JP2023508871A - テルペンの毒性の低減および微生物中での生成可能性の増大 - Google Patents

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Abstract

本発明は、毒性物質、例えば、テルペンおよびアルコールならびに他の膜破壊性物質に対する微生物宿主細胞の耐性を増大させるための新規方法、ならびに未改変型生物と比較してそのような増大した耐性を有する改変型生物に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、毒性物質、例えば、テルペンおよびアルコールならびに他の膜破壊性物質に対する微生物宿主細胞の耐性を増大させるための新規方法、ならびに未改変型生物と比較してそのような増大した耐性を有する改変型生物に関する。
イソプレノールは、天然に存在するテルペノイド化合物のクラスに属する（Withers and Keasling, 2006）。3-メチル-3-ブテン-1-オールが、これらもまたテルペノイドのクラスに属するシトラール、メントールおよび他の風味化合物の化学生成に対する基礎である。シトラールは、ビタミンAおよびEならびに数種類のカロテノイドの合成のために継続的に用いられている。イソプレノールも、長寿のための先導的栄養補助食品として議論されている（Pandey et al., 2019）。近年、Amyris社およびIsobionics社などの会社が、バイオ技術的発酵プロセスで合成されるアルテミシン酸（artemisinic acid）、バレンセンおよびノートカトンなどのテルペノイド製品を導入している。それらの会社は現在、香料および香味料ビジネスでのその製品ポートフォリオをさらに拡大し（Janssen, 2015）、したがって化学合成に挑戦するために、生物学的生産プラットホームを開発中である。
微生物でのテルペノイド化合物のバイオ技術生産は、そこから単純な脱リン酸化によりイソプレノールが取得できる、天然の前駆体であるイソペンテニル二リン酸（IPP）に依存する。現在までの生物工学は、イソプレノール前駆体IPPの細胞内濃度を増加させることに焦点を当てた。モデル生物である大腸菌では、これは、IPPを生成する追加の代謝経路であるDXP経路を導入することにより達成され、これにより、61mg/Lの生成物力価が生じる（Liu et al., 2014）。プレノールとイソプレノールとの混合物を生成物と考える場合、最大1g/Lの力価が現在可能である（Kang et al., 2017）。現在までに、毒性中間体IPPが、これらのプロセスでの主要な障害として特定されている（George et al., 2018；Kang et al. , 2019）。現在の研究プロジェクトは、イソペンテノールがバイオマスに由来する加水分解型多糖から取得される統一されたプロセスを開発しようと試みている（Wang et al., 2019）。
テルペノイドのバイオ技術的生産での重要な問題は、微生物に対するそれらの毒性であり（Brennan et al., 2015）、したがって、すべての経済的に存続可能なバイオプロセスが直面しなければならない問題である。この問題は、国際公開第2015/002528号として公開された国際特許出願に開示される通りの二相産生システムを用いることにより、かつ比較的高い耐性まで産生株を進化遺伝子操作することにより、克服することができる。
微生物中でモノテルペンエステルを生産することもまた実証されてきた。ゲラニオールを大腸菌で産生する場合、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子が酢酸ゲラニルの形成を媒介したことが観察された（Liu et al. Biotechnol Biofuels (2016) 9:58）。より特異的な酵素の使用が、以下の利点をもたらすことが示されている：ゲラニオールなどのモノテルペンアルコールのみならず、多数の植物の花の香りに見出される非環式モノテルペンであるリナロールもまた、微生物に対して非常に毒性である一方で、それらのエステルは、多くの場合にはるかに毒性が低い。モノテルペンアルコールの毒性は、しばしば、成長および/または産生の停止を引き起こし、したがって、非常に低い生成物力価しか達成されない。Chaconらは、ゲラニオールを生成するために遺伝子操作された大腸菌でのRhAATの発現が、RhAATの非存在下で生成されるゲラニオールのレベルと比較して実質的に増加したレベルで、酢酸ゲラニルの形成をもたらしたことを示している（Chacon, M.G., et al. Esterification of geraniol as a strategy for increasing product titre and specificity in engineered Escherichia coli. Microb Cell Fact 18, 105 (2019)；https://doi.org/10.1186/s12934-019-1130-0；国際公開第2019/092388号）。その理由のために、ゲラニオールなどのモノテルペンアルコールのin situエステル化が、生成物を解毒し、したがって、テルペン生成を増大させるための手段として推進されてきている。
国際公開第2015/002528号 国際公開第2019/092388号
Withers, S. T. and Keasling, J. D. (2006) ‘Biosynthesis and engineering of isoprenoid small molecules’, Applied Microbiology and Biotechnology. Springer-Verlag, 73(5), pp. 980-990. doi: 10.1007/s00253-006-0593-1. Pandey, S. et al. (2019) ‘3-Methyl-3-buten-1-ol (isoprenol) confers longevity and stress tolerance in Caenorhabditis elegans’, International Journal of Food Sciences and Nutrition. Taylor & Francis, pp. 1-8. doi: 10.1080/09637486.2018.1554031. Janssen, T. (2015) Isobionics Presentation Food Valley Expo 15. Liu, H. et al. (2014) ‘MEP pathway-mediated isopentenol production in metabolically engineered Escherichia coli’, Microbial Cell Factories. BioMed Central, 13(1), p. 135. doi: 10.1186/s12934-014-0135-y. Kang, A. et al. (2017) ‘High-throughput enzyme screening platform for the IPP-bypass mevalonate pathway for isopentenol production’, Metabolic Engineering. Elsevier Inc., 41, pp. 125-134. doi: 10.1016/j.ymben.2017.03.010. George, K. W. et al. (2018) ‘Integrated analysis of isopentenyl pyrophosphate (IPP) toxicity in isoprenoid-producing Escherichia coli’, Metabolic Engineering. Elsevier Inc. doi: 10.1016/j.ymben.2018.03.004. Kang, A et al.(2019) "Optimization of the IPP-bypass mevalonate pathway and fed-batch fermentation for the production of isoprenol in Escherichia coli", Metabolic Engineering, Volume 56, pp 85-96, https://doi.org/10.1016/j.ymben.2019.09.003. Wang, S. et al. (2019) ‘NaCl enhances Escherichia coli growth and isoprenol production in the presence of imidazolium-based ionic liquids’, Bioresource Technology Reports. Elsevier, 6, pp. 1-5. doi: 10.1016/J.BITEB.2019.01.021. Brennan, T. C. R. et al. (2015) ‘Evolutionary Engineering Improves Tolerance for Replacement Jet Fuels in Saccharomyces cerevisiae.’, Applied and environmental microbiology. American Society for Microbiology, 81(10), pp. 3316-25. doi: 10.1128/AEM.04144-14. Liu et al. Biotechnol Biofuels (2016) 9:58 Chacon, M.G., et al. Esterification of geraniol as a strategy for increasing product titre and specificity in engineered Escherichia coli. Microb Cell Fact 18, 105 (2019) https://doi.org/10.1186/s12934-019-1130-0
解決するための課題は、イソプレノール生物産生に比較的適した宿主細胞などの、テルペノイドおよび/または他の毒性物質に対する耐性を有する宿主細胞およびテルペノイドおよび/または他の毒性物質に対する耐性を増大させるための方法を開発することであった。
驚くべきことに、宿主細胞に対するいくつかの新規かつ予測されない改変が、テルペンおよび他の物質に対する広範囲の耐性を生じることが見出された。
本発明は、毒性物質、例えば、テルペンおよびアルコールならびに他の膜破壊性物質に対する微生物宿主細胞の耐性を増大させるための新規方法、ならびに未改変型宿主細胞と比較してそのような増大した耐性を有する宿主細胞を開示する。
テルペンであるメントール、ゲラニオール、シトラール、イソプレノールの毒性は、大腸菌、サッカロミセス・セレビシエ、シュードモナス・プチダおよびロドバクター・スフェロイデスの未改変型生物を用いて試験された。全部が毒性作用を示したが、特にゲラニオールおよびシトラールが強く分解され、このことが、それらを本発明者らの遺伝子操作アプローチに対して好適でなくさせた。これらおよび類似の毒性物質に対する微生物の耐性を増大させるのに有用な改変を決定するために、大腸菌株MG1655の細胞を、細胞を死滅させないが、順応および突然変異を可能にする様式で、60mMイソプレノールの存在下で一定増殖させた。続いて、選択圧を増大させるために、80世代後に、最初の60mM（50％阻害用量EC50よりも10mM高い）から80mMイソプレノールまで濃度を増加させた。この濃度レジメンでは、野生型大腸菌細胞は増殖できないが、順応した大腸菌株は増殖し、親大腸菌と比較して低下したイソプレノール濃度でさらに早い増殖を示した。220世代超の過程にわたって、分離株を詳細な分析のために生成した。3つの並行培養（分離株A～C）および進化の7つの異なる時点（T1～T7）に由来する分離株を、増大した耐性の原因である改変に関して分析した。深度分析での後、最も有望であると考えられる改変を単離し、大腸菌野生型細胞およびノックアウト細胞へと導入した。
これらの改変を用いて、本明細書中に開示される通りの多数の物質の宿主細胞に対する増殖阻害作用を低減できた。したがって、本発明は、テルペンの毒性を低減し、かつ微生物での産生能力を増大させる方法およびそのような改善された特徴を有する宿主細胞を開示する。
以下の物質の構造式を示す図である：A：イソプレノール（3-メチル-3-ブタン-1-オール）、B：イソブタノール、C：プレノール、D：ゲラニオールおよびE：バニリン。 増殖が50％阻害されるイソブタノール濃度（EC50）（65mM）での単離された菌株の増殖を示す図である。 増殖が50％阻害されるプレノール濃度（EC50）（40mM）での単離された菌株の増殖を示す図である。 進化実験中の突然変異の発生の概要を示す図である。A：突然変異の合計頻度および突然変異の培養中での最初の発生の時点。 進化実験中の突然変異の発生の概要を示す図である。B：順応した菌株での突然変異の持続性。持続性は、進化実験中での発生の時点に関して補正された突然変異の頻度である。 A：yghBプロモーター領域中の仮想的調節エレメントを示す図である。上側の鎖および下側の相補的配列が示される。黒色四角は、オープンリーディングフレーム（ORF）の開始および開始メチオニン（Met）を示す。この上流の非翻訳領域（UTR）が示される。この領域中には、-35領域の上流に考えられる調節モチーフ、直接反復および-35領域の下流の逆向き反復が予測される。黒色矢印は、市松模様のボックスにより示される欠失の領域中のモチーフ、および逆向きモチーフに関して示される。転写因子結合性は、リプレッサーとして作用して転写を阻害する可能性がある。B：仮想的結合性モチーフのコンセンサス配列を示す図である（van Helden, Andre and Collado-Vides, 1998）。 C：Aに示されたプロモーター部分の拡大図を示す図である：yghB ORFの上流の欠失（濃灰色バー）および推定上の調節モチーフの注記（灰色矢印）がより詳細に示される。D：順応菌株でのyghBのプロモーター領域中の配列変化を示す図である。上側の鎖は野生型配列（P_yghB wt）を表わし、下側の鎖は欠失を有する配列（P_yghB del.）を表わす。市松模様のボックスは、下部に示されるものに野生型プロモーター配列を変化させた欠失を表わす。黒色四角は、オープンリーディングフレーム（ORF）の開始および開始メチオニン（Met）を示す。この上流のUTRが示される。 野生型と比較して有意に差次的に発現された転写産物を示す図である。全3種類の生物学的サンプル中で、異なるDEアルゴリズムに関して、有意に差次的に発現された遺伝子（P＜0.05）。(A) 有意に過剰発現された転写産物（log2＞1.35）、(B) 有意にダウンレギュレーションされた転写産物（log2＜-2.7）。 50mMイソプレノールでの突然変異体rob H48fs発現菌株の相対的適応度（μ菌株/μwt）を示す図である。 50mMイソプレノールでの、0μM IPTG誘導を用いて突然変異型robH48fsを発現するrobおよびmarCの組み合わせノックアウト菌株の相対的適応度（μ菌株/μwt）を示す図である。 A：異なるブタノール濃度でのブタノール毒性に関するスクリーニングの結果ならびに様々な濃度での元の菌株および7.5g/Lでの順応菌株での増殖速度を示す図である。略語Mut T6 Aは、本明細書中、上記の通りの分離株AのT6世代の突然変異型菌株を定義する。B：5g/Lブタノールを用いた異なる遺伝子操作型菌株の増殖速度の評価。本アッセイでの野生型増殖速度は、0.25 1/hであった。yghBおよびrob H48fsは、誘導を伴わずに、漏出性IPTG誘導性プロモーターから発現された。 A：バニリン耐性の評価を示す図である。異なるバニリン濃度で、大腸菌野生型菌株を増殖させた。1g/Lバニリンでは、順応菌株の増殖速度も試験された。Mut T6 Aは、本明細書中、上記の通りの分離株AのT6世代の突然変異型菌株を定義する。B：1.5g/Lバニリンを用いた異なる遺伝子操作型菌株の増殖速度の評価。本アッセイでの野生型増殖速度は、0.23 1/hであった。yghBおよびrobHは、誘導を伴わずに、漏出性IPTG誘導性プロモーターから発現された。 BW25113菌株中の50mMイソプレノールでのΔrraAの相対的適応度（μ菌株/μwt）を示す図である。
属性または値と関連する用語「本質的に」、「約」、「おおよそ」、「実質的に」などはまた、特に、それぞれ、属性を正確にも、または値を正確にも、規定する。同じ機能的活性または実質的に同じ機能の文脈での用語「実質的に」とは、参照機能と比較して、好ましくは20％の範囲内、より好ましくは10％の範囲内、最も好ましくは5％以下の範囲内の、機能の差異を意味する。製剤または組成物の文脈では、用語「実質的に」（例えば、「実質的に化合物Xからなる組成物」）は、製剤または組成物内で所与の作用を有する言及された化合物を実質的に含有し、そのような作用を有するさらなる化合物を含有しないか、またはそのような化合物の測定可能もしくは関連する作用を示さない最大量で含有することとして、本明細書中で用いることができる。所与の数値または範囲の文脈での用語「約」は、特に、所与の値もしくは範囲の、20％以内、10％以内、または5％以内である値もしくは範囲に関する。本明細書中で用いる場合、用語「含む」はまた、用語「からなる」も包含する。
用語「単離された」とは、物質が、その元来の環境内で天然に関連する少なくとも1種の他の構成要素を実質的に含まないことを意味する。例えば、生存動物中に存在する、天然に存在するポリヌクレオチド、ポリペプチド、または酵素は単離されていないが、天然の系で共存する物質の一部もしくは全部から分離された同じポリヌクレオチド、ポリペプチド、または酵素は、単離されている。さらなる例として、単離された核酸（例えば、DNAまたはRNA分子）は、それが由来する生物の天然に存在するゲノム中に存在する場合には通常は直に連続する、5'または3'隣接配列と直に連続していないものである。そのようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部であるか、無関係の遺伝的バックグラウンドの細胞のゲノムに（または本質的に類似する遺伝的バックグラウンドを有する細胞のゲノムに、しかしそれが天然に存在する箇所とは異なる箇所に）組み込まれるか、またはPCR増幅もしくは制限酵素消化により生成されることができるであろうが、あるいはin vitro転写により生成されるRNA分子、および/またはそのようなポリヌクレオチド、ポリペプチド、または酵素は、組成物の一部であり得、かつさらに単離されて、そのようなベクターまたは組成物がその天然の環境の一部ではないものであり得る。
「精製された」とは、物質が比較的純粋な状態にあること、例えば、少なくとも約90％純粋、少なくとも約95％純粋、または少なくとも約98％もしくは99％純粋であることを意味する。好ましくは、「精製された」とは、物質が100％純粋な状態にあることを意味する。
「合成」または「人工的」化合物は、in vitro化学合成または酵素合成により生成される。この用語は、限定するものではないが、酵母細胞宿主もしくは選択された他の発現宿主などの宿主生物に対する最適なコドン使用頻度を有して作製された変異体核酸、または、例えば、ポリペプチドの特性を最適化するために、野生型タンパク質配列と比較して、アミノ酸改変（例えば、置換など）を有する変異体タンパク質配列を含む。
用語「天然に存在しない」とは、その元来の環境または供給源中に存在しない、（ポリ）ヌクレオチド、アミノ酸、（ポリ）ペプチド、酵素、タンパク質、細胞、生物、または他の物質を意味するが、それが当初はその元来の環境または供給源に由来し、その後に他の手段により再生したものであり得る。そのような天然に存在しない（ポリ）ヌクレオチド、アミノ酸、（ポリ）ペプチド、酵素、タンパク質、細胞、生物、または他の物質は、構造的および/もしくは機能的に、その天然の対応物に類似するかまたはそれと同じであることができる。
用語「生来型」（または「野生型」もしくは「内因性」）細胞または生物および「生来型」（または野生型もしくは内因性）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは、それぞれ、天然に見出される細胞または生物、ならびに、その天然の形態および遺伝的環境中の細胞中で見出される（すなわち、いかなるヒト介入も有さない）、対象となるポリヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する。
用語「異種」（または外因性もしくは外来性もしくは組み換え）ポリペプチドは、以下の通りに本明細書中で定義される：
(a) 宿主細胞に対して生来型でないポリペプチド。そのような異種ポリペプチドのタンパク質配列は、合成、天然に存在しない、「人造の」タンパク質配列である；
(b) 宿主細胞に対して生来型のポリペプチドであるが、構造的改変（例えば、欠失、置換、および/または挿入）が、該生来型ポリペプチドを変化させるための組み換えDNA技術による宿主細胞のDNAの操作の結果として含められる；または
(c) 組み換えDNA技術による宿主細胞のDNAの操作（例えば、より強力なプロモーター）の結果として、その発現が量的に変更されるか、またはその発現が生来型の宿主細胞とは異なるゲノム位置から行なわれる、宿主細胞に対して生来型であるポリペプチド。
上記の説明(b)および(c)は、その天然の形態にあるが、産生に用いられる細胞により天然に発現されない配列を意味する。産生されたポリペプチドは、したがって、「組み換え的に発現される内因性ポリペプチド」としてより正確に定義され、これは上記の定義とは矛盾しないが、タンパク質の配列は合成または操作されていないが、ポリペプチド分子が産生される様式である特別な状況を反映する。
同様に、用語「異種」（または外因性もしくは外来性もしくは組み換え）ポリヌクレオチドは、以下のことを意味する：
(a) 宿主細胞に対して生来型でないポリヌクレオチド；
(b) 宿主細胞に対して生来型のポリヌクレオチドであるが、構造的改変（例えば、欠失、置換、および/または挿入）が、該生来型ポリヌクレオチドを変化させるための組み換えDNA技術による宿主細胞のDNAの操作の結果として含められる；
(c) 組み換えDNA技術によるポリヌクレオチドの調節エレメントの操作（例えば、より強力なプロモーター）の結果として、その発現が量的に変更されている、宿主細胞に対して生来型であるポリヌクレオチド；または
(d) 組み換えDNA技術による遺伝子操作の結果として、宿主細胞に対して生来型であるが、その天然の遺伝的環境内にインテグレーションされていないポリヌクレオチド。
2種類以上のポリヌクレオチド配列または2種類以上のアミノ酸配列に関して、用語「異種」は、2種類以上のポリヌクレオチド配列または2種類以上のアミノ酸配列が、互いにその特定の組み合わせで天然に存在しないことを特徴付けるために用いられる。
用語「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、「核酸分子」は、本明細書中で相互に交換可能に用いられ、かついずれかの長さのポリマー性非分岐形態のヌクレオチド（リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドまたは両者の組み合わせのいずれか）を意味する。
ヌクレオチド配列（例えば、コンセンサス配列）に関して、IUPACヌクレオチド命名法（Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry (NC-IUB) (1984). “Nomenclature for Incompletely Specified Bases in Nucleic Acid Sequences”）を、本発明に対して重要な以下のヌクレオチドおよびヌクレオチド多義性定義を含めて用いた：A、アデニン；C、シトシン；G、グアニン；T、チミン；K、グアニンまたはチミン；R、アデニンまたはグアニン；W、アデニンまたはチミン；M、アデニンまたはシトシン；Y、シトシンまたはチミン；D、シトシンでない；N、いずれかのヌクレオチド。
加えて、表記「N（3～5）」は、示されたコンセンサス位置が、3～5個のいずれかの（N）ヌクレオチドを有し得ることを意味する。例えば、コンセンサス配列「AWN（4～6）」は、4個、5個、または6個のいずれかのヌクレオチドを末端に含む、3種類の考えられる変異体AWNNNN、AWNNNNN、AWNNNNNNを表わす。
用語「調節エレメント」および「調節配列」は、本明細書中ですべて相互に交換可能に用いられ、限定するものではないが、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現をはじめとする、それに関連付けられる配列の発現に影響を及ぼすことが可能である調節核酸配列を意味するとして広い文脈で解釈されるべきである。調節エレメントまたは調節配列としては、個別に、かつ/あるいは特定の配置内または配置内の他のエレメントもしくは配列のグループ内で、機能または目的を有するいずれかのヌクレオチド配列が挙げられる。調節配列の例としては、限定するものではないが、リーダーまたはシグナル配列（5'-UTRなど）、開始シグナル、プロペプチド配列、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、ポリアデニル化配列、リボソーム結合部位（RBS、シャイン・ダルガノ配列）、終止シグナル、ターミネーター、3'-UTR、およびそれらの組み合わせが挙げられる。調節エレメントまたは調節配列は、互いに、または発現対象であるヌクレオチド配列に対して、生来型（すなわち、同じ遺伝子に由来する）または外来性（すなわち、異なる遺伝子に由来する）であり得る。
用語「機能的に連結された」とは、記載された構成要素が、それらの意図される様式で機能することを許容する関係にあることを意味する。例えば、コード配列に機能的に連結された調節配列は、コード配列の発現が調節配列と適合し得る条件下で達成される様式で、ライゲーションされる。
核酸およびポリペプチドは、タグまたはドメインを含むように改変することができる。タグは、検出、精製、可溶化、または固相化のためをはじめとする様々な目的のために利用することができ、例えば、ビオチン、蛍光団、エピトープ、接合因子、または調節配列を含むことができる。ドメインは、いずれかのサイズであり得、所望の機能を提供する（例えば、増大した安定性、溶解性、活性を賦与する、精製を簡素化する）ものであり得、例えば、結合性ドメイン、シグナル配列、プロモーター配列、調節配列、N末端伸長部、またはC30末端伸長部を含むことができる。タグおよび/またはドメインの組み合わせもまた利用することができる。
用語「融合タンパク質」とは、当技術分野で公知のいずれかの手段により、一緒に連結された2つ以上のポリペプチドを意味する。これらの手段としては、化学合成または組み換え遺伝子操作によるコード核酸のスプライシングが挙げられる。
コードされるタンパク質に変化を導入するための核酸の改変方法
・遺伝子編集
遺伝子編集またはゲノム編集は、DNAが挿入されるか、置き換えられるかまたはゲノムから除去され、かつ改変された生物学的活性を有するタンパク質をコードする核酸もしくはその一部の変異体を作製するために（Castle et al., (2004) Science 304(5674): 1151-4；米国特許第5,811,238号および同第6,395,547号）、DNAシャッフリングの反復およびそれに続く適切なスクリーニングおよび/もしくは選択からなる「遺伝子シャッフリング」または「指向性進化」などの様々な技術を用いることにより、または生じるトランスジェニック生物が導入されたプロモーターに近接する遺伝子の改変された発現に起因して優性表現型を示す「T-DNA活性化」タグ付け（Hayashi et al. Science (1992) 1350-1353）、または「TILLING」（ゲノム中の標的化誘発性局所的損傷(Targeted Induced Local Lesions In Genomes)）により、取得できる、遺伝子操作の種類であり、改変された発現および/または活性を有するタンパク質をコードする核酸を作製および/または特定するために有用な突然変異誘発技術を意味する。TILLINGはまた、そのような突然変異体を保持する生物の選択も可能にする。TILLINGのための方法は、当技術分野で周知である（McCallum et al., (2000) Nat Biotechnol 18: 455-457；Stemple (2004) Nat Rev Genet 5(2): 145-50により総説される）。別の技術は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、CRISPR/Casシステム、および遺伝子操作型メガヌクレアーゼ（再遺伝子操作型ホーミングエンドヌクレアーゼなど）などの人工的に操作されたヌクレアーゼを用いる（Esvelt, KM.; Wang, HH. (2013), Mol Syst Biol 9 (1): 641; Tan, WS.et al. (2012), Adv Genet 80: 37-97; Puchta, H.; Fauser, F. (2013), Int. J. Dev. Biol 57: 629-637）。
・突然変異誘発
DNAおよびそれらがコードするタンパク質は、新規もしくは変化した特性を有する変異体タンパク質または酵素を作製するために、分子生物学で公知の様々な技術を用いて、改変することができる。例えば、ランダムPCR突然変異誘発（例えば、Rice (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5467-5471を参照されたい）；またはコンビナトリアル多重カセット突然変異誘発（例えば、Crameri (1995) Biotechniques 18:194-196を参照されたい）。
あるいは、核酸（例えば、遺伝子）は、ランダムな、または「確率論的」な断片化後に再アセンブリさせることができ、例えば、米国特許第6,291,242号；同第6,287,862号；同第6,287,861号；同第5,955,358号；同第5,830,721号；同第5,824,514号；同第5,811,238号；同第5,605,793号を参照されたい。
あるいは、改変、付加または欠失は、エラープローンPCR、シャッフリング、部位指向性突然変異誘発、アセンブリPCR、セクシュアルPCR突然変異誘発（sexual PCR mutagenesis）、in vivo突然変異誘発（ファージ支援漸進的進化、in vivo漸進的進化）、カセット突然変異誘発、再帰的アンサンブル突然変異誘発、指数関数的アンサンブル突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、遺伝子再アセンブリ、遺伝子部位飽和突然変異誘発（GSSM）、合成的ライゲーション再アセンブリ（SLR）、組み換え、再帰的配列組み換え、ホスホロチオエート（phosphothioate）修飾DNA突然変異誘発、ウラシル含有鋳型突然変異誘発、ギャップあり二重鎖突然変異誘発、点ミスマッチ修復突然変異誘発、修復欠損宿主株突然変異誘発、化学的突然変異誘発、放射起源突然変異誘発、欠失突然変異誘発、制限選択突然変異誘発、制限精製突然変異誘発、人工的遺伝子合成、アンサンブル突然変異誘発、キメラ型核酸マルチマー作製、ならびに/またはこれらおよび他の方法の組み合わせにより、導入される。
あるいは、「遺伝子部位飽和突然変異誘発」または「GSSM」は、米国特許第6,171,820号および同第6,764,835号に詳細に記載される通り、ポリヌクレオチドに点突然変異を導入するために、縮重オリゴヌクレオチドプライマーを用いる方法を含む。
あるいは、合成的ライゲーション再アセンブリ（SLR）は、非確率論的にオリゴヌクレオチド構成要素同士を一緒にライゲーションさせる方法を含む（例えば、米国特許第6,537,776号に開示される通り）。
あるいは、テイラーメイド複数部位コンビナトリアルアセンブリ（Tailored multi-site combinatorial assembly）（「TMSCA」）は、1回の反応で、少なくとも2種類の突然変異誘発性非重複オリゴヌクレオチドプライマーを用いることにより、複数部位で様々な突然変異の異なる組み合わせを有する複数の子孫ポリヌクレオチドを生成する方法である（PCT国際公開第2009/018449号に記載される通り）。
配列アライメントは、以下のものなどの多数のソフトウェアツールを用いて生成できる：
－ Needleman and Wunschアルゴリズム - Needleman, Saul B. & Wunsch, Christian D. (1970). "A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins". Journal of Molecular Biology. 48 (3): 443-453.
このアルゴリズムは、例えば、2つの配列の全域アライメントを行なう、「NEEDLE」プログラム中に実装される。NEEDLEプログラムは、例えば、欧州分子生物学オープンソフトウェアスイート（EMBOSS）内に含められる。
－ EMBOSS：様々なプログラムの集合体：The European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS), Trends in Genetics 16 (6), 276 (2000)。
－ BLOSUM（BLOcks SUbstitution Matrix）：典型的には、（例えば、タンパク質ドメインの）保存領域のアライメントに基づいて作成される（Henikoff S, Henikoff JG: Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 1992 Nov 15;89(22):10915-9）。多数のBLOSUMのうちの1つが、「BLOSUM62」であり、これはしばしば、タンパク質配列をアライメントする場合の多数のプログラムの「デフォルト」設定である。
－ BLAST（基本的局所アライメント検索ツール）は、数種類の個別のプログラム（BlastP、BlastN、...）からなり、これらは、大型配列データベース中で類似配列に関して検索をするために主に用いられる。BLASTプログラムはまた、局所アライメントも作成する。典型的には、NCBI（米国国立生物工学情報センター）により提供される「BLAST」インターフェースが用いられ、これは改良バージョン（「BLAST2」）である。「元の」BLAST：Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J. (1990) "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215:403-410；BLAST2：Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402。
酵素変異体は、親酵素と比較した場合の、それらの配列同一性により定義することができる。配列同一性は、通常、「％配列同一性」または「％同一性」として提供される。第1のステップで2種類のアミノ酸配列間の同一性パーセントを決定するために、それら2種類の配列間でペアワイズ配列アライメントを作成し、このとき、2種類の配列は、それらの完全長でアライメントされる（すなわち、ペアワイズ全域アライメント）。アライメントは、プログラムのデフォルトパラメータ（gapopen＝10.0、gapextend＝0.5およびmatrix＝EBLOSUM62）を用いて、好ましくはプログラム「NEEDLE」（欧州分子生物学オープンソフトウェアスイート（EMBOSS））を用いることにより、Needleman and Wunschアルゴリズム（J. Mol. Biol. (1979) 48, p. 443-453）を実装するプログラムを用いて、生成される。本発明の目的のために好ましいアライメントは、最高配列同一性を決定できるアライメントである。
以下の例は、2種類のヌクレオチド配列を説明することを意図するが、同じ計算が、タンパク質配列に適用される：
Seq A：AAGATACTG 長さ：9塩基
Seq B：GATCTGA 長さ：7塩基。
それ故、より短い配列は、配列Bである。
それらの完全長にわたって両方の配列を示すペアワイズ全域アライメントの生成は、以下のものを生じる。
Figure 2023508871000001
アライメント中の「｜」記号は、同一の残基（DNAに関しては塩基またはタンパク質に関してはアミノ酸を意味する）を示す。同一残基の数は6である。
アライメント中の「-」記号はギャップを示す。Seq B内でアライメントにより導入されるギャップの数は、1である。Seq Bの縁でアライメントにより導入されるギャップの数は2であり、Seq Aの縁では1である。
それらの完全長にわたってアライメントされた配列を示すアライメント長は、10である。
本発明に従ってその完全長にわたってより短い配列を示すペアワイズアライメントの生成は、結果として、以下のものを生じる：
Figure 2023508871000002
本発明に従ってその完全長にわたって配列Aを示すペアワイズアライメントの生成は、結果として、以下のものを生じる：
Figure 2023508871000003
本発明に従ってその完全長にわたって配列Bを示すペアワイズアライメントの生成は、結果として、以下のものを生じる：
Figure 2023508871000004
その完全長にわたってより短い配列を示すアライメント長は、8である（1つのギャップが存在し、これは、より短い配列のアライメント長に含まれる）。
したがって、その完全長にわたってSeq Aを示すアライメント長は、9である（Seq Aが本発明の配列であることを意味する）。
したがって、その完全長にわたってSeq Bを示すアライメント長は、8である（Seq Bが本発明の配列であることを意味する）。
2つの配列をアライメントした後、第2のステップで、同一性値が、生成されたアライメントから決定される。この説明の目的のために、同一性パーセントは、％同一性＝(同一残基/その完全長にわたってより短い配列を示すアライメント領域の長さ)*100により算出される。つまり、本実施形態に従う2つのアミノ酸配列の比較に関連する配列同一性は、その完全長にわたってより短い配列を示すアライメント領域の長さによって、同一残基の数を除算することにより、算出される。この値に100を乗じて、「％同一性」を与える。上記で提供された例に従えば、％同一性は：(6/8)*100＝75％である。
サンタレンシンターゼの変異体は、全長ポリペプチド配列と比較して、それぞれの親ポリペプチド分子のアミノ酸配列に対して少なくともnパーセント同一であるアミノ酸配列を有することができ、nは、50～100の整数、好ましくは、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98または99である。
サンタレンシンターゼ変異体は、親酵素と比較した場合のそれらの配列類似性により定義することができる。配列類似性は通常、「％配列類似性」または「％類似性」として提供される。第1のステップで配列類似性を算出するために、上記の通りに配列アライメントを作成する必要がある。第2のステップでは、類似性パーセントを算出する必要があり、一方で、配列類似性パーセントは、規定されたアミノ酸の組が、例えば、それらのサイズにより、それらの疎水性により、それらの電荷により、または他の特徴により、類似の特性を共有することを考慮する。本明細書中では、類似するアミノ酸による、あるアミノ酸の交換は、「保存的突然変異」と称される。保存的突然変異を含む酵素変異体は、タンパク質フォールディングに対して最小限の影響を有するようであり、それにより、親酵素の酵素特性と比較した場合に、特定の酵素特性が実質的に維持される。
本発明に従う％類似性の決定のために、例えば、データベース検索および配列アライメントのために最も用いられるアミノ酸類似性マトリックスのうちの1つである、「NEEDLE」プログラム（上記で言及される通り）により用いられる通りの、BLOSUM62マトリックスにも従って、以下のことが適用される。
アミノ酸Aは、アミノ酸Sに類似する
アミノ酸Dは、アミノ酸E；Nに類似する
アミノ酸Eは、アミノ酸D；K；Qに類似する
アミノ酸Fは、アミノ酸W；Yに類似する
アミノ酸Hは、アミノ酸N；Yに類似する
アミノ酸Iは、アミノ酸L；M；Vに類似する
アミノ酸Kは、アミノ酸E；Q；Rに類似する
アミノ酸Lは、アミノ酸I；M；Vに類似する
アミノ酸Mは、アミノ酸I；L；Vに類似する
アミノ酸Nは、アミノ酸D；H；Sに類似する
アミノ酸Qは、アミノ酸E；K；Rに類似する
アミノ酸Rは、アミノ酸K；Qに類似する
アミノ酸Sは、アミノ酸A；N；Tに類似する
アミノ酸Tは、アミノ酸Sに類似する
アミノ酸Vは、アミノ酸I；L；Mに類似する
アミノ酸Wは、アミノ酸F；Yに類似する
アミノ酸Yは、アミノ酸F；H；Wに類似する。
保存的アミノ酸置換は、酵素などの機能的タンパク質のポリペプチド配列の配列の全長にわたって生じ得る。一実施形態では、そのような突然変異は、酵素の機能的ドメインに付随しない。一実施形態では、保存的突然変異は、酵素の触媒中心に付随しない。
したがって、本説明に従えば、以下の類似性パーセントの算出が適用される：
％類似性＝[(同一残基＋類似残基)/その完全長にわたってより短い配列を示すアライメント領域の長さ]*100。つまり、本実施形態に従う2つのアミノ酸配列の比較に関連する配列類似性は、同一残基の数プラス類似残基の数をその完全長にわたってより短い配列を示すアライメント領域の長さによって除算することによって算出される。この値に100を乗じて、「％類似性」を与える。
全長ポリペプチド配列と比較して、それぞれの親配列に対して少なくともm％類似である保存的突然変異を含む変異体酵素であって、mは50～100の整数、好ましくは50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98または99である変異体酵素は、本質的に変化していない酵素特性（酵素活性など）を有することが予測される。
本明細書中で用いる場合、「構築物」、「遺伝子構築物」または「発現カセット」（相互に交換可能に用いられる）は、本明細書中に記載される通りの1種以上の調節配列に（少なくともプロモーターに）機能的に連結された、発現される対象となる少なくとも1種の配列から構成されるDNA分子である。典型的には、発現カセットは、3つのエレメントを含む：プロモーター配列、オープンリーディングフレーム、および3'非翻訳領域（真核生物では通常、ポリアデニル化部位を含む）。追加の調節エレメントとしては、転写エンハンサーならびに翻訳エンハンサーが挙げられる。イントロン配列もまた、細胞質中に蓄積する成熟メッセージの量を増加させるために、5'非翻訳領域（UTR）に、またはコード配列中に、付加することができる。当業者は、成功裏に発現されるべき発現カセット中に存在しなければならない遺伝的エレメントをよく知っている。好ましくは、DNAまたは発現カセットを形成する遺伝的エレメントの配置のうちの少なくとも一部が、人工的である。発現カセットはベクターの一部であることができ、または宿主細胞のゲノムへとインテグレートされ、その宿主細胞のゲノムと共に複製されることができる。発現カセットは、対象となるDNAおよび/またはタンパク質の発現を増加または減少させることが可能である。
用語「導入」または「形質転換」は、本明細書中で言及される場合、移入のために用いる方法とは無関係に、宿主細胞への外因性ポリヌクレオチドの移入を包含する。すなわち、本明細書中で用いる場合、用語「形質転換」は、ベクター、シャトル系、または宿主細胞から独立しており、当技術分野で公知の形質転換のポリヌクレオチド移入法（例えば、Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYを参照されたい）に関連するばかりでなく、限定するものではないが、形質導入またはトランスフェクションなどの、いずれかのさらなる種類のポリヌクレオチド移入法を包含する。
用語「組み換え生物」とは、遺伝的に変化、改変または遺伝子操作されており、それにより、それから誘導された野生型生物と比較した場合に、変化したか、改変されたかまたは異なる遺伝子型を示す、真核生物（酵母、真菌、藻類、植物、動物）または原核微生物（例えば、細菌）を意味する。好ましくは、「組み換え生物」は、外因性核酸を含む。「組み換え生物」、「遺伝的に改変された生物」および「トランスジェニック生物」は、相互に交換可能に本明細書中で用いられる。外因性核酸は、DNAの染色体外小片（プラスミドなど）上に位置することができ、または生物の染色体DNAにインテグレートされることができる。組み換え真核生物の場合、用いる核酸が、当該生物のゲノム中に存在しないか、もしくはそれに由来せず、または当該生物のゲノム中に存在するが、当該生物のゲノム中のその天然の遺伝子座には存在せず、1種以上の内因性および/または外因性調節エレメントの調節下で核酸が発現されることが可能であることを意味するものと理解される。
定義では、用語「テルペン」は、炭素および水素から構成される炭化水素のみ、およびテルペン化合物を含む。用語「テルペン化合物」とは、テルペンおよび追加の官能基を含有し、それによりアルコール、アルデヒド、ケトンおよび酸などの誘導体を生じるテルペンを意味するが、4炭素（C4）アルコールであるブタノールおよびイソブタノールまたは8炭素アルデヒドであるバニリンなどの関連化合物も含む。典型的なテルペン化合物は、以下のものである：
－ 4個の炭素原子（C4）を有するアルコール、限定するものではないが、ブタノールおよびイソブタノールなど；
－ 5個の炭素原子（C5）を有する化合物、限定するものではないが、ヘミテルペンであるイソプレンおよびヘミテルペノイドであるプレノールおよびイソ吉草酸など；
－ 7または8炭素のフェノール性アルデヒド、限定するものではないが、バニリンなど；
－ テルペンであるかまたはテルペンから誘導される、10個の炭素原子（C10）を有する化合物、またはC10テルペンから誘導される化合物、限定するものではないが、ゲラニオール、テルピネオール、リモネン、ミルセン、リナロールまたはピネンなどのモノテルペンおよびモノテルペノイドなど；
－ テルペンであるかまたはテルペンから誘導される、15個の炭素原子（C15）を有する化合物、またはC15テルペンから誘導される化合物、限定するものではないが、フムレン、ファルネセン、ファルネソールなどのセスキテルペンおよびセスキテルペノイドなど；および
－ テルペンであるかまたはテルペンから誘導される、20個の炭素原子（C20）を有する化合物、25個の炭素原子（C25）を有する化合物、30個の炭素原子（C30）を有する化合物、35個の炭素原子（C35）を有する化合物、もしくは40個の炭素原子（C40）を有する化合物、またはC20、C25、C30、C35もしくはC40テルペンから誘導される化合物。
一実施形態では、テルペン化合物は、テルペン；1個以上の追加の官能基を含有し、それにより、アルコール、アルデヒド、ケトンもしくは酸などの誘導体を生じるテルペン；C4アルコール、好ましくはブタノールもしくはイソブタノール；またはバニリンもしくはイソバニリンであると理解されるべきである。好ましくは、テルペン化合物は、5個、10個もしくは15個の炭素原子を有するテルペンまたはそれから誘導される化合物である。
モノテルペン化合物に関して、C10化合物ゲラニル二リン酸（GPP）は、加水分解、環化、および酸化還元をはじめとする一連の連続的な反応を含むモノテルペンの形成での直接的前駆体である。
非環式（または直鎖）および単環式または二環式であり得る環式の2種類の主要なタイプのモノテルペンがある。シス-α-オシメンおよびβ-ミルセンなどの非環式モノテルペンは、2,6-ジメチルオクタン誘導体である。リモネンおよびシメンなどの典型的な単環式モノテルペンは、原則として、通常は可変的な二重結合部分を含有する、イソプロピル置換基を有するシクロヘキサン誘導体である。α-ピネンおよびβ-ピネンは、一方で、一般的なタイプの二環式モノテルペンである。
本明細書中で用いる場合、「テルペンアルコール」とは、官能基としてアルコール基を含むテルペン化合物を意味する。多数の例が当技術分野で公知である。
本明細書中で用いる場合、「モノテルペンアルコール」とは、官能基としてアルコール基を含むモノテルペン（C10）を意味する。モノテルペンアルコールは、当技術分野で十分に説明されている。
本明細書中で用いる場合、「セスキテルペンアルコール」とは、官能基としてアルコール基を含むセスキテルペン（C15）を意味する。セスキテルペンアルコールは、当技術分野で周知である。
テルペンアルコール、例えば、モノテルペンまたはセスキテルペンアルコールは、当技術分野で公知である通りの、第1級、第2級または第3級アルコールであり得る。
好ましい第1級アルコールは、ゲラニオール、シトロネロール、ラバンジュロールであり、好ましい第2級アルコールは、ボルネオール、イソボルネオール、フェンコール、ベルベノール、カルベオール、メントールである。ネロリドール、サンタロール、キュベボール（cubebol）、パチョロール、ビサボロール、ゲルマクレンD-オール、ヘジカリオールもまた好ましい。
スクラレオールなどのジテルペンアルコールもまた、本発明の方法で用いることができる。
非環式モノテルペンアルコール、またはモノテルペノールは、文献中で一部の場合に言及される通り、可変二重結合部分およびヒドロキシル官能基を含有する2,6-ジメチルオクタン誘導体である。このクラスの最も重要な物質は、リナロール、ゲラニオール、ネロール、シトロネロール、ミルセノール、およびジヒドロミルセノールである。これらは、古代から、それらの心地よい嗅覚特性に起因して、香水中で用いられる。本発明の改変型生物または方法は、一実施形態中においてこれらの生成でも用いることができる。
定義では、エステルは、少なくとも1箇所の-OH（水酸）基が-O-アルキル（アルコキシ）基により置き換えられている、酸（有機または無機）から誘導される化合物である。それ故、「テルペンエステル」は、少なくとも1箇所の-OH（水酸）基が-O-アルキル（アルコキシ）基により置き換えられている、テルペンアルコールである。
本明細書中で用いる場合、「モノテルペンエステル」は、モノテルペンアルコール由来のエステルを意味する。この用語は、本明細書中で定義する場合、第1級モノテルペンアルコール、第2級モノテルペンアルコールまたは第3級モノテルペンアルコール由来のエステルを含む。
本明細書中で用いる場合、「セスキテルペンエステル」は、セスキテルペンアルコール由来のエステルを意味する。この用語は、本明細書中で定義する場合、第1級セスキテルペンアルコール、第2級セスキテルペンアルコールまたは第3級セスキテルペンアルコール由来のエステルを含む。
本発明は、1種以上のテルペン化合物に対する改善された耐性を有する改変型生物を対象とし、このとき、改変型生物は、野生型改変型生物と比較して以下からなる群より選択される1つ以上の変化を有し：
i. テルペン化合物の存在下での、配列番号2のタンパク質もしくはそのホモログの非存在、不活性化または低下した存在量および配列番号3のタンパク質もしくはそのホモログの非存在、不活性化または低下した存在量および配列番号2のタンパク質またはそのホモログの突然変異型タンパク質の存在であって、配列番号2のタンパク質またはそのホモログの突然変異型タンパク質は、未改変型生物の配列番号2のタンパク質またはそのホモログと、好ましい順序で、最初の54、53、52、51、50、49、48または47個のアミノ酸のみを共有する；
ii. テルペン化合物の存在下での、配列番号2のタンパク質もしくはそのホモログの非存在、不活性化または低下した存在量；
iii. テルペン化合物の存在下での、配列番号3のタンパク質もしくはそのホモログの非存在、不活性化または低下した存在量；
iv. テルペン化合物の存在下での、配列番号2のタンパク質またはそのホモログの非存在および配列番号2のタンパク質またはそのホモログの突然変異型タンパク質の存在であって、配列番号2のタンパク質またはそのホモログの突然変異型タンパク質は、配列番号2の48位に対応する位置に突然変異を有する；
v. テルペン化合物の存在下での、配列番号2のタンパク質またはそのホモログの突然変異型タンパク質の存在であって、配列番号2のタンパク質またはそのホモログの突然変異型タンパク質は、配列番号2の48位に対応する位置に突然変異を有する；
vi. テルペン化合物の存在下での、配列番号1のタンパク質もしくはそのホモログの未改変型生物と比較して増大したレベルまたは増大した活性であって、好ましくは、配列番号1のホモログに対する内因性遺伝子が欠失され、配列番号1をコードする遺伝子またはその変異体の組み換え発現を有し、さらにより好ましくは、配列番号1をコードする遺伝子またはその変異体の組み換え発現は、低～中強度のプロモーターまたは他の制御エレメント下にある；
vii. テルペン化合物の存在下での、配列番号4のタンパク質またはそのホモログの突然変異型タンパク質の存在であって、配列番号4のタンパク質またはそのホモログの突然変異型タンパク質は、配列番号4の74位に対応する位置に突然変異を有する；
viii. テルペン化合物の存在下での、配列番号5のタンパク質またはそのホモログの突然変異型タンパク質の存在であって、好ましくは、配列番号5のタンパク質またはそのホモログの突然変異型タンパク質は、(a) 配列番号5の291位に対応する位置の突然変異、および/または(b) 配列番号5の274位以降に対応する位置の突然変異を有し、突然変異型タンパク質は、配列番号5のタンパク質またはそのホモログよりも短い存在、または配列番号5のタンパク質の非存在、不活性化もしくは低下した存在量；
ix. テルペン化合物の存在下での、配列番号6のタンパク質またはそのホモログの突然変異型タンパク質の存在であって、配列番号6のタンパク質またはそのホモログの突然変異型タンパク質は、配列番号6の96位に対応する位置の突然変異（好ましくは、突然変異は、グルタミン酸でバリンを置き換える突然変異である）および/または、好ましくは、セリンでグリシンを置き換える、配列番号6の67位に対応する位置の突然変異を有する；
x. テルペン化合物の存在下での、配列番号6のタンパク質もしくはそのホモログの非存在、不活性化または低下した存在量；
xi. テルペン化合物の存在下での、配列番号8またはそのホモログの改変型タンパク質、好ましくは、配列番号8のタンパク質もしくはそのホモログの非存在、不活性化または低下した存在量；
xii. テルペン化合物の存在下での配列番号9またはそのホモログの改変型タンパク質、好ましくは、配列番号9のタンパク質もしくはそのホモログの非存在、不活性化または低下した存在量；
xiii. テルペン化合物の存在下での、配列番号7またはそのホモログの改変型タンパク質、好ましくは、配列番号7のタンパク質もしくはそのホモログの非存在、不活性化、増加した活性または低下した存在量；
xiv. 上記i～xiiiのいずれかの組み合わせ；
このとき、耐性が、未改変型生物と比較して改善している。
好ましくは、改変型生物は、テルペン化合物、好ましくはモノテルペンアルコールからの、テルペンエステル、好ましくはモノテルペンエステルの生成のための方法で利用される。
本発明に従う改変型生物は、生物を突然変異させるための慣用の方法および/または当技術分野で一般的に公知の標準的な遺伝学および分子生物学技術（例えば、Sambrook, J., and Russell, D.W. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (2001)；およびF.M. Ausubel et al , eds., "Current protocols in molecular biology", John Wiley and Sons, Inc., New York (1987)、ならびにそれらに対する後の補遺に記載される通り、およびCRISPR/CAS等などの技術を含む）に基づいて生成することができる。
改変型生物は、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、藻類細胞もしくはシアノバクテリア細胞、非ヒト動物細胞もしくは哺乳動物細胞、または植物細胞から選択されるいずれかの細胞であり得る。
具体的には、改変型生物は、以下の生物のうちのいずれか1種から選択することができる：
細菌
細菌改変型生物は、例えば、エシェリキア属（Escherichia）、クレブシエラ属（Klebsiella）、ヘリコバクター属（Helicobacter）、バシラス属（Bacillus）、ラクトバシラス属（Lactobacillus）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、アミコラトプシス属（Amycolatopsis）、ロドバクター属（Rhodobacter）、シュードモナス属（Pseudomonas）、パラコッカス属（Paracoccus）またはラクトコッカス属（Lactococcus）からなる群より選択することができる。
グラム陽性：バシラス属、ストレプトミセス属など
有用なグラム陽性細菌改変型生物としては、限定するものではないが、バシラス（Bacillus）細胞、例えば、バシラス・アルカロフィウス（Bacillus alkalophius）、バシラス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バシラス・ブレビス（Bacillus brevis）、バシラス・サークランス（Bacillus circulans）、バシラス・クラウシイ（Bacillus clausii）、バシラス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バシラス・フィルムス（Bacillus firmus）、バシラス・ジョータス（Bacillus Jautus）、バシラス・レンタス（Bacillus lentus）、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バシラス・プミラス（Bacillus pumilus）、バシラス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、枯草菌（Bacillus subtilis）およびバシラス・チューリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）が挙げられる。最も好ましくは、原核生物は、バシラス（Bacillus）細胞、好ましくは、枯草菌（Bacillus subtilis）、バシラス・プミラス（Bacillus pumilus）、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、またはバシラス・レンタス（Bacillus lentus）のバシラス細胞である。
一部の他の好ましい細菌としては、放線菌目（Actinomycetales）の菌株、好ましくは、ストレプトミセス属（Streptomyces）、好ましくはストレプトミセス・スフェロイデス（Streptomyces spheroides）（ATTC 23965）、ストレプトミセス・テルモビオラセウス（Streptomyces thermoviolaceus）（IFO 12382）、ストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）またはストレプトミセス・ムリヌス（Streptomyces murinus）またはストレプトベルチシルム・ベルチシリウムssp.ベルチシリウム（Streptoverticillum verticillium ssp. verticillium）が挙げられる。他の好ましい細菌としては、ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）、ロドモナス・パルストリ（Rhodomonas palustri）、ストレプトコッカス・ラクチス（Streptococcus lactis）が挙げられる。さらに好ましい細菌としては、ミクソコッカス属（Myxococcus）に属する菌株、例えば、M.ビレセンス（M. virescens）が挙げられる。
グラム陰性：大腸菌、シュードモナス属、ロドバクター属、パラコッカス属
好ましいグラム陰性細菌は、大腸菌（Escherichia coli）、シュードモナス属種（Pseudomonas sp.）、好ましくは、シュードモナス・プルロシニア（Pseudomonas purrocinia）（ATCC 15958）またはシュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）（NRRL B-11）、ロドバクター・カプスラタス（Rhodobacter capsulatus）またはロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）、パラコッカス・カロチニファシエンス（Paracoccus carotinifaciens）またはパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス（Paracoccus zeaxanthinifaciens）である。
真菌
アスペルギウス属、フザリウム属、トリコデルマ属
改変型生物は、真菌細胞であり得る。本明細書中で用いる場合、「真菌」としては、子嚢菌門（Ascomycota）、担子菌門（Basidiomycota）、ツボカビ門（Chytridiomycota）、および接合菌門（Zygomycota）ならびに卵菌門（Oomycota）および不完全菌亜門（Deuteromycotina）およびすべての栄養胞子形成性（mitosporic）真菌が挙げられる。子嚢菌門の代表的な群としては、例えば、ニューロスポラ属（Neurospora）、ユーペニシリウム属（Eupenicillium）（＝ペニシリウム属（Penicillium））、エメリセラ属（Emericella）（＝アスペルギルス属（Aspergillus））、ユーロチウム属（Eurotium）（＝アスペルギルス属（Aspergillus））、および以下に列記される正酵母（true yeast）が挙げられる。担子菌門の例としては、キノコ、さび菌、および黒穂菌が挙げられる。ツボカビ門の代表的な群としては、例えば、アロミセス属（Allomyces）、ブラストクラジエラ属（Blastocladiella）、コエロモミセス属（Coelomomyces）、および水生真菌が挙げられる。卵菌門の代表的な群としては、例えば、ワタカビ属（Achlya）などのサプロレグニオミセトス（Saprolegniomycetous）水生真菌（ミズカビ）が挙げられる。栄養胞子形成性真菌の例としては、アスペルギルス属（Aspergillus）、ペニシリウム属（Penicillium）、カンジダ属（Candida）、およびアルタナリア属（Alternaria）が挙げられる。接合菌門の代表的な群としては、例えば、クモノスカビ属（Rhizopus）およびケカビ属（Mucor）が挙げられる。
一部の好ましい真菌としては、不完全菌亜門（subdivision Deuteromycotina）、不完全糸状菌綱（class Hyphomycetes）に属する菌株、例えば、フザリウム属（Fusarium）、フミコラ属（Humicola）、トリコデルマ属（Tricoderma）、ミロテシウム属（Myrothecium）、バーティシリウム属（Verticillum）、アルトロミセス属（Arthromyces）、カルダリオミセス属（Caldariomyces）、ウロクラジウム属（Ulocladium）、エンベリシア属（Embellisia）、クラドスポリウム属（Cladosporium）またはドレスクレラ属（Dreschlera）、特に、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）（DSM 2672）、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、トリコデルマ・レシイ（Trichoderma resii）、ミロテシウム・ベルルカナ（Myrothecium verrucana）（IFO 6113）、バーティシリウム・アルボアトラム（Verticillum alboatrum）、バーティシリウム・ダーリエ（Verticillum dahlie）、アルトロミセス・ラモサス（Arthromyces ramosus）（FERM P-7754）、カルダリオミセス・フマゴ（Caldariomyces fumago）、ウロクラジウム・チャルタラム（Ulocladium chartarum）、エンベリシア・アリイ（Embellisia alli）またはドレスクレラ・ハロデス（Dreschlera halodes）が挙げられる。
他の好ましい真菌としては、担子菌門（subdivision Basidiomycotina）、担子菌綱（class Basidiomycetes）に属する菌株、例えば、ササクレヒトヨタケ属（Coprinus）、マクカワタケ属（Phanerochaete）、カワラタケ属（Coriolus）またはシロアミタケ属（Trametes）、特に、コプリナス・シネレウスf.ミクロスポラス（Coprinus cinereus f. microsporus）（IFO 8371）、コプリナス・マクロリズス（Coprinus macrorhizus）、ファネロケテ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）（例えば、NA-12）またはシロアミタケ属（Trametes）（以前にはタマチョレイタケ属（Polyporus）と称された）、例えば、カワラタケ（T. versicolor）（例えば、PR4 28-A）が挙げられる。
さらなる好ましい真菌としては、接合菌門（subdivision Zygomycotina）、ミコラセアエ綱（class Mycoraceae）に属する菌株、例えば、クモノスカビ属（Rhizopus）またはケカビ属（Mucor）、特に、ムコール・ヒエマリス（Mucor hiemalis）が挙げられる。
以下のものなどの酵母もまた、本発明で用いることができる：
ピチア属（Pichia）またはサッカロミセス属（Saccharomyces）。真菌改変型生物は、酵母細胞であり得る。本明細書中で用いる場合、酵母としては、子嚢胞子形成性（ascosporogenous）酵母（エンドミセタレス（Endomycetales））、担子胞子形成性（basidiosporogenous）酵母、および不完全真菌（Fungi lmperfecti）（ブラストミセス属（Blastomycetes））に属する酵母が挙げられる。子嚢胞子形成性酵母は、スペルモフトラ科（Spermophthoraceae）およびサッカロミセス科（Saccharomycetaceae）に分けられる。後者は、4つの亜科：Schizosaccharomycoideae亜科（例えば、シゾサッカロミセス属（Schizosaccharomyces））、Nadsonioideae亜科、Lipomycoideae亜科、およびSaccharomycoideae亜科（例えば、クルイベロミセス属（Kluyveromyces）、ピチア属（Pichia）、およびサッカロミセス属（Saccharomyces））から構成される。担子胞子形成性酵母としては、ロイコスポリジウム属（Leucosporidim）、ロドスポリジウム属（Rhodosporidium）、スポリジオボラス属（Sporidiobolus）、フィロバシジウム属（Filobasidium）、およびフィロバシジエラ属（Filobasidiella）が挙げられる。不完全真菌に属する酵母は、2つの科：Sporobolomycetaceae科（例えば、スポロボロミセス属（Sporobolomyces）およびブレラ属（Bullera））およびCryptococcaceae科（例えば、カンジダ属（Candida））に分けられる。
真核生物
真核生物改変型生物としてはさらに、限定するものではないが、非ヒト動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、鳥類細胞、爬虫類細胞、昆虫細胞、または植物細胞が挙げられる。
好ましい実施形態では、改変型生物は、以下の群から選択される改変型生物である：
(a) グラム陰性細菌の群の細菌細胞、ロドバクター属（Rhodobacter）（例えば、ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）またはロドバクター・カプスラタス（Rhodobacter capsulatus））、パラコッカス属（Paracoccus）（例えば、P.カロチニファシエンス（P. carotinifaciens）、P.ゼアキサンチニファシエンス（P. zeaxanthinifaciens））、エシェリキア属（Escherichia）またはシュードモナス属（Pseudomonas）など；
(b) グラム陽性細菌の群から選択される細菌細胞、バシラス属（Bacillus）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、ブレビバクテリウム属（Brevibacterium）、アミコラトプシス属（Amycolatopis）など；
(c) アスペルギルス属（Aspergillus）、ブラケスレア属（Blakeslea）、ペニシリウム属（Peniciliium）、ファフィア属（Phaffia）（キサントフィロミセス属（Xanthophyllomyces））、ピチア属（Pichia）、サッカロミセス属（Saccharamoyces）、クルイベロミセス属（Kluyveromyces）、ヤロウイア属（Yarrowia）、およびハンセヌラ属（Hansenula）の群から選択される真菌細胞；
(d) トランスジェニック植物細胞またはトランスジェニック植物細胞を含む培養物であって、細胞が、シロイヌナズナ属種（Arabidopsis spp.）、タバコ属種（Nicotiana spp）、チコリー（Cichorum intybus）、レタス（lacuca sativa）、メンサ属種（Mentha spp）、クソニンジン（Artemisia annua）、塊茎形成性（tuber forming）植物、油料作物（例えば、アブラナ属種またはセイヨウアブラナ（Brassica napus））、果実を生成する顕花植物（被子植物）（限定するものではないが、イチゴまたはラズベリー植物）および木から選択されるトランスジェニック植物のものである；または
(e) トランスジェニックキノコまたはトランスジェニックキノコ細胞を含む培養物であって、微生物が、スエヒロタケ属（Schizophyllum）、ハラタケ属（Agaricus）およびプレウロティシ属（Pleurotisi）から選択される。
生物由来のより好ましい改変型生物は、エシェリキア属（Escherichia）、サッカロミセス属（Saccharomyces）、ピチア属（Pichia）、ロドバクター属（Rhodobacter）、シュードモナス属（Pseudomonas）またはパラコッカス属（Paracoccus）（例えば、パラコッカス・カロチニファシエンス（Paracoccus carotinifaciens）、パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス（Paracoccus zeaxanthinifaciens））に属する微生物由来の改変型生物であり、大腸菌（E.coli）、S.セレビシエ（S. cerevisae）、ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）、ロドバクター・カプスラタス（Rhodobacter capsulatus）、またはアミコラトプシス属種（Amycolatopis sp.）の生物種のものが、さらにより好ましい。
ロドバクター・カプスラタス（Rhodobacter capsulatus）およびロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）の群から選択されるロドバクター属改変型生物、または大腸菌（Escherichia coli）が特に好ましい。
本発明のさらなる態様は、以下の群から選択される突然変異型タンパク質に関する：
i. 配列番号2として示されるタンパク質またはそのホモログの突然変異型変異体であって、配列番号2のタンパク質または未改変型生物のそのホモログを有する、タンパク質のN末端から好ましい順に最初の54、53、52、51、50、49、48もしくは47個のアミノ酸のみを含む、変異体。
ii. 配列番号2の48位に対応する位置に突然変異を有する、配列番号2に示されるタンパク質またはそのホモログの突然変異型変異体；
iii. 配列番号4の74位に対応する位置に突然変異を有する、配列番号4に示されるタンパク質またはそのホモログの突然変異型変異体；
iv. (a) 配列番号5の291位に対応する位置での突然変異および/または(b) 配列番号5の274位以降に対応する位置での突然変異を有する、配列番号5のタンパク質またはそのホモログの突然変異型変異体であって、突然変異型タンパク質が配列番号5のタンパク質またはそのホモログよりも短い、変異体；
v. 好ましくはグルタミン酸でバリンを置き換える突然変異である、配列番号6の96位に対応する位置での突然変異および/または好ましくはセリンでグリシンを置き換える、配列番号6の67位に対応する位置での突然変異を有する、配列番号6のタンパク質またはそのホモログの突然変異型変異体。
本発明のさらなる実施形態は、本発明の突然変異型タンパク質をコードするいずれかの核酸、本発明の突然変異型タンパク質をコードする核酸を含む発現カセット、本発明の突然変異型タンパク質をコードする核酸を含むベクター、本発明の突然変異型タンパク質をコードする核酸を含む宿主細胞および本発明の突然変異型タンパク質を含む組み換え非ヒト生物に関する。
1つの好ましい実施形態では、本発明の改変型生物または突然変異型タンパク質は、1種以上のテルペン化合物および/または1種以上のテルペンエステルの生成で用いられる。
テルペン化合物および/またはテルペンエステルを生成するための本発明の方法は、好ましくは、以下のステップを含む：(a) 適切な条件下で、本発明の改変型生物を培養するステップ、および(b) ステップ(a)の改変型生物から、テルペン化合物および/またはテルペンエステルを取得するステップ。
別の好ましい実施形態では、改変型生物は、本発明の方法を実施するために好適である。
例えば、改変型生物は、モノテルペンエステルを調製するための方法で用いることができ、該方法は、アルコールアシルトランスフェラーゼの存在下で、モノテルペンアルコールをモノテルペンエステルへとエステル化するステップを含む。この目的のために、改変型生物は、好ましくは、異種的に、所望のアルコールアシルトランスフェラーゼを発現する。モノテルペンアルコールが、リナロール、ゲラニオール、α-テルピネオール、γ-テルピネオール、ラバンジュロール、フェンコール、ペリリルアルコール、メントールまたはベルベノールであり、かつモノテルペンエステルの生成が望まれる場合、これらのうちのいずれかまたはこれらの混合物が、アルコールアシルトランスフェラーゼに対する基質として用いられることが好ましい。モノテルペンアルコール基質は、好ましくは、生物がモノテルペンエステルの生成に好適である1種以上のアルコールアシルトランスフェラーゼを含む場合、改変型生物により生成できるか、かつ/または改変型生物に外因的に付加することができる。
本発明のさらなる態様は、未改変型生物と比較して、改変型生物の1種以上のテルペン化合物に対する耐性を増大させるための方法であり、該方法は、本発明の改変型生物を作製するステップおよび任意により該改変型生物を維持するステップを含む。
好ましい実施形態では、本発明は、生物を用いる1種以上のテルペン化合物の生成のための方法であり、該方法は、本発明の改変型生物を作製するステップ、改変型生物が増殖し、かつ該1種以上のテルペン化合物を生成するために好適な条件下で、テルペン化合物の存在下で該改変型生物を維持するステップ、および任意により該改変型生物から該1種以上のテルペン化合物を分離するステップを含む。
好ましい実施形態では、本発明の方法および改変型生物は、1種以上のテルペン化合物の生成を目的とし、このとき、少なくとも1種のテルペン化合物は、C4およびC5アルコールである。
テルペン化合物が2.0以下、好ましくは1.5以下のlogP値を有し、かつ/または少なくとも1.0g/L、好ましくは1.5g/L以上の標準的条件下での水中での溶解度を有する、本発明の方法、使用または改変型生物。
本発明の好ましい実施形態は、本発明の方法、使用、突然変異型タンパク質または改変型生物を目的とし、このとき、イソプレノール、プレノール、ブタノール、イソブタノール、バニリン、ゲラニオールおよび/またはシトラール（好ましくは、ゲラニアールおよびネラールの両方）に対する、好ましくはイソプレノール、プレノール、ブタノール、イソブタノールおよび/またはバニリンに対する耐性が、未改変型生物と比較して増大している。
さらなる実施形態は、本発明の方法、使用または改変型生物であり、このとき、改変型生物は、(a) 配列番号3のタンパク質またはそのホモログのタンパク質をコードする遺伝子の一部もしくは全体のノックアウトもしくは欠失、ノックアウト、または(b) 配列番号2のタンパク質もしくはそのホモログのタンパク質をコードする遺伝子の一部もしくは全体の欠失、または(c) テルペン化合物の存在下での、配列番号2のタンパク質またはそのホモログの突然変異型タンパク質の存在であって、配列番号2のタンパク質またはそのホモログの突然変異型タンパク質は、未改変型生物の配列番号2のタンパク質またはそのホモログと、N末端から最初の50、49、48個のアミノ酸のみ、さらにより好ましくは、最初の47個のアミノ酸のみを共有する、存在、あるいは(a)～(c)のいずれかの組み合わせ、を含む。
また別の実施形態では、本発明のいずれかの方法は、配列番号6のタンパク質またはそのホモログをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレーションするステップ、配列番号6のタンパク質またはそのホモログをコードする遺伝子を欠失させるステップ、または配列番号6のタンパク質またはそのホモログをコードする遺伝子のノックアウト、を含む。
好ましい実施形態では、本発明は、未改変型生物と比較して、改変型生物のバニリンに対する耐性を増大させるための方法を目的とし、該方法は、配列番号2のタンパク質と、好ましい順に最初の54、53、52、51、50、49、48または47個のアミノ酸のみを共有するタンパク質をコードするDNA配列を、改変型生物で発現させるかまたは生成するステップを含み、このとき、改変型生物は、配列番号1および/もしくは2のタンパク質またはそのホモログが非存在であるか、不活性であるかもしくは実質的に低減しているというさらなる特徴を有する。
テルペンの存在下で改変型生物の増殖を増加させるための、配列番号2の脱調節型タンパク質またはそのホモログの使用が、本発明によりさらに包含される。
配列番号2の突然変異型もしくは脱調節型タンパク質、またはそのホモログは、好ましい一実施形態では、フレームシフト、好ましくは配列番号2のタンパク質と比較して、得られるタンパク質を短縮するフレームシフトを生じる、配列番号2の48位に対応するヒスチジン残基の突然変異を有する。
別の好ましい実施形態では、配列番号1～9の配列のうちのいずれかが、それぞれのタンパク質に対して表3に示される通りの突然変異を保有するために突然変異される。
さらに、本発明は：
(i) テルペン生合成経路の異種再構成のための；
(ii) 工業製品、好ましくは香味料もしくは香料、バイオ燃料、殺虫剤、昆虫忌避剤または抗微生物剤を製造するための；
(iii) モノテルペンアルコールから、好ましくは第3級モノテルペンアルコールから、脂肪族および/または芳香族モノテルペンエステルを製造するための、
本発明の改変型生物または突然変異型タンパク質の使用を含む。
本発明は、(i) テルペン生合成経路の異種再構成のための；(ii) 工業製品、好ましくは香味料もしくは香料、バイオ燃料、殺虫剤、昆虫忌避剤または抗微生物剤を製造するための；(iii) モノテルペンアルコールから、好ましくは第3級モノテルペンアルコールから、脂肪族および/または芳香族モノテルペンエステルを製造するための；(iv) 発酵中にモノテルペンアルコールを解毒し、それにより該発酵によるモノテルペン産生を増加させるための、本発明の改変型生物もしくは突然変異型タンパク質、本発明の核酸、本発明のベクターもしくは遺伝子構築物、本発明の宿主細胞、または本発明のトランスジェニック非ヒト生物の使用にさらに関連する。
本発明はまた、
(i) テルペン生合成経路の異種再構成のための；
(ii) 工業製品、好ましくは香味料もしくは香料、バイオ燃料、殺虫剤、昆虫忌避剤または抗微生物剤を製造するための；
(iii) モノテルペンアルコールから、好ましくは第3級モノテルペンアルコールから、脂肪族および/または芳香族モノテルペンエステルを製造するための；
(iv) 本発明の改変型生物および細菌または真菌（例えば、酵母）などの微生物の混合物中でモノテルペンアルコールを解毒し、それにより該微生物の混合物によるモノテルペン産生を増加させるための、
本発明の改変型生物もしくは突然変異型タンパク質、本発明の核酸、本発明のベクターもしくは遺伝子構築物、本発明の宿主細胞、または本発明のトランスジェニック非ヒト生物の使用にも関連する。
好ましい第3級モノテルペンアルコールとしては、限定するものではないが、リナロール（S-リナロールおよび/またはR-リナロール）、α-テルピネオール、フェンコール、γ-テルピネオール、p-シメン-8-オール、p-メンタ-3-エン-1-オール、p-メンタ-8-エン-1-オール、4-カルボメントール、4-ツヤノールが挙げられる。
本発明の一態様は、本発明の方法および本発明の改変型生物に従うモノテルペンの生成、およびそれらをモノテルペンエステルへとエステル化することによる、モノテルペンエステルの生成のための方法である。そのようなエステル化は、並行して、例えば、本発明に従うモノテルペンに対する改善された産生能力の同じ改変型生物内で、または同じかもしくは異なる細胞または抽出物中もしくは単離されたかのいずれかのエステル化酵素を用いる後続のステップで、または化学的エステル化で、好ましくはモノテルペンの単離および精製後に、行なうことができる。本発明のこの方法に従って生成されるモノテルペンエステルは、そのままで、例えば、香味料または香料として、昆虫忌避剤として、殺虫剤として、または抗微生物剤として、用いることができ；バイオ燃料を製造するために用いることもでき、または別の化合物、例えば、別の香味料もしくは香料のための出発物質として用いることができる。
1. 結果
1.1 順応菌株での順応の様式の調査
イソプレノールに対する順応進化の終了時に、イソプレノールに対する増大した耐性を示す数種類の菌株を単離した。イソプレノールに対する耐性を、バッフル付き密封250mLフラスコでのイソプレノールを含むM9培地中での増殖の確立された毒性アッセイを用いて確認した。耐性形質の作用様式を調べるために、類似の特性を有する化学物質を試験した。
多くの場合に、溶媒様特性を有する化学物質は膜機能を妨げるので、標準的なアッセイであるヨウ化プロピジウム染色を、進化的に順応した菌株でのイソプレノールストレス下での細胞膜特性を決定するために用いた。
1.1.1 異なる化学物質に対する耐性
耐性メカニズムの限界を評価するために、3種類の追加の化学物質に対する耐性を試験した。本発明者らは、イソプレノールの生物学的異性体であるプレノール、分岐アルコールであるイソブタノールおよびモノテルペンであるゲラニオールを試験した。
Figure 2023508871000005
約65mMの50％阻害濃度を確立した後、本発明者らは、配列決定にも用いられた最終順応菌株に対するイソプレノールの耐性を試験した。すべての菌株がイソブタノールに対する増大した耐性を示す。耐性メカニズムはイソプレノールに限定されず、イソブタノールもまた十分に耐容された。順応菌株のうちで、培養物Aから単離された菌株が最も高い耐性を示し、その一方、培養物Cから単離された菌株は、増殖速度での比較的小さな増大を示す。イソブタノールはその物理化学的特性が非常に似通っており、すなわち、類似のlogP値および水中での溶解度を有する。
次の組の実験では、本発明者らは、野生型菌株のプレノール耐性を系統的に決定し、50％阻害プレノール濃度が40mMであることを見出した。プレノールとイソプレノールとの構造的類似性にもかかわらず、分離株Aのみが、プレノールに対する増大した耐性を示した。分離株Cは、野生型耐性と異ならず、分離株Bは、40mMプレノールで低減した増殖速度さえも有した。
単離された異なる菌株の異なる耐性は、同じイソプレノール耐性表現型にもかかわらず異なる遺伝子型を示唆し得るであろう。
最後に、モノテルペン化合物であるゲラニオールを試験した。単離された順応菌株の全部が、ゲラニオールに対する非常に上昇した感受性を示した。イソプレノール耐性を増大させる形質は、ゲラニオール毒性から保護できないだけでなく、メカニズムが、化合物をさらに毒性化させるようである。順応菌株では、イソプレノール分解に関する証拠を見出さなかったので、ゲラニオールがそれらの菌株により徐々に分解され、したがって毒性分解生成物が蓄積し得るとは考えづらい。むしろ、耐性メカニズムが、細胞の構成要素がゲラニオールの毒性作用に対してさらに感受性となるように、それらの構成要素の構造を変化させるはずである。
1.1.2 順応菌株の膜透過性
1に近いlogPにより、イソプレノールは、膜透過性を増大させることによりその毒性作用を発揮し得るであろう（Heipieper et al., 1994）。このことを試験するために、ヨウ化プロピジウム（PI）染色を用いた。ヨウ化プロピジウム染色は死滅/生存染色であり、死滅細胞が通常は欠陥のある細胞膜を有するので、染色剤が膜を横切り、細胞のDNA中に介在することができる。このことは、ヨウ化プロピジウム染色が、細胞膜損傷を検出するために好適であることを意味する。
未処理野生型細胞は、約1.4×103のPI媒介蛍光中央値を示し、染色手順の陽性対照として用いられる消毒剤バシロールAF（Bacillol AF）を染色前に用いて細胞を処理する場合には、蛍光中央値は100倍増加する。50mMイソプレノール（すなわち、それでも細胞が増殖する中間的なイソプレノール濃度）を用いてインキュベートした大腸菌細胞は、生存細胞の強度とバシロール処理死滅細胞の強度との間に位置する約1.3×104のPI強度中央値を有する。この集団はまだ活発に増殖しているので、このことは、イソプレノールにより細胞膜完全性が実際に損なわれるが、増殖を終わらせる程ではないことを意味する。
興味深いことに、イソプレノール処理は、より高いPI染色への単峰性シフトをもたらす。イソプレノールは、原理上は、生存細菌の殺傷を増加させることもでき、それにより、染色によって「生存」および「死滅」でのイソプレノール処理細胞の二峰性の分割を生じたであろう。このことは、イソプレノールが細胞膜を不安定化することの別の示唆である。
次に、本発明者らは、どのようにして順応菌株がイソプレノール処理に反応するかを調べた。分離株A～Cは、野生型イソプレノール処理細胞と比較して、2.2～3.4×103の低下したPI蛍光強度中央値を有した。しかしながら、PI蛍光は、野生型未処理細胞と比較して若干増大したままであった。このことは、進化的に順応した細胞が、膜ストレスに対処し、かつ部分的には膜完全性を修復し、したがってPI染色における透過性を低減させるメカニズムを発達させたことを意味する。
1.2 標的菌株のDNA配列決定
観察された順応メカニズム、すなわち、イソプレノール、イソブタノールおよびプレノールに対する耐性ならびにイソプレノールストレス下での低下した膜透過性の遺伝学的基礎を理解するために、数種類の菌株を順応的進化実験から単離し、配列決定した。
表1に列記される通り、64～80mMの範囲のイソプレノール濃度での32～226世代後に、菌株を単離した。3種類の進化的培養物のそれぞれの低温培養物を、イソプレノールを含有するLB寒天上に筋状に塗り付け、その後、5種類の最大菌株をそれらの増殖に関してイソプレノールを含むM9中で評価し、最も速い培養物を保存し、配列決定に用いた。順応菌株に加えて、1種類の野生型培養物を配列決定のために準備した。
Figure 2023508871000006
1.2.1 進化実験で特定された突然変異
実験で特定された突然変異を、表2に列記する。大腸菌MG 1655野生型菌株が、異なる変異体中に存在する（Freddolino, Amini and Tavazoie, 2012）。本発明者らの野生型変異体は、ガラクチトールPTSの一部である再構成されたgatC遺伝子、および機能的glrRグリセロール-3-リン酸リプレッサーを有する。加えて、反復REP321jに変動がある。
Figure 2023508871000007
Figure 2023508871000008
突然変異獲得の時間経過およびゲノム中でのそれらの位置に関する概要を与えるために、結果を図4Aに模式的に提示する。実験の開始時から、突然変異の数が着実に増加するが、出現するが再度失われる突然変異もあることが理解できる。突然変異は、特定の遺伝子座に限定されず、ゲノム全体に広がっているようである。
大多数の突然変異が、すべての配列決定されたゲノムと比較して、10％未満の比較的低い頻度で存在する（図4）。より高い頻度で存在する4種類の突然変異がある。このことは、それぞれの突然変異の「持続性」、すなわち、進化実験中に残留する時点の数に対して標準化された頻度を算出する場合に、明らかになる。これは、突然変異が開始時に起こり、かつすべての培養物中に残留する場合に、持続性が100％になることを意味する。突然変異が実験の中間に生じるが、失われない場合には、合計頻度は50％であるが、持続性は100％であろう。結果として、野生型で特定される変異は、100％の持続性を有するが、それらの遺伝子は分析から除外することができる。高い持続性を有する4種類の突然変異は、fabF F74C、marC M35stop、PyghbΔ-35およびrob H48frameshiftである。
1.2.2 fabF F74CおよびmarC
高度に持続性の突然変異fabF F74Cは、1-ブタノールに関してスクリーニングする以前の突然変異実験で既に記載されている（Haeyoung and Jihee, 2010）。FabFは、β-ケトアシル-ACPシンターゼIIをコードし、脂肪酸生合成の一部である。この突然変異は、野生型FabF活性と比較して、シス-バクセン酸の濃度を上昇させる。
破壊されたバージョンのmarCは、イソブタノールに対する大腸菌EcNR1の順応的進化実験で以前に特定されている（Minty et al., 2011）。marCは、保存された膜タンパク質であり、このタンパク質の欠失は、イソブタノール耐性表現型を生じた。本発明者らの進化実験中に存在するmarC遺伝子中の最も高頻度な突然変異は、M35の後ろの終止コドンの導入であり、これにより生来型タンパク質のうちの約15％のみが残される。この突然変異は、marC遺伝子の機能を無効にすると考えられるが、切断型バージョンがまだ耐性の利益を有する可能性がある。
1.2.3 rob
次に高度に顕著な標的は、rob遺伝子中の突然変異である。rob遺伝子は、構成的に発現される調節因子であり、レギュロンは、marA/soxS調節因子と共有される（Rosenberg et al., 2003；Griffith et al., 2009）。レギュロンは、抗生物質抵抗性、スーパーオキシド抵抗性および有機溶媒に対する耐性に関与する（Aono, 1998）。robの過剰発現は、シクロヘキサンおよびn-ヘキサンに対する耐性を賦与し、欠失はそれらの化合物に対して感受性にする（White et al., 1997）。本発明者らの配列決定結果中の2種類の突然変異は、G273およびY103の後ろに早すぎる終止コドンを導入し、最も高頻度な突然変異は、H48の後ろにフレームシフトを導入する。H48フレームシフト突然変異は、そのヘリックス-ターン-ヘリックスドメイン、すなわち、タンパク質がそのDNA結合性部位と相互作用して、不活性にさせる可能性がある部分で、タンパク質を破壊する（提供元：https://www.rcsb.org/pdb/protein/P0ACI0）。
1.2.4 P yghb Δ-35
高い頻度を有する最後の突然変異は、metCとyghBとの間の遺伝子間領域中の突然変異である。metCはメチオニン生合成経路に属し、yghBは温度および抗生物質耐性に関与する膜貫通タンパク質である（Kumar and Doerrler, 2014）。yghBは、大腸菌ではDedAタンパク質ファミリーに属し、yghBおよびyqjA（これもまたDedAファミリーに属する）の二重欠失は、温度感受性を生じるが、mdfA（Na+-K+/H+アンチポーター）の過剰発現により回復できる。
現在までに、yghBの調節因子は知られていないが、コンピューターによる証拠により、σ70ハウスキーピングシグマ因子により調節されることが示唆される。突然変異の配列解析により、野生型での-35位の上流部分が欠失により失われることが明らかになる。これにより、抑制性プロモーターに対する結合性部位が欠失され、それにより、yghB遺伝子の発現が脱調節され、yghB-mRNA濃度が上昇する可能性がある。図5Cを参照されたい。
1.2.5 遺伝子型相関
すべての他の突然変異は、実験中にはるかに低い持続性を有するが、一部の標的遺伝子（例えば、plsX遺伝子）は、比較的高い頻度を有するようである。突然変異が異なるサンプル中の同じ遺伝子で生じる場合、それらが同じ表現型作用を有し、したがって遺伝子機能性に対して同じ作用を有し得ることが想定できる。遺伝子型に関する遺伝子セットおよびどのようにして遺伝子標的が相関するかを特定するために、本発明者らは、標的遺伝子のみを考慮して、異なる標的遺伝子突然変異同士を区別せずにデータセットを簡略化し、主成分分析を行なった。
主成分分析（PCA分析）を行なった。第1の最も重要なローディングベクトルに対する最大の影響は、既に特定された標的であるfabF、rob、PyghbおよびmarCである。第2成分は、plsX、rraAおよびgltAからなる遺伝子型を規定する。予測される通り、実験の終了時（T7）での表現型では、第1成分が優勢である。
1.2.6 PCA成分2遺伝子型
興味深いことに、第2の遺伝子型成分は、T4およびT5での培養物A中に強く存在する。この遺伝子型は、リン脂質生合成経路の一部であるplsX遺伝子、リボヌクレアーゼ阻害因子rraAおよびクエン酸シンターゼgltA中の突然変異からなる。plsX遺伝子中の突然変異は、細胞の脂肪酸組成を変化させるfabF突然変異と類似の順応であり得る。plsXはカノニカルなリン脂質経路には属さないが、黄色ブドウ球菌（S. aureus）に存在する第2経路に対する相同性を有する（Yao and Rock, 2013）。第2経路およびカノニカル経路が異なる脂肪酸に対する異なる優勢度を有すると仮定すると、この突然変異は、細胞膜の脂肪酸組成を変化させる可能性がある。
この遺伝子型中の他の2種類の突然変異は、細胞に対するイソプレノールのより多面的な作用（エネルギー代謝およびタンパク質合成など）に関連し得る。gltAでの突然変異は、NADHの阻害作用に対するクエン酸シンターゼのアロステリックな応答に影響を及ぼし（Duckworth et al., 2013）、したがって、TCA回路を脱調節し、エネルギー代謝に影響し得る。リボヌクレアーゼE阻害因子rraA中の2種類の独立な突然変異も出現する。この遺伝子の機能喪失は、tRNAおよびrRNAプロセシングに対する影響を有するであろうが、mRNAをさらに不安定にもさせるであろう。実際に、V96Eは、むしろ保存された残基でのものであるように思われる（Monzingo et al., 2003）。
1.2.7 他の突然変異
第3成分trkHおよびiscRでの2種類の高頻度な突然変異は、イソプレノールによる膜ストレスに起因するイオン喪失に対する応答であり得る（Heipieper et al., 1994）。iscRは、鉄・硫黄クラスター調節因子であり、この突然変異は、鉄・硫黄クラスター生物発生を差次的に調節する可能性がある。増加したカリウム取り込みは、溶媒ストレスに対するシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）P8での既知の順応であり（Heipieper et al., 1994）、類似のメカニズムが、カリウムイオン輸送体での突然変異に現われ得る（Cao et al., 2011）。
fabFおよびplsXでの脂肪酸代謝遺伝子中の突然変異に加えて、1種類のさらなる突然変異が、リン脂質生合成に必要なplsB遺伝子中で一度見出された。yfgOもまた、marCおよびyghBに加えて、突然変異の別の膜タンパク質標的である。
興味深いことに、最後の3種類の分離株のうちの2種類（T7 BおよびC）は、ホルムアルデヒド代謝を調節するfrmRリプレッサー中に独立した突然変異を示す。ホルムアルデヒド感受性は以前の報告で試験されており、イソプレノールと、高含有量および低含有量の残留ホルムアルデヒドとの間には差異は見出されなかったが、これは長期順応に対応する可能性があり、この場合、ホルムアルデヒドの蓄積が重要となる。興味深いことに、frmR遺伝子中の突然変異を有する菌株は、プレノールに対する比較的高い感受性を有する。
1.3 イソプレノールストレス応答のRNA配列決定に基づく分析
順応菌株がどのようにイソプレノールストレスに応答するかは、それらの遺伝子型により決定されるが、菌株の生理学的変化および調節性応答の組み合わせに起因して、遺伝子型から直接的に明らかにならない二次的な影響が生じ得る。これらの二次的影響は、最終的には、菌株操作における重要な標的である。それらを特定するために、本発明者らは、3種類の最終的な順応菌株のRNA配列決定を用い、イソプレノールストレスに対する応答で、野生型に対して順応菌株のトランスクリプトームを比較した。
この分析では、差次的発現（DE）の特定のために3種類の標準的なアルゴリズムcuffdiff、edgeRおよびDESeq2を用いた。アルゴリズムは、4つの主要な点で異なり、第1には生の読み取りデータが通常は補正する必要があることであり；この補正は、複製物での変動する配列決定深度に主に起因する。第2の点は、計数に対する基礎となる統計学的モデルであり、cuffdiffの場合には、ベータ負の二項モデルが想定され、edgeRおよびDESeq2は負の二項分布を想定する。したがって、アルゴリズムは、分布のパラメータがどのように推定されるかが異なる。それぞれの分布のパラメータは、通常はまばらである（例えば、サンプル当たり3つの生物学的複製）ので、1つのデータ点から直接的に推定することができず、データ全体から推論しなければならない。最後に、異なる有意性検定を、DEを特定するために利用することができる。
1.3.1 野生型と比較した順応菌株の差次的発現
3種類の順応菌株の遺伝子型は非常に似通っているので、本発明者らは、最も強いトランスクリプトーム変化が3種類すべての菌株で生じているはずであると推論した。
3種類の用いたアルゴリズムのすべてでアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションされた遺伝子の上位10種類を（図6）に示す。
トランスクリプトームデータの性質に起因して、ダウンレギュレーションは、アライメントの品質および高い適用範囲にも依存するので、確認するのが比較的困難である。アップレギュレーション遺伝子セットでは、本発明者らは、yghB転写産物の強い過剰発現を観察する。yghBプロモーターは-35領域の欠失によって脱調節されるので、このことは、順応菌株のゲノムデータとよく対応する。本発明者らは、欠失metCの上流の遺伝子での顕著な変化をここで見出す。
アップレギュレーションからの他の標的は、ala-alaペプチドエクスポーターalaE、外膜ポーリンompF、バリン生合成遺伝子ilvG、ilvM、ならびにUVおよびX線耐性に関与するyahO遺伝子である。他の高発現遺伝子は、3種類のアルゴリズムのうちの1種のみで有意であり、したがって、妥当な標的であるとは考えられない。
1.3.2 脂質生合成の差次的応答およびrobレギュロン
実験中の突然変異のうちの多数が脂肪酸生合成で標的化されているので、本発明者らは、対応する経路中に差次的調節が存在するのではないかと考えた。
脂肪酸合成遺伝子全体が野生型と比較してアップレギュレーションされ、最も目立つのはfabH、fabBおよびclsBである。興味深いことに、リン脂質合成の重要な段階を触媒するpsdのみがダウンレギュレーションされる。しかしながら、psdのみに関して、このダウンレギュレーションは、すべての培養物およびすべてのアルゴリズムについて有意であり、fabBアップレギュレーションは、edgeRアルゴリズムでのみ有意である。
配列決定データは、4種類の最も重要な突然変異標的のうちの1つとしてrob調節因子を特定した。遺伝学的データのみからは、この突然変異の正確な影響が何かは不明であり、本発明者らは、突然変異が有害作用を有し、robは活性化因子として作用するので、これがrobレギュロン中の遺伝子の発現を減少させるであろうという仮説を立てた。
結果は、acnA、aldAおよびfumCを除いて、robレギュロンに属するすべての遺伝子（ecocyc.orgにより指定される通り）が、野生型と比較してダウンレギュレーションされることを示す。このことは、観察されるrob突然変異が有害作用を有し、この活性化因子の欠失がその後のレギュロン遺伝子のダウンレギュレーションをもたらすという仮説を支持する。robレギュロンはSoxおよびMarレギュロンと重複しているので、アップレギュレーションされているように見える遺伝子は、他の調節因子のさらに強い制御下にある可能性がある。最も強いダウンレギュレーションは、AcrAB-TolC多剤排出ポンプ小型タンパク質acrZの一部、および酸誘導性タンパク質inaAで起こる。
1.3.3 順応菌株間の差次的発現
最後に、本発明者らは、イソプレノールストレスに対するそれらのトランスクリプトーム応答で、異なる突然変異体がどのようにして互いに異なるかを考えた。一度に3種類すべてのデータセットでの差異に見当をつけるための包括的な方法として、野生型と比較した各単離菌株の差次的発現データのPCA分析を行なった。この分析は、3種類の突然変異体菌株でのfrmRABの差次的発現が、3種類のアルゴリズムすべてで一貫していることを示す。上記で示した通り、突然変異体菌株7Bおよび7Cのみが、frmR調節因子中に突然変異を有し、これは増大したプレノール感受性と相関する。一例として、3種類の分離株での差次的発現に関して、edgeRアルゴリズムにより算出される菌株間の差次的発現を調べた。実際に、frmRABの発現は、菌株BおよびCの間で異ならないが、菌株Aと比較して、frmRABは菌株BおよびCでアップレギュレーションされている。このデータは、frmR中の両方の突然変異が、同じ作用、すなわち、構成的発現または野生型および菌株Aと比較したアップレギュレーションをもたらす、frmRABオペロンの脱調節を有することを示唆する。
1.4 突然変異の再構成
1.4.1 Keioノックアウト菌株
本発明者らは、容易に入手可能なKeioコレクション由来の最も有望な遺伝子標的のノックアウト菌株を試験することにより、最終表現型で見出される突然変異の調査を開始した。Keioコレクションは、Keioコレクション由来の菌株を用いる場合に耐性試験に対する参照として本発明者らがその後に用いた、BW25113バックグラウンドに実装されている。MG1655と比較して、BW25113菌株は、アラビノースおよびラムノースについての栄養要求株である。グルコースが本発明者らの増殖アッセイでの唯一の炭素源であるので、このことは耐性の生理学に影響しないはずである。
野生型BW25113は、MG1655よりも、イソプレノールストレス下で若干高い増殖速度を有するようであるが、この差異は有意ではない。調節因子robのノックアウトは、増殖速度を若干増大させるが、この差異は有意ではない。欠失したmarCを有するKeio菌株は、増殖速度を顕著に増大させる。このことは、イソブタノールストレスについて以前の研究で得られた結果と合致する（Minty et al., 2011）。本発明者らは、yghB遺伝子の上流に見出される突然変異が遺伝子発現を増大させ、逆に、この遺伝子の欠失は耐性に対して負の作用を有するはずであるという仮説を立てた。実際に、本発明者らは、KeioコレクションのyghB欠失菌株で、イソプレノールストレス下での低下した増殖速度を観察する。
1.4.2 yghB再構成
yghBの発現を増加させることによりテルペンに対する耐性を増大させるために、yghBについての発現ベクターを、ギブソンクローニングにより構築した。プラスミドは、pUC由来oriを有し、すなわち、高コピープラスミドである（Hoschek, Buhler and Schmid, 2017）。発現は、Ptrc1Oプロモーターにより調節され、このプロモーターは、高発現trpプロモーターおよびlacUV5プロモーターに由来し、lacI発現のための1つのlac1Oオペレーターを含む（Brosius, Erfle and Storella, 1985）。転写を制御するために、プラスミドは、1コピーのlacI阻害因子を保有する。発現プラスミドを、コロニーPCRおよび配列決定により確認した。宿主中では、プラスミドはアンピシリンまたはクロラムフェニコール抵抗性を介して選択することができ、プラスミドは、yghBの発現のために用いられるIPTG誘導性Ptrc1Oプロモーターを含む。
野生型バックグラウンドでのyghB過剰発現
以前の報告に記載される通り、yghB mRNAレベルは、約14倍アップレギュレーションされ、したがって、本発明者らは、MG1655野生型での過剰発現プラスミドからのyghBの追加的な発現が、yghBの突然変異体様発現レベルをもたらし、耐性表現型を回復させる可能性があるという仮説を立てた。100μM IPTGを用いる完全誘導は、空ベクター対照菌株と比較して、増殖を減少させることが見出された。誘導を伴わないかまたは10μM IPTGの低誘導を伴うyghB過剰発現菌株は、適応度の小さいが取るに足りない増大を示す。
1.4.2.1 marCノックアウトバックグラウンドでのyghB過剰発現
野生型バックグラウンドでのyghBの強力な過剰発現は、正の適応度の利益を有しなかった。進化実験の突然変異体菌株では、yghB突然変異は、分離して生じず、他の突然変異と同時に生じる。単一の突然変異は負の適応度作用を有し、他の突然変異と一緒にのみ正の適応度作用を有する可能性があるので（Minty et al., 2011）、本発明者らは、これまでのところ最も強い適応度作用を有する突然変異、すなわち、marCノックアウトとの関連で、yghB過剰発現を試験したいと考えた。この目的のために、本発明者らは、KeioコレクションのΔmarC菌株にyghB発現プラスミドを導入した。marCノックアウトは有意な適応度の増大を示すが、これはyghB誘導の適応度作用には影響しない。10μM IPTGを用いる最小限の誘導は、ΔmarC菌株と比較して若干適応度を低減させ、100μM IPTGを用いる強力な誘導は、野生型菌株を下回る程度まで、marCノックアウトの適応度を低減させる。ここまでで、本発明者らのデータは、yghB過剰発現が、適応度に対して負の作用のみを有することを示す。本発明者らは、本発明者らの発現プラスミドが、機能的YghBを産生し、yghBノックアウト菌株を補完できるのではないかと考えた。
1.4.2.2 yghBノックアウトバックグラウンドでのyghB過剰発現
最後に、yghB過剰発現プラスミドを、KeioコレクションのΔyghB菌株へと形質転換した。yghBのノックアウトは、適応度を約30％低減させる。yghB過剰発現プラスミドを用いて補完されたノックアウト菌株は、イソプレノールストレスに対して多様な応答を示す。誘導なしでは、補完菌株の適応度は、野生型の適応度を若干超えるが、この適応度増大は、有意ではない。3～10μM IPTGの軽度の発現誘導は、参照菌株と類似のイソプレノール耐性をもたらす。以前の実験と同様に、50μMの強力な誘導は、耐性を再び低下させる。yghBプラスミドは、狭い誘導レジメンのみではあるが、yghB欠損菌株を補完することができる。
yghB調節異常の仮説上の基礎
CRISPR gRNA構築物の計画中に、本発明者らは、-35領域の上流のプロモーター中の欠失部分が、-35領域と重複して直接的に反復し（1bpの交換を含む）、かつ-35領域の下流の反対側の鎖上で完全に反復される配列モチーフを含むことに気づいた（図5A）。MEMEスイートのTOMTOMツール（Gupta et al., 2007）を用いて、本発明者らは、類似の結合性モチーフを有する考えられる調節因子として、脂肪酸分解調節因子FadRおよびcAMP受容体タンパク質CRPを特定し、一般的な原核生物モチーフの中では、枯草菌（Bacillus subtilis）NatR調節因子が最も類似の結合性モチーフを有する。
1.4.3 突然変異体タンパク質を用いるノックアウト補完
本発明者らは当初、marCおよびrob遺伝子中に見出される突然変異が機能喪失をもたらす可能性があるという仮説を立てたが、突然変異型タンパク質がそれらの機能の一部を保持するか、または異なる機能性を有し、それによりイソプレノール耐性に対して正の作用を有するか否かは不明である。このことを調べるために、本発明者らは、ノックアウトバックグラウンドで対応する突然変異体タンパク質を発現させた。
1.4.3.1 marC
marC遺伝子中の最も高頻度の突然変異は、35位のメチオニンの後ろに終止コドン（M35stop）を導入し、それにより、最初の膜貫通ドメインの後ろで、タンパク質を著しく切断する。35位のメチオニンの後ろに終止を有するmarCのバージョンの発現のためのプラスミドを、標準的な方法を用いて構築した。プラスミドは、pUCバックグラウンドに基づき、アンピシリンまたはクロラムフェニコール抵抗性を介して選択することができ、かつmarC M35stopの発現のために用いられるIPTG誘導性Ptrc1Oプロモーターを含む。
本明細書中で上記の通り、marCノックアウト単独では、イソプレノールに対する増大した耐性を有する。IPTG誘導性marC M35stopタンパク質を用いるノックアウトの補完は、イソプレノールに対する耐性をさらに増大させなかった。
1.4.3.2 rob
転写調節因子robは、48位のヒスチジンでのフレームシフトにより突然変異される。これは、107アミノ酸長の切断型タンパク質を生じる。タンパク質結合性HTHモチーフは無傷であり得るが、タンパク質の残りの部分は、元のタンパク質とはわずかな類似性しか共有しない。このようなフレームシフトバージョンが、ノックアウトバックグラウンドで過剰発現された場合に何らかの作用を有し得るかを試験するために、robH48fsの過剰発現のためのプラスミドを、標準的な方法を用いて構築した。プラスミドは、pUCバックグラウンドに基づき、アンピシリンまたはクロラムフェニコール抵抗性を介して選択することができ、かつrob H48fsの発現のために用いられるIPTG誘導性Ptrc1Oプロモーターを含む。
rob遺伝子のノックアウトは、イソプレノールに対する耐性のわずかな増大しか生じない。8は、rob H48fsを含むプラスミドの導入が、耐性をさらに増大させることを示す。この作用は、タンパク質が強力に誘導されると再び失われ、これはタンパク質発現の追加的な代謝負荷に起因すると考えられる。突然変異体Robタンパク質は、無傷のHTHモチーフによってそのDNA結合能を保持し得るが、c末端相互作用ドメインが欠失するので、調節機能は変化する可能性がある。
1.4.4 二重ノックアウトの耐性試験
1つの再構成された突然変異を有する大腸菌株を調べた後、本発明者らは、複数遺伝子突然変異の考えられるエピスタシス作用を調べたいと考えた。この目的のために、robノックアウトでのカナマイシン抵抗性カセットをFLP組み換えにより置き換えた。このことは、カナマイシン抵抗性カセットを用いる追加のノックアウトの導入を促進する。
本発明者らは、robとmarCとの二重ノックアウトの組み合わせ作用を調べた。両方のノックアウトの組み合わせは、イソプレノールに対する増大した耐性を有する菌株を生じたが、野生型菌株と比較した適応度の増大は、marCの単一ノックアウトよりも小さかった。rob単独のノックアウトが、実際の突然変異を再構成しないことも考えられ、上記で示される通り、突然変異型Rob H48fsタンパク質は、調節を変化させてイソプレノール耐性に利益を及ぼす。このことを調べるために、本発明者らは、robおよびmarCの二重ノックアウトに、突然変異型Rob H48fsタンパク質を発現するプラスミドを導入した。実際には、突然変異体タンパク質を発現するプラスミドを用いて、耐性は、marCノックアウト単独と比較して若干増大する。
1.5 本発明の宿主細胞および方法での耐性の増大の広範囲の応用可能性
1.5.1 ブタノール
微生物に対する毒性作用を有する別の物質として、ブタノールが知られている。本発明の宿主細胞および方法の広範囲の応用可能性を実証して、4種類の主要な突然変異のすべてを示す突然変異体菌株は、7.5g/Lブタノール（50％阻害濃度に関する文献値）での増大した耐性を示した（図9A）。
本発明者らの実験設定での実験的EC50は5g/Lに近いことがわかっているので、本発明者らは続いて、この濃度で最も関連がある突然変異を試験した（図9B）。同様に、イソプレノール耐性に対して、本発明者らは、yghBのノックアウトがブタノールに対する耐性を低減させることを見出す。漏出性発現条件下（0μM IPTG）でyghBを発現するyghB発現プラスミドを用いるyghBノックアウトの補完は、相対的適応度を約11％増大させる。イソプレノール耐性から予測される通り、marCのノックアウトは、ブタノールに対する耐性を32％増大させ、興味深いことに、robノックアウトもまた、耐性を約25％上昇させる。耐性は、Δrobバックグラウンドでのrob H48frameshiftの漏出性発現により、34％までさらに増大する。41％の増殖速度の増大を伴うブタノールに対する最高の耐性は、rob H48fs発現を用いて補完されたrobおよびmarCの二重ノックアウトで観察することができる。
1.5.2 バニリン
バニリンは、これもまた多数の微生物に対する負の作用を有する、テルペンに対する幾分かの類似性を有する商業的に関心を持たれる物質である。この製品に対する耐性メカニズムの考えられる応用を試験するために、本発明者らは、バニリンを用いて野生型大腸菌MG1655の増殖速度を系統的に評価した（図10A）。試験された濃度レジメンでは、本発明者らは、完全な増殖阻害は見出さず、野生型の増殖速度の1/3までの低減のみを見出した。1g/Lの中間的バニリン濃度では、イソプレノール順応突然変異体菌株（第6世代での分離株A、MutT6A）は、有意に増加した増殖速度を示す。
バニリンに関して、50％増殖抑制は、1～1.5g/Lで達成される。比較のために、本発明者らは、1.5g/Lのバニリン濃度で、顕著な突然変異を試験した（図10Bを参照されたい）。他の試験された化学物質とは対照的に、yghBノックアウトは、バニリン耐性に対して正の作用を有し、増殖速度を18％増加させる。追加のyghB発現を用いるこの菌株の補完は、追加の3％速い増殖という軽微な作用のみを有する。予期せぬことに、marCのノックアウトは、バニリンストレス下での顕著な正の作用を有しない。同様に、robノックアウトは、8％の軽微な増加のみをもたらす。しかしながら、robノックアウトが突然変異体バージョンのrob H48fsを用いて補完される場合、耐性は野生型と比較して36％まで増大する。この菌株へのmarCノックアウトの追加は、耐性を、28％の増殖速度増加まで再び低減させる。
1.6 RNA-Seq実験由来の標的のスクリーニング
順応菌株に対するイソプレノールストレスの本発明者らのRNA-Seq解析は、野生型と比較して順応菌株で有意にアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションされた標的遺伝子のリストを明らかにした。ダウンレギュレーションされた表現型は、原理上は、ノックアウト菌株により模倣することができるであろう。この目的のために、本発明者らは、Keioノックアウトライブラリーの菌株をそれらのイソプレノール耐性について試験した。
5種類の標的遺伝子glgS、rraA、menA、cspLおよびfluのうちで、rraAノックアウトのみが、野生型と比較して、50mMイソプレノールを用いて有意に増加した増殖速度を示した。
2 考察
2.1 順応的進化実験で発見された突然変異
本発明者らは当初、進化の過程で発生する22種類の突然変異の組を特定した。これらの22種類のうち、4種類の標的遺伝子および突然変異が、進化実験での出現時点から、非常に安定かつ持続的であった。文献調査から、robおよびyghBの突然変異が、以前には溶媒またはアルコール耐性で言及されていなかったことが明らかになった。fabF突然変異は、以前にブタノール耐性で特定されていた（Jeong et al., 2012）。
marC欠失突然変異体は、イソブタノール耐性の関連で研究されていたが（Minty et al., 2011）、MarC M35stopなどの切断型タンパク質が追加の耐性作用を有するか否かは不明であった。本発明者らの実験は、突然変異型MarC M35stopの発現が、イソプレノールに対する追加の耐性を生じないことを明らかにした。したがって、marC突然変異は遺伝子欠失として機能する可能性があり、本発明者らの進化実験は、新規の耐性メカニズムを明らかにしなかった。
本発明者らはまた、rraA遺伝子中に突然変異を含む3種類の菌株を単離し、RNA-Seqデータは順応菌株でのrraA遺伝子の強力なダウンレギュレーションを示したので、これらの突然変異もまた、タンパク質機能に対する有害作用を有する可能性がある。試験により、実際は、rraAノックアウト菌株が、増大したイソプレノール耐性を有することが明らかになった。
別の実施形態では、単離された菌株のうちの4種類で見られた新規のplsX突然変異体が、本発明の宿主細胞および方法でテルペンなどの当該毒性物質に対する耐性を増大させるために有用である。異なるplsX突然変異体であるPlsX E216Gが、イソブタノール耐性進化で見出されているが（Minty et al., 2011）、そのメカニズムおよび作用は不明である。
Figure 2023508871000009
2.2 yghBプロモーター突然変異
ゲノム解析により、-35領域に近接したyghB遺伝子の上流で、すべての最終的な分離株で15bpが欠失されていることが明らかになった。RNA-Seqによる追加的調査は、すべての順応菌株で、yghB遺伝子の発現が、野生型と比較して14倍、有意にアップレギュレーションされることを示した。yghBプロモーター配列を詳しく調べると、-35領域は2つの反復する配列モチーフで挟まれている可能性があることが示された。興味深いことに、モチーフの上流反復は、突然変異体菌株では欠失されている。このモチーフの構造は、考えられるDNA結合性因子の抑制的作用を示唆する。推定される調節因子結合性部位の欠失は、プロモーターの脱調節を導く可能性があり、それにより、yghBの増大した平均発現がもたらされる。このモチーフは文献中に記載されていないので、推定上のリプレッサーの役割は不明なままである。
yghB発現が、野生型ではイソプレノールストレス下で抑制され、この抑制が、突然変異体では解除される可能性がある。しかしながら、yghBは、野生型で高度に発現され；発現中央値よりも約6倍高い。別の仮説は、yghB発現が、異種的にのみ抑制されること、およびこの部分集団での異種抑制は、プロモーター欠失突然変異により解除されることであり得る。この場合、イソプレノールストレス下で蛍光顕微鏡観察を用いてyghBプロモーター活性を研究することが示唆されるであろう。
この突然変異を再構成するための当初のアプローチは、過剰発現プラスミドを構築することであった。しかしながら、野生型バックグラウンドでのyghBの発現および強力な誘導のみが、低下した増殖速度をもたらした。yghBが誘導なしで（すなわち、プラスミドの漏出性発現に依存して）発現された場合、ΔyghBバックグラウンドでは、耐性を改善できた。このことは、yghBが、耐性に対する非線形の限定的な作用を有すること、すなわち、yghB発現が、細かに調節された発現レジームのみで有益であること、および強力な発現プロモーターを含む高コピープラスミドが用いられる場合には発現レベルがこのレジームを超える場合があることを示唆する。漏出性yghB発現でのΔyghBの補完は、イソプレノール、ブタノールおよびバニリンに対する耐性を増大させた。しかしながら、バニリンストレス下では、yghBのノックアウトもまた耐性を改善した。
2.3 rob突然変異
単離された菌株の中で、rob遺伝子の3種類の異なる突然変異が特定された。2種類の突然変異は、G273およびY103の後ろでのタンパク質の切断を引き起こし、この最も高頻度の突然変異はH48の後ろでのフレームシフトを引き起こし、107aa長のタンパク質を生じる。rob遺伝子の欠失は、イソプレノールに対する耐性に対して中等度の作用のみを有した。突然変異型rob H48フレームシフトでのrobノックアウト菌株の補完は、イソプレノールに対する耐性を有意に増大させる。rob H48 fsを有するこのノックアウト菌株は、バニリンおよびブタノールに対する高い耐性も生じる。突然変異型Rob H48fsは、HTH DNA結合性モチーフの一部を含み、したがって、このタンパク質はまだDNAに結合できるが、そのC末端レシーバードメインを用いる分子的合図に対して反応するその能力を失っている（Griffith et al., 2009）。
2.4 組み合わせ作用
進化プロセスの過程で、新たな突然変異の獲得は、多くの場合、いわゆるエピスタシス作用、すなわち、組み合わせられた2種類の突然変異の適応度の利益が、単一の適応度の利益の和（または積）を超過することによって支援される。本発明者らは、marCおよびrobノックアウトとRob H48fs発現との組み合わせで、イソプレノールおよびブタノール耐性に対する追加的な適応度の利益を見出したが、この組み合わせは、いかなる相乗作用も示さなかった。バニリン毒性の場合には、Δrob rob H48fs菌株へのmarCノックアウトの付加は適応度を減少させ、このことは、負のエピスタシス相互作用の証拠である。
2.5 RNA-Seq由来のノックアウト標的
イソプレノールストレス下で野生型菌株に対して順応菌株の発現を比較する本発明者らのRNA-Seq実験で、本発明者らは、順応菌株で高度にアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションされた遺伝子の組を特定した。差次的調節が耐性に対して有益である場合、アップレギュレーションおよびダウンレギュレーションの分子的遺伝子操作が、この作用を模倣できるであろう。これは明らかに、上記で示した通りのyghBのアップレギュレーションについての場合である。順応菌株での標的遺伝子の極端なダウンレギュレーションは、理論的には、標的遺伝子のノックアウトにより達成できるであろう。
この目的のために、利用可能なノックアウト菌株の組を、それらのイソプレノール耐性に関して試験した。本発明者らは、イソプレノール耐性において有益である標的ノックアウトとして、rraA遺伝子を特定した。突然変異体菌株でのダウンレギュレーションに加えて、本発明者らは、進化実験の初期分離株中の2種類の突然変異も見出した。ノックアウト菌株が正の耐性作用を達成するので、本発明者らは、突然変異体RraAタンパク質中のアミノ酸交換V96-EおよびG67-Sが、in vivo RraA機能に対して負の作用を有し得るという仮説を立てる。G67-S突然変異は、他の生物種にも存在する構造的β-シートエレメントに隣接している。より高頻度のV96-E突然変異は、非常に保存されたバリン残基でのものであり、RraA機能において極めて重要であり得る（Monzingo et al., 2003）。RNアーゼEの阻害因子として、rraAの非存在は、mRNA転写産物のレベルを多面的に減少させる（Lee et al., 2003）。
2.6 追加的化学物質への正の突然変異の拡大
本発明の宿主細胞および方法は、大腸菌などの微生物での増大したイソプレノール耐性を達成する。さらに、本発明の宿主細胞および方法は、追加的な化学物質に対する微生物の耐性を増大させる。本発明の宿主細胞は、ブタノールおよびまたイソブタノールに対する比較的高い耐性を有し、C4およびC5本体を有する他のアルコールまたはアルデヒドに適用された。
本発明者らは、モノテルペン化合物ゲラニオールに対する耐性に関しても順応菌株を試験したが、それらの菌株がゲラニオールに対する増大した感受性を有することを見出した。本発明者らは、本発明の耐性メカニズムは、類似の物理化学特性を有する化合物のみに適用されると推論し、したがって、両方ともゲラニオールよりも低い水中での溶解度および高いlogP値を有するシトラールおよびメントールは試験しなかった。結果として、本発明者らは、耐性メカニズムが機能する限界物理化学特性を決定しようと試み、イソプレノールとゲラニオールの中間のlogP値を有するバニリンを選択した。本発明者らは、marCがバニリン耐性で役割を果たさなかったことを例外として、バニリン耐性が、本発明の宿主細胞および方法により達成できることを見出した。Δrobバックグラウンドでの突然変異型rob H48 fsの発現は、耐性に対して強力な正の作用を有した。yghBもバニリン耐性で役割を果たすが、C4およびC5アルコールに対するのとは異なる様式である。yghBのノックアウトは、イソプレノールおよびブタノール耐性に対して負の作用を有した一方で、バニリン耐性では正の作用を有する。
変動性が高い物理化学特性を有する広範囲の化合物に1つの耐性メカニズムが適用できないであろうことは明らかである。しかしながら、同じ細胞内標的（例えば、細胞膜）が関わっている場合、同じ遺伝子が、異なる様式ではあるが、耐性メカニズムにそれでも関与する可能性がある。本発明の一実施形態では、毒性化合物の細胞内標的は同じであり、耐性は、本発明に開示される遺伝子の細かに調節された発現および機能により達成され得る。このことは、膜ストレス誘導性化合物に関して、1種類の膜遺伝子が、正確な物性に応じて過剰発現またはダウンレギュレーションされる必要がある場合があるが、それぞれの場合で、同じ標的遺伝子が本発明の一実施形態で利用できることを意味する。別の実施形態では、ツールボックスアプローチもまた、指向性進化アプローチのための標的を提示する。特定の耐性メカニズムに関与する遺伝子を、エラープローンPCRアプローチを用いて増幅させ、耐性に対するそれらの利益に関して選択することができる。
Figure 2023508871000010
 本発明者らは、これらの結果のうちの一部を発表している（Babel and Kromer 2020を参照されたい）。
3 実験材料および方法
3.1 菌株、プラスミドおよびプライマー
Figure 2023508871000011
Figure 2023508871000012
Figure 2023508871000013
Figure 2023508871000014
Figure 2023508871000015

Figure 2023508871000016
3.2 菌株およびプラスミド構築
3.2.1 発現プラスミド
対応するKeio菌株由来の25bp重複を有する抵抗性カセットの増幅により、ノックアウト菌株を構築した（プライマー3＋4、5＋6および7＋8）。相同な25bp配列およびカナマイシン抵抗性を保有するPCR産物を用いて、標準的手順を使用して大腸菌MG1655を形質転換した（Baba et al., 2006）。過剰発現プラスミドに関して、標的遺伝子を、pAH030過剰発現プラスミドに対する25bp相同性を含んで増幅した。SpeI制限部位を用いてプラスミドを線形化し、対象となる遺伝子を含むPCR産物を、ギブソンアセンブリを用いて挿入した（Gibson et al., 2009）。
3.2.2 ノックアウト菌株
対応するKeioコレクション菌株から単離されたDNA断片を用いて、ノックアウト菌株を準備した。標準的RED/ETキット（Genebridges Red/ETキット、2019）を用いて、組み換えを行なった。
3.3 微生物の培養
3.3.1 化学組成既知培地
大腸菌の増殖のために、M9培地（Green and Sambrook, 2012）を用いた。M9 10×を、pH7に調整した。
Figure 2023508871000017
Figure 2023508871000018
Figure 2023508871000019
3.4 培養スキームおよび条件
3.4.1 振盪フラスコに基づく進化
大腸菌を、37℃の温度でインキュベートした。
好適な化学組成既知培地上に微生物を筋状に塗り付け、至適温度で増殖させた。コロニー形成が観察されたら、10mLの化学組成既知培地にコロニーを接種し、Infors HT Multitron（Switzerland, Bottmingen）またはEcotron（25mm振盪距離）で、200rpmの振盪速度にて、100mLバッフル付きフラスコ中でインキュベートした。この培養物から、250mLバッフル付きフラスコ中の25mL培地の一晩培養物を接種し、16時間インキュベートして、次の日に培養物が中間指数増殖期にあるようにした。
次の日、テフロン(登録商標)裏打ちスクリューキャップ（screw cab）を有する250mLバッフル付きフラスコ中の25mLの培地に、OD0.2まで接種し、200rpmでインキュベートした。明記された濃度まで、テルペノイドストレスを付加した。細胞培養物が定常期に達する前に、培養物の一部を、テルペノイドを含む新しいフラスコ中の新鮮培地へと移した。平均培養増殖速度を、初期ODと継代前の培養物ODとを比較することにより決定した。
継代前に、600μLの細胞培養物を取り出し、600μLの50％v/vグリセロール溶液と混合した。サンプルを－80℃で保存した。
Figure 2023508871000020
3.5 増殖データの評価
増殖速度は、自然対数を用いて各実験のOD値を変換することにより決定した。線形領域の増殖では、直線をデータにフィッティングして傾斜を決定し、これが増殖速度と等しい。各フラスコについて個別に増殖速度を決定し、各条件の増殖速度を、3回の生物学的複製の平均および標準偏差として与える。
50％増殖速度（MIC50）に隣接する2つのデータ点の線形補間を用いて、50％増殖速度の化合物濃度を推定した。増殖速度の対応する標準偏差が利用可能である場合、MIC50の標準誤差を、誤差伝搬により計算した。
3.6 ヨウ化プロピジウム染色
ヨウ化プロピジウム染色のために、250mLバッフル付き密封振盪フラスコ中で適切なイソプレノール濃度下で5時間、細胞を増殖させた。各条件の2mLのサンプルを取得し、同体積の0.85％NaCl溶液中に再懸濁した。陰性対照として、野生型サンプルを、バシロールAFを用いて5分間インキュベートした。陰性対照も洗浄した後、サンプルを、1.5×107細胞/mLの濃度まで希釈し、SYTO 9 50μLストック溶液（DMSO中）およびヨウ化プロピジウム6mMストック溶液（DMSO中）を添加し、5μM SYTO 9および6μM PIの最終濃度とした。SYTO 9染色は、サンプル中の残渣から細胞を識別するための陽性染色として用いた。サンプルを、室温で少なくとも20分間インキュベートした。測定前に、サンプルを1.5×106細胞/mLの最終濃度まで希釈した。Beckman Coulter CytoFLEXフローサイトメーターを用いて、サンプルを測定した。ヨウ化プロピジウム染色は、488nmレーザーおよび610/20 BPフィルターを用いて励起して検出し、SYTO 9は524/40 BPフィルターおよび同じ励起波長を用いて測定した。
3.7 DNAおよびRNA配列決定
3.7.1 DNA配列決定
3.7.1.1 サンプル調製
選択した菌株を、60mMイソプレノールを添加した5mL LB培地中で一晩増殖させた（突然変異体菌株に関して）。標準的方法を用いて、ゲノムDNAを単離した。
3.7.1.2 ライブラリー調製および配列決定
1. コバリス（Covaris）を用いるDNA断片化（所望の断片サイズ：300bp）
2. MinEluteカラム（Qiagen社）を用いるサンプル精製、20μL EBバッファー中に溶出
3. Illuminaライブラリー構築：
Ovation Rapid DR Multiplex System 1-96（NuGEN社）をマニュアルに従って用いて、インデックス付きIlluminaライブラリーを調製する
4. ライブラリー増幅およびサイズ選択
MyTaq（Bioline社）および標準的Illuminaプライマーを用いて、13サイクルにわたってライブラリーを増幅した。サイズ選択は、300～500bpの範囲を選択して、Pippin Prepシステム（Sage Science社）上で行なった
5. 最終ライブラリー精製ステップならびにBioAnalyzerおよびQubitを介するDNAライブラリーの品質管理
6. 配列決定は、製造業者の説明書に従って、2×150bp読み取り長でIllumina NextSeq 500/550（Illumina社）上で行なった。
3.7.1.3 データ解析
1. 読み取り値予備加工：
・Illumina bcl2fastq 2.17.1.14ソフトウェアを用いる各配列決定レーンに対するすべてのライブラリーの分離（フォルダ「RAW」）：
・レーン上のすべてのライブラリー間のバーコード距離が許容した場合には、バーコード読み取り値中の1箇所もしくは2箇所のミスマッチまたはNが許容された
・すべての生読み取り値からの配列決定アダプター残留物のクリッピング（フォルダ「AdapterClipped」）
・20塩基未満の最終長を有する読み取り値は廃棄された。
・アダプタークリッピングされたIllumina読み取り値の品質トリミング（フォルダ「QualityTrimmed」）
・Nを含む読み取り値の除去
・10塩基のウインドウにわたる20の最小平均Phredクオリティスコアを得るための3'末端での読み取り値のトリミング
・20塩基未満の最終長を有する読み取り値は廃棄された
・すべてのFASTQファイルに対するFastQCレポートの作成
・一見してすべてのサンプルに対するすべての読み取りカウントを含む、read_counts.xlsxの生成
2. アライメントおよび変異体発見
・BWA-MEMバージョン0.7.12（http://bio-bwa.sourceforge.net/）を用いる参照ゲノムに対する品質トリミングされた読み取り値のアライメント（フォルダ「Alignments」）：
・座標により選別されたBAM形式でのサンプル当たり1個のアライメントファイル
・Picard v1.92 MarkDuplicates（http://picard.sourceforge.net/）を用いるPCRおよび光学複製読み取り値のマークアップ
・Freebayes v1.0.2-16（https://github.com/ekg/freebayes#readme）を用いる変異体発見およびサンプルの遺伝子型決定（フォルダ「VariantAnalysis/[reference]/Freebayes」）
・2箇所を超えるミスマッチを有する読み取り値は除外された
・MNPおよび複合体変異体は除外された
・倍数性は1に設定された。
3.7.2 RNA配列決定
3.7.2.1 サンプル調製
野生型および3種類の最終的な突然変異体菌株を、上記の通り、ODが1.0になるまで、50mMイソプレノールを用いて生物学的3回複製で増殖させた（25mL密封フラスコ）。続いて、10mLの細胞培養物を、0.8μM孔径を有するSupor(登録商標)800 Gridフィルターを用いて真空ろ過した。細胞を含むフィルターを、700μL PGTX溶液が入った15mLファルコンチューブに入れ、液体窒素中で直ちに凍結させた。さらなる処理まで、サンプルを－80℃で保存した。
RNAを抽出するために、サンプルを、水浴中65℃で15分間、ときどきボルテックスにかけながらインキュベートし、続いて、氷上で5分間インキュベートした。続いて、700μLのクロロホルムを添加し、室温で10分間インキュベートした。サンプルを15分間遠心分離し、上層の水相を新しいバイアルに移し、同体積のクロロホルムを添加した。混合後、サンプルをさらに15分間遠心分離した。上層の水相（約500μL）を新しいバイアルに移し、同体積のイソプロパノールと混合した。続いて、混合物を－20℃で一晩インキュベートした。
次の日、混合物を、RNaseZAPを用いて清掃した遠心分離機中で、4℃かつ12000gで30分間遠心分離した。上清を除去し、ペレットを、1mLの70％v/vエタノール溶液を用いて注意深く洗浄した（ペレットを再懸濁することなく）。12000gかつ4℃で5分間のさらなる遠心分離ステップの後、ペレットを、クリーンベンチの下で約15分間風乾させた。最後に、RNAをRNアーゼ不含水（40μL）中に再懸濁した。Nanodropを用いてサンプル濃度を測定した。Turbo DNA-freeキット（Invitrogen社）を用いるサンプルの処理後、再び濃度を測定し、サンプルを、TAE中の1.5％アガロース非変性ゲル上で調べた。EZ-Vision Three染色を用いてサンプルを染色した。
3.7.2.2 ライブラリー調製および配列決定
1. Bioanalyzerを介して総RNAの品質管理チェックを行った
2. Ribo-Zero細菌用rRNA除去キット（Illumina社）を製造業者の説明書に従って用いるrRNA枯渇
3. ファーストストランドcDNA合成：NEBNext RNAファーストストランド合成モジュール（New England Biolabs社）を、マニュアルに従って用いた
4. セカンドストランド合成：NEBNext RNAセカンドストランド合成モジュール（New England Biolabs社）を、マニュアルに従って用いた
5. cDNAの精製および濃縮：ステップ5からのcDNAを、MinEluteカラム（Qiagen社）を用いて精製し、20μL EBバッファー中に溶出させた
6. Illuminaライブラリー構築
Encore Rapid DR Multiplexシステム（Nugen社）を、マニュアルに従って、ライブラリー調製のために用いた
7. ライブラリー増幅およびサイズ選択
MyTaq（Bioline社）および標準的Illuminaプライマーを用いて、12サイクルにわたって100μLの体積中でライブラリーを増幅した。サイズ選択は、300～500bpの断片を選択する調製的アガロースゲル上で行なった
8. BioanalyzerおよびQubitを介して、RNAライブラリーの品質管理を行なった
9. 製造業者の説明書に従った、Illumina NextSeq500/550（1×75bp）上での配列決定。
3.7.2.3 データ解析
1. データ予備加工
・Illumina bcl2fastq 2.17.1.14ソフトウェアを用いる各配列決定レーンに対するすべてのライブラリーの分離（フォルダ「RAW」）：
・レーン上のすべてのライブラリー間のバーコード距離が許容した場合には、バーコード読み取り値中の1箇所もしくは2箇所のミスマッチまたはNが許容された
・すべての生読み取り値からの配列決定アダプター残留物のクリッピング（フォルダ「AdapterClipped」）
・20塩基未満の最終長を有する読み取り値は廃棄された
・RiboPicker 0.4.3（http://ribopicker.sourceforge.net/）を用いるrRNA配列のフィルタリング（フォルダ「RiboPicker」）
・一見してすべてのサンプルに対するすべての読み取りカウントを含む、read_counts.xlsの生成
・すべてのFASTQファイルに対するFastQCレポートの作成
2. 差次的発現解析
・STAR 2.4.（https://github.com/alexdobin/STAR/releases）を用いる参照に対するアライメント（フォルダ「Alignments」）
・rRNAまたはtRNA領域に対してアライメントする読み取り値のアライメント後フィルタリング（フォルダ「Alignments」）
・htseq-count（http://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq/）を用いるTopHatアライメントされた読み取り値の計数（フォルダ「Alignments」）
・edgeR 3.2.3（http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html）、DESeq 1.12.0（http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq.html）およびcuffdiff 2.1.1（http://cufflinks.cbcb.umd.edu）を用いる差次的発現解析（フォルダ「ExpressionAnalysis」、下位フォルダ「edgeR」、「DESeq」および「cuffdiff」）：
・統計学的検定からの生のp値を、Benjamini-Hochberg偽発見率（FDR）法による多重検定のために調整した。
本発明者らは、これらの結果のうちの一部を発表している（Babel and Kromer 2020を参照されたい）。
4 参考文献
Figure 2023508871000021
Figure 2023508871000022
Figure 2023508871000023
本発明のさらなる態様
好ましくは、テルペンなどの毒性物質の存在下での増殖速度が、対照（すなわち、未改変型生物）と比較して、5％、10％または15％、より好ましくは20％、25％、30％、35％、40％、45％または50％以上、増加する。
より好ましくは、テルペンなどの毒性物質の存在下での増殖速度が、1.1倍、1.2倍、1.25倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.75倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、または10倍改善する。
本発明の大腸菌の改変に対応する改変が、本発明の方法および改変型生物で特に有用であり、好ましくは、配列番号1～9に提供される通りのタンパク質をコードする遺伝子、またはそれらに対して少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％もしくは98％の配列同一性のものでの開示される改変に対応する。
特に明記しない限り、本明細書中で用いられる用語は、関連する技術分野の当業者による慣用的な使用方法に従うと理解されるべきである。本明細書中に提供される用語の定義に加えて、分子生物学での一般的な用語の定義は、Rieger et al., 1991 Glossary of genetics: classical and molecular, 5th Ed., Berlin: Springer-Verlag；およびCurrent Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Eds., Current Protocols（Greene Publishing Associates, Inc.およびJohn Wiley & Sons, Inc.の合弁事業）（1998年補遺）にも見出すことができる。
本明細書中および特許請求の範囲中で用いる場合、「a」または「an」は、それが用いられる文脈に応じて、1つまたはそれ以上を意味し得ることが理解されるべきである。つまり、例えば、「a cell」に対する言及は、少なくとも1つの細胞が利用できることを意味し得る。本明細書中で用いられる用語は、具体的な実施形態を説明する目的のみのためのものであり、限定を意図しないことが理解されるべきである。
クローニング、DNA単離、増幅および精製に関する、DNAリガーゼ、DNAポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼ等を含む酵素反応に関する、標準的技術、ならびに様々な分離技術は、公知であり、かつ当業者により一般的に利用されるものである。多数の標準的技術が、M. Green & J. Sambrook (2012) Molecular Cloning: a laboratory manual, 4th Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York；Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Online Library；Maniatis et al., 1982 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, N.Y.；Wu (編) 1993 Meth. Enzymol. 218, Part I；Wu (編) 1979 Meth Enzymol. 68；Wu et al., (編) 1983 Meth. Enzymol. 100および101；Grossman and Moldave (編) 1980 Meth. Enzymol. 65；Miller (編) 1972 Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.；Old and Primrose, 1981 Principles of Gene Manipulation, University of California Press, Berkeley；Schleif and Wensink, 1982 Practical Methods in Molecular Biology；Glover (編) 1985 DNA Cloning Vol. I and II, IRL Press, Oxford, UK；Hames and Higgins (編) 1985 Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UK；およびSetlow and Hollaender 1979 Genetic Engineering: Principles and Methods, Vols. 1-4, Plenum Press, New Yorkに記載されている。
本明細書中で別途明記されなければ、用いられる場合、略語および命名法は、当該分野で標準的であると見なされ、かつ本明細書中に引用されるものなどの専門雑誌で一般的に用いられる。
宿主細胞へのDNA構築物またはベクターの導入は、形質転換、エレクトロポレーション、核微小注入、形質導入、トランスフェクション（例えば、リポフェクション媒介もしくはDEAE-デキストラン媒介トランスフェクションまたは組み換えファージウイルスを用いるトランスフェクション）、リン酸カルシウムとのインキュベーションでのDNA沈殿、DNA被覆微粒子の高速ボンバードメント、およびプロトプラスト融合などの技術を用いて行なうことができる。一般的な形質転換技術は、当技術分野で公知である（例えば、Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al. (編) Chapter 9, 1987；Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, 1989；およびCampbell et al, Curr. Genet. 16:53-56, 1989を参照されたい。これらの文献は、特に形質転換法に関して、それらの全体で参照により本明細書中にそれぞれ組み入れられる）。トリコデルマ属（Trichoderma）での異種ポリペプチドの発現は、米国特許第6,022,725号；同第6,268,328号；同第7,262,041号；国際公開第2005/001036号；Harkki et al., Enzyme Microb. Technol. 13:227-233, 1991；Harkki et al, Bio Technol 7:596-603, 1989；欧州特許出願公開第244,234号；同第215,594号；およびNevalainen et al, "The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous and Heterologous Genes," in Molecular Industrial Mycology, Eds. Leong and Berka, Marcel Dekker Inc., NY pp. 129-148, 1992に記載されている（これらの文献は、特に形質転換および発現方法に関して、それらの全体で参照により本明細書中にそれぞれ組み入れられる）。アスペルギルス属（Aspergillus）菌株の形質転換に関して、Cao et al, Sd. 9:991-1001, 2000；欧州特許出願公開第238023号；およびYelton et al, Proceedings. Natl. Acad. Sci. USA 81:1470-1474, 1984もまた参照される（これらの文献は、特に形質転換法に関して、それらの全体で参照により本明細書中にそれぞれ組み入れられる）。導入された核酸は、染色体DNAへと統合されるか、または染色体外複製配列として維持される場合がある。
一実施形態では、本発明は、生物または宿主細胞へと、テルペン化合物、好ましくはモノテルペン化合物に対する増大した耐性を伝達する、単離された遺伝子および/またはそれらによりコードされる単離されたタンパク質に関する。遺伝子およびタンパク質の変異体ならびに本明細書中に記載されるそのような能力の核酸にハイブリダイズするその変異体および核酸も含められ、このとき、これらの変異体および本発明のハイブリダイズ性配列は、少なくとも実質的に本発明の核酸の保護的作用と同程度に高いテルペン化合物に対する保護的作用を、生物または宿主細胞に伝達する。
用語「遺伝子」とは、ポリペプチド鎖の生成に関与するDNAのセグメントを意味し；コード領域に先立つ領域およびその後に続く領域（リーダーおよびテイラー）ならびに個別のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含む。典型的には、これは親から子孫へと伝えられ、かつ生物の表現型に寄与する遺伝情報を含むDNAのセグメントである。生物の形態および機能に対する遺伝子の影響は、RNA（tRNA、rRNA、mRNA、非コードRNA）への転写を介して、かつmRNAの場合にはペプチドおよびタンパク質への翻訳を介して、媒介される。
用語「ハイブリダイゼーション」は、本明細書中で定義される場合、実質的に相補的なヌクレオチド配列が互いにアニーリングするプロセスである。ハイブリダイゼーションプロセスは、完全に溶液中で起こることができ、すなわち、両方の相補的核酸が溶液中にある。ハイブリダイゼーションプロセスはまた、一方の相補的核酸が磁性ビーズ、セファロースビーズまたはいずれかの他の樹脂などのマトリックスに固相化された状態で起こることもできる。ハイブリダイゼーションプロセスはさらに、一方の相補的核酸がニトロセルロース膜もしくはナイロン膜などの固体支持体に固相化されているか、または、例えばフォトリソグラフィーにより、ケイ質ガラス（siliceous glass）支持体に固相化されている（後者は、核酸アレイもしくはマイクロアレイまたは核酸チップとして知られる）状態で起こることができる。ハイブリダイゼーションを起こすために、核酸分子は一般的に、2本の一本鎖へと二本鎖を融解させるために、かつ/または一本鎖核酸からヘアピンもしくは他の二次構造を除去するために、熱的または化学的に変性される。
用語「ストリンジェンシー」とは、ハイブリダイゼーションが起こる条件を意味する。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、温度、塩濃度、イオン強度およびハイブリダイゼーションバッファー組成などの条件により影響を受ける。一般的に、低ストリンジェンシー条件は、規定されたイオン強度およびpHでの特異的配列に対する熱的融点（Tm）よりも約30℃低く選択される。中等度ストリンジェンシー条件は、温度がTmよりも20℃低い場合であり、高ストリンジェンシー条件は、温度がTmよりも10℃低い場合である。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、典型的に、標的核酸配列に対して高い配列類似性を有するハイブリダイズ性配列を単離するために用いられる。しかしながら、核酸は、遺伝的コードの縮重に起因して、配列が逸脱しながらも実質的に同一のポリペプチドをコードする場合がある。したがって、中等度ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件が、一部の場合に、そのような核酸分子を同定するために必要であり得る。
「Tm」は、規定されたイオン強度およびpHで、完璧にマッチするプローブに対して標的配列のうちの50％がハイブリダイズする温度である。Tmは、溶液条件ならびにプローブの塩基組成および長さに依存する。例えば、より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。最大のハイブリダイゼーション速度は、Tmよりも約16℃から最大で32℃低い温度で得られる。ハイブリダイゼーション溶液中の一価カチオンの存在は、2つの核酸鎖の間の静電反発力を減少させ、それによりハイブリッド形成を促進し；この作用は、最大で0.4Mのナトリウム濃度で観察される（より高濃度ではこの作用は無視できる）。ホルムアミドは、ホルムアミド1％につき0.6～0.7℃、DNA-DNAおよびDNA-RNA二重鎖の融解温度を低下させ、50％ホルムアミドの添加は、30～45℃でハイブリダイゼーションが起こるのを可能にするが、ハイブリダイゼーション速度は低下するであろう。塩基対ミスマッチは、ハイブリダイゼーション速度および二重鎖の熱安定性を低下させる。平均して、大きなプローブに関して、Tmは塩基ミスマッチ1％当たり約1℃低下する。Tmは、ハイブリッドの種類に応じて、以下の方程式を用いて算出することができる：
・DNA-DNAハイブリッド（Meinkoth and Wahl, Anal. Biochem., 138: 267-284, 1984）：
Tm＝81.5℃＋16.6×log[Na+]a＋0.41×％[G/Cb]－500×[Lc]-1－0.61×％ホルムアミド
・DNA-RNAまたはRNA-RNAハイブリッド：
Tm＝79.8＋18.5(log10[Na+]a)＋0.58(％G/Cb)＋11.8(％G/Cb)2－820/Lc
・オリゴDNAまたはオリゴRNAdハイブリッド：
20ヌクレオチド未満に関して：Tm＝2(ln)
20～35ヌクレオチドに関して：Tm＝22＋1.46(ln)
aまたは他の一価カチオンに関して、0.01～0.4Mの範囲でのみ正確である。
b 30％～75％の範囲でのみ％GCに関して正確である。
c L＝二重鎖の塩基対の長さ。
d オリゴ：オリゴヌクレオチド；ln：プライマーの有効長＝2×(G/Cの数)＋(A/Tの数)。
非特異的結合は、例えば、タンパク質含有溶液を用いるメンブレンのブロッキング、ハイブリダイゼーションバッファーへの異種RNA、DNA、およびSDSの添加、およびRNアーゼを用いる処理などの多数の公知の技術のうちのいずれか1種を用いて制御することができる。無関係なプローブに関して、一連のハイブリダイゼーションを、以下のうちの一方を変化させることにより行なうことができる：(i) アニーリング温度を徐々に低下させること（例えば、68℃から42℃まで）または(ii) ホルムアミド濃度を徐々に低下させること（例えば、50％から0％まで）。当業者は、ハイブリダイゼーション中に変更することができ、かつストリンジェンシー条件を維持または変化させるであろう様々なパラメータを知っている。
ハイブリダイゼーション条件に加えて、ハイブリダイゼーションの特異性は、典型的には、ハイブリダイゼーション後の洗浄の機能にも依存する。非特異的ハイブリダイゼーションから生じるバックグラウンドを除去するために、サンプルは希釈塩溶液を用いて洗浄される。そのような洗浄の重要な因子は、最終洗浄溶液のイオン強度および温度を含み：塩濃度が低いほど、および洗浄温度が高いほど、洗浄のストリンジェンシーが高くなる。洗浄条件は、典型的に、ハイブリダイゼーションストリンジェンシーで、またはそれ以下のストリンジェンシーで行なわれる。陽性のハイブリダイゼーションは、バックグラウンドのシグナルの少なくとも2倍のシグナルを生じる。一般的に、核酸ハイブリダイゼーションアッセイまたは遺伝子増幅検出手順に関する好適なストリンジェント条件は、上記で説明される通りである。より高いかまたはより低いストリンジェント条件もまた、選択することができる。当業者は、洗浄中に変更することができ、かつストリンジェンシー条件を維持または変化させるであろう様々なパラメータを知っている。
例えば、50ヌクレオチドよりも長いDNAハイブリッドに対する典型的な高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、65℃で1×SSC中または42℃で1×SSCおよび50％ホルムアミド中でのハイブリダイゼーション、およびそれに続く65℃で0.3×SSC中での洗浄を包含する。50ヌクレオチドよりも長いDNAハイブリッドに対する中等度ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の例は、50℃で4×SSC中または40℃で6×SSCおよび50％ホルムアミド中でのハイブリダイゼーション、およびそれに続く50℃で2×SSC中での洗浄を包含する。ハイブリッドの長さは、ハイブリダイズ性核酸に対して予測される長さである。既知の配列の核酸をハイブリダイズさせる場合、ハイブリッドの長さは、配列をアライメントし、本明細書中に記載される保存された領域を特定することにより決定することができる。1×SSCは、0.15M NaClおよび15mMクエン酸ナトリウムであり；ハイブリダイゼーション溶液および洗浄溶液は、5×デンハルト試薬、0.5～1.0％SDS、100μg/mL変性断片化サケ精子DNA、0.5％ピロリン酸ナトリウムをさらに含む場合がある。高ストリンジェンシー条件の別の例は、65℃で0.1％SDSおよび任意により5×デンハルト試薬、100μg/mL変性断片化サケ精子DNA、0.5％ピロリン酸ナトリウムを含む0.1×SSC中でのハイブリダイゼーション、およびそれに続く65℃で0.3×SSC中での洗浄である。
ストリンジェンシーのレベルを規定する目的のために、Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York または Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y.（1989および年1回の改訂）を参照することができる。
「組み換え」（またはトランスジェニック）とは、細胞または生物に関しては、細胞または生物が、遺伝子技術により導入される外因性ポリヌクレオチドを含むことを意味し、ポリヌクレオチドに関しては、以下のいずれか：
(a) ポリヌクレオチドもしくはその一部の配列、または
(b) ポリヌクレオチドに機能的に連結されている1種以上の遺伝子制御配列（例えば、プロモーター）、または
(c) (a)および(b)の両方
が、それらの野生型遺伝的環境中に位置しないかまたは改変されている、遺伝子技術/組み換えDNA技術によりもたらされるすべてのそれらの構築物を意味する。
用語「単離された核酸」または「単離されたポリペプチド」は、一部の例では、それぞれ「組み換え核酸」または「組み換えポリペプチド」に対する同義語であると考えることができ、かつそれぞれ、その天然の遺伝的環境または細胞環境に位置しないか、かつ/または組み換え法により改変されている、核酸またはポリペプチドを意味することが、さらに留意されるであろう。単離された核酸配列または単離された核酸分子は、その生来の周囲環境またはその生来の核酸近傍にはないが、物理的および機能的に他の核酸配列または核酸分子に連結し、核酸構築物、ベクター配列または染色体の一部として見出されるものである。典型的には、単離された核酸は、実験室条件で細胞からRNAを単離し、それをコピーDNA（cDNA）へと変換することにより取得される。
核酸、タンパク質、酵素、または生物の「親」（または「参照」もしくは「鋳型」）（「親核酸」、「参照核酸」、「鋳型核酸」、「親タンパク質」、「参照タンパク質」、「鋳型タンパク質」、「親酵素」、「参照酵素」、「鋳型酵素」、「親生物」、「参照生物」、または「鋳型生物」とも称される）は、（例えば、1箇所以上の核酸またはアミノ酸置換を導入することによる）親の「変異体」をもたらす変化の導入における出発点である。つまり、「酵素変異体」または「配列変異体」または「変異体タンパク質」などの用語は、それぞれの変異体配列、タンパク質、酵素、または生物に対する起源である親配列、タンパク質、酵素、または生物から、改変型もしくは変異体配列、タンパク質、酵素、または生物を区別するために用いられる。したがって、親配列、タンパク質、酵素、または生物は、野生型配列、タンパク質、酵素、または生物、およびさらなる変異体の開発のために用いられる野生型配列、タンパク質、酵素、または生物の変異体を含む。変異体タンパク質または酵素は、一定の程度までそれらのアミノ酸配列が親タンパク質または酵素とは異なるが；しかしながら、変異体は、それぞれの親の機能的特性（例えば、酵素特性）を少なくとも維持する。一実施形態では、酵素特性は、それぞれの親酵素と比較した場合、変異体酵素で改善される。一実施形態では、変異体酵素は、それぞれの親酵素と比較した場合に、少なくとも同じ酵素活性を有するか、または変異体酵素は、それぞれの親酵素と比較した場合に、増大した酵素活性を有する。
変異体を説明する際に、以下の通りに説明される命名法が用いられる：本発明の中で用いられる単一アミノ酸に対する略称は、一般に認められるIUPAC 1文字または3文字アミノ酸略称に従う。以下の定義はアミノ酸変化の文脈での変異体を説明するが、核酸を同様に（例えば、ヌクレオチドの置換、欠失、および/または挿入により）改変することができる。
「置換」は、元のアミノ酸と、それに続くアミノ酸配列内での位置の番号、およびそれに続く置換されたアミノ酸を与えることにより記載される。例えば、120位のヒスチジンのアラニンによる置換は、「His120Ala」または「H120A」と記載される。
「欠失」は、元のアミノ酸と、それに続くアミノ酸配列内での位置の番号、およびそれに続く*を与えることにより記載される。したがって、150位のグリシンの欠失は、「Gly150*」または「G150*」と記載される。あるいは、欠失は、例えば、「D183およびG184の欠失」により示される。
「挿入」は、元のアミノ酸と、それに続くアミノ酸配列内での位置の番号、およびそれに続く元のアミノ酸および追加のアミノ酸を与えることにより記載される。例えば、グリシンの隣りでのリジンの180位での挿入は、「Gly180GlyLys」または「G180GK」と記載される。2個以上のアミノ酸残基が挿入される場合（例えば、Gly180の後ろのLysおよびAlaなど）、これは、Gly180GlyLysAlaまたはG180GKAと示すことができる。
置換および挿入が同じ位置で起こる場合、これは、S99SD+S99Aまたは短くS99ADと示すことができる。
既存のアミノ酸残基と同一のアミノ酸残基が挿入される場合、命名法の縮退が生じることが明らかである。例えば、上記の例でグリシンの後ろにグリシンが挿入される場合、これはG180GGにより示されるであろう。
複数の変化を含む変異体は、「＋」により分離され、例えば、「Arg170Tyr+Gly195Glu」または「R170Y+G195E」は、それぞれチロシンおよびグルタミン酸による、170位および195位のアルギニンおよびグリシンの置換を表わす。あるいは、複数の変化は、スペースまたはカンマにより分離しても良い（例えば、それぞれR170Y G195EまたはR170Y, G195E）。
異なる変化を1つの位置に導入できる場合、異なる変化はカンマにより分離され、例えば、「Arg170Tyr, Glu」は、チロシンまたはグルタミン酸による、170位のアルギニンの置換を表わす。あるいは、異なる変化または任意的な置換は、括弧内に示すことができる（例えば、Arg170[Tyr, Gly]もしくはArg170{Tyr, Gly}または短くR170 [Y,G]もしくはR170 {Y, G}）。
変異体は、同じ種類のうちのいずれか、例えば、すべての置換、または置換、欠失、および/もしくは挿入の組み合わせの1箇所以上の変化を含むことができる。変化は、核酸配列またはアミノ酸配列に導入することができる。
一実施形態では、配列変異体（すなわち、アミノ酸配列変異体または核酸配列変異体）は、1箇所、2箇所、3箇所、4箇所、5箇所、6箇所、7箇所、8箇所、9箇所、10箇所、11箇所、12箇所、13箇所、14箇所、15箇所、16箇所、17箇所、18箇所、19箇所、20箇所、21箇所、22箇所、23箇所、24箇所、25箇所、26箇所、27箇所、28箇所、29箇所、30箇所、35箇所、40箇所またはそれ以上の変化を含む。
変異体は、それぞれ、配列番号1～9、10または10～1820のうちのいずれかに対して、約70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上の配列同一性を有する核酸およびポリペプチドを含む。
配列番号1～9の配列のうちのいずれかから選択される基礎配列のアミノ酸を、これらの配列の他のものの中でのアミノ酸の存在にかかわらず、置換するために、以下の条件が適用され、このとき、文字は一般的な略称を用いてL-アミノ酸を示し、括弧付きの数字は置き換えの優先度を示す（より大きい数がより高い優先度を示す）：Aは、S (1)、C (0)、G (0)、T (0)またはV (0)から選択されるいずれかのアミノ酸により置き換えることができる。Cは、A (0)により置き換えることができる。Dは、E (2)、N (1)、Q (0)またはS (0)から選択されるいずれかのアミノ酸により置き換えることができる。Eは、D (2)、Q (2)、K (1)、H (0)、N (0)、R (0)またはS (0)から選択されるいずれかのアミノ酸により置き換えることができる。Fは、Y (3)、W (1)、I (0)、L (0)またはM (0)から選択されるいずれかのアミノ酸により置き換えることができる。Gは、A (0)、N (0)またはS (0)から選択されるいずれかのアミノ酸により置き換えることができる。Hは、Y (2)、N (1)、E (0)、Q (0)またはR (0)から選択されるいずれかのアミノ酸により置き換えることができる。Iは、V (3)、L (2)、M (1)またはF (0)から選択されるいずれかのアミノ酸により置き換えることができる。Kは、R (2)、E (1)、Q (1)、N (0)またはS (0)から選択されるいずれかのアミノ酸により置き換えることができる。Lは、I (2)、M (2)、V (1)またはF (0)から選択されるいずれかのアミノ酸により置き換えることができる。Mは、L (2)、I (1)、V (1)、F (0)またはQ (0)から選択されるいずれかのアミノ酸により置き換えることができる。Nは、D (1)、H (1)、S (1)、E (0)、G (0)、K (0)、Q (0)、R (0)またはT (0)から選択されるいずれかのアミノ酸により置き換えることができる。Qは、E (2)、K (1)、R (1)、D (0)、H (0)、M (0)、N (0)またはS (0)から選択されるいずれかのアミノ酸により置き換えることができる。Rは、K (2)、Q (1)、E (0)、H (0)またはN (0)から選択されるいずれかのアミノ酸により置き換えることができる。Sは、A (1)、N (1)、T (1)、D (0)、E (0)、G (0)、K (0)またはQ (0)から選択されるいずれかのアミノ酸により置き換えることができる。Tは、S (1)、A (0)、N (0)またはV (0)から選択されるいずれかのアミノ酸により置き換えることができる。Vは、I (3)、L (1)、M (1)、A (0)またはT (0)から選択されるいずれかのアミノ酸により置き換えることができる。Wは、Y (2)またはF (1)から選択されるいずれかのアミノ酸により置き換えることができる。Yは、F (3)、H (2)またはW (2)から選択されるいずれかのアミノ酸により置き換えることができる。
核酸およびポリペプチドは、タグまたはドメインを含めるために改変することができる。タグは、検出、精製、可溶化、または固相化のためをはじめとする様々な目的のために利用することができ、例えば、ビオチン、蛍光団、エピトープ、接合因子、または調節配列を含むことができる。ドメインは、いずれかのサイズであり得、所望の機能を提供する（例えば、増大した安定性、溶解性、活性を賦与する、精製を簡素化する）ものであり得、例えば、結合ドメイン、シグナル配列、プロモーター配列、調節配列、N末端伸長部、またはC30末端伸長部を含むことができる。タグおよび/またはドメインの組み合わせもまた利用することができる。
「酵素活性」とは、酵素により発揮される少なくとも1種の触媒作用を意味する。一実施形態では、酵素活性は、酵素1ミリグラム当たり（比活性）または酵素の分子1個当たりの1分間当たりに変換される基質の分子（分子活性）の単位として表現される。
配列のアライメントは、好ましくは、Needleman and Wunschのアルゴリズムを用いて行なわれる。
Needleman and Wunschアルゴリズム：Needleman, Saul B. & Wunsch, Christian D. (1970). "A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins". Journal of Molecular Biology. 48 (3): 443-453。このアルゴリズムは、例えば、2つの配列の全域アライメントを実行する「NEEDLE」プログラムへと実装されている。NEEDLEプログラムは、例えば、様々なプログラムの集合体である欧州分子生物学オープンソフトウェアスイート（EMBOSS）内に含まれる：The European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS), Trends in Genetics 16 (6), 276 (2000)。
生物のゲノム中での標的化された改変のための多数の技術が公知である。CRIPRまたはCRISPR/CASとして公知の技術が、最も広く知られている：
CRISPR（クラスター化され規則的に間隙を設けられた短い回文反復（clustered regularly interspaced short palindromic repeats））技術は、標的生物のゲノムを改変するために、例えば、ゲノムのほとんどいずれの部位にでもいずれかの所与のDNA断片を導入するために、所望の配列を用いてゲノムの一部を置き換えるために、または標的生物のゲノム中の所与の領域を正確に欠失させるために用いることができる。これは、ゲノム操作の先例のない精密さを可能にする。
CRISPRシステムは、当初、ストレプトコッカス属（Streptococcus）に属する細菌の順応的防御メカニズムとして特定された（国際公開第2007/025097号）。それらの細菌CRISPRシステムは、侵入しているウイルスDNA内に存在する相補的配列の分解に向かわせるための、切断性タンパク質を含む複合体中のガイドRNA（gRNA）に依存する。様々な真核生物での遺伝子操作に対するCRISPRシステムの応用が示されている（国際公開第2013/141680号；同第2013/176772号；同第2014/093595号）。CRISPR/Casシステムの最初に特定されたタンパク質であるCas9は、2種類の非コードRNA：CRSIPR RNA（crRNA）およびトランス活性化crRNA（tracrRNA）の複合体により、PAM（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列モチーフに隣接するDNA標的配列へとガイドされる、大型の単量体DNAヌクレアーゼである。crRNAをtracrRNAと融合させることにより作製される合成RNAキメラ（単一ガイドRNAまたはsgRNA）もまた、等しく機能的であることが示された（国際公開第2013/176772号）。Cas9と異なるDNAヌクレアーゼ（Cpf1、C2c1pまたはC2c3pなど）を含む他の供給源由来のCRISPRシステムが、同じ機能性を有すると記載されている（国際公開第2016/0205711号、同第2016/205749号）。他の著者らは、ヌクレアーゼがRNA分子でなくDNA分子によりガイドされるシステムを記載する。そのようなシステムは、例えば、米国特許出願公開第2016/0046963号に開示される通りのAGOシステムである。
数組の研究グループが、CRISPR切断特性を、先例のない容易さを伴って、ほぼいずれの生物のゲノムでも、標的領域を破壊するために用いることができることを見出している。近年では、修復のための鋳型を提供することにより、ほとんどいずれの部位でも、ほとんどいずれの所望の配列を有するゲノムでも編集することが可能になり、このことが、CRISPRを強力な遺伝子編集ツールにすることが明らかになった（国際公開第2014/150624号、同第2014/204728号）。修復のための鋳型は、ドナー核酸と呼ばれ、それぞれのヌクレアーゼによる標的核酸での二本鎖破壊の導入後に、それぞれの鋳型中での相同組み換えを可能にする、標的領域に対して相補的な配列を3'および5'末端に含む。
所与のゲノム中で標的領域を選ぶ際の主な制限は、CRISPR関連ヌクレアーゼが二本鎖破壊を導入する領域の近傍でのPAM配列モチーフの存在の必要性である。しかしながら、様々なCRISPRシステムが、異なるPAM配列モチーフを認識する。このことは、それぞれの標的領域に対する最も好適なCRISPRシステムを選択することを可能にする。さらに、AGOシステムは、PAM配列モチーフをまったく必要としない。
本技術は、例えば、標的遺伝子の上流のプロモーターを異なる強度または特異性のプロモーターと交換することにより、例えば、いずれかの生物での遺伝子発現の変化のために適用することができる。先行技術で開示されている他の方法は、ヌクレアーゼであるマイナスCRISPRヌクレアーゼタンパク質に対する活性化または抑制性転写因子の融合を記載する。そのような融合タンパク質は、標的生物中でいずれかの所望のプロモーターに対する融合タンパク質の転写因子部分をガイドする1種以上のガイド核酸と一緒に、標的生物中で発現させることができる（国際公開第2014/099744号；同第2014/099750号）。遺伝子のノックアウトは、それぞれの標的遺伝子へと点突然変異または欠失を導入することにより、例えば、通常は遺伝子破壊につながる非相同性末端結合（non-homologous-end-joining；NHEJ）を導入することにより、容易に達成することができる（国際公開第2013/176772号）。
「改変型生物」は、ヒト介入により改変、単離、選択および/または家畜化されており、かつ野生に存在したかまたは存在するままの生物とは異なる生物である。改変型生物は、本明細書中で定義される通りの組み換え生物および宿主細胞を含むが、遺伝子編集を使用せず、もしくは組み換えエレメントをそれ以上用いずに、例えば、突然変異型生物を作製するために用いられるCRISPR技術を用いない、突然変異型生物も含む。
「宿主細胞」
宿主生物とも称される宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞、真菌、藻類、もしくはシアノバクテリア細胞、非ヒト動物もしくは哺乳動物細胞、または植物細胞から選択されるいずれかの細胞であり得る。当業者は、対象となる配列を含む宿主細胞を成功裏に形質転換、選択および繁殖させるために遺伝子構築物上に存在しなければならない遺伝的エレメントをよく知っている。
一実施形態では、宿主細胞または宿主生物は、相互に交換可能に用いられる。
典型的な宿主細胞または改変型生物は、グラム陽性：バシラス属（Bacillus）、ストレプトミセス属（Streptomyces）などの細菌である。有用なグラム陽性細菌としては、限定するものではないが、バシラス（Bacillus）細胞、例えば、バシラス・アルカロフィウス（Bacillus alkalophius）、バシラス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バシラス・ブレビス（Bacillus brevis）、バシラス・サークランス（Bacillus circulans）、バシラス・クラウシイ（Bacillus clausii）、バシラス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バシラス・フィルムス（Bacillus firmus）、バシラス・イアウタス（Bacillus iautus）、バシラス・レンタス（Bacillus lentus）、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バシラス・プミラス（Bacillus pumilus）、バシラス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、枯草菌（Bacillus subtilis）およびバシラス・チューリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）が挙げられる。最も好ましくは、原核生物は、バシラス（Bacillus）細胞、好ましくは、枯草菌（Bacillus subtilis）、バシラス・プミラス（Bacillus pumilus）、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、またはバシラス・レンタス（Bacillus lentus）のバシラス細胞である。一部の他の好ましい細菌としては、放線菌目（Actinomycetales）の菌株、好ましくは、ストレプトミセス属（Streptomyces）、好ましくはストレプトミセス・スフェロイデス（Streptomyces spheroides）（ATTC 23965）、ストレプトミセス・テルモビオラセウス（Streptomyces thermoviolaceus）（IFO 12382）、ストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）またはストレプトミセス・ムリヌス（Streptomyces murinus）またはストレプトベルチシルム・ベルチシリウムssp.ベルチシリウム（Streptoverticillum verticillium ssp. verticillium）が挙げられる。他の好ましい細菌としては、ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）、ロドモナス・パルストリ（Rhodomonas palustri）、ストレプトコッカス・ラクチス（Streptococcus lactis）が挙げられる。さらに好ましい細菌としては、ミクソコッカス属（Myxococcus）に属する菌株、例えば、M.ビレセンス（M. virescens）が挙げられる。
さらなる典型的な宿主細胞または改変型生物は、グラム陰性であり：大腸菌、シュードモナス属（Pseudomonas）、好ましいグラム陰性細菌は、大腸菌（Escherichia coli）、シュードモナス属種（Pseudomonas sp.）、好ましくは、シュードモナス・プルロシニア（Pseudomonas purrocinia）（ATCC 15958）またはシュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）（NRRL B-11）である。
さらなる典型的な宿主細胞または改変型生物は、アスペルギルス属（Aspergillus）、フザリウム属（Fusarium）、トリコデルマ属（Tricoderma）などの真菌である。微生物は、真菌細胞であり得る。本明細書中で用いる場合、「真菌」としては、子嚢菌門（Ascomycota）、担子菌門（Basidiomycota）、ツボカビ門（Chytridiomycota）、および接合菌門（Zygomycota）ならびに卵菌門（Oomycota）および不完全菌亜門（Deuteromycotina）およびすべての栄養胞子形成性（mitosporic）真菌が挙げられる。子嚢菌門の代表的な群としては、例えば、ニューロスポラ属（Neurospora）、ユーペニシリウム属（Eupenicillium）（＝ペニシリウム属（Penicillium））、エメリセラ属（Emericella）（＝アスペルギルス属（Aspergillus））、ユーロチウム属（Eurotium）（＝アスペルギルス属（Aspergillus））、および以下に列記される正酵母（true yeast）が挙げられる。担子菌門の例としては、キノコ、さび菌、および黒穂菌が挙げられる。ツボカビ門の代表的な群としては、例えば、アロミセス属（Allomyces）、ブラストクラジエラ属（Blastocladiella）、コエロモミセス属（Coelomomyces）、および水生真菌が挙げられる。卵菌門の代表的な群としては、例えば、ワタカビ属（Achlya）などのサプロレグニオミセトス（Saprolegniomycetous）水生真菌（ミズカビ）が挙げられる。栄養胞子形成性真菌の例としては、アスペルギルス属（Aspergillus）、ペニシリウム属（Penicillium）、カンジダ属（Candida）、およびアルタナリア属（Alternaria）が挙げられる。接合菌門の代表的な群としては、例えば、クモノスカビ属（Rhizopus）およびケカビ属（Mucor）が挙げられる。
一部の好ましい真菌としては、不完全菌亜門（subdivision Deuteromycotina）、不完全糸状菌綱（class Hyphomycetes）に属する菌株、例えば、フザリウム属（Fusarium）、フミコラ属（Humicola）、トリコデルマ属（Tricoderma）、ミロテシウム属（Myrothecium）、バーティシリウム属（Verticillum）、アルトロミセス属（Arthromyces）、カルダリオミセス属（Caldariomyces）、ウロクラジウム属（Ulocladium）、エンベリシア属（Embellisia）、クラドスポリウム属（Cladosporium）またはドレスクレラ属（Dreschlera）、特に、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）（DSM 2672）、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、トリコデルマ・レシイ（Trichoderma resii）、ミロテシウム・ベルルカナ（Myrothecium verrucana）（IFO 6113）、バーティシリウム・アルボアトラム（Verticillum alboatrum）、バーティシリウム・ダーリエ（Verticillum dahlie）、アルトロミセス・ラモサス（Arthromyces ramosus）（FERM P-7754）、カルダリオミセス・フマゴ（Caldariomyces fumago）、ウロクラジウム・チャルタラム（Ulocladium chartarum）、エンベリシア・アリイ（Embellisia alli）またはドレスクレラ・ハロデス（Dreschlera halodes）が挙げられる。
他の好ましい真菌としては、担子菌門（subdivision Basidiomycotina）、担子菌綱（class Basidiomycetes）に属する菌株、例えば、ササクレヒトヨタケ属（Coprinus）、マクカワタケ属（Phanerochaete）、カワラタケ属（Coriolus）またはシロアミタケ属（Trametes）、特に、コプリナス・シネレウスf.ミクロスポラス（Coprinus cinereus f. microsporus）（IFO 8371）、コプリナス・マクロリズス（Coprinus macrorhizus）、ファネロケテ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）（例えば、NA-12）またはシロアミタケ属（Trametes）（以前にはタマチョレイタケ属（Polyporus）と称された）、例えば、カワラタケ（T. versicolor）（例えば、PR4 28-A）が挙げられる。
さらなる好ましい真菌としては、接合菌門（subdivision Zygomycotina）、ミコラセアエ綱（class Mycoraceae）に属する菌株、例えば、クモノスカビ属（Rhizopus）またはケカビ属（Mucor）、特に、ムコール・ヒエマリス（Mucor hiemalis）が挙げられる。
さらなる典型的な宿主細胞または改変型生物は、酵母である。ピチア属（Pichia）の種またはサッカロミセス属（Saccharomyces）の種など。真菌宿主細胞は、酵母細胞であり得る。本明細書中で用いる場合、「酵母」としては、子嚢胞子形成性（ascosporogenous）酵母（エンドミセタレス（Endomycetales））、担子胞子形成性（basidiosporogenous）酵母、および不完全真菌（Fungi lmperfecti）（ブラストミセス属（Blastomycetes））に属する酵母が挙げられる。子嚢胞子形成性酵母は、スペルモフトラ科（Spermophthoraceae）およびサッカロミセス科（Saccharomycetaceae）に分けられる。後者は、4つの亜科：Schizosaccharomycoideae亜科（例えば、シゾサッカロミセス属（Schizosaccharomyces））、Nadsonioideae亜科、Lipomycoideae亜科、およびSaccharomycoideae亜科（例えば、クルイベロミセス属（Kluyveromyces）、ピチア属（Pichia）、およびサッカロミセス属（Saccharomyces））から構成される。担子胞子形成性酵母としては、ロイコスポリジウム属（Leucosporidim）、ロドスポリジウム属（Rhodosporidium）、スポリジオボラス属（Sporidiobolus）、フィロバシジウム属（Filobasidium）、およびフィロバシジエラ属（Filobasidiella）が挙げられる。不完全真菌に属する酵母は、2つの科：Sporobolomycetaceae科（例えば、スポロボロミセス属（Sporobolomyces）およびブレラ属（Bullera））およびCryptococcaceae科（例えば、カンジダ属（Candida））に分けられる。
典型的な宿主細胞または改変型生物はまた、非ヒト動物、非ヒト哺乳動物、鳥類、爬虫類、昆虫、植物、酵母、真菌または植物などの真核生物である。
一実施形態では、改変型生物は、原核微生物である。
好ましくは、本発明に従う宿主生物または改変型生物は、グラム陽性またはグラム陰性原核細胞微生物であり得る。
有用なグラム陽性原核細胞微生物としては、限定するものではないが、バシラス（Bacillus）細胞、例えば、バシラス・アルカロフィウス（Bacillus alkalophius）、バシラス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バシラス・ブレビス（Bacillus brevis）、バシラス・サークランス（Bacillus circulans）、バシラス・クラウシイ（Bacillus clausii）、バシラス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バシラス・フィルムス（Bacillus firmus）、バシラス・イアウタス（Bacillus iautus）、バシラス・レンタス（Bacillus lentus）、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バシラス・プミラス（Bacillus pumilus）、バシラス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、枯草菌（Bacillus subtilis）、およびバシラス・チューリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）が挙げられる。最も好ましくは、原核生物は、バシラス（Bacillus）細胞、好ましくは、枯草菌（Bacillus subtilis）、バシラス・プミラス（Bacillus pumilus）、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、またはバシラス・レンタス（Bacillus lentus）のバシラス細胞である。一部の他の好ましい細菌としては、放線菌目（Actinomycetales）の菌株、好ましくは、ストレプトミセス属（Streptomyces）、好ましくはストレプトミセス・スフェロイデス（Streptomyces spheroides）（ATTC 23965）、ストレプトミセス・テルモビオラセウス（Streptomyces thermoviolaceus）（IFO 12382）、ストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）またはストレプトミセス・ムリヌス（Streptomyces murinus）またはストレプトベルチシルム・ベルチシリウムssp.ベルチシリウム（Streptoverticillum verticillium ssp. verticillium）が挙げられる。他の好ましい細菌としては、ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）、ロドモナス・パルストリ（Rhodomonas palustri）、ストレプトコッカス・ラクチス（Streptococcus lactis）が挙げられる。さらに好ましい細菌としては、ミクソコッカス属（Myxococcus）に属する菌株、例えば、M.ビレセンス（M. virescens）が挙げられる。
さらなる典型的な原核生物は、グラム陰性であり：大腸菌（Escherichia coli）、シュードモナス属（Pseudomonas）、好ましいグラム陰性原核細胞微生物は、大腸菌（Escherichia coli）、シュードモナス属種（Pseudomonas sp.）、好ましくは、シュードモナス・プルロシニア（Pseudomonas purrocinia）（ATCC 15958）またはシュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）（NRRL B-11）である。
最も好ましくは、原核細胞微生物は、大腸菌（Escherichia coli）である。
テルペンなどの毒性物質に対する感受性を低減することおよびその存在下での増殖を増大させることの文脈での、用語「増大する」、「改善する」または「増強する」は、相互に交換可能であり、かつ、応用の意味で、本明細書中で定義される通り、対照との比較での、少なくとも3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％または10％、好ましくは少なくとも15％または20％、より好ましくは25％、30％、35％または40％の増大を意味するであろう。
微生物の培養は、しばしば、細胞が、炭素源、窒素源、およびそれらの細胞の増殖に必要とされる、限定するものではないが、アミノ酸、ビタミン、鉱物をはじめとする他の栄養素などの、様々な栄養素の供給源を含む培地中で培養されることを必要とする。発酵培地は、国際公開第98/37179号に記載される通りの最小培地であり得、または発酵培地は、複合窒素および炭素源を含む複合培地であり得、このとき、複合窒素源は、国際公開第2004/003216号に記載される通り、部分的に加水分解されていても良い。
つまり、発酵培地は、培養される微生物の増殖に必要な成分を含む。一実施形態では、発酵培地は、窒素源、リン供給源、硫黄供給源および塩からなる群より選択される1種以上の成分、ならびに任意によりビタミン、アミノ酸、鉱物、および微量元素などの微量栄養素からなる群より選択される1種以上のさらなる成分を含む。一実施形態では、発酵培地はまた、炭素源も含む。そのような成分は、一般的に、当技術分野で周知である（例えば、Ausubel, et al, Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons, 1995；Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, 1989 Cold Spring Harbor, N.Y.；Talbot, Molecular and Cellular Biology of Filamentous Fungi: A Practical Ap-proach, Oxford University Press, 2001；Kinghom and Turner, Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi, Cambridge University Press, 1992；およびBacillus (Biotechnology Handbooks) by Colin R. Harwood, Plenum Press, 1989を参照されたい）。所与の細胞タイプに対する培養条件はまた、科学文献中にも見出すことができ、かつ/またはアメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）および真菌遺伝学ストックセンター（Fungal Genetics Stock Center）などの細胞の供給源から見出すこともできる。
窒素の供給源として、無機および有機窒素化合物を、個別および組み合わせでの両方で用いることができる。好適な有機窒素源としては、限定するものではないが、微生物、動物または植物細胞由来の抽出物などのタンパク質含有物質が挙げられ、限定するものではないが、植物タンパク質調製物、ダイズ粉、トウモロコシ粉、エンドウ粉、トウモロコシグルテン、ワタ粉、ラッカセイ粉、ジャガイモ粉、肉およびカゼイン、ゼラチン、ホエイ、魚粉、酵母タンパク質、酵母抽出物、トリプトン、ペプトン、バクトトリプトン、バクトペプトン、微生物細胞、植物、肉または動物身体の加工に由来する廃棄物、およびそれらの組み合わせが挙げられる。無機窒素源としては、限定するものではないが、アンモニウム、硝酸塩、および亜硝酸塩、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。一実施形態では、発酵培地は窒素源を含み、このとき、窒素源は、複合窒素源もしくは組成既知窒素源またはそれらの組み合わせである。一実施形態では、複合窒素源は、限定するものではないが、ジャガイモタンパク質、ダイズタンパク質、トウモロコシタンパク質、ラッカセイ、ワタタンパク質、および/またはエンドウタンパク質をはじめとする植物タンパク質、カゼイン、トリプトン、ペプトンおよび酵母抽出物ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される。一実施形態では、組成既知窒素源は、アンモニア、アンモニウム、アンモニウム塩（例えば、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム）、尿素、硝酸、硝酸塩、亜硝酸、およびアミノ酸（限定するものではないが、グルタミン酸を含む）、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
一実施形態では、発酵培地は、少なくとも1種の炭素源をさらに含む。炭素源は、複合炭素源もしくは組成既知炭素源またはそれらの組み合わせであり得る。様々な糖および糖含有物質が、好適な炭素の供給源であり、糖は、多量体化の様々なステージで存在し得る。複合炭素源としては、限定するものではないが、糖蜜、コーンスティープリカー、サトウキビ糖、デキストリン、デンプン、デンプン加水分解物、およびセルロース加水分解物、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。組成既知炭素源としては、限定するものではないが、炭水化物、有機酸、およびアルコールが挙げられる。一実施形態では、組成既知炭素源としては、限定するものではないが、グルコース、フルクトース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、スクロース、マルトース、ラクトース、グルコン酸塩、酢酸、プロピオン酸、乳酸、ギ酸、リンゴ酸、クエン酸、フマル酸、グリセロール、イノシトール、マンニトールおよびソルビトール、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。一実施形態では、組成既知炭素源は、最大20％、最大10％、または最大5％の不純物を含み得るシロップの形態で提供される。一実施形態では、炭素源は、サトウダイコンシロップ、サトウキビシロップ、コーンシロップ（限定するものではないが、高フルクトースコーンシロップを含む）である。複合炭素源としては、限定するものではないが、糖蜜、コーンスティープリカー、デキストリン、およびデンプン、またはそれらの組み合わせが挙げられる。好ましい実施形態では、組成既知炭素源としては、限定するものではないが、グルコース、フルクトース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、スクロース、マルトース、デキストリン、ラクトース、グルコン酸塩またはそれらの組み合わせが挙げられる。
一実施形態では、発酵培地はまた、限定するものではないがリン酸塩をはじめとするリン供給源、および/または限定するものではないが硫酸塩をはじめとする硫黄供給源も含む。一実施形態では、発酵培地はまた、塩も含む。一実施形態では、発酵培地は、限定するものではないが、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、リン酸塩および硫酸塩をはじめとする、1種以上の無機塩を含む。一実施形態では、1種以上の塩としては、限定するものではないが、NaCl、KH2PO4、MgSO4、CaCl2、FeCl3、MgCl2、MnCl2、ZnSO4、Na2MoO4およびCuSO4が挙げられる。一実施形態では、発酵培地はまた、限定するものではないが、塩化チアミン、ビオチン、ビタミンB12をはじめとする、1種以上のビタミンも含む。一実施形態では、発酵培地はまた、限定するものではないが、Fe、Mg、Mn、Co、およびNiをはじめとする微量元素も含む。一実施形態では、発酵培地は、Na、K、Ca、Mg、Mn、Fe、Co、Cu、およびNiからなる群より選択される1種以上の塩カチオンを含む。一実施形態では、発酵培地は、限定するものではないが、CaおよびMgをはじめとする、1種以上の二価または三価カチオンを含む。
一実施形態では、発酵培地はまた、消泡剤も含む。
一実施形態では、発酵培地はまた、限定するものではないが、細胞の選択マーカーがそれらに対する抵抗性を提供する、抗生物質（限定するものではないが、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシンまたはフレオマイシンを含む）または除草剤をはじめとする、選択剤も含む。
発酵は、バッチ、反復バッチ、流加、反復流加または連続的発酵プロセスとして行なうことができる。流加プロセスでは、発酵の開始前に、炭素源または窒素源などの、構造的および/または触媒的元素のうちの1種以上を含む化合物を添加しないかまたは一部を培地へと添加し、かつそれぞれ、構造的および/または触媒的元素のうちの1種以上を含む化合物の全部または残余の部分が、発酵プロセス中に供給される。供給のために選択される化合物は、一緒に、または互いに別個に、発酵プロセスへと供給することができる。反復流加または連続的発酵プロセスでは、完全な開始培地が、発酵中に追加的に供給される。開始培地は、フィードと一緒に、またはフィードとは別個に、供給することができる。反復流加プロセスでは、バイオマスを含む発酵ブロスの一部を、規則的な時間間隔で取り出すが、連続的プロセスでは、発酵ブロスの一部の除去が、連続的に行なわれる。それにより、発酵プロセスは、取り出された発酵ブロスの量に対応する新鮮培地の一部が補充される。
多数の細胞培養が、発酵中の細胞培養中での基質フィードとして、グルコースなどの炭素源を組み込む。つまり、一実施形態では、微生物を培養する方法は、炭素源を含むフィードを含む。炭素源含有フィードは、本明細書中に詳細に記載される通りの組成既知炭素源もしくは複合炭素源、またはそれらの混合物を含むことができる。
発酵時間、pH、導電率、温度、または他の具体的な発酵条件は、当技術分野で公知の標準的条件に従って当てはめることができる。一実施形態では、発酵条件は、対象となるタンパク質の最大収量を得られるように調整される。
一実施形態では、発酵中の発酵ブロスの温度は、30℃～45℃である。
一実施形態では、発酵培地のpHは、pH6.5～9に調整される。
一実施形態では、発酵培地の導電率は、pH調整後に、0.1～100mS/cmである。
一実施形態では、発酵時間は、1～200時間である。
一実施形態では、発酵は、発酵培地を撹拌および/または振盪しながら行われる。一実施形態では、発酵は、50～2000rpmで発酵培地を撹拌しながら行われる。
一実施形態では、限定するものではないが、撹拌（stirringおよび/またはagitation）によるかまたは通気（限定するものではないが、0～3bar空気または酸素を用いる通気を含む）によることをはじめとして、培養中に、発酵培地に酸素が添加される。一実施形態では、発酵は、酸素飽和下で行なわれる。
一実施形態では、発酵培地および発酵培地を用いる方法は、工業規模での発酵のためのものである。一実施形態では、本説明の発酵培地は、少なくとも20リットル、少なくとも50リットル、少なくとも300リットル、または少なくとも1000リットルの培養培地を有するいずれかの発酵のために有用であり得る。
一実施形態では、発酵方法は、限定するものではないが、少なくとも2gタンパク質（乾物）/kg未処理発酵培地、少なくとも3gタンパク質（乾物）/kg未処理発酵培地、少なくとも5gタンパク質（乾物）/kg未処理発酵培地、少なくとも10gタンパク質（乾物）/kg未処理発酵培地、または少なくとも20gタンパク質（乾物）/kg未処理発酵培地の量で発現される、対象となるタンパク質をはじめとする、相対的高収量での対象となるタンパク質の生成のためのものである。
耐性は、実質的レベルでのその正常な機能（例えば、正常または幾分か低下した速度での生物の増殖）を行なう生物の能力として理解されるべきである。テルペンなどの毒性物質は、それらの毒性および投与量に応じて、実質的に低減した増殖もしくは増殖の停止をもたらすか、または生物を死滅させさえする場合がある。テルペンなどの毒性物質に対する改善された耐性は、生物に対して通常はより重度の作用を有する投与量で、生物がよりよく振る舞うことを可能にするであろう。
好ましい実施形態では、タンパク質Xのホモログは、タンパク質Xが元来見出される生物とは別の生物中のタンパク質Xに機能および/または配列が対応する1種以上のタンパク質である。
対象となるタンパク質の活性は、当該タンパク質の正常な生物学的機能として理解されるべきである。不活性化は、当該活性が、同じ正常レベルでは存在しないが、実質的により低いかまたは完全に非存在であることと理解されるべきである。正常レベルでの対象となるタンパク質の存在量が、正常な生物学的機能に同様に必要とされる。対象となるタンパク質の存在量が実質的に減少している場合、生物学的機能およびしたがって全体的活性が減少するであろう。対象となるタンパク質が（例えば、それをコードする遺伝子が非機能的にされているか、部分的もしくは完全に欠失されているか、ノックアウトされているか、またはその発現が妨げられるために）非存在である場合、生物学的機能は、生物中で比較的早くもしくは遅く無効にされるか、またはもはや存在しない。
好ましい実施形態では、テルペン化合物は、好ましくは、C4およびC5アルコール、図1に示される、2.0以下、好ましくは1.5以下のlogP値および/または少なくとも1.0g/L、好ましくは1.5g/L以上の水中での溶解度を有する物質および/またはこれらの化合物：イソプレノール、プレノール、ブタノール、イソブタノール、バニリンのうちのいずれかである。
別の実施形態では、テルペン化合物は、ゲラニオール、シトラール、(-)-カルボン、リナロール、ファルネソール、リモネンおよびメントールを含む。
好ましい実施形態では、テルペンに対する増大した耐性を有し、かつ/または本発明の方法で有用な生物は、配列番号2のタンパク質またはその生物中の配列番号2のホモログと最初の47個のアミノ酸を共有するが、配列番号2の48位に対応するアミノ酸以降といかなる実質的同一性も共有しないか、または配列番号2の未改変型ホモログもしくは配列番号2の1～47位に対応するアミノ酸に続く部分での配列番号2と比較して短縮されている、タンパク質を含む。
好ましい実施形態では、テルペンに対する増大した耐性を有し、かつ/または本発明の方法で有用な生物は、配列番号2のタンパク質またはその生物中の配列番号2のホモログと最初の47個のアミノ酸を共有するが、配列番号2の48位に対応するアミノ酸以降といかなる実質的同一性も共有しないか、または配列番号2の未改変型ホモログもしくは配列番号2の1～47位に対応するアミノ酸に続く部分での配列番号2と比較して短縮されている、タンパク質を含む。

本発明は、以下を提供する。
１． 1種以上のテルペン化合物に対する改善された耐性を有する改変型生物であって、以下のものからなる群より選択される野生型改変型生物と比較した1種以上の変化を有し、耐性が、未改変型生物と比較して改善する、上記改変型生物：
i. 1種以上のテルペン化合物の存在下での、配列番号2のタンパク質もしくはそのホモログの非存在、不活性化または低下した存在量、および配列番号3のタンパク質もしくはそのホモログの非存在、不活性化または低下した存在量、および配列番号2のタンパク質またはそのホモログの突然変異型タンパク質の存在であって、配列番号2のタンパク質またはそのホモログの突然変異型タンパク質は、未改変型生物の配列番号2のタンパク質またはそのホモログと、最初の47個のアミノ酸のみを共有する；
ii. 1種以上のテルペン化合物の存在下での、配列番号2のタンパク質もしくはそのホモログの非存在、不活性化または低下した存在量；
iii. 1種以上のテルペン化合物の存在下での、配列番号3のタンパク質もしくはそのホモログの非存在、不活性化または低下した存在量；
iv. 1種以上のテルペン化合物の存在下での、配列番号2のタンパク質またはそのホモログの非存在、および配列番号2のタンパク質またはそのホモログの突然変異型タンパク質の存在であって、配列番号2のタンパク質またはそのホモログの突然変異型タンパク質は、配列番号2の48位に対応する位置に突然変異を有する；
v. 1種以上のテルペン化合物の存在下での、配列番号2のタンパク質またはそのホモログの突然変異型タンパク質の存在であって、配列番号2のタンパク質またはそのホモログの突然変異型タンパク質は、配列番号2の48位に対応する位置に突然変異を有する；
vi. 1種以上のテルペン化合物の存在下での、配列番号1のタンパク質もしくはそのホモログの未改変型生物と比較して増大したレベルまたは増大した活性であって、好ましくは、配列番号1のホモログに対する内因性遺伝子が欠失され、配列番号1をコードする遺伝子またはその変異体の組み換え発現を有し、さらにより好ましくは、配列番号1をコードする遺伝子またはその変異体の組み換え発現は、低～中強度のプロモーターまたは他の制御エレメント下にある；
vii. 1種以上のテルペン化合物の存在下での、配列番号4のタンパク質またはそのホモログの突然変異型タンパク質の存在であって、配列番号4のタンパク質またはそのホモログの突然変異型タンパク質は、配列番号4の74位に対応する位置に突然変異を有する；
viii. 1種以上のテルペン化合物の存在下での、配列番号5のタンパク質またはそのホモログの突然変異型タンパク質の存在であって、好ましくは、配列番号5のタンパク質またはそのホモログの突然変異型タンパク質は、(a) 配列番号5の291位に対応する位置の突然変異、および/または(b) 配列番号5の274位以降に対応する位置の突然変異を有し、突然変異型タンパク質は、配列番号5のタンパク質またはそのホモログよりも短く、または配列番号5のタンパク質の非存在、不活性化もしくは低下した存在量；
ix. 1種以上のテルペン化合物の存在下での、配列番号6のタンパク質またはそのホモログの突然変異型タンパク質の存在であって、配列番号6のタンパク質またはそのホモログの突然変異型タンパク質は、配列番号6の96位に対応する位置の突然変異であって、好ましくは、突然変異は、グルタミン酸を用いてバリンを置き換える突然変異である突然変異、および/または、好ましくは、セリンを用いてグリシンを置き換える、配列番号6の67位に対応する位置の突然変異を有する；
x. 1種以上のテルペン化合物の存在下での、配列番号6のタンパク質もしくはそのホモログの非存在、不活性化または低下した存在量；
xi. 1種以上のテルペン化合物の存在下での、配列番号8の改変型タンパク質またはそのホモログ、好ましくは、配列番号8のタンパク質もしくはそのホモログの非存在、不活性化または低下した存在量；
xii. 1種以上のテルペン化合物の存在下での、配列番号9の改変型タンパク質またはそのホモログ、好ましくは、配列番号9のタンパク質もしくはそのホモログの非存在、不活性化または低下した存在量；
xiii. 1種以上のテルペン化合物の存在下での、配列番号7の改変型タンパク質またはそのホモログ、好ましくは、配列番号7のタンパク質もしくはそのホモログの非存在、不活性化、増加した活性または低下した存在量；
xiv. 上記i～xiiiのいずれかの組み合わせ。
２． 上記1に記載の改変型生物を作製するステップ、および任意により該改変型生物を維持するステップを含む、未改変型生物と比較して改変型生物の1種以上のテルペン化合物に対する耐性を増大させるための方法。
３． 上記1に記載の改変型生物を作製するステップ、該改変型生物が増殖し、かつ1種以上のテルペン化合物を生成するために好適な条件下で、該1種以上のテルペン化合物の存在下で該改変型生物を維持するステップ、および任意により該改変型生物から該1種以上のテルペン化合物を分離するステップを含む、生物を用いる1種以上のテルペン化合物の生成のための方法。
４． 前記改変型生物が、1種以上のテルペン化合物の存在下での、(a) 配列番号3のタンパク質またはそのホモログのタンパク質をコードする遺伝子の一部もしくは全体のノックアウトまたは欠失、ノックアウト、あるいは(b) 配列番号2のタンパク質またはそのホモログをコードする遺伝子の一部もしくは全体の欠失、あるいは(c) 配列番号2のタンパク質またはそのホモログの突然変異型タンパク質の存在であって、配列番号2のタンパク質またはそのホモログの突然変異型タンパク質は、未改変型生物の配列番号2のタンパク質またはそのホモログと、最初の47個のアミノ酸のみを共有する、存在、あるいは(a)～(c)のいずれかの組み合わせ、を含む、上記2または3に記載の方法。
５． 配列番号6のタンパク質もしくはそのホモログをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレーションするステップ、配列番号6のタンパク質もしくはそのホモログをコードする遺伝子を欠失させるステップ、または配列番号6のタンパク質もしくはそのホモログをコードする遺伝子をノックアウトするステップを含む、上記2～4のいずれかに記載の方法。
６． 上記3～5のいずれかに記載の方法に従う1種以上のモノテルペンの生成、および少なくとも1種のモノテルペンをモノテルペンエステルへとエステル化するステップ、および任意により該1種以上のモノテルペンエステルの分離を含む、モノテルペンエステルの生成のための方法。
７． 改変型生物中で、配列番号2のタンパク質と最初の47個のアミノ酸のみを共有するタンパク質をコードするDNA配列を発現または生成させるステップを含む、未改変型生物と比較して改変型生物のバニリンに対する耐性を増大させるための方法であって、該改変型生物が、配列番号1および/もしくは2のタンパク質またはそのホモログが非存在であるか、不活性であるかまたは実質的に減少しているというさらなる特徴を有する、上記方法。
８． 1種以上のテルペン化合物、好ましくは1種以上のテルペンまたは1種以上のテルペンエステルの存在下での改変型生物の増殖を増加させるための、配列番号2の脱調節型タンパク質またはそのホモログの使用。
９． 配列番号2の前記突然変異型もしくは脱調節型タンパク質またはそのホモログが、フレームシフト、好ましくは配列番号2のタンパク質と比較して得られるタンパク質を短縮するフレームシフトを生じる、配列番号2の48位に対応するヒスチジン残基の突然変異を有する、上記1～8のいずれかに記載の改変型生物、方法または使用。
１０． 配列番号1～9の配列のうちのいずれかが、それぞれのタンパク質に対して表3に示される突然変異を保有するために突然変異される、上記1～9のいずれかに記載の改変型生物、方法または使用。
１１． イソプレノール、プレノール、ブタノール、イソブタノール、バニリン、ゲラニオール、サンタレン、バレンセン、スクラレオール、アルテミシンアルコール、アルテミシン酸および/またはシトラールに対する耐性が、未改変型生物と比較して増大する、上記1～10のいずれかに記載の方法、使用、突然変異型タンパク質または改変型生物。
１２． イソプレノール、プレノール、ブタノール、イソブタノールおよび/またはバニリンに対する耐性が、未改変型生物と比較して増大する、上記1～11のいずれかに記載の方法、使用、突然変異型タンパク質または改変型生物。
１３． 少なくとも1種のテルペン化合物が、2.0以下、好ましくは1.5以下のlogP値を有する、上記1～12のいずれかに記載の方法、使用または改変型生物。
１４． 少なくとも1種のテルペン化合物の水中での溶解度が、少なくとも1.0g/L、好ましくは1.5g/L以上である、上記1～13のいずれかに記載の方法、使用または改変型生物。
１５． 少なくとも1種のテルペン化合物が、モノテルペンアルコールまたはC4およびC5アルコールである、上記1～14のいずれかに記載の方法、使用または改変型生物。

Claims (15)

1種以上のテルペン化合物に対する改善された耐性を有する改変型生物であって、以下のものからなる群より選択される野生型改変型生物と比較した1種以上の変化を有し、耐性が、未改変型生物と比較して改善する、上記改変型生物：
i. 1種以上のテルペン化合物の存在下での、配列番号2のタンパク質もしくはそのホモログの非存在、不活性化または低下した存在量、および配列番号3のタンパク質もしくはそのホモログの非存在、不活性化または低下した存在量、および配列番号2のタンパク質またはそのホモログの突然変異型タンパク質の存在であって、配列番号2のタンパク質またはそのホモログの突然変異型タンパク質は、未改変型生物の配列番号2のタンパク質またはそのホモログと、最初の47個のアミノ酸のみを共有する；
ii. 1種以上のテルペン化合物の存在下での、配列番号2のタンパク質もしくはそのホモログの非存在、不活性化または低下した存在量；
iii. 1種以上のテルペン化合物の存在下での、配列番号3のタンパク質もしくはそのホモログの非存在、不活性化または低下した存在量；
iv. 1種以上のテルペン化合物の存在下での、配列番号2のタンパク質またはそのホモログの非存在、および配列番号2のタンパク質またはそのホモログの突然変異型タンパク質の存在であって、配列番号2のタンパク質またはそのホモログの突然変異型タンパク質は、配列番号2の48位に対応する位置に突然変異を有する；
v. 1種以上のテルペン化合物の存在下での、配列番号2のタンパク質またはそのホモログの突然変異型タンパク質の存在であって、配列番号2のタンパク質またはそのホモログの突然変異型タンパク質は、配列番号2の48位に対応する位置に突然変異を有する；
vi. 1種以上のテルペン化合物の存在下での、配列番号1のタンパク質もしくはそのホモログの未改変型生物と比較して増大したレベルまたは増大した活性であって、好ましくは、配列番号1のホモログに対する内因性遺伝子が欠失され、配列番号1をコードする遺伝子またはその変異体の組み換え発現を有し、さらにより好ましくは、配列番号1をコードする遺伝子またはその変異体の組み換え発現は、低～中強度のプロモーターまたは他の制御エレメント下にある；
vii. 1種以上のテルペン化合物の存在下での、配列番号4のタンパク質またはそのホモログの突然変異型タンパク質の存在であって、配列番号4のタンパク質またはそのホモログの突然変異型タンパク質は、配列番号4の74位に対応する位置に突然変異を有する；
viii. 1種以上のテルペン化合物の存在下での、配列番号5のタンパク質またはそのホモログの突然変異型タンパク質の存在であって、好ましくは、配列番号5のタンパク質またはそのホモログの突然変異型タンパク質は、(a) 配列番号5の291位に対応する位置の突然変異、および/または(b) 配列番号5の274位以降に対応する位置の突然変異を有し、突然変異型タンパク質は、配列番号5のタンパク質またはそのホモログよりも短く、または配列番号5のタンパク質の非存在、不活性化もしくは低下した存在量；
ix. 1種以上のテルペン化合物の存在下での、配列番号6のタンパク質またはそのホモログの突然変異型タンパク質の存在であって、配列番号6のタンパク質またはそのホモログの突然変異型タンパク質は、配列番号6の96位に対応する位置の突然変異であって、好ましくは、突然変異は、グルタミン酸を用いてバリンを置き換える突然変異である突然変異、および/または、好ましくは、セリンを用いてグリシンを置き換える、配列番号6の67位に対応する位置の突然変異を有する；
x. 1種以上のテルペン化合物の存在下での、配列番号6のタンパク質もしくはそのホモログの非存在、不活性化または低下した存在量；
xi. 1種以上のテルペン化合物の存在下での、配列番号8の改変型タンパク質またはそのホモログ、好ましくは、配列番号8のタンパク質もしくはそのホモログの非存在、不活性化または低下した存在量；
xii. 1種以上のテルペン化合物の存在下での、配列番号9の改変型タンパク質またはそのホモログ、好ましくは、配列番号9のタンパク質もしくはそのホモログの非存在、不活性化または低下した存在量；
xiii. 1種以上のテルペン化合物の存在下での、配列番号7の改変型タンパク質またはそのホモログ、好ましくは、配列番号7のタンパク質もしくはそのホモログの非存在、不活性化、増加した活性または低下した存在量；
xiv. 上記i～xiiiのいずれかの組み合わせ。
請求項1に記載の改変型生物を作製するステップ、および任意により該改変型生物を維持するステップを含む、未改変型生物と比較して改変型生物の1種以上のテルペン化合物に対する耐性を増大させるための方法。
請求項1に記載の改変型生物を作製するステップ、該改変型生物が増殖し、かつ1種以上のテルペン化合物を生成するために好適な条件下で、該1種以上のテルペン化合物の存在下で該改変型生物を維持するステップ、および任意により該改変型生物から該1種以上のテルペン化合物を分離するステップを含む、生物を用いる1種以上のテルペン化合物の生成のための方法。
前記改変型生物が、1種以上のテルペン化合物の存在下での、(a) 配列番号3のタンパク質またはそのホモログのタンパク質をコードする遺伝子の一部もしくは全体のノックアウトまたは欠失、ノックアウト、あるいは(b) 配列番号2のタンパク質またはそのホモログをコードする遺伝子の一部もしくは全体の欠失、あるいは(c) 配列番号2のタンパク質またはそのホモログの突然変異型タンパク質の存在であって、配列番号2のタンパク質またはそのホモログの突然変異型タンパク質は、未改変型生物の配列番号2のタンパク質またはそのホモログと、最初の47個のアミノ酸のみを共有する、存在、あるいは(a)～(c)のいずれかの組み合わせ、を含む、請求項2または3に記載の方法。
配列番号6のタンパク質もしくはそのホモログをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレーションするステップ、配列番号6のタンパク質もしくはそのホモログをコードする遺伝子を欠失させるステップ、または配列番号6のタンパク質もしくはそのホモログをコードする遺伝子をノックアウトするステップを含む、請求項2～4のいずれか1項に記載の方法。
請求項3～5のいずれか1項に記載の方法に従う1種以上のモノテルペンの生成、および少なくとも1種のモノテルペンをモノテルペンエステルへとエステル化するステップ、および任意により該1種以上のモノテルペンエステルの分離を含む、モノテルペンエステルの生成のための方法。
改変型生物中で、配列番号2のタンパク質と最初の47個のアミノ酸のみを共有するタンパク質をコードするDNA配列を発現または生成させるステップを含む、未改変型生物と比較して改変型生物のバニリンに対する耐性を増大させるための方法であって、該改変型生物が、配列番号1および/もしくは2のタンパク質またはそのホモログが非存在であるか、不活性であるかまたは実質的に減少しているというさらなる特徴を有する、上記方法。
1種以上のテルペン化合物、好ましくは1種以上のテルペンまたは1種以上のテルペンエステルの存在下での改変型生物の増殖を増加させるための、配列番号2の脱調節型タンパク質またはそのホモログの使用。
配列番号2の前記突然変異型もしくは脱調節型タンパク質またはそのホモログが、フレームシフト、好ましくは配列番号2のタンパク質と比較して得られるタンパク質を短縮するフレームシフトを生じる、配列番号2の48位に対応するヒスチジン残基の突然変異を有する、請求項1～8のいずれか1項に記載の改変型生物、方法または使用。
配列番号1～9の配列のうちのいずれかが、それぞれのタンパク質に対して表3に示される突然変異を保有するために突然変異される、請求項1～9のいずれか1項に記載の改変型生物、方法または使用。
イソプレノール、プレノール、ブタノール、イソブタノール、バニリン、ゲラニオール、サンタレン、バレンセン、スクラレオール、アルテミシンアルコール、アルテミシン酸および/またはシトラールに対する耐性が、未改変型生物と比較して増大する、請求項1～10のいずれか1項に記載の方法、使用、突然変異型タンパク質または改変型生物。
イソプレノール、プレノール、ブタノール、イソブタノールおよび/またはバニリンに対する耐性が、未改変型生物と比較して増大する、請求項1～11のいずれか1項に記載の方法、使用、突然変異型タンパク質または改変型生物。
少なくとも1種のテルペン化合物が、2.0以下、好ましくは1.5以下のlogP値を有する、請求項1～12のいずれか1項に記載の方法、使用または改変型生物。
少なくとも1種のテルペン化合物の水中での溶解度が、少なくとも1.0g/L、好ましくは1.5g/L以上である、請求項1～13のいずれか1項に記載の方法、使用または改変型生物。
少なくとも1種のテルペン化合物が、モノテルペンアルコールまたはC4およびC5アルコールである、請求項1～14のいずれか1項に記載の方法、使用または改変型生物。
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