CN1875099B

CN1875099B - 颗粒淀粉水解酶在木霉菌中的表达和从颗粒淀粉底物产生葡萄糖的方法

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Publication number: CN1875099B
Application number: CN2004800323750A
Authority: CN
Inventors: T·L·鲍德文; B·S·鲍尔; G·K·肖塔尼; N·邓恩－科勒曼; Jr·O·兰特罗; S·E·兰茨; M·J·佩珀森; J·K·谢蒂; B·A·斯托姆
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 2003-11-21
Filing date: 2004-11-18
Publication date: 2011-05-04
Anticipated expiration: 2024-11-18
Also published as: US20050136525A1; WO2005052148A3; DK1685244T3; US8679815B2; AU2004293789A1; CN1875099A; ATE550424T1; AU2009203191A1; BRPI0416762A; CN102174490B; US7335503B2; US20130122569A1; US8034590B2; AU2009203191B2; EP1698692A2; US9382563B2; EP1698692A3; US7262041B2; EP1685244A2; US20050208623A1

Abstract

本发明涉及丝状真菌宿主细胞，尤其是用于产生具有葡糖淀粉酶活性的异源颗粒淀粉水解酶(GSHE)的木霉菌宿主细胞。进一步，本发明涉及用于产生葡萄糖糖浆的方法，所述方法包括使用α淀粉酶和GSHE，在等于或低于颗粒淀粉的胶凝化温度的温度，同时接触从颗粒淀粉底物获得的颗粒淀粉浆，以得到葡萄糖糖浆的组合物。

Description

颗粒淀粉水解酶在木霉菌中的表达和从颗粒淀粉底物产生葡萄糖的方法

本申请要求如下专利申请的优先权：美国临时专利申请序列号60/524,279，于2003年11月21日提交，题目为Expression of Granular Starch Hydrolyzing Enzymein Trichoderma；美国临时专利申请序列号60/531,953，于2003年12月22日提交，题目为Enzyme Compositions for Glucose Feed from Granular Starch Substrates；以及美国临时专利申请序列号60/566,358，于2004年4月28日提交，题目为颗Expression of Granular Starch Hydrolyzing Enzyme in Trichoderma。

技术领域

本发明涉及丝状真菌宿主细胞，其可用于具有葡糖淀粉酶活性的异源颗粒淀粉水解酶(GSHE)的表达。本发明进一步涉及GSHE在由颗粒淀粉底物产生葡萄糖糖浆和其它终产物的方法中的用途，所述方法包括在颗粒淀粉的胶凝化温度(gelatinization temperature)或者低于该温度的温度，同时用淀粉液化淀粉酶(starchliquefying amylase)和GSHE接触颗粒淀粉底物。本发明进一步涉及包括GSHE和淀粉液化淀粉酶的酶组合物。

背景技术

工业发酵主要使用葡萄糖作为产生各种蛋白质、酶、氨基酸、醇、有机酸、药物和其它化学品的原料。在许多应用中，葡萄糖是从碳底物如生物材料(biomass)和淀粉的酶促转化产生的。淀粉在绿色植物中很丰富，以显微颗粒累积，直径在0.5到175微米之间变化。这些淀粉颗粒的部分结晶性质使得其在冷水中具有不溶解性。结果，淀粉颗粒在水中的溶解需要大量的热能，以破坏颗粒的结晶结构，这导致部分地水解的淀粉的溶解。各种增溶方法已经被使用，这些方法包括直接和间接的加热体系，如通过蒸气注入(stream injection)的直接加热。(参见例如STARCH CHEMISTRY AND TECHNOLOGY，由R.L.Whistler等人编著，第二版，1984 Academic Press Inc.，Orlando，FL；STARCH CONVERSION TECHNOLOYGY，由G.M.A.Van Beynum等人编著，Food Science and Technology Series，Marcel DekkerInc.，NY；以及THE ALCOHOL TEXTBOOK，第三版，由K.Jacques，T.P.Lyons和D.R.Kelsall编著，1999，Nottingham University Press，UK)。

一般地，为了将淀粉水解为葡萄糖，使用两个酶步骤。第一个步骤是液化步骤，第二个步骤是糖化步骤。在液化步骤中，在存在已经加入的钙的情况下，使不可溶的淀粉颗粒在水中成为浆状物，通过加热使其凝胶化，通过热稳定α淀粉酶(EC 3.2.1.1，α-(1-4)-葡聚糖葡聚糖水解酶)进行水解，产生糊精醪液(a mash ofdextrins)。所得到的醪液通常冷却到大约60-65℃。在糖化步骤中，可溶的糊精(糖)通过具有葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3，α-(1-4)-葡聚糖葡糖水解酶)活性的酶被进一步水解为右旋糖(葡萄糖)。然后葡萄糖可以被用作最终产品或用作前体，被转化为其它在商业上重要的期望的最终产品，如果糖、山梨糖醇、醇、乳酸、抗坏血酸(ASA)中间产物和1，3-丙二醇。

在20世纪50年代晚期，来源于黑曲霉(Aspergillus niger)的葡糖淀粉酶就已经商业化，这些酶显著地改进了淀粉到葡萄糖的转化。另一个重要的改进发生在20世纪70年代。从地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)得到了一种热稳定的α淀粉酶，并且已经商业化，该热稳定的α淀粉酶具有改进的热稳定性、pH稳定性和较低的钙依赖性(USP 3,912,590)。

进一步的工业工艺已经为淀粉甜味剂行业采纳，用于酶液化过程(USP5,322,778)。这些工艺中的一些工艺包括，具有较低蒸气需求的低温工艺(105-110℃，5-8分钟)，和高温工艺(148℃+/-5℃，5-8秒)，该工艺改进了淀粉颗粒的胶凝化作用，从而导致改进的过滤特性以及液化淀粉底物的品质(Shetty等人，(1988)Cereal Foods World 33：929-934)。

尽管酶淀粉液化过程已经很好地被建立，但在产量损失、加工成本、能量消耗、pH调节、温度阈值、钙需求以及回生淀粉(retrograded amylase)水平方面的改进将是被期望的。尤其是，已知液化步骤残余的α淀粉酶，在糖化条件下，对工艺效率具有负面影响，并且残余的α淀粉酶在通过葡糖淀粉酶进行糖化之前必须被灭活。灭活通常通过在95℃将液化淀粉的pH降低到pH 4.2到4.5来实现。液化过程的另一个缺点是还原基团的碱性异构化。碱性异构化导致形成一种二糖，即maltulose(4-α-D-吡喃葡萄糖基-D-果糖)的形成。Maltulose降低了葡萄糖的产量，这是由于它对葡糖淀粉酶和α淀粉酶的水解具有抗性。进一步地，很难对在高葡萄糖浓度下由活性葡糖淀粉酶催化的逆转反应产物的形成进行控制。来自黑曲霉的葡糖淀粉酶，在典型的糖化条件下，通常是热稳定的。因此，显著数量的葡糖淀粉酶活性可以保留到糖化反应后。此处讨论的一些问题的解决方案已经由不同研究者提出建议。

例如，Leach等人(USP 4,113,509和USP 3,922,196)公开了一种方法，该方法通过用细菌α淀粉酶在低于淀粉胶凝化温度的温度温育颗粒淀粉，将颗粒淀粉(精制的)转化为可溶解的水解产物。然后将β淀粉酶用于水解，以产生高麦芽糖糖浆。

欧洲专利申请0350737 A2公开了一种产生麦芽糖糖浆的方法，该方法通过使用来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的α淀粉酶，在60℃水解来自玉米、小麦、马铃薯和甜薯的颗粒(纯化的)淀粉，没有传统的液化步骤(胶凝化作用之后是高温下的液化)。

以前已经描述了使用葡糖淀粉酶将颗粒(粗)淀粉转化为葡萄糖的多步骤工艺，该葡糖淀粉酶显示出粗淀粉水解能力(USP 4,618,579)。然而，只有60％的淀粉被水解，这因而导致大量的循环过程。

改进颗粒淀粉转化的传统方法不仅是有利的，而且提供可使得由此所使用的酶的表达和产量增加的方法将是被期望的。例如，具有颗粒淀粉水解活性的葡糖淀粉酶——其具有改进的特性如增加的比活性、不同的pH范围和/或不同的糖基化水平，对于在工业淀粉转化中的应用可能是特别有利的。本发明不仅满足这些需求中的一些需求，而且导致了通过淀粉水解获得的各种最终产品的生产效率有所增加。

发明概述

本发明的一个实施方案涉及一种一步骤工艺，其用于将颗粒淀粉转化为葡萄糖，这是通过在颗粒淀粉底物的胶凝化温度或低于该温度的温度水解颗粒淀粉，同时用内切作用的(endo-acting)α淀粉酶和具有葡糖淀粉酶活性的糖化酶——更特别地是具有颗粒淀粉水解活性的糖化酶，接触未胶凝化的淀粉底物来实现。

相对于现有技术工艺，本发明在以下方面中的至少一个方面有益处和改进：a)α淀粉酶和具有颗粒淀粉水解活性的葡糖淀粉酶在糖化作用中都有活性；b)淀粉底物以颗粒形式被使用，并且淀粉被水解；c)颗粒淀粉的溶解和糖化使用单一pH；d)相对于使用液化的淀粉底物的目前的糖化时间，使用颗粒淀粉的糖化时间要更短；e)与从液化的淀粉底物获得的葡萄糖糖浆相比，获得了具有降低的高级糖(higher sugar)含量的高葡萄糖糖浆；f)由于maltulose形成而造成的葡萄糖损失被降低；g)Milliard反应被消除或被降至最低程度；h)糖化后由于喷射蒸煮(jetcooking)所致的回生淀粉形成而形成碘阳性淀粉聚合物(Blue-Sac)的风险更低；i)省去了向淀粉浆状物中加入钙；和j)由于水解的淀粉不会堵塞过滤系统，过滤得到了改进。本发明所包括的方法和组合物提供了一种更加经济和有效的手段，来生产用于工业和特种化学品的葡萄糖供给料。

在本发明的一个方面，提供了丝状真菌菌株，其用编码具有葡糖淀粉酶活性的颗粒淀粉水解酶(GSHE)的异源多核苷酸转化。优选的丝状真菌菌株是木霉菌菌株，更特别的是里氏木霉(T.reesei)菌株，其表达GSHE并且将GSHE分泌到培养基中。

在该方面的一些实施方案中，本发明涉及在丝状宿主细胞中产生GSHE的方法，该方法包括用DNA构建物转化丝状真菌宿主细胞，所述DNA构建物包括一个启动子，启动子在该丝状真菌宿主细胞中具有转录活性，并可操作性地连接(operably linked)到编码GSHE的异源多核苷酸上；在合适的培养基中培养转化的丝状真菌宿主细胞，以允许表达GSHE；并产生GSHE。在其它实施方案中，编码GSHE的异源多核苷酸来源于灰腐质霉(Humicola grisea)的菌株或泡盛曲霉 (Aspergillus awamori)的菌株。在一些实施方案中，GSHE与SEQ ID NO：3具有至少90％序列同一性，或者与SEQ ID NO：6具有至少90％同一性。在进一步的实施方案中，回收由重组宿主细胞产生的GSHE。

在第二个方面，本发明包括由重组的里氏木霉(Trichoderma reesei)的培养物所产生的发酵液(fermentation broth)，其中里氏木霉包含编码与SEQ ID NO：3具有至少90％序列同一性或与SEQ ID NO：6具有至少90％序列同一性的GSHE的异源多核苷酸。

在第三个方面，本发明涉及用于由颗粒淀粉底物产生葡萄糖糖浆的一步工艺，所述工艺包括(a)在等于或低于淀粉底物的胶凝化温度的温度，同时用α淀粉酶和具有葡糖淀粉酶活性的颗粒淀粉水解酶(GSHE)接触干固体含量(ds)为10-55％的颗粒淀粉底物浆状物，和(b)允许α淀粉酶和GSHE发挥作用一段足够的时间，以水解颗粒淀粉，得到葡萄糖糖浆。在一个实施方案中，至少95％的颗粒淀粉被水解。在第二个实施方案中，葡萄糖糖浆的产率按重量计是至少90％。在第三个实施方案中，颗粒淀粉底物的干固体含量在大约15到40％之间。在第四个实施方案中，水解颗粒淀粉的时间在大约5小时到100小时的范围内。在第五个实施方案中，α淀粉酶是具有EC 3.2.1.1的酶。在第六个实施方案中，α淀粉酶来源于芽孢杆菌(Bacillus)，尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株。在进一步的实施方案中，α淀粉酶来源于重组的芽孢杆菌菌株。在第七个实施方案中，GSHE是来源于灰腐质霉高温变种(Humicola grisea var.thermoidea)菌株或泡盛曲霉河内变种(Aspergillus awamori var.kawachi)菌株的葡糖淀粉酶。在第八个实施方案中，GSHE是来源于重组的木霉菌菌株的葡糖淀粉酶，尤其是里氏木霉菌株，其表达编码灰腐质霉GSHE或泡盛曲霉河内变种GSHE的异源基因。在第九个实施方案中，该方法进一步包括分离葡萄糖糖浆，尤其是通过过滤进行分离。在第十个实施方案中，来自葡萄糖糖浆的葡萄糖被进一步转化为果糖。在第十一个实施方案中，该一步工艺的温度为大约50到大约70℃。在第十二个实施方案中，该工艺的pH为pH 4.5到6.5。

在第四个方面，本发明涉及用于由颗粒谷物淀粉底物产生葡萄糖糖浆的一步工艺，所述工艺包括(a)在大约55-65℃的温度和大约5.0到6.0的pH，用来源于芽孢杆菌的α淀粉酶和来源于真菌的具有颗粒淀粉水解活性的葡糖淀粉酶，同时接触干固体含量(ds)为25-45％的颗粒淀粉底物浆状物，并且允许α淀粉酶和具有颗粒淀粉水解活性的葡糖淀粉酶作用一段足够的时间，以水解颗粒淀粉，获得葡萄糖糖浆。在一个实施方案中，至少80％的颗粒淀粉被水解，葡萄糖糖浆的产率按重量计是至少90％。在第二个实施方案中，葡糖淀粉酶是来源于重组的里氏木霉的GSHE，其表达编码灰腐质霉GSHE或泡盛曲霉河内变种GSHE的异源多核苷酸。

在第五个方面，本发明涉及水解颗粒淀粉的方法，该方法包括：用α淀粉酶和来源于木霉菌菌株的具有颗粒淀粉水解活性的葡糖淀粉酶，同时接触干固体含量为20-55％的颗粒淀粉浆状物，其中木霉菌菌株包含编码来源于灰腐质霉的GSHE的异源多核苷酸；并且允许α淀粉酶和葡糖淀粉酶作用一段足够的时间，以水解颗粒淀粉。在一个实施方案中，至少90％的颗粒淀粉被水解。在第二个实施方案中，颗粒淀粉是玉米淀粉或小麦淀粉。在第三个实施方案中，GSHE以大约0.5到1.0GSHE单位的Humicola GA/克淀粉的浓度提供给浆状物；α淀粉酶以大约0.1到0.5kg/MT淀粉的浓度提供给浆状物，浆状物的pH被调节到大约pH 4.5到6.0；浆状物的温度被调节到大约55到65℃。

在第六个方面，本发明涉及用于产生葡萄糖糖浆的方法，所述方法包括用α淀粉酶和颗粒淀粉水解酶(GSHE)同时接触颗粒淀粉底物，以得到葡萄糖糖浆，其中GSHE是由丝状真菌菌株分泌的，所述真菌菌株包含异源多核苷酸，其编码来源于腐质霉菌株的GSHE，并且其氨基酸序列与SEQ ID NO：3具有至少90％同一性。在一个实施方案中，葡萄糖被进一步转化为期望的终端产物。

在第七个方面，本发明涉及酶组合物，该酶组合物包括α淀粉酶和具有颗粒淀粉水解活性的葡糖淀粉酶。在一个实施方案中，α淀粉酶来源于芽孢杆菌属某种，GSHE来源于灰腐质霉GSHE。在第二个实施方案中，GSHE来源于木霉菌属菌株，该菌株通过遗传工程被改造，以包含编码灰腐质霉GSHE的多核苷酸。在第三个实施方案中，该组合物的pH介于4.5和6.5之间。在第四个实施方案中，α淀粉酶来源于嗜热脂肪芽孢杆菌菌株。在进一步的实施方案中，该酶组合物中α淀粉酶与GSHE的比率是15∶1到1∶15。

在第八个方面，本发明涉及用于产生高果糖淀粉基糖浆(high fructose starchbased syrup)的工艺，包括将通过本发明所包括的方法获得的葡萄糖糖浆转化为果糖基糖浆。

在第九个方面，本发明涉及产生终端产物(end product)的方法，其中对通过本发明所包括的方法获得的葡萄糖糖浆进行发酵。在该方面的一些实施方案中，终端产物是醇，优选地是乙醇。在该方面的进一步的实施方案中，发酵与接触步骤同时进行，在其它实施方案中，相对于接触步骤，发酵被独立地随后予以进行。在仍然进一步的实施方案中，发酵产物从发酵液中分离出来。

在第十个方面，本发明涉及用于产生残余淀粉(residual starch)的方法，该方法通过分离根据本发明的方法产生的葡萄糖糖浆，并保留包括残余淀粉的组合物来实现。在一个实施方案中，该残余淀粉被用于终端产物的生产。在第二个实施方案中，残余淀粉被循环，与GSHE和α淀粉酶在低于颗粒淀粉的胶凝化温度的温度同时接触。

附图说明

图1提供了基因组DNA序列，其编码具有葡糖淀粉酶活性的天然的灰腐质霉高温变种颗粒淀粉水解酶(GSHE)(SEQ ID NO：1)。推定的内含子是黑体字并且加有下划线。

图2A提供了灰腐质霉高温变种GSHE的信号序列和成熟氨基酸序列(SEQID NO：2)。推定的信号序列内含子是黑体字并且加有下划线。

图2B提供了灰腐质霉高温变种GSHE的成熟氨基酸序列(SEQ ID NO：3)。

图3提供了pTrex3g_N13质粒的示意性说明，其被用于表达编码灰腐质霉GSHE的核酸，并且其含有真菌表达载体侧翼的Xba1位点，其中

a)cbh1启动子是里氏木霉纤维二糖水解酶启动子，

b)H.grisea gla1是编码SEQ ID NO：3的灰腐质霉GSHE的多核苷酸，

c)cbh1终止子是里氏木霉纤维二糖水解酶终止子，和

d)amdS是构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶标记基因。

图4提供了图3的pTrex3g_N13质粒的核苷酸序列(SEQ ID NO：11)(10738bp)。

图5提供了SDS-PAGE凝胶，说明了灰腐质霉高温变种GSHE在一个代表性发酵程序中的表达，用里氏木霉克隆进行，正如实施例1中所描述的。泳道1代表商业来源分子量标记物，SeeBlue(Invitrogen)；泳道2是空白组；泳道3表示在48小时时的rGSHE表达；泳道4表示在56小时时的rGSHE表达；泳道5表示在64小时时的rGSHE表达。

图6提供了编码泡盛曲霉河内变种GSHE的基因组DNA序列(SEQ IDNO：4)。推定的内含子是黑体字并且加有下划线。

图7A提供了泡盛曲霉河内变种GSHE的信号序列和成熟氨基酸序列(SEQID NO：5)。信号序列是黑体字并且加有下划线。

图7B提供了泡盛曲霉河内变种GSHE的成熟氨基酸序列(SEQ ID NO：6)。

图8A和8B示意性说明了pH稳定性，以天然灰腐质霉高温变种GSHE(nGSHE)和在里氏木霉宿主中表达的灰腐质霉高温变种GSHE(RGSHE)(SEQID NO：3)的％残余活性表示，正如实施例1中所描述的。

图9示意性说明了天然的灰腐质霉高温变种GSHE和在重组里氏木霉宿主中表达的灰腐质霉高温变种GSHE对玉米淀粉的水解，在一段时间内进行测量，表示为mg葡萄糖/mg蛋白质，正如实施例1中所描述的。

图10提供了SDS-PAGE凝胶，说明了泡盛曲霉河内变种GSHE在一个代表性发酵程序中的表达，用里氏木霉克隆进行，正如实施例2中所描述的。泳道1代表商业来源的分子量标记物，SeeBlue(Invitrogen)；泳道2描绘在162小时时的rGSHE表达；泳道3是对照组，描绘在162小时时的未转化的里氏木霉宿主。

图11是一般性示意图，该图示意性说明了利用颗粒淀粉底物的低能量葡萄糖生产的本发明工艺的一个实施方案。

图12图示了，在进行本发明的工艺之前，典型的玉米淀粉颗粒的扫描电子显微照片(a)；以及在进行本发明所包含的工艺之后，残余淀粉的扫描电子显微照片(b-d)。

发明详述

在一些方面，本发明依赖于在遗传工程和分子生物学领域所使用的常规技术和方法。下述来源包括了在本发明中有用的一般技术的描述：Sambrook等人，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL(2^nd Ed.，1989)；Kreigler，GENE TRANSFER AND EXPRESSION；A LABORATORY MANUAL(1990)；和Ausubel等人编著，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(1994)。

除非本文另外定义，本文所使用的所有技术和科学术语，具有与本发明所属的技术领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY，2D ED.，JohnWiley and Sons，New York(1994)，和Hale & Markham，THE HAPPER COLLINSDICTIONARY OF BIOLOGY，Harper Perennial，NY(1991)为普通技术人员提供了本发明中所使用的许多术语的一般词义。尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等价的任何方法和材料可以在本发明的实践或实验中使用，但还是描述了优选的方法和材料。

现在，将通过仅仅使用下述定义和实施例的参考方式，对本发明进行详细描述。本文中参考的所有专利和公开文献，包括这些专利和公开文献中所公开的所有序列，都被特别地明确地引入作为参考。

数字范围包括定义该范围的数值在内。

除非另有指明，核酸以5’到3’方向从左到右书写；氨基酸序列以氨基到羧基方向从左到右书写。

本文提供的标题不是对本发明的各个方面或实施方案的限定，通过参考作为整体的说明书，可以得到本发明的各个方面或实施方案。

A.定义

正如此处所用，术语“淀粉”是指由植物的复合多糖碳水化合物构成的任何材料，包括具有式(C₆H₁₀O₅)x的直链淀粉和/或支链淀粉，其中X可以是任何数目。尤其是，该术语指任何基于植物的材料，包括但不限于：谷物、草、块茎和根，更特别地是植物小麦、大麦、玉米、黑麦、大米、高梁、豆类、木薯、黍、马铃薯、甜薯和木薯粉(tapioca)。

术语“颗粒淀粉”指未蒸煮(粗)淀粉，其还没有进行胶凝化作用。

术语“淀粉胶凝化作用”意指淀粉分子的溶解，形成粘性悬液。

术语“胶凝化温度”指淀粉底物开始发生胶凝化的最低温度。确切温度取决于具体的淀粉底物，进一步可能依赖于获得该淀粉的植物种类的特定品种以及生长条件。

术语“DE”或“葡萄糖当量(dextrose equivalent)”是测量总还原糖浓度的一个行业标准，基于干重量以D-葡萄糖进行计算。未水解的颗粒淀粉的DE基本上为0，D-葡萄糖的DE为100。

术语“葡萄糖糖浆”指含有葡萄糖固体的含水组合物。在一个实施方案中，葡萄糖糖浆将包括至少90％的D-葡萄糖，在另一个实施方案中，葡萄糖糖浆将包括至少95％的D-葡萄糖。在一些实施方案中，术语“葡萄糖”、“葡萄糖糖浆”和“右旋糖”可被交替使用。

术语“总糖含量(total sugar content)”指在淀粉组合物中存在的总糖含量。

术语“干固体含量(ds)”指浆状物的总固体(以％表示)，基于干重量来计算。

“白利(Brix)”指一种熟知的液体比重计标度，用于量度在给定温度下溶液的糖含量。白利标度测量的是每100克含水糖溶液中存在的蔗糖的克数(总的溶解固体含量)。白利测量值通常通过使用液体比重计或折光计来获得。

术语“淀粉液化酶(starch-liquefying enzyme)”指可实现颗粒淀粉液化的酶。例证性的淀粉液化酶包括α淀粉酶(E.C.3.2.1.1)。

术语“淀粉酶(amylases)”指催化淀粉水解的酶。

术语“α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1类)”指催化α-1，4-糖苷键水解的酶。这些酶也已经被描述为在含有1，4-α-连接的D-葡萄糖单元的多糖中实现1，4-α-D-糖苷键的外切或内切水解的那些酶。用于描述这些酶的另一个术语是糖原酶(glycogenase)。例证性的酶包括α-1，4-葡聚糖4-葡聚糖水化酶葡聚糖水解酶(α-1，4-glucan4-glucanohydrase glucanohydrolase)。

在此处可被交替使用的术语“糖化酶(saccharification enzyme)”和“葡糖淀粉酶(glucoamylase)”指淀粉葡糖苷酶类别的酶(E.C.3.2.1.3，葡糖淀粉酶，α-1，4-D-葡聚糖葡糖水解酶)。这些是外切作用的酶，其从直链淀粉和支链淀粉分子的非还原末端释放葡糖残基。这些酶也水解α-1，6和α-1，3-键，尽管是以比α-1，4-键低得多的速率水解。

正如此处所用，术语“颗粒淀粉水解酶(GSHE)”或“具有颗粒淀粉水解活性的酶”特别地指这样的酶，其具有葡糖淀粉酶活性，并且具有水解颗粒形式的淀粉的能力。优选的GSHE是那些来源于丝状真菌的GSHE，其中对丝状真菌细胞而言，GSHE是内源或外源的。一种优选的GSHE是来源于灰腐质霉高温变种的天然GSHE。另一种优选的GSHE来源于泡盛曲霉河内变种。特别优选的GSHE是重组的GSHE，其是在宿主菌株中表达的GSHE，所述宿主菌株已经被进行了遗传工程改造，以便包含编码GSHE的异源多核苷酸。在一些优选的实施方案中，GSHE作为胞外酶而被表达。

术语“淀粉的水解”指在加入水分子的情况下糖苷键的裂解。

术语“聚合度(degrss of polymerization，DP)”是指，在给定的糖中脱水吡喃型葡萄糖单位的数量。DP1的实例是单糖，如葡萄糖和果糖。DP2的实例是二糖，如麦芽糖和蔗糖。DP4⁺(＞DP3)表示聚合度大于3的聚合物。

术语“接触”指将各酶放置到与各自的底物足够接近的位置，以便使该酶能够将底物转化为终端产物。本技术领域的技术人员将认识到，酶与各自底物的混合溶液能实现接触。

术语“酶促转化”通常指通过酶作用进行的底物修饰。正如此处所用，该术语也指通过酶的作用对颗粒淀粉底物进行修饰。在优选的实施方案中，颗粒淀粉底物的酶促转化将产生葡萄糖糖浆。

术语“浆状物(slurry)”指含有不可溶淀粉颗粒的含水混合物。

术语“糖基化(glycosylation)”指通过加入碳水化合物部分(moieties)对蛋白质进行的转录后修饰，其中碳水化合物是N-连接的或者O-连接的，由此产生糖蛋白。糖蛋白的N-连接碳水化合物部分通过糖苷键连接到天冬酰胺残基的β-氨基氮上。通过丝氨酸或苏氨酸残基的羟基，O-连接碳水化合物通过糖苷键连接到蛋白质上。

术语“重组的”，当它的使用涉及例如细胞、核酸、蛋白质或载体时，表示细胞、核酸、蛋白质或载体已经通过引入异源核酸或蛋白质或者通过改变天然核酸或蛋白质而被修饰，或者表明细胞是来源于如此而被修饰的细胞。因此，例如，重组的细胞表达在该细胞的天然(非重组的)形式中不存在的基因；或者表达天然基因，但这些天然基因以别的方式被异常表达、不足地表达或者根本不表达。

术语“重组GSHE”、“重组表达的GSHE”和“重组产生的GSHE”指成熟GSHE蛋白质序列，其是在宿主细胞中由异源多核苷酸产生。符号“r”可以用于表示重组子。rGSHE的蛋白序列不包括信号序列。在一个实施方案中，在里氏木霉的菌株中所表达的灰腐质霉高温变种GSHE，用“rH-GSHE”表示。

术语“天然GSHE”和“nGSHE”指GSHE，其来源于微生物宿主生物，不是来源于需要表达重组GSHE的真菌宿主。优选的天然GSHE来源于灰腐质霉菌株，或者泡盛曲霉菌株。

术语“蛋白质”和“多肽”在此处可被交替使用。本文对于氨基酸残基，使用了传统的单字母或三字母代码。

“信号序列”指与蛋白质的N末端部分结合的氨基酸的序列，其有助于成熟形式的蛋白质分泌到细胞外。信号序列的定义是功能性定义。胞外蛋白质的成熟形式缺乏信号序列，其在分泌过程中被切割掉。

“基因”指在产生多肽中所涉及的DNA片段，包括该编码区域之前的区域和之后的区域，以及在各编码片段(外显子)之间的间插序列(内含子)。

术语“核酸”包括DNA、RNA、单链或双链及其化学修饰。术语“核酸”和“多核苷酸”在此处可以被交替使用。由于遗传密码是简并的，所以不止一种密码子可以被用于编码特定氨基酸，本发明包括多核苷酸，其编码特定的氨基酸序列。

“载体”是指被设计用于将核酸引入到一种或多种细胞类型中的多核苷酸序列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、序列盒及类似物。

正如此处所用，“表达载体”指DNA构建物，其包括可操作地连接到适当的控制序列上的DNA序列，所述适当的控制序列能实现DNA在适当宿主中的表达。这样的控制序列可以包括启动子以实施转录、任选的操纵子序列以控制转录、编码mRNA上合适的核糖体结合位点的序列、增强子以及控制转录和翻译终止的序列。

“启动子”是在结合RNA聚合酶中以启动基因的转录中所涉及的调节序列。启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。本发明中使用的优选启动子是里氏木霉cbh1，其是诱导型启动子。

“在转录控制下(under transcriptional control)”是本技术领域熟知的一个术语，该术语表明，多核苷酸序列——通常是DNA序列——的转录依赖于其被可操作地连接到对转录的启动有贡献或者促进转录的元件上。

“在翻译控制下(under translational control)”是本技术领域熟知的一个术语，该术语表明在mRNA已经形成后发生的调节过程。

正如此处所用，当描述蛋白质和编码它们的基因时，用于该基因的术语不是大写字母，并且是斜体字，例如编码灰腐质霉GSHE的基因可以表示为gla1。用于该蛋白质的术语通常不是斜体字，第一个字母是大写的，例如由gla1基因编码的蛋白质可以表示为Gla1。

术语“可操作地连接”是指并列关系，其中元件以可允许它们在功能上相关的方式排列。例如，如果启动子控制编码序列的转录，那么启动子就是可操作地连接到该编码序列上。

术语“选择性标记”指能在宿主中表达的基因，其可以使得含有被引入的核酸或载体的那些宿主的选择容易一些。选择性标记的实例包括但不限于抗微生物剂(例如潮霉素、博来霉素或氯霉素)或赋予代谢优势例如营养优势给宿主细胞的基因。

术语“来源(derived)”包括术语“源自(originated from)”、“得自或可获自”以及“分离自”。

“宿主菌株”或“宿主细胞”指用于表达载体或DNA构建物的适当宿主，其包含编码根据本发明的GSHE的多核苷酸。特别地，宿主菌株是丝状真菌细胞。在本发明的一个优选的实施方案中，“宿主细胞”指从丝状真菌菌株的细胞所产生的细胞和原生质体，尤其是木霉菌属某种或曲霉菌属某种。

术语“丝状真菌”指所有丝状形式的所有丝状形式的真菌亚门(Eumycotina)(参见Alexopoulos，C.J.(1962)，INTRODUCTORY MYCOLOGY，New York： Wiley)。这些真菌是以营养菌丝为特征，其具有由几丁质、纤维素和其它复合多糖组成的细胞壁。本发明的丝状真菌与酵母在形态上、生理上以及遗传上不同。丝状真菌的营养生长通过菌丝延长进行，碳代谢是专性需氧的。在本发明中，丝状真菌亲本细胞可以是如下种类的细胞，但不限于它们：木霉菌属，例如里氏木霉(以前被分类为T.longibrachiatum，现在被称为红褐肉座菌(Hypocrea jecorina))、绿色木霉(Trichoderma viride)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)；青霉属某种(Penicillium sp.)；腐质霉属某种(Humicolasp.)，包括异常腐质霉(Humicola insolens)和灰腐质霉(Humicola grisea)；金孢菌某种(Chrysosporium sp.)，包括拉克淖金孢菌(C.lucknowense)；粘帚霉某种(Gliocladium sp.)；曲霉属某种，包括米曲霉、构巢曲霉(A.nidulans)、黑曲霉和泡盛曲霉(A.awamori)；镰孢菌属某种(Fusarium sp.)、脉孢菌属某种(Neurosporasp.)、肉座菌属某种(Hypocrea sp.)和裸孢壳属某种(Emericella sp.)。也参考Innis等人，(1995)Sci.228：21-26。

正如此处所用，术语“木霉菌”或“木霉菌属某种”指之前已被归入木霉属的任何真菌菌株或目前被归入木霉属的任何真菌菌株。。

术语“培养”指，在液体或固体培养基中、在合适的条件下，培养微生物细胞群。在一个实施方案中，培养指颗粒淀粉底物到葡萄糖糖浆或其它期望的终端产物的发酵型生物转化(通常是在容器或反应器中)。

谈及多核苷酸或蛋白质时，术语“异源的”或“外源的”，是指在宿主细胞中不天然发生的多核苷酸或蛋白质。在一些实施方案中，该蛋白质是商业上重要的工业蛋白质。这意味着，该术语包括由天然发生的基因、突变的基因和/或合成基因编码的蛋白质。关于多核苷酸或蛋白质，术语“同源的”或“内源的”，指在宿主细胞中天然发生的多核苷酸或蛋白质。

术语“回收的”、“分离的”和“分开的”，正如此处所用，指分子、蛋白质、细胞、核酸、氨基酸或碳水化合物，其与同其天然相关的至少一个成分是分离的。

正如此处所用，术语“被转化的”、“被稳定地转化的”或“转基因的”，在涉及细胞时，是指该细胞具有非天然的(异源的)核酸序列，其被整合到它的基因组中或者作为在多个世代中被维持的附加型质粒而存在。

正如此处所用，术语“表达”指这样的过程，通过该过程，基于基因的核酸序列，产生出多肽。该过程既包括转录也包括翻译。

术语“被引入”，在将核酸序列插入到细胞中的上下文中，意指“转染”或“转化”或“转导”，包括指将核酸序列导入到真核或原核细胞中，其中核酸序列可以被掺入到细胞的基因组中(例如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA)，被转化为自主复制子，或者被短暂地表达(例如，转染的mRNA)。

正如此处所用，术语“比活性”指酶的单位，定义为在特定条件下，每单位时间内通过酶制剂转化为产物的底物摩尔数。比活性表示为单位(U)/mg蛋白质。

正如此处所用，“酶活性”指酶对其底物的作用。

正如此处所用，术语“酶单位”指在最适测定条件下，每分钟将1mg底物转化为底物产物的酶数量。例如，在一个实施方案中，术语颗粒淀粉水解酶单位(GSHEU)被定义为：在测定条件下，例如50℃和pH4.5，每分钟由颗粒淀粉产生1mg葡萄糖所需要的GSHE的量。例如，在一个实施方案中，术语α淀粉酶酶单位(AU)被定义为：在pH 5.2和40℃的标准测定条件下，在1分钟时间内水解1微摩尔淀粉底物的α淀粉酶的量。

术语“终端产物”或“期望的终端产物”指衍生自任何碳来源的分子产物，该产物是从颗粒淀粉底物酶促转化而来的。优选地，终端产物是葡萄糖或葡萄糖糖浆。然后葡萄糖可以被用作其它期望的终端产物的前体。

术语“残余淀粉”，正如此处所用，指当包括葡萄糖糖浆或其它终端产物的组合物被分离时，本发明的颗粒淀粉水解工艺的副产物或剩余的组分。残余淀粉包括剩余的不可溶的淀粉，其在分离后留在组合物中。

“残余淀粉的循环步骤”指残余淀粉循环回到容器或反应器中，其中包括GSHE和α淀粉酶。

术语“产量(yield)”指使用本发明的方法产生的终端产物或期望的终端产物的量。在一些优选的实施方案中，产量大于使用本技术领域已知方法所产生的产量。在一些实施方案中，该术语指终端产物的体积，在其它实施方案中，该术语指终端产物的浓度。

正如此处所用，“产乙醇微生物”指有能力将糖或寡糖转化为乙醇的微生物。由于其表达一种或多种酶的能力，产乙醇微生物是乙醇生成型的，所述酶单独地或合起来将糖转化为乙醇。

在本发明的上下文中，术语“基本上纯的多肽(substantially pure polypeptide)”指这样的多肽制剂，按重量计其含有最多10％的与之天然联系的其它多肽物质(更低百分比的其它多肽物质是优选的，例如最多8wt％，最多6wt％，最多5wt％，最多4wt％，最多3wt％，最多2wt％，最多1wt％，以及最多1/2wt％)。因此，优选地，基本上纯的多肽是至少92％纯度，即，该多肽构成在制剂中存在的总多肽材料的至少92wt％，更高百分比是优选的，如至少94％纯度，至少95％纯度，至少96％纯度，至少96％纯度，至少97％纯度，至少98％纯度，至少99％纯度，和至多99.5％纯度。此处公开的多肽优选地是基本上纯的形式。尤其是，优选地，此处公开的多肽是“实质上纯的形式(essentially pure form)”，即多肽制剂基本上不含与其天然相关的其它多肽材料。这是可以实现的，例如通过用熟知的重组方法制备多肽来实现。

“ATCC”指美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，位于Manassas，VA20108(ATCC，www/atcc.org)。

“NRRL”指Agricultural Research Service Culture Collection，National Center，Agricultural Utilization Research(以前被称为USDA Northern Regional ResearchLaboratory)，Peoria，ILL。

“一个(A)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数指代，除非文中另外清楚地指明。

正如此处所用，术语“包括(comprising)”及其同源词在本文中被使用时，它们具有包含的意思；也就是，相当于术语“包含(including)”及其对应的同源词。

B.优选的实施方案

淀粉底物-

在本发明的方法中，将被加工的颗粒淀粉底物可以从包括茎干、谷粒、根和块茎的任何植物部分获得。尤其优选的植物来源包括玉米；小麦；黑麦；高梁；大米；黍；大麦；木薯；豆类，如蚕豆和豌豆；马铃薯；甜薯；香蕉；和木薯粉。淀粉可以是高度精制的粗淀粉或者来自淀粉精制过程的原料。尤其预期到的淀粉底物是玉米淀粉和小麦淀粉。本技术领域的普通技术人员知道，用于制备在本发明所包括的方法中使用的颗粒淀粉底物的有效方法。这些有效方法中的一些方法包括：使用锤磨机(hammer mills)和辊磨机(roller mills)的全谷类谷物(whole cerealgrains)干磨，以及湿磨。

各种淀粉可通过商业途径获得。例如，玉米淀粉可以从Cerestar、Sigma和Katayama Chemistry Industry Co.(Japan)获得；小麦淀粉可以从Sigma获得；甜薯淀粉可以从Wako Pure Chemistry Industry Co.(Japan)获得；马铃薯淀粉可以从Nakaari Chemical Pharmaceutical Co.(Japan)获得。

尽管目的不在于以任何方式限制本发明，但下面的表1提供了在一些常见的谷类谷物中存在的淀粉含量的一般性指南。本技术领域的普通技术人员熟知，谷物中的淀粉含量可能依赖于如基因型这样的因素和环境。

表1

各种谷物的淀粉含量

原材料	淀粉％
		玉米	60-68
小麦	60-65
		燕麦	50-53
大麦	55-65
		蜀黍	60-65
马铃薯	10-25
		木薯	25-30
黑麦	60-65
		大米(去除外壳)	70-72
高梁(黍)	75-80

The Alcohol Textbook，第3版，K.Jacques等人编著，1999，Nottingham University Press，第11页。

在本发明所包括的方法的一些实施方案中，颗粒淀粉底物被浆体化(通常是用水)，所述浆状物包括i)大约10％-大约55％干固体含量，ii)大约20％-大约50％干固体含量；iii)大约25％-大约45％干固体含量；iv)大约30％-大约45％干固体含量；v)大约30％-大约40％干固体含量：和vi)大约30％-大约35％干固体含量。

α淀粉酶-

在本发明所包括的一些实施方案中，α淀粉酶是微生物酶，其E.C.号为E.C.3.2.1.1-3，尤其是E.C.3.2.1.1。在一些实施方案中，α淀粉酶是热稳定的细菌α淀粉酶。合适的α淀粉酶可以是天然发生的、重组的和突变的α淀粉酶。在尤其优选的实施方案中，α淀粉酶来源于杆菌种类。优选的杆菌种类包括枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌(B.lentus)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)和淀粉液化芽孢杆菌(USP 5,763,385；USP 5,824,532；USP 5,958,739；USP 6,008,026和USP 6,361,809)。特别优选的α淀粉酶来源于杆菌菌株嗜热脂肪芽孢杆菌、淀粉液化芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌。也可以参考具有如下ATCC编号的菌株：ATCC 39709；ATCC 11945；ATCC 6598；ATCC 6634；ATCC 8480；ATCC 9945A和NCIB 8059。

预期可以在本发明的组合物和方法中使用的可商购获得的α淀粉酶包括SPEZYME AA；SPEZYME FRED；GZYME G997(Genencor International Inc.)和TERMAMYL 120-L，LC，SC和SUPRA(Novozyme Biotech)。

正如本技术领域技术人员所理解的，在本发明的组合物和方法中所使用的α淀粉酶的数量将依赖于α淀粉酶的酶活性。通常，每公吨(MT)原材料(颗粒淀粉底物)中加入大约0.01-5.0kg的α淀粉酶。该数量大约相当于0.06AU/gds到30AU/g ds的GZYME 997。在一些实施方案中，每公吨中α淀粉酶的加入量为大约0.05-5.0kg；大约0.05-2.5kg；大约0.1-2.5kg；大约0.1-2.0kg；大约0.1-1.5kg；大约0.1-1.0kg；大约0.5-5.0kg以及大约0.5-2.0kg。这些数值大约等于0.3-30AU/gds；0.3-15AU/g ds；0.6-15AU/g ds；0.6-12AU/g ds；0.6-9AU/g ds；0.6-6AU/g ds；3-30AU/g ds以及3-12AU/g：ds的GZYME 997。在进一步的实施方案中，可以使用其它数量，例如通常大约0.01-1.0kg之间的GZYME 997或SPEZYME FRED(Genencor International Inc.)被加入到1公吨淀粉中。在其它实施方案中，每公吨淀粉中加入的酶的量为大约0.05-1.0kg之间；大约0.1-0.6kg之间；大约0.2-0.6kg之间；和大约0.4-0.6kg之间的GZYME 997或SPEZYME FRED。

具有葡糖淀粉酶活性的颗粒淀粉水解酶-

葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)是从淀粉的非还原末端去除连续的葡萄糖单元的酶。该酶能水解淀粉，直链淀粉和支链淀粉的直链和支链糖苷键。尽管葡糖淀粉酶可以是细菌、植物和真菌来源的，但本发明所包括的优选的葡糖淀粉酶是真菌菌株来源的。

从曲霉菌属、根霉菌属、腐质霉属和毛霉菌属的真菌分泌的葡糖淀粉酶是真菌菌株来源的，包括黑曲霉、泡盛曲霉、雪白根霉(Rhizopus niveus)、米根霉(Rhizopus oryzae)、米黑毛霉(Mucor miehe)、灰腐质霉、Aspergillus shirousami和Humicola(Thermomyces)laniginosa(参见Boel等人(1984)EMBO J.3：1097-1102；WO 92/00381；WO 00/04136；Chen等人(1996)Prot.Eng.9：499-505；Taylor等人，(1978)Carbohydrate Res.61：301-308和Jensen等人(1988)Can.J.Microbiol.34：218-223)。

商业上使用的具有葡糖淀粉酶活性的酶是从，例如黑曲霉(商标名为OPTIDEX L-400和G ZYME G990 4X，来自Genencor International Inc.)或根霉菌种类(商标名为CU.CONC.，来自Shin Nihon Chemicals，Japan；商标名为GLUCZYME，来自Amano Pharmaceuticals，Japan)产生的。

一组特定的具有葡糖淀粉酶活性的酶是颗粒淀粉水解酶GSHE(参见Tosi等人，(1993)Can.J.Microbiol.39：846-855)。GSHE不仅具有葡糖淀粉酶活性，而且能水解颗粒(生的)淀粉。GSHE已经从真菌细胞如腐质霉属某种、曲霉菌属某种和根霉菌属某种回收。米根霉GSHE已经在Ashikari等人(1986)Agric.Biol.Chem.50：957-964和USP 4,863,864中描述。灰腐质霉GSHE已经在Allison等人(1992)Curr.Genet.21：225-229和欧洲专利171218中描述。编码该酶的基因在本技术领域也是已知的，已知为gla1。泡盛曲霉河内变种(Aspergillus awaomori var.kawachi)GSHE已经由Hayashida等人(1989)Agric.Biol.Chem 53：923-929描述。Aspergillusshirousami GSHE已经由Shibuya等人(1990)Agric.Biol.Chem.54：1905-1914描述。

在一个实施方案中，GSHE可以来源于灰腐质霉菌株，尤其是灰腐质霉高温变种的菌株(参见USP 4,618,579)。

在一些优选的实施方案中，GSHE是从包括ATCC 16453、NRRL 15219、NRRL 15220、NRRL 15221、NRRL 15222、NRRL 15223、NRRL 15224和NRRL15225及其遗传上被改变的菌株的真菌中回收的。(EP 0171218)。

在一个实施方案中，GSHE可以来源于泡盛曲霉菌株，尤其是泡盛曲霉河内变种菌株(参见Hayashida等人(1989)Agric.Biol.Chem.53：923-929)。

在另一个实施方案中，GSHE可以在4至7.5的pH范围内、5.0至7.5的pH范围内表现出最大的pH活性，在50-60℃的温度范围内表现出最大活性。

在一个实施方案中，GSHE与SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％和99％的序列同一性。在另一个实施方案中，GSHE包括与SEQ ID NO：3中所示的序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在其它实施方案中，包括SEQ IDNO：3的氨基酸序列的GSHE或与SEQ ID NO：3的序列具有至少80％序列同一性的GSHE，由与SEQ ID NO：1具有至少70％、80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％和99％序列同一性的多核苷酸编码。

在另一个实施方案中，GSHE与SEQ ID NO：6中所示的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％和99％的序列同一性。在另一个实施方案中，GSHE包括与SEQ ID NO：6中所示的序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在其它实施方案中，包括SEQID NO：6的氨基酸序列的GSHE或与SEQ ID NO：6的序列具有至少80％序列同一性的GSHE，由与SEQ ID NO：4具有至少70％、80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％和99％序列同一性的多核苷酸编码。

与另一个序列具有一定的序列同一性百分比(例如80％、85％、90％或99％)的多核苷酸或多肽是指：当联配时，在两个序列的比较中所述百分比的碱基或氨基酸残基是相同的。该联配和同源性或同一性百分比可以使用本技术领域已知的任何合适的软件程序确定，例如在Current Protocols in Molecular Biology中描述的那些程序(Ausubel等人编著，1987，Supplement 30，7.7.18部分)。优选的程序包括GCG Pileup程序，FASTA和BLAST。另一个优选的联配程序是ALIGN Plus和TFASTA。

本技术领域技术人员将意识到，本发明中所包括的序列也可以由在严紧杂交条件下与例证性GSHE序列(例如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4)杂交的能力进行定义。在适当的温度和溶液离子强度条件下，当单链形式的核酸可以退火到另一核酸上时，则该核酸是能与该另一核酸序列进行杂交的。杂交和洗涤条件在本技术领域是已知的(例如参见Sambrook(1989)见上文，尤其是第9和11章)。在一些实施方案中，严紧条件对应于Tm 65℃，0.1×SSC，0.1％SDS。在进一步的实施方案中，GSHE酶可以来源于根霉菌菌株。如来源于雪白根霉(R.niveus)的Koji菌株的酶(其销售商标名为“CU CONC”)，或者来源于商标名为GLUCZYME的根霉菌的酶。

在一个优选的实施方案中，在本发明所包括的方法或组合物中使用的GSHE是从丝状真菌菌株获得的重组表达的GSHE，所述丝状真菌菌株已经被进行了遗传工程改造以便表达异源多核苷酸，所述异源多核苷酸编码GSHE，该GSHE的来源并非该宿主菌株。

在一些实施方案中，丝状真菌菌株是曲霉菌属某种、木霉菌属某种、镰刀霉菌属某种(Fusarium sp.)或青霉菌属某种(Penicillium sp.)的菌株。尤其优选的真菌宿主包括构巢曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、棘孢曲霉(A.aculeatus)、黑曲霉、日本曲霉(A.japonicus)、里氏木霉、绿色木霉(T.viride)、尖镰孢霉(F.oxysporum)和F.solani。曲霉菌菌株公开在Ward等人(1993)Appl.Microbiol.Biotechnol.39： 738-743和Goedegebuur等人(2002)Curr.Gene 41：89-98中。在一个最优选的实施方案中，宿主是木霉菌属菌株，尤其是里氏木霉菌株。里氏木霉的菌株是已知的，非限定性实例包括ATCC No.13631，ATCC No.26921，ATCC No.56764，ATCCNo.56765，ATCC No.56767和NRRL 15709。在一些优选的实施方案中，宿主菌株是RL-P37的衍生物。RL-P37公开在Sheir-Neiss等人(1984)Appl.Microbiol.Biotechnol.20：46-53中。

表达rGSHE的宿主菌株可能已经通过遗传工程进行过操作。在一些实施方案中，真菌宿主的多种基因已经失活。这些基因包括，例如编码纤维素分解酶例如内切葡聚糖酶(EG)和外切纤维二糖水解酶(CBH)的基因(例如cbh1、cbh2、egl1、egl2和egl3)。美国专利5,650,322公开了在cbh1基因和cbh2基因中具有缺失的RL-P37衍生菌株。

在一些实施方案中，真菌菌株已经被进行了遗传工程，以包括编码来自灰腐质霉的GSHE的多核苷酸。在一个实施方案中，rGSHE将与SEQ ID NO：3中所示的氨基酸具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％和99％的序列同一性。在其它实施方案中，编码SEQ ID NO：3的GSHE的多核苷酸将与SEQ ID NO：1的序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、97％和98％的序列同一性。在特别优选的实施方案中，GSHE在里氏木霉菌株中表达，所产生的蛋白质与SEQ ID NO：3的序列具有至少80％、85％、90％、95％、97％和98％的序列同一性。

在其它实施方案中，真菌宿主已经被进行了遗传工程，以表达编码来自泡盛曲霉的GSHE的多核苷酸。在一个实施方案中，rGSHE将与SEQ ID NO：6中所示的氨基酸具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％和99％的序列同一性。在其它实施方案中，编码SEQ ID NO：6的GSHE的多核苷酸将与SEQ ID NO：4的序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、97％和98％的序列同一性。在特别优选的实施方案中，GSHE在里氏木霉菌株中表达，所产生的蛋白质与SEQ ID NO：6的序列具有至少80％、85％、90％、95％、97％和98％的序列同一性。

在一些实施方案中，重组表达的GSHE的糖基化水平与对应的天然GSHE的糖基化水平不同(例如原始来源于灰腐质霉或泡盛曲霉的GSHE具有与木霉菌中表达的GSHE的糖基化水平不同的糖基化水平)。在一个实施方案中，糖基化水平是不同的，即使rGSHE与相应的天然GSHE具有至少80％、85％、90％、95％氨基酸同一性。在一些实施方案中，在木霉菌特别是里氏木霉的菌株中表达的rGSHE，具有与相应的nGSHE中的水平不同的糖基化水平。在其它实施方案中，糖基化水平要更高，而在其它实施方案中糖基化水平则更低。

例如，rGSHE的糖基化水平可以比相应的nGSHE的糖基化水平低至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或65％。在其它实施方案中，被表达的rGSHE的糖基化水平可以比相应的nGSHE的糖基化水平高至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、100％、125％、150％、175％、200％、225％或250％。

在另一个实施方案中，与相应的天然GSHE相比，根据本发明产生的重组产生的GSHE在最适温度水平可以在更低pH水平具有更高的稳定性。更特别地，在木霉菌中表达的最初来源于灰腐质霉高温变种的GSHE，与相应nGSHE相比，在45-55℃的温度在3.5-4.0的pH水平具有更高的稳定性。在一些条件下，rGSHE的稳定性，特别是在里氏木霉中表达的灰腐质霉高温变种SEQ ID NO：1，比nGSHE的稳定性水平的两倍还要高。

载体和真菌转化：

根据本发明，构建DNA构建物，其包括编码本发明所包括的GSHE的多核苷酸，以便将GSHE转移到宿主细胞中。因此，可以以酶形式被表达的GSHE多核苷酸可以使用载体被引入到宿主细胞中，所述载体尤其是包括可操作地连接到GSHE编码序列上的调节序列的表达载体。

载体可以是任何载体，当被引入到真菌宿主细胞中时，所述载体被整合到宿主细胞基因组中并且被复制。对于载体的列表，可参考Fungal Genetics StockCenter Catalogue of Strains(www.FGSC.net)。而且，合适的表达载体的实例可以在Sambrook等人(1989)见上文，和Ausubel(1987)见上文中发现，更特别地参考van den Hondel等人(1991)，Bennett和Lasure编著，MORE GENEMANIPULATIONS IN FUNGI，Academic Press 396-428页。特别有用的载体包括pFB6，pBR322，PUC18，pUC100和pENTR/D。

在一些实施方案中，编码GSHE的核酸可操作地连接到合适的启动子上，该启动子在真菌宿主细胞中表现出转录活性。启动子可以来源于编码与宿主细胞同源或者异源的蛋白质的基因。优选地，启动子在木霉菌宿主中有用，启动子的合适的非限定性实例包括cbh1、cbh2、egl1、egl2。在一个实施方案中，对宿主细胞而言，启动子是天然的启动子。例如，当里氏木霉是宿主时，启动子将是天然的里氏木霉启动子。在优选的实施方案中，启动子是里氏木霉cbh1，该启动子是诱导型启动子，已经存档在GenBank中，其登记号为D86235。诱导型启动子是在环境或发育调节下有活性的启动子。在另一个实施方案中，启动子是与真菌宿主细胞异源的启动子。有用的启动子的其它实例包括来自泡盛曲霉和黑曲霉葡糖淀粉酶基因的启动子(参见Nunberg等人，(1984)Mol.Cell Biol.4：2306-2315，和Boel等人(1984)EMBO J.3：1581-1585)。而且，里氏木霉xln1基因和纤维二糖水解酶1基因的启动子可以是有用的(EPA 137280A1)。

在一些实施方案中，GSHE编码序列可操作地连接到信号序列上。编码信号序列的DNA优选是与将被表达的GSHE基因天然相关。优选地，信号序列由编码GSHE的灰腐质霉或泡盛曲霉基因编码。更优选地，信号序列与图2A和6A中描述的信号序列具有至少90％、至少95％、至少97％和至少99％序列同一性。在其它实施方案中，包括将被引入到真菌宿主细胞中的DNA构建物或载体的信号序列和启动子序列来源于相同的来源。例如，在一些实施方案中，信号序列是cdh1信号序列，其可操作地连接到cdh1启动子上。

在一些实施方案中，表达载体也包括终止序列。在一个实施方案中，终止序列和启动子序列来源于相同的来源。在另一个实施方案中，终止序列与宿主细胞同源。特别合适的终止序列是cbh1，其来源于木霉菌菌株，尤其是里氏木霉。其它有用的真菌终止子包括来自黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的终止子(Nunberg等人(1984)见上文，和Boel等人，(1984)见上文)。

在一些实施方案中，表达载体包括选择性标记。优选的选择性标记的实例包括赋予抗微生物抗性的标记(例如潮霉素和腐草霉素)。营养选择性标记也在本发明中可以使用，包括本技术领域已知的那些标记物，如amdS、argB和pyr4。在用于木霉菌的转化的载体系统中有用的标记物描述在Finkelstein，第6章，BIOTECHNOLOGY OF FILAMENTOUS FUNGI，Finkelstein等人编著，Butterworth-Heinemann，Boston，MA(1992)，第6章，和Kinghorn等人(1992)APPLIED MOLECULAR GENETICS OF FILAMENTOUS FUNGI，BlackieAcademic and Professional，Chapman and Hall，London。在优选的实施方案中，选择性标记是amdS基因，其编码乙酰胺酶，其允许被转化的细胞以乙酰胺作为氮源生长。(参见Kelley等人(1985)EMBO J.4：475-479和Penttila等人(1987)Gene 61：155-164。

包括编码GSHE的多核苷酸的表达载体可以是任何载体，其能在给定的真菌宿主生物体中自我复制，或者能整合到宿主的DNA中。在一些实施方案中，表达载体是质粒。在优选的实施方案中，预期使用用于获得基因表达的两种类型的表达载体。

第一种表达载体包括DNA序列，其中的启动子、GSHE编码区以及终止子都来源于将被表达的基因。在一些实施方案中，基因通过删除不需要的DNA序列(例如，编码不需要的结构域)而被截短，留下将要被表达的结构域置于其本身的转录和翻译调节序列的控制下。

第二种类型的表达载体是预装配的，含有高水平转录所需要的序列和选择性标记物。在一些实施方案中，GSHE基因的编码区域或其部分被插入到该通用的表达载体中，以便其在表达构建物启动子和终止序列的转录控制下。在一些实施方案中，基因或其部分被插入到强cbh1启动子的下游。

用于装配载体并且将它们插入到合适的载体中的方法在本技术领域是已知的，所述载体包括编码GSHE的多核苷酸、启动子、终止子和其它序列。连接通常通过在合适的限制位点处的装配来实现。如果这样的位点不存在，那么就根据传统实践使用合成的寡核苷酸连接子。(参见Sambrook(1989)见上文，Bennett和Lasure，MORE GENE MANIPULATIONA IN FUNGI，Academic Press，San Diego(1991)70-76页)。另外，载体可以使用已知的重组技术来构建(例如Invitrogen LifeTechnologies，Gateway Technology)。

在期望获得具有一个或多个失活基因的真菌宿主细胞的情况下，可以使用已知的方法(参见美国专利5,246,853；美国专利5,475,101和WO 92/06209)。基因灭活可以通过完全或部分缺失、通过插入失活或通过可使基因对于其期望目的而言变为无功能的任何其它方法来实现(这样就可以阻止基因表达功能蛋白)。已经被克隆的、来自木霉菌某种或其它丝状真菌宿主的任何已被克隆的基因，可以被删除，例如cbh1、cbh2、egl1和egl2。在一些实施方案中，基因缺失通过使用已知的方法将欲被灭活的期望基因的一种形式插入到质粒中来实现。然后，在适当的限制酶位点切割缺失质粒，限制酶位点是在期望基因编码区域的内部，基因编码序列或其部分用选择性标记予以代替，将要被删除的基因位的侧翼DNA序列保留在标记的两侧(优选地在大约0.5-2.0kb)。适当的缺失质粒通常在其中存在有独特的限制酶位点，这使得含有缺失了的基因的片段——包括侧翼DNA序列和选择性标记基因，可以作为单一的线性片段而被移除。

将DNA构建物或载体引入到宿主细胞中包括如下技术，如转化；电穿孔；细胞核微注射；转导；转染，包括脂转染介导的转染和DEAE-Dextrin介导的转染；磷酸钙DNA沉淀温育；使用DNA包被的微射弹的高速轰击；以及原生质体融合。一般的转化技术在Ausubel等人(1987)见上文，第9章，和Sambrook(1989)见上文中有所教导。更特别的，丝状真菌的转化方法公开在Campbell等人(1989)Curr.Genet.16：53-56中。特别地，为了实施异源蛋白质在木霉菌中的表达，参考USP 6,022,725；USP 6,268,328；Harkki等人(1991)；Enzyme Mcirob.Technol.13：227-233；Hakki等人，(1989)Bio Technol.7：596-603；EP 244,234；和EP 215,594。也参考Nevalainen等人，“The Molecular Biology of Trichoderma and its Applicationto the Expression of Both Homologous and Heterologous Genes”，在MOLECULARINDUSTRIAL MYCOLOGY，Leong和Berka编著，Marcel Dekker Inc.，NY(1992)129-148页。对于曲霉菌菌株的转化，也参考Cao等人(2000)Sci.9：991-1001。

优选地，遗传上稳定的转化子可以用载体系统构建，从而编码GSHE的核酸被稳定地整合到宿主菌株染色体中。然后可以通过已知技术纯化转化子。

在一个非限定性实例中，包含amdS标记的稳定转化子与不稳定的转化子不同，其不同在于它们在含有乙酰胺的固体培养基上更快的生长速率，以及形成具有平滑的而不是粗糙的轮廓的环状集落。另外，在一些情况下，稳定性的进一步测试通过在固体非选择性培养基(即缺乏乙酰胺)上培养转化子来进行，从该培养基收获孢子，并且确定随后将发芽并在含有乙酰胺的选择性培养基上生长的这些孢子的百分比。另外，本技术领域已知的其它方法可以用于选择转化子。

在一个特定的实施方案中，用于转化的木霉菌属某种的制备涉及从真菌菌丝制备原生质体。(参见Campbell等人(1989)Curr.Genet.16：53-56)。在一些实施方案中，菌丝是从萌发的营养孢子获得的，并且用消化细胞壁的酶处理，从而产生原生质体。然后原生质体通过在悬浮的培养基中存在的渗透稳定剂得到保护。这些稳定剂包括山梨糖醇、甘露醇、氯化钾、硫酸镁及其类似物。通常这些稳定剂的浓度在0.8M和1.2M之间变化。优选地在悬浮培养基中使用大约1.2M的山梨糖醇溶液。

将DNA摄取到宿主木霉菌属某种菌株中是依赖于钙离子浓度。在摄取溶液中通常使用大约10mM和50mM之间的CaCl₂。在摄取溶液中除了需要钙离子，通常所包括的其它项目是缓冲体系，如TE缓冲液(10Mm Tris，pH 7.4；1mM EDTA)或10mM MOPS，pH 6.0缓冲液(吗啉代丙烷磺酸)和聚乙二醇(PEG)。据信，聚乙二醇发挥融合细胞膜的作用，从而允许培养基中的物质被传递到木霉菌属某种菌株的细胞质内，并且质粒DNA被转移到核中。该融合常常使得质粒DNA的多个拷贝温和地整合到宿主染色体中。

通常在转化中使用含有木霉菌属某种原生质体或细胞的悬浮液，其已经以10⁵到10⁷/mL，优选地2×10⁶/mL的密度进行了渗透处理。将100μL体积的含有这些原生质体或细胞的适当溶液(例如1.2M山梨糖醇；50mM CaCl₂)与期望的DNA混合。通常将高浓度的PEG加入到摄取溶液中。0.1到1体积的25％PEG 4000可以被加入到原生质体悬液中。然而，优选地将大约0.25体积加入到原生质体悬液中。添加剂如二甲基亚砜、肝素、亚精胺、氯化钾及其类似物也可以被加入到摄取溶液中，以便有助于转化。对于其它真菌宿主细胞，类似方法是可以获得的。例如参见美国专利6,022,725和6,268,328，其内容通过引用方式被并入。

通常，混合物然后在大约0℃被培养10到30分钟。然后在混合物中再次加入PEG，以进一步增强期望基因或DNA序列的摄取。25％ PEG 4000通常以转化混合物体积的5到15倍体积加入；然而，更大或更小的体积也可以是合适的。25％ PEG 4000优选地是转化混合物体积的大约10倍。在加入PEG后，在加入山梨糖醇和CaCl₂溶液之前，在室温或在冰上温育转化混合物。原生质体悬液然后被进一步加入到融化的生长培养基等份中。该生长培养基仅仅允许转化子生长。

细胞培养物-

适当的宿主细胞通常在含有生理盐分和营养物的标准培养基中培养，如下述文献中所描述的：Pourquie，J等人，BIOCHEMISTRY AND GENETICS OFCELLULOSE DEGRADATION，Aubert，J.P.等人编著，Academic Press，71-86页，1988，和Ilmen，M.等人，(1997)Appl.Environ.Microbiol.63：1298-1306。也可以参考普通的商业上制备的培养基，如Yeast Malt Extract(YM)培养基，Luria Bertani(LB)培养基和Sabouraud Dextrose(SD)培养基。

培养条件也是标准的，例如培养物在大约28℃，在适当的培养基中，在振荡培养器或发酵桶中培养，直到实现期望的GSHE表达水平。给定的丝状真菌的优选的培养条件可以在科学文献中发现，和/或从真菌的来源发现，如AmericanType Culture Collection和Fungal Genetics Stock Center(www.FGSC.net)。

在真菌生长已经建立后，将细胞暴露于可以有效地导致或允许GSHE尤其是本文所定义的GSHE表达的条件下。在GSHE编码序列处于诱导型启动子的控制下的情况下，诱导剂，例如糖、金属盐或抗生素，以可以有效地诱导GSHE表达的浓度加入到培养基中。

rGSHE的工业应用-发酵-

在本发明的一些实施方案中，在分批或连续发酵条件下培养表达异源GSHE的真菌细胞。典型的分批发酵(batch fermentation)是一个封闭的系统，其中在发酵的起点将培养基的成分设置好，在发酵过程中不进行人工变化。因此，在发酵的开始，用期望的生物体接种培养基。在该方法中，发酵被允许在不向系统中加入任何组分的情况下发生。通常，分批发酵中“分批”的限定是针对碳源的添加而言的，同时常常也在对诸如pH和氧浓度的因素的控制方面进行尝试。分批体系的代谢物和生物材料组分不断地变化，直到发酵被终止的时刻。在分批培养中，细胞从静止迟滞期(static lag phase)发展到高生长的对数期，最后到稳定期，此时生长速率被降低或者停止。如果不被处理，稳定期中的细胞最终会死亡。通常，处在对数期的细胞负责大量地产生终端产物。

标准的分批体系的一个变型是“补料-分批发酵”体系，该体系也在本发明中有用。在典型的分批体系的这一变型中，底物随着发酵的进展以增量加入。当分解代谢物抑制(catabolite repression)有抑制细胞的代谢的倾向时，并且期望培养基中具有有限量的底物的情况下，补料-分批系统是有用的。补料-分批系统中的实际底物浓度的测量是很困难的，因此基于可测量因素的变化来估计，所述因素例如pH、溶解氧和废气如CO₂的分压。分批和补料-分批发酵在本技术领域是常见的，并且是熟知的。

连续发酵是一个开放式系统，其中，对于加工过程，确定成分的发酵培养基被连续地加入到生物反应器，等量的条件培养基被同时取出。连续发酵通常将培养物维持在一个固定的高密度，其中细胞主要处于对数生长期。

连续发酵允许调制影响细胞生长和/或终端产物浓度的一个因素或任意数量的因素。例如，在一个实施方案中，限制性营养物如碳源或氮源被维持在固定的比率，所有其它参数允许调节。在其它系统中，影响生长的许多因素可以被连续地改变，而通过培养基浊度测量的细胞浓度被维持在常量。连续系统努力维持稳定态生长条件。因此，针对发酵中的细胞生长率，必须平衡由于培养基被移除所导致的细胞损失。调节连续发酵过程的营养物和生长因子的方法，以及最大化产物形成速率的技术，在工业微生物领域是熟知的。

GSHE活性的鉴定-

为了通过评价细胞系对GSHE的表达，测定可以在蛋白质水平、RNA水平进行，或通过使用功能性生物测定法进行，尤其是针对葡糖淀粉酶活性和/或产生，所述细胞系已经用编码本发明所包括的GSHE的异源多核苷酸转化。一般来说，用于分析GSHE表达的测定法包括，Northern印迹、点印迹(DNA或RNA分析)、RT-PCR(反转录酶聚合酶链式反应)或原位杂交，使用适当标记的探针(基于核酸编码序列)和传统的Southern印迹和放射自显影。此外，GSHE的产生和/或表达可以直接在样品中测量，例如通过直接测量在培养基中的还原糖如葡萄糖的测定法，通过测量葡糖淀粉酶活性、表达和/或产生的测定法。可以用于测定GSHE活性的底物包括颗粒淀粉底物。例如，葡萄糖浓度可以通过任何便利的方法来确定，如通过使用葡萄糖试剂盒No 15-UV(Sigma Chemical Co.)，或设备如Technicon Autoanalyzer。也可以参考葡萄糖氧化酶试剂盒和葡萄糖己糖试剂盒，它们可从Instrumentation Lab.(Lexington，MA)商购。葡糖淀粉酶活性可以通过3，5-二硝基水杨酸(DNS)方法测定(参见Goto等人，(1994)Biosci.Biotechnol.Biochem.58：49-54)。在非限定性例子中，rGSHE有能力在水中的15％淀粉固体悬液中水解颗粒淀粉，水解为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％wt葡萄糖的糖溶液，以干物质为基础进行计算。

在本发明的一个实施方案中，由重组宿主表达的GSHE将大于1克蛋白质每升培养物(g/L)。优选地，在一些实施方案中，宿主是木霉菌或曲霉菌宿主。在一些实施方案中，由重组的木霉菌宿主表达的GSHE的量将大于2g/L培养物。在其它实施方案中，由重组的木霉菌宿主表达的GSHE的量将大于5g/L培养物。仍然在其它实施方案中，由重组的木霉菌宿主表达的GSHE的量将大于10g/L培养物。表达的GSHE的量在一些例子中可为大于20g/L、大于25g/L、大于30g/L和大于50g/L培养基。

此外，蛋白质表达可以通过免疫学方法评价，如细胞的免疫组织化学染色、组织切片或组织培养基的免疫测定法，例如通过Western印迹或ELISA。这样的免疫测定法可以用于定性地和定量地评价GSHE的表达。这样的方法的细节对本技术领域技术人员是已知的，实践这样的方法的许多试剂可以商购获得。

例证性的测定法包括ELISA、竞争免疫测定法、放射免疫测度法、Western印迹、间接免疫荧光测定法及其类似方法。一般地，商购的抗体和/或试剂盒可以用于GSHE的表达水平的定量免疫测定。

纯化GSHE的方法-

一般地，在细胞培养物中产生的GSHE(nGSHE或rGSHE)被分泌到培养基中，并且可以被纯化或分离，例如通过从细胞培养基中去除不需要的组分。在一些情况下，GSHE可以以细胞内形式产生，从而必须从细胞裂解物进行回收。在这样的情况下，从细胞中纯化该酶，其中它是使用本技术领域技术人员常规使用的技术产生。实例包括但不限于，亲和层析(Tibeurgh等人，(1984)FEBS Lett.16：215)；离子交换层析方法(Goyal等人(1991)Biores.Technol.36：37；Fliess等人(1983)Eur.J.Appl.Microbiol.Biotechnol.17：314；Bhikhabhai等人(1984)J.Appl.Biochem.6：336；和Ellouz等人(1987)Chromatography396：307)，包括使用具有高分辨能力材料的离子交换(Medve等人(1998)J.Chromatography A 808：153；疏水相互作用层析(Tomaz和Queiroz，(1999)J.Chromatography A 865：123；两相分离(Brumbauer等人(1999)Bioseparation 7：287)；乙醇沉淀；反相HPLC；硅或阳离子交换树脂上的层析，如DEAE；层析聚焦(chromatofocusing)；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；和胶凝过滤，使用例如Sephadex G-75。所期望的纯化程度依赖于GSHE的用途。在一些实施方案中，纯化并不是必须的。

在一些实施方案中，重组表达的GSHE来自木霉菌宿主。在其它实施方案中，木霉菌宿主表达异源多核苷酸，其编码来自灰腐质霉菌株的GSHE，尤其是灰腐质霉高温变种菌株的GSHE。在其它实施方案中，木霉菌表达重组的GSHE，其中异源多核苷酸编码与SEQ ID NO：3的序列具有至少50％序列同一性的GSHE。

在一些实施方案中，木霉菌宿主表达异源多核苷酸，其编码来自泡盛曲霉菌株的GSHE，尤其是泡盛曲霉河内变种菌株的GSHE。在其它实施方案中，木霉菌表达重组的GSHE，其中异源多核苷酸编码与SEQ ID NO：6的序列具有至少50％序列同一性的GSHE。

组合物以及工艺条件-

不论GSHE是以不含细胞的提取物形式被供应，还是在包括表达和分泌GSHE的真菌细胞的培养基(发酵液)中供应，将颗粒淀粉底物——优选地以浆状物形式——与GSHE和α淀粉酶基本上同时(本文被称作同时)接触，从而水解颗粒淀粉，产生葡萄糖糖浆。颗粒淀粉的水解是一步骤(one-step)过程。

GSHE可以被加入到包括α淀粉酶和颗粒淀粉底物的组合物中，加入量为大约0.01-10.0GSHE U/g淀粉干固体的浆状物，该浆状物被调节至10-55％干固体。在一些实施方案中，GSHE的加入量的范围为大约0.01-5.0GSHE U/g；大约0.01-2.0GSHE U/g；大约0.01-1.5GSHE U/g；大约0.05-1.5GSHE U/g；大约0.1-5.0GSHEU/g；大约0.1-1.0GSHE U/g；大约0.25-2.5GSHE U/g；大约0.5-5.0GSHE U/g；大约0.5-1.0GSHE U/g这样的溶液。而且在一些优选的实施方案中，GSHE的加入量为大约0.05-1.5GSHE U/g这样的溶液，也可为大约0.1-2.0GSHE U/g这样的溶液，也可为大约0.1-1.0GSHE U/g这样的溶液。

在进一步的实施方案中，GSHE基本上同时与α淀粉酶被加入到颗粒淀粉浆组合物中，其中浆状物被调节到10％至大约55％ds，优选地20-45％ds，以及25-45％ds。在某些实施方案中，构成该组合物的α淀粉酶的加入量在每公吨淀粉大约0.01-1.0kg GZYME 997的范围内。

在一个实施方案中，将颗粒淀粉底物与GSHE接触，其中GSHE可以以无细胞的过滤物形式获得(这样，GSHE从培养基中分离出来)。在另一个实施方案中，将颗粒淀粉底物与GSHE接触，其中GSHE可以以含有分泌的GSHE和真菌细胞的培养基形式获得。优选地，GSHE将由里氏木霉分泌，里氏木霉含有编码多肽的异源多核苷酸，所述多肽具有颗粒淀粉水解活性，并且与SEQ ID NO：3或SEQID NO：6的序列具有至少90％、至少95％和至少98％序列同一性。

本发明的方法在等于或低于底物的颗粒淀粉的胶凝温度的温度下进行。在一些实施方案中，该方法在至少大约25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃和75℃的温度下进行。在其它实施方案中，该方法在低于大约65℃的温度下进行，也在低于大约60℃的温度下进行。在其它实施方案中，该方法在大约30℃到65℃之间的温度下进行；也在大约35℃到65℃之间；大约40℃到65℃之间；大约45℃到65℃之间；大约50℃到65℃之间的温度下进行。在本发明中使用的精确温度依赖于具体的淀粉底物，进一步地可能依赖于特定的植物品种。在一些实施方案中，当玉米是颗粒淀粉底物时，温度是大约55℃到65℃之间，更特别地在大约60℃到65℃之间。

表2说明了对多种淀粉的一般性的淀粉胶凝化温度范围。该表遵从多个来源，这不意味着限制本发明，而是提供作为指导。

表2

淀粉胶凝化的温度范围

淀粉	胶凝化温度范围℃
		大麦	52-59
小麦	58-64
		燕麦	57-70
玉米(maize)	62-72
		高直链淀粉玉米	67-80
大米	68-77
		高梁	68-77
马铃薯	58-68
		木薯粉	59-69
甜薯	58-72

(J.J.M Swinkels 32-38页，STARCH CONVERSIONTECHNOLOGY，Van Beynum等人编著，(1985)MarcelDekker Inc.New York和The Alcohol Textbook 3^rd ED。A reference for the beveraee，fuel and industrial alcoholindustries，Jacques等人编著，(1999)NottinghamUniversity Press，UK)

实施本发明所述方法时的pH范围在大约pH 3.0到pH 6.5的范围；在pH 3.5到pH 6.5的范围；pH 4.0到pH 6.5的范围；pH 4.5到pH 6.0的范围，这些范围在这些方法中可被使用。pH范围有些依赖于具体的酶，本技术领域技术人员将能确定进行这些方法的最佳pH范围，而不需要过多的实验。在一些实施方案中，当玉米是底物时，pH范围是大约pH 4.5-pH 6.0，大约pH 5.0-pH 5.5。

在一些实施方案中，至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、94％、95％、96％、97％、98％和99％的颗粒淀粉干固体被转化为葡萄糖糖浆的组分。在一些实施方案中，颗粒淀粉底物被完全水解。在某些实施方案中，至少90％的颗粒淀粉底物在24小时的时间期间内被水解。在其它实施方案中，至少95％的颗粒淀粉底物在24小时的时间期间内被水解。在其它实施方案中，根据本发明产生的右旋糖糖浆将是含有至少90％葡萄糖的大约32％至46％ds糖浆。

在一些实施方案中，水解颗粒淀粉以产生葡萄糖糖浆所需要的时间期间为大约2-100小时。在一些实施方案中，该时间期间是大约5-100小时。在其它实施方案中，该时间期间是大约10-100小时。仍然在其它实施方案中，该时间期间是大约5-50小时。在其它实施方案中，该时间期间是至少大约10小时，但低于大约50小时。在优选的实施方案中，该一步工艺将在2-100小时内进行，在一些实施方案中，该工艺将在5到50小时内进行。

优选地，溶解的组合物中的葡萄糖产率(总溶解的干固体中的葡萄糖百分比)是至少大约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％和99.5％。更优选地，该产率是至少大约95％，最优选地，该产率是至少大约96％。

本发明的组合物和方法所包括的组分的精确量依赖于所应用的酶的组合，以及所加工的颗粒淀粉的类型。在一些实施方案中，α淀粉酶单位与GSHE单位的比(α淀粉酶∶GSHE)在15∶1到1∶15之间，在一些实施方案中，在10∶1到1∶10之间。在其它实施方案中，该比率在5∶1到1∶5之间，在进一步的实施方案中，α淀粉酶∶GSHE将在4∶1到1∶4之间。在优选的实施方案中，该比率将在大约2∶1到1∶4之间，最优选地在大约2∶1到1∶2之间。

本发明所包括的一步工艺可以包括加入进一步的成分，而不降低颗粒淀粉水解的效果。这些进一步的成分包括但不限于其它酶，如纤维素酶、蛋白酶、支链淀粉酶、半纤维素酶、木聚糖酶及其类似物。

根据本发明的方法产生的葡萄糖可以通过本领域已知的方法从反应混合物中分离。这些方法中的一些方法包括离心、传统的过滤方法和优选的膜分离方法。也可以使用超滤膜系统。在一个优选的实施方案中，葡萄糖糖浆使用分子量截留(MWCO)超滤膜，通过过滤来分离。这些膜在本技术领域是已知的。在一些实施方案中，该膜可以是1,000到1,000,000的MWCO。在其它实施方案中，该分离膜可以是0.1-1.0微升型膜。

葡萄糖到期望的终端产物的进一步转化-

在本发明所包括的方法中，葡萄糖糖浆是优选的终端产物。然而，葡萄糖可以被进一步纯化，以便通过已知方法产生结晶右旋葡萄糖。

葡萄糖也可以被转化为其它期望的终端产物。葡萄糖到其它期望的终端产物的转化可以通过任何合适的方法实现，如酶方法或化学方法。在一个实施方案中，通过用能将葡萄糖转化为终端产物的微生物接触根据本发明获得的葡萄糖，通过葡萄糖的生物转化实现转化。接触步骤可以是连续步骤，其中本发明的方法产生的葡萄糖糖浆接着用微生物接触，以产生终端产物，或者接触步骤可以是同时的步骤，其中颗粒淀粉底物用GSHE和α淀粉酶以及能将通过酶转化产生的葡萄糖糖浆转化为终端产物的微生物接触。微生物可以是野生型、突变的或者重组的微生物。在一些实施方案中，期望的终端产物是果糖、抗坏血酸(ASA)中间产物，如葡萄糖酸酯、2-酮-D-葡萄糖酸酯、2，5-二酮-D-葡萄糖酸酯、2-酮-L-古洛糖酸酯、艾杜糖酸、异抗坏血酸和抗坏血酸；乙醇、1，3-丙二醇、谷氨酸一钠、氨基酸、糖醇、有机酸和靛蓝。

当果糖是期望的终端产物时，根据本发明获得的葡萄糖糖浆可以通过葡萄糖异构酶被酶促转化为果糖糖浆。在一些实施方案中，葡萄糖异构酶被固定化。预期的葡萄糖异构酶包括那些可商购的酶，如G ZYME^TM G993液体和GENSWEET^TM(Genencor International，Inc.)和SWEETZYME T(Novozyme)。(例如参见美国专利3,939,041和美国专利4,687,742)。

当ASA中间产物和ASA是期望的终端产物时，根据本发明获得的葡萄糖糖浆可以被酶促生物转化为葡萄糖酸酯，使用例如葡萄糖脱氢酶(或者葡萄糖氧化酶-过氧化氢酶。葡萄糖酸酯可以通过DKG还原酶被氧化为2，5-二酮-D-葡萄糖酸酯(DKG)。DKG可以通过KLG还原酶还原为2-酮-L-古洛糖酸(KLG)。KLG然后可以被转化为ASA。将葡萄糖转化为ASA和ASA中间产物的方法是熟知的(例如参见美国专利4,945,052，美国专利5,008,193；美国专利5,817,490和美国专利6,358,715)。

当1，3-丙二醇是期望的终端产物时，根据本发明获得的葡萄糖可以与大肠杆菌或其它重组的微生物接触(例如参见美国专利6,013,494，美国专利5,356,812)。

当乙醇是期望的终端产物时，葡萄糖可以后续地或者同时与产乙醇微生物如酿酒酵母接触，以得到乙醇。(例如参见美国专利4,316,956)。可以在本发明的方法中使用的产乙醇微生物的进一步实例，是那些表达醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶的产乙醇微生物例如Zymomonas mobillis(例如参见美国专利5,028,539；5,424,202；5,487,989和5,514,583)。一旦用酵母完成发酵，就可以回收乙醇，例如通过蒸馏，并且应用于可饮用产品、燃料和工业乙醇产品。发酵的副产物包括液体和固体物质，其可以被分离并进一步使用。例如，回收的固体材料可以被用作动物饲料，所述固体材料例如干酒糟(DDG)和DDS与液体副产物的混合物，这形成了带有可溶物的干酒糟(DDGS)。在发酵和乙醇生产过程中应用酵母产生乙醇，在THEALCOHOL TEXTBOOK，A REFERENCE FOR THE BEVERAGE，FUEL ANDINDUSTRIAL ALCOHOL INDUSTRIES，第3版，K.A.Jacques等人编著，1999，Nottingham University Press，UK中有进一步的讨论。

在本发明的一些实施方案中，当葡萄糖糖浆通过例如离心或过滤从反应混合物中分离时，正如上面所提及的，剩余的组分将包括残余淀粉。残余淀粉副产物可以在多种应用中使用。例如，残余淀粉可以被再利用，用作根据本发明的方法中的组分；残余淀粉可以被用作进一步发酵中的碳原料；残余淀粉可以被用在传统的淀粉水解工艺中；残余淀粉可以被用作食物制剂的成分。本发明的一个优选的实施方案包括，在低于颗粒淀粉胶凝的温度，用GSHE和α淀粉酶同时接触颗粒淀粉底物，以水解颗粒淀粉，得到葡萄糖糖浆，从反应混合物分离葡萄糖糖浆，得到葡萄糖糖浆组分和包括残余淀粉的副产物组分。

在一些实施方案中，根据本发明，当残余淀粉在循环步骤中被再利用并且在本发明所包括的方法中使用时，残余淀粉将在低于颗粒淀粉底物的胶凝化温度的温度与包括GSHE和α淀粉酶的组合物同时接触。残余淀粉组分可以包括通过分离膜而被保留下来的酶和/或最新加入到反应器中的GSHE和α淀粉酶。在一些实施方案中，循环步骤联合同时的接触步骤可以被重复多次，进一步地可以在连续的循环条件下发生，其中葡萄糖糖浆通过本技术领域已知的方法分离。反应器或容器中各种组分的接触时间将与上面列出的时间相同，即2-100小时。在一些优选的实施方案中，驻留时间将在5-50小时之间。

在循环步骤实施方案中，残余淀粉可以被循环，以获得葡萄糖糖浆。在一个非限定性实例中，颗粒淀粉浆体(即，具有38-42％ds的玉米淀粉浆状物)可以用腐质霉GSHE(即1.0GSHE U/g)和SPEZYME乙基(即0.6AU/g)在大约58-62℃的温度和pH 5.0-6.0下水解20-24小时，其中至少55％的玉米淀粉被水解，产生了具有至少90％葡萄糖的葡萄糖糖浆。残余淀粉可以被回收，被重悬，与第二轮GSHE和α淀粉酶组合。在第二轮中，大约90％的淀粉被水解，产生了至少90％葡萄糖。葡萄糖糖浆然后可以通过本技术领域已知的方法蒸发，例如真空蒸发，然后被用作葡萄糖供给料。

在循环步骤实施方案中，残余淀粉可以被再利用，以获得除葡萄糖之外的终端产物。例如，当终端产物是乙醇时，颗粒淀粉底物与GSHE、α淀粉酶和产乙醇微生物或者独立地并且连续地，或者同时地接触，以水解颗粒淀粉并且产生乙醇，乙醇可以通过蒸馏回收，包括含有残余淀粉的固体和液体材料的剩余材料可以被再利用，与GSHE和α淀粉酶在进一步的步骤中使用，从而再利用在连续的循环条件下发生。

实验

在随后的公开和实验部分，使用了如下缩写：rH-GSHE(在里氏木霉中表达的灰腐质霉高温变种GSHE)；wt％(重量百分比)；℃(摄氏温度)；rpm(每分钟的转数)；H₂O(水)；dH₂O(去离子水)；bp(碱基对)；kb(千碱基对)；kD(千道尔顿)；gm(克)；μg(微克)；mg(毫克)；ng(纳克)；μl(微升)；ml和mL(毫升)；mm(毫米)；nm(纳米)；μm(微米)；M(摩尔)；mM(毫摩尔)；μM(微摩尔)；U(单位)；V(伏)；MW(分子量)；sec(秒)；min(s)(分钟)；hr(s)(小时)；PAGE(聚丙烯酰胺胶凝电泳)；Di(去离子的)；邻苯二甲酸缓冲液(水中的邻苯二甲酸钠，20mM，pH 5.0)；Cerestar(Cerestar，Inc.，a Cargill Inc.，Minneapolis，MN)； (FMC公司)；SDS(十二烷基硫酸钠)；Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)；w/v(重量与体积之比)；v/v(体积与体积之比)；Genencor(GenencorInternational，Inc.，Palo Alto，CA)；Shin Nihon(Shin Nihon，Japan)。

一般方法：

淀粉底物-纯化的和/或精制的玉米淀粉、小麦淀粉和木薯淀粉被用于下面提供的实施例中。

寡糖分析-寡糖反应产物的组成通过高压液相色谱法测定(Beckman System Gold32 Karat Fullerton，California，USA)，配备有HPLC柱(Rezex 8 u8％H，单糖)，保持在50℃，装配有折射率(RI)检测器(ERC-7515A，RI Detector，The AnspecCompany，Inc.)。稀释的硫酸(0.01N)以每分钟0.6ml的流速被用作流动相。20微升的4.0％溶液被注射到柱子上。柱子基于糖的分子量进行分离。例如DP1表示单糖，如葡萄糖；DP2表示二糖，如麦芽糖；DP3表示三糖，如麦芽三糖，“DP4⁺”指定为聚合度(DP)为4或更高的寡糖。

固体的相对溶解-用传统的低温喷射蒸煮(jet cooking)方法来溶解淀粉(USP3,912,590)。在淀粉与水比率的限定参数下，测定的BRIX被视作淀粉的100％溶解。在典型的喷射蒸煮方法中，在350克水中悬浮150克淀粉产生30％的淀粉浆状物。然后用10％NaOH将pH调节到pH 5.8。热稳定的α淀粉酶，SPEZYME FRED(Genencor International Inc.)以0.4Kg/MT，ds加入，在维持于105℃的喷射蒸煮器中加热8分钟。胶凝化的淀粉于95℃进一步水解90分钟。取出等份水解产物，并且离心。将清澈的上清液用于测量BRIX(ABBE Refractometer，American OpticalCorporation，Scientific Instrument Division，Buffalo，New York)。表3中给出了在30％ds的不同淀粉底物的100％溶解淀粉的BRIX，这些BRIX值用于计算不同处理条件下淀粉的相对溶解百分比。可供选择地，不同条件下100％溶解的BRIX通过在95℃用10微升SPEZYME FRED(Genencor International Inc，)与5ml的等份样品温育5分钟来确定。将高温处理的样品于85℃保持2小时。通过离心分离不溶解的固体，测量清澈上清液的BRIX。

表3

酶喷射蒸煮的淀粉底物在30％浆状物时的BRIX

酶喷射蒸煮的淀粉底物，30％ds	测定的BRIX
		玉米淀粉	28.2
小麦淀粉	27.9
		木薯淀粉	28.5

实施例

提供下述实施例，以便证明并且进一步示意性说明本发明的某些优选的实施方案和方面，不应该认为是限定其范围。实际上，应该预期到这些教导将在进一步优化此处描述的工艺系统中有用。

实施例1

里氏木霉中灰腐质霉高温变种GSHE基因的表达

A.灰腐质霉高温变种GSHE基因的克隆

从冷冻的Scytalidium thermophilum(ATCC 16453，anamorph，灰腐质霉高温变种)菌丝体提取基因组DNA(SEQ ID NO：1)。用干冰在咖啡豆研磨器中研磨冷冻的菌丝体，用EasyDNA方法(Invitrogen)提取DNA。在标准方法中加入额外的氯仿/苯酚/异戊基醇提取物。基于NCBI数据库登记号#M89475序列，设计PCR引物。正向引物含有一个用于定向克隆到pENTR/D载体(Invitrogen)中的基序。

RSH003f引物的序列是：

CAACATGCATACCTTCTCCAAGCTCCTC(SEQ ID NO：7)，RSH004r引物的序列是：TTAACGCCACGAATCATTCA CCGTC(SEQ ID NO.8)。

根据Invitrogen Gateway系统方法，将PCR产物克隆到pENTR/D中。然后将载体转化到化学感受态Top 10大肠杆菌(Invitrogen)中，卡那霉素选择。来自几个克隆的质粒DNA被限制性消化，以确认正确尺寸的插入物。随后从几个克隆对gla1插入物进行测序(Sequetech，Mountain View，CA)。来自一个克隆的质粒DNA，pENTR/D_N13，被加入到带有pTrex3g/amdS目的载体DNA的LR克隆酶反应(Invitrogen Gateway系统)中。在LR克隆酶反应中，通过重组，目的载体的CmR和ccdB基因被来自pENTR/D载体的灰腐质霉gla1代替。该重组在目的载体的cbh1启动子和终止子之间定向插入gla1。48bp和50bp的重组位点序列分别保持在gla1的上游和下游。将等份的LR克隆酶反应转化到化学感受态Top 10大肠杆菌中，过夜培养，用羧苄青霉素选择。将来自几个克隆的质粒DNA用适当的限制酶消化，以确认正确的插入物大小。用Xba1消化来自克隆的质粒DNA，pTrex3g_N13(参见图3和4)，以释放包含cbh1启动子：gla1：cbh1终止子：amdS的表达盒子。该6.6kb盒子使用标准技术通过琼脂糖凝胶提取方法进行纯化，并转化到源自可公开获得的菌株QM6a的里氏木霉菌株中，正如下面进一步描述的。

通过Sequetech，Mountain View，CA对盒子进行测序，图1中描述了GSHE的DNA(SEQ ID NO：1)，图2中描述了氨基酸序列(SEQ ID NO：2和3)。

B.里氏木霉的转化-

将大约2cm²的形成孢子的菌丝体(在PDA平板上在30℃生长5天)平板接种到置于250ml的、带有4个挡板的振荡烧瓶中的50mM YEG(5g/L酵母提取物加上20g/L葡萄糖)培养液中，37℃在200rpm下培养16-20小时。通过将液体体积转移到50ml锥形管中并且于2500rpm旋转离心10分钟，回收菌丝体。弃去上清液。将菌丝体沉淀物转移到250ml的、0.22微米CA Corning过滤瓶中，CACorning过滤瓶中含有40ml的、经滤过的β-D-葡聚糖酶溶液，30℃、200rpm下培养2小时，以便产生用于转化的原生质体。

通过用无菌miracloth进行过滤，原生质体被收获到50ml锥形管中。通过以2000rpm旋转离心5分钟将它们沉淀，并抽吸掉液体。用50ml的1.2M山梨糖醇将原生质体沉淀物洗涤一次，旋转沉淀下来，抽吸掉液体，用25ml的山梨糖醇/CaCl₂洗涤。对原生质体计数，然后以2000rpm 5分钟沉淀，倒尽上清液，将原生质体沉淀物重悬在足够量的山梨糖醇/CaCl₂中，以获得每毫升含1.25×10⁸个原生质体的原生质体浓度，从而产生原生质体溶液。

将最多20μg的表达载体DNA(体积不超过20μl)的等份物放置到15ml锥形管中，将管子置于冰上。然后在每份转化等份物中加入200μl的原生质体悬液，以及50μl PEG溶液。轻轻地混合管子，冰上温育20分钟。将PEG溶液(2ml)加入到转化等份物管子中，室温下将这些管子温育5分钟。加入山梨糖醇/CaCl₂溶液(4ml)至管子中(得到的总体积为6.2ml)。将转化混合物分为3个等份，每份含有大约2ml。通过将这三份等份物中的每一份加入到含有融化的顶层琼脂的三个管子中(通过维持在50℃而保持融化状态)，形成覆盖混合物(overlay mixture)；并将该覆盖混合物倾倒到转化平板上。然后在30℃将转化平板培养4到7天。

实施转化，用amdS进行选择。对于转化，使用乙酰胺/山梨糖醇平板和顶层琼脂。制备顶层琼脂的配方是与平板一样的山梨糖醇/乙酰胺琼脂配方，除了使用低熔点琼脂糖代替Noble琼脂。通过将分离出的克隆转移到含有乙酰胺的新鲜选择性培养基(即，山梨糖醇/乙酰胺琼脂，没有山梨糖醇)中，来纯化转化子。

关于实施例，如下所述地制备溶液。

1)在1.2M山梨糖醇中配制40ml β-D-葡聚糖酶溶液，含有600mg β-D-葡聚糖酶(InterSpex Products Inc.，San Mateo，CA)和400mg MgSO₄·7H₂O。

2)200ml PEG混合物，含有50g PEG 4000(BDH Laboratory Supplies Poole，England)和1.47g CaCl₂·2H₂O，配制在dH₂O中。

3)山梨糖醇/CaCl₂，含有1.2M山梨糖醇和50mM CaCl₂。

4)乙酰胺/山梨糖醇琼脂：

第I部分-0.6g乙酰胺(Aldrich，99％纯度.)，1.68g CsCl，20g葡萄糖，20gKH₂PO₄，0.6g MgSO₄·7H₂O，0.6g CaCl₂·2H₂O，1ml 1000x盐(见下文)，调节到pH 5.5，用dH₂O补足体积(300mls)，无菌过滤。

第II部分-20g Noble琼脂和218g山梨糖醇，用dH₂O补足体积(700mls)，高压灭菌。

将第II部分加入到第I部分，至终体积为1L。

5)1000x盐-将5g FeSO₄·7H₂O，1.6g MnSO₄·H₂O，1.4g ZnSO₄·7H₂O，1g CoCl₂·6H₂O混合，用dH₂O将体积补足到1L。将溶液无菌过滤。

C.用灰腐质霉高温变种GSHE基因转化的里氏木霉的发酵

一般地，遵照如Foreman等人所描述的发酵方法(Foreman等人(2003)J.Biol.Chem 278：31988-31997)。更具体地，对图5中所示的每一菌株进行双份发酵。用1.5ml冷冻的孢子悬液接种含有5％葡萄糖的0.8L的Vogels基本培养基(Davis等人(1997)Methods in Enzymology 17A，第79-143页；和Davis，Rowland，NEUROSPORA，CONTRIBUTIONS OF A MODEL ORAGNISM，Oxford UniversityPress，(2000))。48小时后，将每一培养物转移到14L Biolafitte发酵罐中的6.2L的相同培养基中。发酵罐在25℃、750RPM和每分钟8个标准升的空气流中运行。在初始葡萄糖消耗完毕后1小时，开始进行25％(w/w)的乳糖供给，以碳限制方式供给，以阻止乳糖累积。用葡萄糖氧化酶测定试剂盒或者葡萄糖己糖激酶测定试剂盒(Instrumentation Laboratory Co.，Lexington，MA)分别监控葡萄糖和乳糖的浓度，其中β-半乳糖苷酶被加入以分解乳糖。以规律的时间间隔获得样品，以便监控发酵进程。收集的样品用International Equipment Company(Needham Heights，MA)的临床离心机在50ml离心管中以3/4速率旋转离心。

样品上清液在4-12％的BIS-TRIS SDS-PAGE凝胶上跑胶，在还原条件下采用MOPS(吗啉代丙烷磺酸)SDS跑胶缓冲液和LDS样品缓冲液进行。结果被提供在图5中。泳道3、4和5说明了在不同时间的68kD rGSHE条带。

D.测定来自转化的里氏木霉克隆的GSHE活性

酶活性-GSHE活性被确定为：将0.1M醋酸盐缓冲液，pH 4.5中的5ml的10％颗粒玉米淀粉与酶制剂等份在50℃温育，在这个过程中每分钟(min)释放出的还原糖(以葡萄糖当量测量)的毫克数(mg)。一个单位的GSHE被定义为：在测定条件下，每分钟释放1.0mg的还原糖。

来自灰腐质霉高温变种的天然GSHE(nGSHE)和从里氏木霉产生的重组体GSHE，是通过标准技术纯化的，其中采用使用了苯基-琼脂糖凝胶的疏水相互作用色谱(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)，随后采用使用了SP-琼脂糖凝胶的离子交换色谱法(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。由里氏木霉克隆最初表达的重组GSHE包括两个蛋白峰组分，以大约相等的浓度存在。这些峰被标记为rGSHE1和rGSHE2。这两个峰值在质量上相差1500D，且相差0.3个pH单位，正如通过基质辅助激光解吸附法和离子化法(MALDI-TOF)所测量的，这是在voyageur质谱仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)和等电聚焦凝胶(SERVAElectrophoresis，GmbH，Heidelberg，Germany)上根据制造商的说明书进行的。rGSHE1和rGSHE2都具有相同的比活性，如通过生淀粉水解测定和蛋白质测定来测量的，所述测定使用了MicroBCA蛋白测定试剂盒(Pierce，Rockford，IL)和白分溶液消光系数(A280 0.1％＝1.963)。在一段时间后，在初始的rGSHE表达后的大约72小时时进行测量，只有一种形式的rGSHE被呈现(rGSHE3)(参见表4)。

表4

GSHE的来源	比活性GSHE单位/mg	％总碳水化合物
			天然GSHE	9.0	1.12
rGSHE1/rGSHE2	8.0/8.0	2.70
			rGSHE3	8.0	0.57

GSHEs的％碳水化合物(CHO)是通过使用4N三氟乙酸在100℃酸水解5小时来确定的，测量值由使用对羟基苯甲酸酰肼时释放的还原糖获得。

当最初被表达时，rGSHE1和rGSHE2的糖基化是总碳水化合物的2.70％。然而，在72小时后，在培养基中发现的rGSHE3的糖基化水平是0.57％总CHO。天然GSHE的糖基化水平是1.12％。

E.来自灰腐质霉高温变种的天然GSHE和里氏木霉中重组表达的灰腐质霉高温变种GSHE的比较

(1)在pH 3到7确定pH稳定性

用pH 4.5的20mM乙酸盐缓冲液，将上面描述的重组产生的GSHE的收集样品以及天然GSHE的样品稀释到相等的蛋白质浓度。然后，在100mM柠檬酸盐/NaOH缓冲液中，在50℃在pH 3到7的pH水平，进行反应30分钟。

然后，将1.0ml的反应物加入到样品管中，样品管中含有处于100mM乙酸盐，pH 4.5之中的5ml 10％玉米淀粉(Cargill Foods，Minneapolis，MN)。在50℃将管子振荡20分钟。然后加入0.5ml的2.0％NaOH。旋转离心管子，使用二硝基水杨酸(Dinitro Salicylic acid，DNS)测定法测定0.5ml上清液的还原糖(Goto等人，(1994)见上文)。

测定结果描述在图8A中。重组产生的GSHE在pH 3.5表现出大约80％的残余活性。作为比较，相应的天然GSHE表现出仅仅大约20％的残余活性。在pH4.0，重组产生的GSHE和天然GSHE都表现出大约82％的残余活性；在pH 5.5两种酶表现出大约90到100％之间的残余活性。

也在pH 7.5到10.5，使用上面描述的方法测量稳定性。然而，缓冲液是100mM的硼酸/NaOH缓冲液。正如图8B中所表现的，在pH 7.5，两种酶表现出大约100％的残余活性。在pH 8.5，重组产生的GSHE表现出大约82％的残余活性，天然GSHE表现出大约90％的残余活性。在pH 9.5，重组产生的GSHE的％残余活性实质性地低于天然GSHE(分别地，10％相对于72％)。

(2)作为温度的函数的活性曲线

在pH 5.75，确定温度稳定性。使用与上面针对pH稳定性研究所描述的程序基本上相同的程序，将酶样品在100mM乙酸盐缓冲液中稀释到相等的蛋白质浓度，然后将1.0ml的稀释酶在温度为40℃、50℃、60℃和70℃的水浴中暴露10分钟，按照上面在pH稳定性研究中的描述进行测定。结果如表5中所示。

表5

GSHE来源	温度℃	％残余活性
			天然的GSHE	40	100
	50	95
				60	90

70	0
		重组的GSHE	40	100
50	93
			60	92
70	0

％残余活性是指，参考于pH 4.0时的100％的差异百分数

重组产生的GSHE的活性关于温度的函数曲线，类似于相应的天然GSHE的曲线。

(3)通过nGSHE和rGSHE进行的颗粒玉米淀粉的水解

将来自灰腐质霉高温变种的天然GSHE(nGSHE)和里氏木霉中重组表达的灰腐质霉高温变种GSHE(rGSHE)，在pH 4.5的乙酸盐缓冲液中稀释到相等的蛋白质浓度。将1ml的稀释物加入到处于20mM pH 4.5乙酸盐缓冲液中的10％玉米淀粉(Cargill Foods，Minneapolis，MN)浆状物中，在50℃以350rpm振荡。以指定的时间间隔，取出100μL的浆状物，加入到10μL的2％NaOH中。旋转离心样品，使用葡萄糖氧化酶试剂，用Monarch临床分析仪器(Instrumentation Laboratory，Lexington，MA)测定上清液的葡萄糖(mg葡萄糖/mg蛋白)。正如图9中所示，与nGSHE相比，rGSHE的玉米淀粉水解略微低一些。

实施例2

里氏木霉中泡盛曲霉河内变种GSHE基因的表达

A.克隆泡盛曲霉河内变种GSHE基因

根据实施例1中描述的方法，从泡盛曲霉河内变种菌株的冷冻菌丝体中提取基因组DNA。基于泡盛曲霉河内变种葡糖淀粉酶GAI的公开序列(Hayashida等人(1989)Agric.Biol.Chem.53：923-929)，设计PCR引物序列。这一GAI是GSHE。使用了下述引物：具有序列：CAC CAT GTC GTT CCG ATC TCT TCT C(SEQ IDNO：9)的RSH10f引物，其包括Gateway(Invitrogen)定向克隆基序CACC；和具有序列：CTA CCG CCA GGT GTC GGT CAC(SEQ ID NO：10)的RSH11r引物。

图6提供了DNA序列(SEQ ID NO：4)。所编码的GSHE多肽序列，包括信号肽，提供在图7A中(SEQ ID NO：5)，成熟蛋白质序列提供在图7B中(SEQID NO：6)。

根据Gateway系统方法，2.16kb PCR产物被凝胶纯化(Gel Purification试剂盒，Qiagen)，并克隆进pENTR/D中。然后将载体转化到化学感受态Top 10大肠杆菌(Invitrogen)中，卡那霉素选择。来自几个克隆的质粒DNA被限制性消化，以确认正确大小的插入物。来自几个克隆的GAI基因插入物(SEQ ID NO：4)被测序(Sequetech，Mountain View，CA)。来自一个克隆的质粒DNA，pENTR/D_Ak33xx#1，被加入到带有pTrex3g/amdS目的载体DNA的LR克隆酶反应(Invitrogen Gateway system)中。在LR克隆酶反应中发生的重组，将目的载体的Cm^R和ccdB基因替换为来自pENTR/D载体的河内曲霉(A.kawachi)GAI。该重组将GAI定向插入到目的载体的cbh1启动子和终止子之间。48bp和50bp的AttB重组位点序列分别保留在葡糖淀粉酶的上游和下游。参考图3，其中灰腐质霉gla1已经在该实施例被河内曲霉GAI替换。将2微升的LR克隆酶反应转化进入化学感受态Top 10大肠杆菌中，过夜培养，用羧苄青霉素选择。用XbaI消化来自几个克隆的质粒DNA，以确认插入物的大小。来自克隆的质粒DNA，pTrex3g_Akxx#3，用XbaI消化，以释放包括cbh1启动子：GAI：cbh1终止子：amdS的表达盒子。使用标准技术通过琼脂糖提取，纯化该6.7kb表达盒子，并且将其转化到源自可公开获得的菌株QM6a的里氏木霉菌株中。

B.用泡盛曲霉河内变种GSHE基因转化里氏木霉

将里氏木霉孢子悬液涂布到MABA转化平板的中心～6cm直径(150μl的5×10⁷-5×10⁸孢子/ml悬液)。然后，将平板在生物学通风橱(biological hood)中风干。将stopping screen(BioRad 165-2336)和macrocarrier holder(BioRad 1652322)浸入到70％乙醇中，并风干。将DriRite干燥剂放置到小的培养皿中(6cm Pyrex)，用Whatman滤纸覆盖。将含有macrocarrier(BioRad 165-2335)的macrocarrier holder平放在滤纸上面，代替培养皿的盖子。

通过在微量离心管中加入60mg钨M-10颗粒(microcarrier，0.7微米，Biorad#1652266)，制备钨颗粒悬液。加入1ml乙醇(100％)。将钨在乙醇溶液中涡旋振荡，允许其浸泡15分钟。以最大速度将微量离心管进行短暂离心，以使钨发生沉淀。倾倒出乙醇，用无菌蒸馏水洗涤三次。在第三次水洗涤被倒出之后，将钨重新悬浮在1ml的无菌50％甘油中。每两周一次，制备新鲜的钨。

对于每一次转化，通过将25μl的悬浮钨加入到1.5ml微量离心管中，制备转化反应物。随后，按次序加入0.5-5μl DNA(0.2-1μg/μl)，25μl 2.5M CaCl₂，10μl0.1M亚精胺。将反应物连续地涡旋振荡5-10分钟，使钨保持悬浮。然后，短暂地微量离心(microfuge)微量离心管，并且倒空液体。用200μl的70％乙醇洗涤钨沉淀，短暂地微量离心，以形成沉淀，并倒出液体。用200μl的100％乙醇洗涤沉淀物，短暂微量离心以发生沉淀，并倒出液体。通过在24μl 100％醇中进行吹打，将钨沉淀重新悬浮。将微量离心管放置到超声波水浴中，时间15秒；将8μl等份试样转移到干燥的macrocarriers的中心。让macrocarriers在干燥的培养皿干燥。

将氦罐(He tank)打开到1500psi。1100psi rupture discs(BioRad 165-2329)被用于Model PDS-1000/氦生物弹射颗粒传送系统(Model PDS-1000/He BiolisticParticle Delivery System(BioRad))。当钨溶液干时，将stopping screen和macrocarrierholder插入到PDS-1000中。MABA平板，其含有靶里氏木霉孢子，被放置到stoppingscreen下面6cm处。将29英寸Hg柱的真空施加到该腔上，并且予以保持。发射氦生物弹射颗粒传送系统。排空该腔，取出MABA平板，在28℃温育5-7天。

关于实施例2，如下地制备溶液。

修饰的amdS Biolistic琼脂(MABA) 每升

部分I 在500ml dH₂O中配制

1000x盐 1ml

Noble琼脂 20g

pH到6.0，高压灭菌

部分II 在500ml dH₂O中配制

乙酰胺 0.6g

CsCl 1.68g

葡萄糖 20g

KH₂PO₄ 15g

MgSO₄·7H₂O 0.6g

CaCl₂·7H₂O 0.6g

pH到4.5，0.2微米过滤除菌；置于50℃烤箱中

加热，加入到部分I中，混合，倒平板

1000x盐每升

FeSO₄·7H₂O 5g

MnSO₄·H₂O 1.6g

ZnSO₄·7H₂O 1.4g

CoCl₂·6H₂O 1g

0.2微米过滤除菌

依照如上在实施例1中针对灰腐质霉高温变种的表达所进行的描述，确定 rGSHE的表达(在里氏木霉中表达的泡盛曲霉河内变种GSHE)。表达水平被确定大于1g/L(数据没有示出)。图10提供了SDS-PAGE凝胶结果，说明了里氏木霉宿主中泡盛曲霉河内变种GSHE的表达情况。

实施例3

通过α淀粉酶进行的不同颗粒淀粉底物的溶解和水解。

在典型的实验中，将150克颗粒淀粉悬浮在350克的蒸馏水中。在混合后，用6N NaOH将pH调节到pH 5.5。将α淀粉酶(GZYME G997，以1.0kg/MT淀粉，ds的量使用)加入到淀粉浆状物中，在维持在60℃的水浴中温育，同时进行不断的搅拌。在不同的时间点取出样品，测量Brix。使用HPLC，在24小时时取出的样品被用来确定糖组成(表6)。

表6

表6中所示的结果表明：在颗粒淀粉底物的溶解上，存在显著性差异。小麦具有最高的溶解固体百分数，玉米具有最低百分数。24小时后，在糖组成上没有观察到显著性差异。

实施例4

α淀粉酶(G ZYME G 997)和rH-GSHE所致的颗粒淀粉底物的溶解和水解

在典型的实验中，将350g水分别地加入到150g的颗粒玉米淀粉、颗粒小麦淀粉和颗粒木薯淀粉中的每一种中，使用6N NaOH将pH调节到pH 5.5。将浆状物保持在水浴中，水浴保持在60℃，同时连续地搅拌以便均匀混合。在温度稳定后，将α淀粉酶如G Zyme G 997(0.1Kgs/MT淀粉ds)和rH-GSHE(1.0GSHE单位/克淀粉ds)加入到每一种淀粉浆状物中，继续温育。在不同的时间取出样品，离心，检查Brix。分析24小时样品的糖组成。通过与喷射蒸煮(jet cooking)工艺的Brix进行比较，计算颗粒淀粉的相对溶解，参考表7。

表7

与目前的高温喷射蒸煮工艺相比，在温和条件下，G Zyme G 997和rH-GSHE的联合作用导致颗粒淀粉底物的几乎完全的溶解。24小时样品的分析显示葡萄糖产率高于96.5％。

实施例5

通过具有颗粒淀粉水解活性的葡糖淀粉酶进行的颗粒玉米淀粉的溶解和水解。

将来自黑曲霉(OPTIDEX L-400和G Zyme G 990 4X，来自GenencorInternational Inc)和雪白根霉(Rhizopus niveus)(CU.CONC.，来自Shin NihonChemicals，Japan)的表现出颗粒淀粉水解活性的可商购获得的葡糖淀粉酶，与上面实施例1中所描述的rH-GSHE进行比较。使用上面描述的测定法，测量这些产品的颗粒淀粉水解活性。

表8

葡糖淀粉酶	GSHE单位/g
		OPTIDEX L-400	555
G Zyme G 990 4X	474
		CU.CONC.	1542
rH-GSHE	518

在一个典型的实验中，处于蒸馏水中的30％颗粒玉米淀粉浆状物(350g蒸馏水中有150克淀粉)被制备，使用6N NaOH将pH调节到pH 5.5。G Zyme G997以0.1kg/MT淀粉ds的量加入，将淀粉浆状物保持在维持于60℃的水浴中。向含有G Zyme G 997的每种淀粉浆状物中，以相等剂量加入不同的葡糖淀粉酶，即1.5个GSHE单位/克淀粉，ds；在60℃温育。在不同的时间取出等份试样，并离心。将清澈的上清液用于测量Brix。通过HPLC分析温育了2、6、22.5和49小时的样品的总糖组成，结果如表9所示。

表9

葡糖淀粉酶以1.5GSHEU/g的剂量加入到具有0.1kG/MT ds的α淀粉酶的起始浆状物中。

实施例6

在用α淀粉酶(G Zyme G 997)和rH-GSHE温育的过程中，pH对颗粒玉米淀粉(35％浆状物)的溶解的影响.

在一个典型的实验中，372g水加入到178g玉米淀粉中。充分搅拌浆状物以便混匀，使用6N NaOH将浆状物的pH调节到pH 4.0、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0。然后将样品保持在维持于60℃的水浴中。在温度平衡后，将Zyme G997以0.1kg/MT淀粉的量和rH-GSHE如实施例1中所描述地(1.0GSHE单位/g淀粉)加入到浆状物中。在温育过程中，连续地搅拌浆状物，1小时后取出样品，测量brix(表10)。

表10

在60℃的温育pH	％最大溶解
		4.0	9.9
5.0	100.0
		5.5	100.0
6.0	95.0
		6.5	92.0
7.0	76.7

最大溶解发生在pH 5.0和pH 5.6。在60℃时颗粒玉米淀粉溶解性的显著性降低发生在低于pH 5.0和pH 5.5时，这表明酶的活性较低或者失活。

实施例7

用α淀粉酶和rH-GSHE温育的过程中，温度对颗粒玉米淀粉(32％浆状物)溶解的影响

在一个典型的实验中，372g水加入到178g玉米淀粉中。充分搅拌浆状物以便混匀，使用6N NaOH将浆状物的pH调节到pH 5.5。然后将浆状物保存在维持于55℃、60℃和65℃的水浴中。在温度平衡后，将Zyme G997以0.1kgs/MT淀粉的量和rH-GSHE如实施例1中所述地(1.0GSHE单位/g淀粉)加入。在温育过程中，连续地搅拌浆状物，1小时后测量brix(表11)。

表11

温育温度℃	％溶解的淀粉
		55	28.7
60	51.4
		65	59.6
70	75.1

在存在G Zyme G997和rH-GSHE的情况下，颗粒玉米淀粉的溶解度随着温度的升高而增加。然而，高于65℃时，对溶解的碳水化合物进行的HPLC分析表明rH-GSHE发生失活，这是以较低水平的葡萄糖含量为证据的。在较高的温度(＞65℃)，溶解的固体含量的增加主要是由于G Zyme G997在较高温度下对颗粒玉米淀粉的液化作用。

实施例8

G Zyme G997和rH-GSHE浓度对颗粒玉米淀粉的溶解和水解的影响

在不同的烧杯中，将372g水中的颗粒玉米淀粉(178g)充分搅拌，以便混匀。将浆状物的pH调节到pH 5.5。将两种不同水平的G Zyme G997，即0.1Kgs/MT淀粉和0.5Kgs/MT，与0.25、0.5和1.0GSHE单位/g ds淀粉的rH-GSHE在60℃温育。在不同的时间取出样品，用于测量brix和总糖组成(表12A和12B)。

表12A

表12A中的结果表明：将G Zyme G997的剂量从0.1Kgs/MT淀粉增加到0.5Kg/MT淀粉，导致颗粒淀粉更快速溶解。但对于两种水平，在存在1.0GSHE单位的rH-GSHE的情况下，都在24小时内发生了大于95％的颗粒淀粉溶解。在存在G Zyme G997的情况下，rH-GSHE浓度对颗粒淀粉溶解的影响随着浓度的剂量增加而显著增加。上述结果清楚地表明：这些酶中的任何一个，G Zyme G997或rH-GSHE，都不能单独地将颗粒淀粉溶解至完全。然而，当这些酶一起加入时，颗粒淀粉发生了完全的溶解。

在pH 5.5和60℃，在用G ZYME G997和rH-GSHE温育颗粒玉米淀粉的过程中，在12、24和30小时时，用HPLC分析溶解的颗粒(32％浆状物)玉米淀粉的碳水化合物(糖)组成，参考表12B。

表12B

表12B中的结果表明：嗜热脂肪芽孢杆菌α淀粉酶和rH-GSHE的适当掺合物，在由颗粒淀粉直接进行糖甜味剂和生化制品的商业生产中，将满足多种需求，而不必使用传统的高温蒸煮过程。高水平的α淀粉酶加快颗粒淀粉的溶解速率，但更高水平的rH-GSHE导致高水平的转化反应产物，从而导致高级糖的显著低水平。

实施例9

通过葡糖淀粉酶制剂进行的酶液化玉米淀粉底物(可溶的淀粉底物)和颗粒玉米淀粉(不可溶的)的水解的比较。

在一个典型的实验中，玉米淀粉(32％ds)采用低温喷射蒸煮工艺(105℃，8分钟)在pH 5.6液化，接着在95℃水解90分钟。在液化工艺中，将SPEZYMEFRED(Genencor International Inc)以0.4Kgs/MT淀粉，ds加入。将SPEZYME FRED液化淀粉底物的pH值调到pH 4.2，以0.22GAU/g ds加入葡糖淀粉酶(OPTIDEXL-400)。水解在60℃进行。在不同的时间取出样品，通过HPLC分析确定达到最大葡萄糖产率所需要的时间。

制备蒸馏水中的32％ds颗粒玉米淀粉浆，使用1N NaOH将浆的pH调节到pH 5.5。然后将烧杯保持在维持于60℃的水浴中，以0.1Kgs/MT ds加入G ZymeG997，以1.0 GSHE单位/克ds加入rH-GSHE，将样品于60℃温育，同时不断地搅拌。在不同时间取出样品，测量BRIX和葡萄糖产率(表13)。

表13

底物	葡糖淀粉酶	达到最大葡萄糖的时间(小时)	在最大葡萄糖产率时的组成(％)DP1 DP2 DP3 DP4⁺
				液化的淀粉可溶的，32％浆状物	OPTIDEXL-400	61	95.2 3.1 0.4 1.3
颗粒淀粉不可溶，32％浆状物	rH-GSHE和GZYME G997	24	96.8 2.8 0.2 0.2

与不可溶的颗粒淀粉的水解相比，液化的可溶性淀粉通过葡糖淀粉酶进行的水解需要更长的时间来达到最大葡萄糖产率。在达到最大葡萄糖产率的峰值时刻，与液化可溶性淀粉相比，颗粒淀粉的葡萄糖水平更高，DP4⁺糖明显更少(96.8和0.2，与95.2和1.3相比)。

更高的葡萄糖产率、更短糖化时间的潜能、总体避免了高温喷射蒸煮步骤，将本发明的α淀粉酶和GSHE酶掺合物的应用区分出来。

实施例10

在用G Zyme G 997(0.1Kgs/MT)和rH-GSHE(1.0GSHE单位/g)进行的温育中，颗粒玉米淀粉浓度对淀粉溶解和水解的影响

在蒸馏水中制备不同浓度的颗粒玉米淀粉浆，即32％、35％、38％、40％和42％。浆的pH调节到pH 5.5。然后将样品保持在维持于60℃的水浴中，连续地搅拌，以便混匀。将G Zyme G997(0.1Kgs/MT的ds)和从实施例1获得的rH-GSHE(1.0GSHE单位/g ds)加入到浆中。在温育过程中，在不同的时间取出等份样品，测量brix和糖组成(表14)。

表14

结果表明，对于高达36％的溶解固体，在24小时的糖化期间内能达到超过96％的葡萄糖糖浆。当在糖化工艺中使用不可溶的颗粒淀粉时，对于高于35％的固体水平，实现了大于96％的葡萄糖产率。

实施例11

正如上面所教导的以及本技术领域已知的，高葡萄糖糖浆的酶-酶淀粉转化工艺包括：通过使用热稳定α淀粉酶对不可溶的淀粉底物进行高温液化，产生可溶性液化物(liquefact)。在商业上，通常的实践是在用葡糖淀粉酶进行糖化之前，灭活残余的α淀粉酶活性，以降低由于存在活性α淀粉酶而造成的葡萄糖产率的损失。残余的α淀粉酶活性的灭活通常是通过在95℃将液化物降低到pH 4.2来进行的。高温和pH 4.5导致α淀粉酶完全灭活。因此，我们研究了在pH 5.5时，在液化淀粉的糖化过程中，存在和不存在活性α淀粉酶对葡萄糖产率的影响。

在一个典型的实验中，使用G Zyme G 997(0.4Kgs/MT淀粉)作为液化酶，在喷射蒸煮工艺条件下(32％ds淀粉，在105℃，8分钟，随后是95℃ 90分钟)，从玉米淀粉产生可溶性液化物。将液化淀粉的一部分进一步加热，以灭活残余α淀粉酶活性。存在和不存在残余α淀粉酶活性的情况下的液化淀粉的糖化，在pH5.5，60℃，使用实施例1中描述的rH-GSHE以0.5GSHE单位/g进一步糖化(32％ds)。在不同时间取出样品，使用HPLC分析葡萄糖产率(表15)。

表15

表15中的结果表明，在通过葡糖淀粉酶进行可溶性淀粉底物(液化物)的糖化过程中，存在G Zyme G 997α淀粉酶活性导致更低的葡萄糖产率。然而，α淀粉酶增强了葡糖淀粉酶进行的不可溶(颗粒)淀粉底物的水解，从而导致实质上高水平的葡萄糖。

实施例12

从玉米淀粉的水解产生葡萄糖糖浆和残余淀粉

在反应器容器中，将1200g水中的颗粒玉米淀粉(800g)充分搅拌，以便混匀，得到浆状物。用4N NaOH将浆状物的pH调节到pH 5.5。将G Zyme G997(0.1Kgs/MT淀粉)和在里氏木霉中表达的灰腐质霉高温变种GSHE(rH-GSHE)以1.0GSHE U/g淀粉的量，在60℃加入。在不同的时间取出样品，用于测量Brix和总的糖组成(表16)。

表16

反应时间	3小时	6小时	9小时
				％溶解	60.7	80.4	88.6

在10小时的反应时间内，得到超过90％的颗粒淀粉溶解后，获得了如表17所示的溶解颗粒玉米淀粉糖组成，这是用HPLC测量的。

表17

糖类型	DP1	DP2	DP3	DP4+
					％组成	97.5	1.9	0.2	0.5

在10小时反应时间后，用4N H₂SO₄将pH调节到3.5，从而终止水解。糖浆混合物含有大于96％的右旋糖，以大于30％溶解固体存在。使用500,000分子量截留(MWCO)超滤膜元件(AG Technology，MA)在60℃过滤混合物。

将残余淀粉的样品干燥，通过扫描电子显微镜(Hitachi S-5000 cold fieldemission SEM(Tokyo，Japan))检查其结构，并与在根据本发明的方法暴露于酶之前的典型的淀粉颗粒进行比较(图12)。使用双面粘合剂碳胶带将干燥样品固定在SEM样品桩上。通过用压缩空气扫尘(dusting)，去除任何过量的样品。然后以大约30°的角度，将样品安装在Bal-Tec Med 020 Modular High Vacuum Coating System(Liechtenstein)中，在以60rpm旋转的同时，用10nn铂(Pt)喷溅涂覆。这些设置确保颗粒均匀地在所有面上被涂覆。与淀粉颗粒的酶促作用所导致的特征的尺寸相比，涂层的厚度是可以忽略的。加速电压在2-5kV之间变化，放大倍数在500-15,000x之间。

显微镜照片图12a描述了暴露于本发明的酶组合物和方法之前的典型淀粉颗粒。表面是光滑且均匀的，仅有的可观察到的特征是细小裂纹，这是由铂金属涂覆所致。一旦暴露于本发明的酶掺合物和方法，颗粒的表面形态学就会变化。正如在图12的显微照片b-d中所看到的，大的圆孔钻入颗粒中，这是由于酶消化淀粉颗粒底物。孔在直径上是有变动的，并且在深度上也有变化，反映出处于酶促反应的不同动力学阶段的淀粉颗粒群体。一些颗粒具有仅仅一些数量的孔，而一些几乎布满了孔(显微镜照片b)。一些颗粒还被分成两半，显示了经消化的内部的横截面(显微镜照片c和d)。显微镜照片d揭示了颗粒消化至完全，显示了中空外壳的片断。

Claims

1.用于在丝状真菌宿主细胞中产生具有葡糖淀粉酶活性的颗粒淀粉水解酶(GSHE)的方法，所述方法包括：

a)用异源DNA构建物转化丝状真菌宿主细胞，所述异源DNA构建物包含选自以下的DNA序列：

(i)由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4代表的DNA序列；

(ii)编码SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：6的DNA序列；或者

(iii)在严紧杂交条件下与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4杂交并且编码具有葡糖淀粉酶活性的蛋白质的DNA序列；

b)在合适的培养基中培养转化的丝状真菌宿主细胞，以允许所述GSHE表达，和

c)产生所述GSHE。

2.根据权利要求1的方法，所述方法进一步包括回收产生的GSHE。

3.根据权利要求1的方法，其中丝状真菌宿主细胞是木霉菌细胞。

4.根据权利要求3的方法，其中木霉菌细胞是里氏木霉(T.reesei)细胞。

5.根据权利要求1的方法，其中由转化的丝状真菌宿主细胞所表达的GSHE的糖基化水平低于在天然真菌宿主中所表达的GSHE的糖基化水平。

6.根据权利要求1的方法，其中转化的丝状真菌宿主细胞在连续发酵条件下培养。

7.根据权利要求1的方法，其中转化的丝状真菌宿主细胞在分批发酵条件下培养。

8.根据权利要求1的方法，其中所述GSHE的序列由SEQID NO：3或SEQ ID NO：6代表。

9.重组的木霉菌细胞，其包括选自以下的异源多核苷酸：

(i)由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4所代表的DNA序列；

(ii)由SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：6所编码的DNA序列；或

(iii)在严紧杂交条件下与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4杂交并且编码具有葡糖淀粉酶活性的蛋白质的DNA序列。

10.发酵培养基，所述培养基包含由根据权利要求9的里氏木霉细胞的培养物所产生的具有葡糖淀粉酶活性的颗粒淀粉水解酶。

11.用于从颗粒淀粉浆产生葡萄糖糖浆的方法，所述方法包括在低于颗粒淀粉的胶凝化温度的温度，用权利要求10所述的发酵培养基和来自芽孢杆菌菌株的α淀粉酶同时接触颗粒淀粉底物；和允许α淀粉酶和GSHE作用2至100小时之间的一段时间，以水解所述颗粒淀粉，得到葡萄糖糖浆。

12.权利要求11的方法，其中所述颗粒淀粉浆包括玉米淀粉。