、キシロース資化酵母の作製のため、2倍体酵母のOC2-T株(Saitoh, S.ら、J. Ferment. Bioeng. 1996年、81巻、98-103頁)のGRE3を1コピー破壊して、XYL1、XYL2及びXKS1遺伝子を導入した。
XYL1、XYL2、XKS1遺伝子過剰発現・GRE3遺伝子破壊用DNA断片の作成
　酵母BY4742株（Open Biosystems）のゲノムDNAを鋳型として、GRE3遺伝子とその5’上流・3’下流非翻訳領域とを含むDNA断片をPCRで増幅した。PCR用プライマーはそれぞれTB2358（5'-TGGGAATATTACCGCTCGAAG-3'：配列番号１）とTB2359（5'-AAGGGGGAAGGTGTGGAATC-3'：配列番号２）を使用した。なお、酵母BY4742株のDNA配列増幅ためのPCRプライマー設計は、Saccharomyces Genome DatabaseのDNA配列データを参考にした。プラスミドpUC19を鋳型として、pUC19のマルチクローニングサイトで切断されるようなpUC19全長を含む直鎖状DNA断片をPCRで増幅した。PCR用プライマーはそれぞれTB2373（5'-CACACCTTCCCCCTTGATCCTCTAGAGTCGACC-3'：配列番号３）とTB2374（5'-GCGGTAATATTCCCAGATCCCCGGGTACCGAGCTC-3'：配列番号４）を使用した。上記二つのDNA断片をIn-FusionTM Advantage PCR Cloning Kit(タカラバイオ)を用いてクローニングし、pUC19-5U_GRE3-GRE3-3U_GRE3と命名した。
　pUC19-5U_GRE3-GRE3-3U_GRE3を鋳型として、GRE3遺伝子の5’上流・3’下流非翻訳領域とpUC19を含む領域のDNA断片と、酵母BY4742株のゲノムDNAを鋳型として、TEF1プロモーター領域を含むDNA断片、XKS1遺伝子、HIS3ターミネーター領域を含むDNA断片をPCRで増幅した。PCR用プライマーはそれぞれTB3018（5'-AACGAGGCGCGCTCTTCCAGCCAGTAAAATCCA-3'：配列番号５）とTB3017（5'-GCTATGGTGTGTGGGCTTTAAAAAATTTCCAATTTTCCTTTACG-3'：配列番号６）、TB2210（5'-CCCACACACCATAGCTTCAAAATG-3'：配列番号７）とTB2269（5'-TCTTTAGATTAGATTGCTATGCTTTCTTTCTAATGAGCAAG-3'：配列番号８）、TB2345（5'-AATCTAATCTAAAGAATGTTGTGTTCAGTAATTCAGAGAC-3'：配列番号９）とTB2346（5'-CTGCGGCCGGCCGCATTAGATGAGAGTCTTTTCCAGTTC-3'：配列番号１０）、TB1401（5'-TGCGGCCGGCCGCAGC-3'：配列番号１１）とTB2683（5'-GCGCCTCGTTCAGAATGA-3'：配列番号１２）を使用した。上記四つのDNA断片をIn-FusionTM Advantage PCR Cloning Kitを用いてクローニングし、pUC19-5U_GRE3-P_TEF1-XKS1-T_HIS3-3U_GRE3と命名した。
　pUC19-5U_GRE3-P_TEF1-XKS1-T_HIS3-3U_GRE3を鋳型として、HIS3ターミネーター領域と、GRE3遺伝子の3’下流非翻訳領域の間で切断したようなプラスミド全長を含む直鎖状DNA断片と、酵母BY4742株のゲノムDNAを鋳型として、TDH2プロモーター領域を含むDNA断片と、ILV3ターミネーター領域を含むDNA断片、ピキア・スチピチスのゲノムDNAを鋳型としてXYL1遺伝子をPCRで増幅した。PCR用プライマーはそれぞれTB9020（5'-TCCAGCCAGTAAAATCCATAC-3'：配列番号１３）とTB2457（5'-CCGTCAAGAGAGCGCGCCTCGTTCAG-3'：配列番号１４）、TB2844（5'-GCGCTCTCTTGACGGGTATTCTGAGCATCTTAC-3'：配列番号１５）とTB2595（5'-TTTGTTTTGTTTGTTTGTGTGATGAATTTAATTTG-3'：配列番号１６）、TB2314（5'-AACAAACAAAACAAAATGCCTTCTATTAAGTTGAAC-3'：配列番号１７）とTB2455（5'-GGGGCCTATAATGCATTAGACGAAGATAGGAATCTTG-3'：配列番号１８）、TB2456（5'-AACAAACAAAACAAAATGCCTTCTATTAAGTTGAAC-3'：配列番号１９）とTB3019（5'-ATTTTACTGGCTGGAATTTCGTAGATTATAATTAAGGCGAC-3'：配列番号２０）を使用した。なお、XYL1遺伝子配列増幅のためのPCRプライマー設計は、GeneBankに登録されているピキア・スチピチスXYL1遺伝子（登録番号XM_001385144）を参考にした。上記四つのDNA断片をIn-FusionTM Advantage PCR Cloning Kitを用いてクローニングし、pUC19-5U_GRE3-P_TEF1-XKS1-T_HIS3-P_TDH2-XYL1-T_ILV3-3U_GRE3と命名した。
　pUC19-5U_GRE3-P_TEF1-XKS1-T_HIS3-P_TDH2-XYL1-T_ILV3-3U_GRE3を鋳型として、ILV3ターミネーター領域と、GRE3遺伝子の3’下流非翻訳領域の間で切断したようなプラスミド全長を含む直鎖状DNA断片と、酵母BY4742株のゲノムDNAを鋳型として、PDC1プロモーター領域を含むDNA断片とILV6ターミネーター領域を含むDNA断片、ピキア・スチピチスのゲノムDNAを鋳型として、XYL2遺伝子をPCRで増幅した。PCR用プライマーはそれぞれTB2375（5'-AGTTGCTTGACACGGTGGAAGAAGGTCCAGCCAGTAAAATCCATA-3'：配列番号２１）とTB3021（5'-ATTTCGTAGATTATAATTAAGGCGAC-3'：配列番号２２）、TB2010（5'-TTTGATTGATTTGACTGTGTTATTTTGC-3'：配列番号２３）とTB2261（5'-CCGTGTCAAGCAACTATGGG-3'：配列番号２４）、TB3022（5'-TATAATCTACGAAATTAATAAGAAAGGTGACCGTG-3'：配列番号２５）とTB2347（5'-GTTAGTCTCTCGGCCTTGCG-3'：配列番号２６）、TB2351（5'-GGCCGAGAGACTAACTTACTCAGGGCCGTCAAT-3'：配列番号２７）とTB2352（5'-GTCAAATCAATCAAAATGACTGCTAACCCTTCC-3'：配列番号２８）を使用した。なお、XYL2遺伝子配列増幅のためのPCRプライマー設計は、GeneBankに登録されているピキア・スチピチスXYL2遺伝子（登録番号AF127801もしくはX55392）を参考にした。上記四つのDNA断片をIn-FusionTM Advantage PCR Cloning Kitを用いてクローニングし、pUC19-5U_GRE3-P_TEF1-XKS1-T_HIS3-P_TDH2-XYL1-T_ILV3-ILV6_T-XYL2-PDC1_P-3U_GRE3と命名した。
　pUC19-5U_GRE3-P_TEF1-XKS1-T_HIS3-P_TDH2-XYL1-T_ILV3-ILV6_T-XYL2-PDC1_P-3U_GRE3を鋳型とし、GRE3遺伝子の5’上流非翻訳領域からGRE3遺伝子の3’下流非翻訳領域までのDNA断片をPCRで増幅し、本断片（図１）をXYL1、XYL2、XKS1遺伝子過剰発現・GRE3遺伝子破壊株作成に用いた。
XYL1、XYL2、XKS1遺伝子過剰発現・GRE3遺伝子へテロ破壊株作製
　XYL1、XYL2、XKS1遺伝子過剰発現・GRE3遺伝子破壊用DNA断片を用いて、OC2-T株をFrozen-EZ Yeast Transformation IIキット（ZYMO RESEARCH）を用いて、キット添付のプロトコールに従い、形質転換した。形質転換後、キシロースを単独炭素源としたプレートにまいて、30℃で7日間培養し、形質転換体を得た。形質転換体よりゲノムDNAを調製し、PCR法により挿入DNA断片の外側とベクター内側のプライマーであるTB2356（5'-TGGGGCTAAACGAGATTTGG-3'：配列番号２９）とTB592（5'-GAAATTTAGTATGCTGTGCTTGGG-3'：配列番号３０）を用いて、染色体に正常に1コピー組込まれていることを確認した。
発酵試験
　得られた形質転換体についてYPD培地（イーストエキストラクト 10g/L、ペプトン 20g/Lグルコース20g/L）もしくは、YPD酢酸培地（イーストエキストラクト 10g/L、ペプトン 20g/Lグルコース20g/L、酢酸1～5g/L；　アンモニアでｐH5に調整）に植菌し、30℃で24時間震盪培養を行った。培養終了後、遠心分離（2000ｇ、3分）により菌体を回収した。
　キシロース培地（キシロース60g/L、イーストエキス10g/L）、グルコース/キシロース培地（グルコース90g/L、キシロース60g/L、イーストエキス10g/L）もしくは、グルコース培地（グルコース90g/L、イーストエキス10g/L）50mlを50ml容のフラスコに入れ、菌体濃度が菌体乾燥重量0.3g/lになるように植菌し、80rpm/分（震とう幅35mm）で34℃48時間発酵を行い、HPLC（LC-10A；島津製作所）でエタノールおよびキシロースの濃度を測定した。測定条件について、カラムはAminexHPX-87H（バイオラッド）、検出器は示差屈折率検出器RID-10A（島津製作所）を使用し、移動相0.01NのH2SO4、流量0.6ml/min、温度30℃で分析した。
　エタノール濃度の分析結果を図２に示す。図２に示すように、発酵試験の結果、キシロース培地では、酢酸無処理区と比較して培養液に酢酸3g/L以上添加した処理区について、エタノール生産速度が向上していることが明らかとなった。一方、グルコース培地では、エタノール生産速度の違いがなかった。
　キシロース濃度の分析結果を図３に示す。図３に示すように、グルコース/キシロース培地を使用した場合、キシロースの消費速度が酢酸3g/L以上添加した処理区で向上したものの、グルコースの消費量についてはコントロールと差異がなかった。
　以上の結果より、エタノール発酵工程に先立って、キシロース代謝能を有する組換え酵母を酢酸含有溶液（本実施例では酢酸を含有する液体培地）に接触させることで、当該組換え酵母におけるキシロース代謝能が大幅に向上することが明らかとなった。また、キシロース代謝能を有する組換え酵母を酢酸含有溶液に接触させても、当該組換え酵母が有するグルコース代謝能は大きく改善することはなかった。このことより、キシロース代謝能を有する組換え酵母を酢酸含有溶液に接触させた場合、当該組換え酵母における炭素源資化能力のうち、キシロース代謝能を特異的に改善できることが明らかとなった。

Claims (5)

  1. 　キシロース代謝能を有する酵母を酢酸含有溶液に接触させる工程と、その後、キシロース含有培地にて当該酵母を培養してエタノール発酵を行う工程とを有するエタノールの製造方法。
  2. 　上記酵母は、キシロース代謝関連遺伝子が導入された組換え酵母であることを特徴とする請求項１記載のエタノールの製造方法。
  3. 　上記キシロース代謝関連遺伝子は、キシロースリダクターゼ遺伝子、キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子及びキシルロキナーゼ遺伝子であることを特徴とする請求項２記載のエタノールの製造方法。
  4. 　上記酵母を酢酸含有溶液に接触させる際、好気条件とすることを特徴とする請求項１記載のエタノールの製造方法。
  5. 　上記酢酸含有溶液は、酵母用培地に酢酸を添加した組成であることを特徴とする請求項１記載のエタノールの製造方法。
PCT/JP2010/070076 2010-11-11 2010-11-11 組換え酵母を用いたエタノールの製造方法 WO2012063344A1 (ja)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CA2819315A CA2819315C (en) 2010-11-11 2010-11-11 Method for producing ethanol using recombinant yeast strain
JP2012542764A JP5590140B2 (ja) 2010-11-11 2010-11-11 組換え酵母を用いたエタノールの製造方法
US13/883,670 US8859248B2 (en) 2010-11-11 2010-11-11 Method for producing ethanol using recombinant yeast strain
CN201080069741.5A CN103180451B (zh) 2010-11-11 2010-11-11 使用重组酵母的乙醇的制造方法
BR112013011473-8A BR112013011473B1 (pt) 2010-11-11 2010-11-11 Processo para produção de etanol usando linhagem de levedura recombinante
PCT/JP2010/070076 WO2012063344A1 (ja) 2010-11-11 2010-11-11 組換え酵母を用いたエタノールの製造方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP2010/070076 WO2012063344A1 (ja) 2010-11-11 2010-11-11 組換え酵母を用いたエタノールの製造方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012063344A1 true WO2012063344A1 (ja) 2012-05-18

Family

ID=46050525

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2010/070076 WO2012063344A1 (ja) 2010-11-11 2010-11-11 組換え酵母を用いたエタノールの製造方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US8859248B2 (ja)
JP (1) JP5590140B2 (ja)
CN (1) CN103180451B (ja)
BR (1) BR112013011473B1 (ja)
CA (1) CA2819315C (ja)
WO (1) WO2012063344A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015042145A (ja) * 2013-08-26 2015-03-05 王子ホールディングス株式会社 エタノールの製造方法
JP2015521043A (ja) * 2012-06-01 2015-07-27 ルサッフル・エ・コンパニーＬｅｓａｆｆｒｅ Ｅｔ Ｃｏｍｐａｇｎｉｅ キシロースを代謝でき、阻害因子に耐性がある酵母菌株、その酵母菌株を得るための方法およびその使用

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6879111B2 (ja) * 2017-08-02 2021-06-02 トヨタ自動車株式会社 組換え酵母及びこれを用いたエタノールの製造方法
CN108823112B (zh) * 2018-06-15 2023-11-17 首都师范大学 定向优化木糖代谢途径提高乙醇产量的方法及工程酿酒酵母

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009195220A (ja) * 2008-01-24 2009-09-03 National Institute Of Advanced Industrial & Technology キシロース発酵能が優れた六炭糖・五炭糖同時発酵酵母およびそれを用いたエタノールの高効率生産方法
JP2010239925A (ja) * 2009-04-08 2010-10-28 Toyota Central R&D Labs Inc キシロースを利用して有用物質を生産する方法

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5866382A (en) * 1990-04-06 1999-02-02 Xyrofin Oy Xylose utilization by recombinant yeasts
DE60325457D1 (de) * 2002-01-23 2009-02-05 Royal Nedalco B V Fermentation von pentosezuckern
US7253001B2 (en) * 2002-03-19 2007-08-07 Forskarpatent I Syd Ab Metabolic engineering for improved xylose utilisation of Saccharomyces cerevisiae
WO2004085627A1 (en) * 2003-03-26 2004-10-07 Forskarpatent I Syd Ab New saccharomyces cerevisiae strains utilizing xylose
PL1626979T3 (pl) * 2003-05-02 2012-09-28 Cargill Inc Genetycznie modyfikowane gatunki drożdży i sposoby fermentacji z użyciem genetycznie modyfikowanych drożdży
DE102007030689C5 (de) * 2007-06-30 2015-03-19 Porextherm-Dämmstoffe Gmbh Vakuum-Isolations-Paneel und Verfahren zu dessen Herstellung
WO2009109630A1 (en) * 2008-03-07 2009-09-11 Dsm Ip Assets B.V. A pentose sugar fermenting cell
US8440449B2 (en) * 2008-09-30 2013-05-14 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Transformed Saccharomyces cerevisiae engineered for xylose utilization
US8728781B2 (en) * 2009-03-13 2014-05-20 University Of Washington Through Its Center Of Commercialization Endophytic yeast strains, methods for ethanol and xylitol production, methods for biological nitrogen fixation, and a genetic source for improvement of industrial strains
JP5804327B2 (ja) * 2009-11-30 2015-11-04 国立大学法人神戸大学 バイオマスからのエタノールの生産方法
WO2011071204A2 (ko) * 2009-12-12 2011-06-16 서울대학교 산학협력단 Nadh 및 nad+의 사용이 커플링된 재조합 사카로마이세스 세레비지애를 이용하여 자일로오스로부터 에탄올을 생산하는 방법
US20110262983A1 (en) * 2010-03-31 2011-10-27 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Metabolically engineered yeasts for the production of ethanol and other products from xylose and cellobiose
CA2798937A1 (en) * 2010-05-28 2011-12-01 Codexis, Inc. Pentose fermentation by a recombinant microorganism

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009195220A (ja) * 2008-01-24 2009-09-03 National Institute Of Advanced Industrial & Technology キシロース発酵能が優れた六炭糖・五炭糖同時発酵酵母およびそれを用いたエタノールの高効率生産方法
JP2010239925A (ja) * 2009-04-08 2010-10-28 Toyota Central R&D Labs Inc キシロースを利用して有用物質を生産する方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BELLISSIMI, E. ET AL.: "Effects of acetic acid on the kinetics of xylose fermentation by an engineered, xylose-isomerase-based Saccharomyces cerevisiae strain", FEMS YEAST RES., vol. 9, 2009, pages 358 - 364 *
HELLE, S. ET AL.: "Effect of inhibitory compounds found in biomass hydrolysates on growth and xylose fermentation by a genetically engineered strain of S. cerevisiae", ENZYME AND MICROBIAL TECHNOLOGY, vol. 33, 2003, pages 786 - 792 *
MOHANDAS, D.V. ET AL.: "Development of Xylose- Fermenting Yeasts for Ethanol Production at High Acetic Acid Concentrations", APPLIED BIOCHEMISTRY AND BIOTECHNOLOGY, vol. 51, no. 52, 1995, pages 307 - 318 *
SOUTO-MAIOR, A. M. ET AL.: "Crabtree-negative charasteristics of recombinant xylose- utilizing Saccharomyces cerevisiae", JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY, vol. 143, 2009, pages 119 - 123 *
TRAFF-BJERRE, K. L. ET AL.: "Endogenous NADPH- dependent aldose reductase activity influences product formation during xylose consumption in recombinant Saccharomyces cerevisiae", YEAST, vol. 21, 2004, pages 141 - 150 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015521043A (ja) * 2012-06-01 2015-07-27 ルサッフル・エ・コンパニーＬｅｓａｆｆｒｅ Ｅｔ Ｃｏｍｐａｇｎｉｅ キシロースを代謝でき、阻害因子に耐性がある酵母菌株、その酵母菌株を得るための方法およびその使用
JP2015042145A (ja) * 2013-08-26 2015-03-05 王子ホールディングス株式会社 エタノールの製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
BR112013011473B1 (pt) 2022-08-09
BR112013011473A2 (pt) 2021-08-24
JPWO2012063344A1 (ja) 2014-05-12
CN103180451B (zh) 2014-12-31
CN103180451A (zh) 2013-06-26
CA2819315A1 (en) 2012-05-18
CA2819315C (en) 2015-11-03
US20130224815A1 (en) 2013-08-29
US8859248B2 (en) 2014-10-14
JP5590140B2 (ja) 2014-09-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6087854B2 (ja) 組換え酵母を用いたエタノールの製造方法
JP5817836B2 (ja) 組換え酵母を用いたエタノールの製造方法
JP5590140B2 (ja) 組換え酵母を用いたエタノールの製造方法
US10745684B2 (en) Recombinant yeast and a method for producing ethanol using the same
US10017788B2 (en) Recombinant yeast and method for producing ethanol using the same
JP6447583B2 (ja) 組換え酵母、及びそれを用いたエタノールの製造方法
WO2014021163A1 (ja) 組換え酵母を用いたエタノールの製造方法
WO2020032233A1 (ja) 組換え酵母、及びそれを用いたエタノールの製造方法
CA3020447A1 (en) Recombinant yeast and method for producing ethanol using the same
US11193113B2 (en) Transgenic yeast and method for producing ethanol using the same
US20220073896A1 (en) Recombinant yeast and method for producing ethanol using same

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 10859554

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

DPE1 Request for preliminary examination filed after expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2012542764

Country of ref document: JP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2819315

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13883670

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 10859554

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112013011473

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112013011473

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20130509