KR20220119408A - 터펜의 독성 감소 및 미생물에서 생산 잠재성 증가 - Google Patents

Abstract

본 발명은 독성 물질, 예를 들어 터펜 및 알콜 및 다른 막 파괴 물질에 대한 미생물 숙주 세포의 내성을 증가시키기 위한 신규 방법뿐만 아니라, 비변형 유기체와 비교하여 이러한 증가된 내성을 갖는 변형 유기체에 관한 것이다.

Description

터펜의 독성 감소 및 미생물에서 생산 잠재성 증가

이소프레놀은 천연 발생 터페노이드 화합물 부류에 속한다 (Withers and Keasling, 2006). 3-메틸-3-부텐-1-올은 시트랄, 멘톨 및 터페노이드 부류에 역시 속하는 다른 풍미 화합물의 화학적 생산을 위한 기초이다. 시트랄은 비타민 A 및 E 및 몇몇 카로테노이드의 합성에 연속하여 사용된다. 이소프레놀은 또한 장수를 위한 선두 약효식품으로서 논의되어 왔다 (Pandey et al., 2019). 최근에 Amyris 및 Isobionics 등과 같은 회사들은 생물공학적 발효 공정으로 합성되는 터페노이드 제품 예컨대 아르테미신산, 발렌센 및 누트카톤을 도입하였다. 이들 회사는 현재 향료 및 풍미제 사업 (Janssen, 2015)에서 그들 제품 포트폴리오를 더 확장하기 위한 생물학적 생산 플랫폼을 개발 중이고 따라서 화학 합성에 도전한다.

미생물에서 터페노이드 화합물의 생물공학적 생산은 단순하게 이소프레놀의 탈인산화로 수득될 수 있는 천연 전구체 이소펜테닐 디포스페이트 (IPP)에 의존한다. 생물조작은 지금까지 이소프레놀 전구체 IPP의 세포내 농도를 증가시키는데 집중하였다. 모델 유기체인 이. 콜라이 (E. coli)에서, 61 mg/L의 생산물 역가를 생성시키는, DXP 경로로서, IPP를 생산하는 추가의 물질대사 경로를 도입하여 획득되었다 (Liu et al., 2014). 프레놀 및 이소프레놀의 혼합물이 생성물로서 고려되면, 1 g/ℓ 이하의 역가가 현재 가능하다 (Kang et al., 2017). 지금까지 독성 중간체 IPP는 이들 과정에서 주요한 장애물로서 확인되었다 (George et al., 2018; Kang et al., 2019). 현재 연구 프로젝트들은 이소펜테놀을 생물량으로부터 기원하는 가수분해된 다당류로부터 수득하는 통합 공정을 개발하려고 시도하고 있다 (Wang et al., 2019).

터페노이드의 생물공학적 생산에서 핵심 문제는 미생물에 대한 그들 독성 (Brennan et al., 2015)이므로, 모든 경제적으로 실현가능한 생물공정이 직면하게 되는 문제이다. 이러한 문제는 WO2015/002528로서 공개된 국제 특허 출원에 개시된 2-단계 생산 시스템을 사용하고 더 높은 내성까지 생산 균주의 진화 조작을 통해서 극복할 수 있다.

미생물에서 모노터펜 에스테르의 생산이 또한 입증되었다. 제라니올을 이. 콜라이에서 생산할 때, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 유전자가 제라닐 아세테이트의 형성을 매개한다는 것을 관찰하였다 (Liu et al. Biotechnol Biofuels (2016) 9:58). 보다 특이적인 효소의 사용이 장점을 가져오는 것으로 확인되었다: 모노터펜 알콜 예컨대 제라니올뿐만 아니라 많은 식물의 꽃 향기에서 발견되는 비환식 모노터펜인 리날로올이 미생물에게 매우 독성이지만, 그들 에스테르는 종종 훨씬 덜 독성이다. 모노터펜 알콜의 독성은 종종 성장 및/또는 생산 중단을 초래하고, 따라서 매우 낮은 생산물 역가만이 획득되었다. Chacon 등은 제라니올을 생산하도록 조작된 이. 콜라이에서 RhAAT의 발현이 RhAAT의 부재 하에서 생산된 제라니올의 수준에 비해서 실질적으로 증가된 수준으로 제라닐 아세테이트의 형성을 초래한다는 것을 확인하였다 (Chacon, M.G., et al. Esterification of geraniol as a strategy for increasing product titre and specificity in engineered escherichia coli. Microb Cell Fact 18, 105 (2019); https://doi.org/10.1186/s12934-019-1130-0; WO 2019/092388). 그러한 이유로, 제라니올같은 모노터펜 알콜의 제자리 에스테르화는 생산물을 해독하여, 터펜 생산을 증가시키는 수단으로서 전달되었다. 해결해야 하는 문제는 터페노이드 및/또는 다른 독성 물질에 대한 내성이 증가된 숙주 세포 및 내성 증가를 위한 방법 예컨대 이소프레놀 생물생산에 더욱 적합한 숙주 세포를 개발하는 것이다.

놀랍게도, 숙주 세포에 대한 일부 신규하고 예상치 못한 변형이 터펜 및 다른 물질에 대한 광범위 내성을 야기시키는 것으로 확인되었다.

본 발명은 독성 물질, 예를 들어 터펜 및 알콜 및 다른 막 파괴 물질에 대한 미생물 숙주 세포의 내성을 증가시키기 위한 신규 방법뿐만 아니라, 비변형된 숙주 세포와 비교하여 이러한 증가된 내성을 갖는 숙주 세포를 개시한다.

터펜 멘톨, 제라니올, 시트랄, 이소프레놀의 독성은 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli), 사카로마이세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisae), 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida) 및 로도박터 스파에로이데스 (Rhodobacter sphaeroides)의 비변형 유기체로 시험되었다. 모두 독성 효과를 보였지만, 특히 제라니올 및 시트랄은 강력하게 분해되어서 우리의 조작 접근법에 덜 적합하게 만들었다. 이들 및 유사한 독성 물질에 대한 미생물의 내성을 증가시키는데 유용한 변형을 결정하기 위해서, 이. 콜라이 균주 MG1655의 세포에 대해서 세포를 사멸시키지 않지만 적응 및 돌연변이를 허용하는 방식으로 60 mM 이소프레놀의 존재 하에서 일정한 성장을 겪었다. 다음으로 농도는 선택 압력을 증가시키기 위해서 초기에 60 mM (최대 억제의 절반 용량의 10 mM 초과, EC₅₀) 에서 80세대 이후 80 mM 이소프레놀까지 증가되었다. 이러한 농도 상황에서, 야생형 이. 콜라이 세포는 성장할 수 없지만, 적합화된 이. 콜라이 균주는 성장하였고, 부모 이. 콜라이와 비교하여 감소된 이소프레놀 농도에서 훨씬 더 빠른 성장을 보였다. 220 세대 초과의 과정 동안, 단리주가 상세한 분석을 위해 생성되었다. 3개 동시 배양물로부터의 단리주 (단리주 A 내지 C) 및 진화의 7개 상이한 시점 (T1-T7)이 증가된 내성을 담당하는 변형에 대해 분석되었다. 심층 분석 후에, 가장 유망한 것으로 간주되는 변형이 단리되었고 이. 콜라이 야생형 세포로 도입되어 세포를 녹아웃시켰다.

이들 변형을 사용하여, 본 명세서에 개시된 바와 같은 다수 물질의 숙주 세포에 대한 성장 억제 효과를 감소시킬 수 있었다. 그러므로 본 발명은 터펜의 독성을 감소시키고 미생물에서 생산 잠재성을 증가시키는 방법 및 이러한 개선된 특성을 갖는 숙주 세포를 개시한다.

속성 또는 값과 관련하여 용어 "본질적으로", "약", "대략", "실질적으로" 등은 특히 또한 각각 정확하게 그 속성 또는 정확하게 그 값을 정의한다. 동일한 기능적 활성 또는 실질적으로 동일한 기능의 문맥에서 용어 "실질적으로"는 기준 기능과 비교하여 바람직하게 20% 범위 이내, 보다 바람직하게 10% 범위 이내, 가장 바람직하게 5% 이하의 범위 이내의 기능 편차를 의미한다. 제제 또는 조성물의 문맥에서, 용어 "실질적으로" (예를 들어, "화합물 X"로 실질적으로 이루어진 조성물")는 제제 또는 조성물 중에 소정 효과를 갖는 언급된 화합물을 실질적으로 함유하고, 이러한 효과를 갖는 추가 화합물 또는 측정가능하거나 또는 관련된 효과를 나타내지 않는 이러한 화합물의 최대량이 없는 것으로서 본 명세서에서 사용될 수 있다. 소정 수치 값 또는 범위의 문맥에서 용어 "약"은 특히 소정 값 또는 범위의 20% 이내, 10% 이내, 또는 5% 이내인 값 또는 범위와 관련된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "포함하는"은 또한 용어 "이루어지는"을 포괄한다.

용어 "단리된"은 물질이 이의 본래 환경 내에서 천연적으로 회합되어 있는 적어도 하나의 다른 성분이 실질적으로 없는 것을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 존재하는 천연 발생 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 또는 효소는 단리되지 않지만, 천연 시스템의 공존 물질의 일부 또는 전부로부터 분리된, 동일한 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 또는 효소는 단리된다. 추가 예로서, 단리된 핵산, 예를 들어 DNA 또는 RNA 분자는 그것이 유래되는 유기체의 천연 발생 게놈에 존재할 때 정상적으로 바로 인접하는 5' 및 3' 측접 서열이 바로 인접하지 않는 것이다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 미관련된 유전자 배경을 갖는 세포의 게놈 (또는 본질적으로 유사한 유전자 배경을 갖는 게놈이지만, 천연적으로 발생되는 것과 상이한 부위)에 도입되거나, 또는 PCR 증폭 또는 제한효소 분해에 의해 생성되는, 벡터의 일부일 수 있거나, 또는 시험관내 전사로 생성된 RNA 분자, 및/또는 이러한 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 또는 효소가 조성물의 일부일 수 있고, 이러한 벡터 또는 조성물이 이의 천연 환경의 일부가 아니라는 점에서 여전히 단리될 수 있다.

"정제된"은 물질이 상대적으로 순수한 상태, 예를 들어 적어도 약 90% 순수하거나, 적어도 약 95% 순수하거나, 또는 적어도 약 98% 또는 99% 순수한 것을 의미한다. 바람직하게 "정제된"은 물질이 100% 순수한 상태인 것을 의미한다.

"합성" 또는 "인공" 화합물은 시험관내 화학 또는 효소 합성에 의해 생산된다. 예를 들어, 폴리펩티드의 성질을 최적화하기 위해서, 야생형 단백질 서열과 비교하여, 숙주 유기체, 예컨대 세포 숙주 또는 다른 선택 발현 숙주에 대한 최적 코돈 용법으로 만들어진 변이체 핵산 또는 아미노산 변형, 예컨대 예를 들어 치환을 갖는 변이체 단백질 서열을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

용어 "비천연 발생"은 이의 본래 환경 또는 공급원에 존재하지 않지만, 초기에 이의 본래 환경 또는 공급원으로부터 유래하고 나서 다른 수단에 의해 재생될 수 있는, (폴리)뉴클레오티드, 아미노산, (폴리)펩티드, 효소, 단백질, 세포, 유기체, 또는 다른 물질을 의미한다. 이러한 비천연 발생 (폴리)뉴클레오티드, 아미노산, (폴리)펩티드, 효소, 단백질, 세포, 유기체, 또는 다른 물질은 이의 천연 대응물과 구조적으로 및/또는 기능적으로 유사하거나 또는 동일할 수 있다.

용어 "천연" (또는 "야생형" 또는 "내생성") 세포 또는 유기체 및 "천연" (또는 야생형 또는 내생성) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 자연계에 존재하는 세포 또는 유기체를 의미하고 각각 이의 천연 형태 및 유전 환경 (즉, 임의의 인간 개입없음)에서 세포에서 발견되는 바와 같은 대상 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 의미한다.

용어 "이종성" (또는 외생성 또는 외래 또는 재조합) 폴리펩티드는 본 명세서에서 다음과 같이 정의된다:

(a) 숙주 세포에 천연이 아닌 폴리펩티드. 이러한 이종성 폴리펩티드의 단백질 서열은 합성, 비천연 발생, "인공" 단백질 서열이거나;

(b) 숙주 세포에 천연이지만 구조적 변형, 예를 들어 결실, 치환, 및/또는 삽입이 천연 폴리펩티드를 변경시키기 위한 재조합 DNA 기술에 의해서 숙주 세포의 DNA의 조작의 결과로서 포함되는 폴리펩티드; 또는

(c) 그의 발현이 정량적으로 변경되거나 또는 그의 발현이 재조합 DNA 기술에 의한 숙주 세포의 DNA의 조작 결과로서 천연 숙주 세포와 상이한 게놈 위치, 예를 들어, 더 강력한 프로모터로부터 유도되는 것인 숙주 세포에 천연인 폴리펩티드.

상기 설명 b) 및 c)는 이의 천연 형태이지만 이의 생산에 사용되는 세포에 의해 천연적으로 발현되지 않는 서열을 의미한다. 그러므로 생산된 폴리펩티드는 상기 정의와 모순되지 않지만 합성되거나 또는 조작되는 단백질의 서열이 아니라 폴리펩티드 분자가 생산되는 방식인 특별한 상황을 반영하는, "재조합적으로 발현된 내생성 폴리펩티드"로서 보다 정확하게 정의된다.

유사하게, 용어 "이종성" (또는 외생성 또는 외래 또는 재조합) 폴리뉴클레오티드는 다음을 의미한다:

(a) 숙주 세포에 천연적인 것이 아닌 폴리뉴클레오티드;

(b) 숙주 세포에 천연이지만 구조적 변형, 예를 들어 결실, 치환 및/또는 삽입이 천연 폴리뉴클레오티드를 변경시키기 위한 재조합 DNA 기술에 의해 숙주 세포의 DNA의 조작의 결과로서 포함된 폴리뉴클레오티드;

(c) 재조합 DNA 기술, 예를 들어 더 강력한 프로모터에 의한 폴리뉴클레오티드의 조절 엘리먼트의 조작의 결과로서 정량적으로 변경된 것인 숙주 세포에 천연적인 폴리뉴클레오티드; 또는

(d) 재조합 DNA 기술에 의한 유전자 조작의 결과로서 이의 천연 유전 환경 내는 아니지만 통합된 숙주 세포에 천연적인 폴리뉴클레오티드.

둘 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 둘 이상의 아미노산 서열과 관련하여, 용어 "이종성"은 둘 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 둘 이상의 아미노산 서열이 서로 특별한 조합으로 천연적으로 발생되지 않는다는 것을 특징으로 하는데 사용된다.

용어 "폴리뉴클레오티드(들)", "핵산 서열(들)", "뉴클레오티드 서열(들)", "핵산(들)", "핵산 분자"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되고 임의 길이의 중합성 비분지 형태로, 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드인 뉴클레오티드 또는 이 둘의 조합을 의미한다.

뉴클레오티드 서열, 예를 들어 공통 서열 경우에, 본 발명과 관련하여, 하기 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 모호성 정의와 함께 IUPAC 뉴클레오티드 명명법 (Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry (NC-IUB) (1984)이 사용된다: A, 아데닌; C, 시토신; G, 구아닌; T, 티민; K, 구아닌 or 티민; R, 아데닌 또는 구아닌; W, 아데닌 또는 티민; M, 아데닌 또는 시토신; Y, 시토신 또는 티민; D, 시토신 아님; N, 임의의 뉴클레오티드.

또한, 표기법 "N(3-5)" 표시된 공통 위치가 3 내지 5의 임의의 (N) 뉴클레오티드를 가질 수 있다는 것을 의미한다. 예를 들어, 공통 서열 "AWN(4-6)"은 3개의 가능한 변이체를 나타내고: 말단에 4, 5, 또는 6개의 임의 뉴클레오티드를 갖는다: AWNNNN, AWNNNNN, AWNNNNNN.

용어 "조절 엘리먼트" 및 "조절 서열"은 본 명세서에서 모두 상호교환적으로 사용되고 제한없이, 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 포함하여, 그들과 회합된 서열의 발현을 실시할 수 있는 조절 핵산 서열을 의미하고자 광범위한 문맥에서 고려된다. 조절 엘리먼트 또는 조절 서열는 개별적으로 기능 또는 목적을 갖고/갖거나 특정 배열 내 또는 배열 내 다른 엘리먼트 또는 서열의 그룹화 내에 임의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 조절 서열의 예는 리더 또는 신호 (예컨대 5'-UTR), 출발 신호, 프로-펩티드 서열, 프로모터, 인핸서, 사일렌서, 폴리아데닐화 서열, 리보솜 결합 부위 (RBS, 샤인 달가르노 서열), 중지 서열, 종결자, 3'-UTR, 및 이의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 조절 엘리먼트 또는 조절 서열은 서로에 대해서 또는 발현하려는 뉴클레오티드 서열에 대해서 천연 (즉, 동일 유전자 유래)일 수 있거나 외래 (즉, 상이한 유전자 유래)일 수 있다.

용어 "작동적으로 연결된"은 기술된 성분이 그들의 의도하는 방식으로 기능하도록 허용하는 관계에 있는 것을 의미한다. 예를 들어, 코딩 서열에 작동적으로 연결된 조절 서열은 코딩 서열의 발현이 제어 서열과 호환되는 조건 하에서 획득되는 방식으로 결찰된다.

핵산 및 폴리펩티드는 태그 또는 도메인을 포함하도록 변형될 수 있다. 태그는 검출, 정제, 가용화 또는 고정화를 포함한 다양한 목적을 위해 이용될 수 있고, 예를 들어 바이오틴, 형광단, 에피토프, 메이팅 인자, 또는 조절 서열을 포함할 수 있다. 도메인은 임의 크기일 수 있고 바람직한 기능 (예를 들어, 증가된 안정성, 용해도, 활성 부여, 정제 단순화)을 제공하고 예를 들어 결합 도메인, 신호 서열, 프로모터 서열, 조절 서열, N-말단 연장부, 또는 C30 말단 연장부를 포함할 수 있다. 태그 및/또는 도메인의 조합이 또한 이용될 수 있다.

용어 "융합 단백질"은 당분야에 공지된 임의 수단을 통해서 함께 연결된 둘 이상의 폴리펩티드를 의미한다. 이들 수단은 화학 합성 또는 재조합 조작에 의한 코딩 핵산의 스플라이싱을 포함한다.

코딩된 단백질에 변화를 도입시키기 위한 핵산의 변형 방법

. 유전자 편집

유전자 편집 또는 게놈 편집은 DNA가 게놈에 삽입되거나, 치환시키거나 또는 그로부터 제거되고, 다양한 기술 예컨대 DNA 셔플링의 반복에 이어서 변형된 생물학적 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산의 변이체 또는 이의 일부분을 생성하기 위한 적절한 스크리닝 및/또는 선택으로 이루어지는 "유전자 셔플링" 또는 "유도 진화" (Castle et al., (2004) Science 304(5674): 1151-4; 미국 특허 제5,811,238호 및 제6,395,547호)를 사용하거나, 또는 최종 유전자이식 유기체가 도입된 프로모터에 가까운 유전자의 변형된 발현으로 인해 우성 표현형을 보이는 것인 "T-DNA 활성화" 태그화 (Hayashi et al. Science (1992) 1350-1353), 또는 "TILLING" (Targeted Induced Local Lesions In Genomes)으로 수득되는 한 유형의 유전자 조작이고, 변형된 발현 및/또는 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산을 생성 및/또는 확인하는데 유용한 돌연변이유발 기술을 의미한다. TILLING은 또한 이러한 변이체를 보유하는 유기체의 선택을 허용한다. TILLING 방법은 당분야에 충분히 공지되어 있다 (McCallum et al., (2000) Nat Biotechnol 18: 455-457; Stemple (2004) Nat Rev Genet 5(2): 145-50 고찰). 다른 기술은 인공적으로 조작된 뉴클레아제 예컨대 아연 핑거 뉴클레아제, 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), CRISPR/Cas 시스템, 및 조작된 메가뉴클레아제 예컨대 재-조작된 호밍 엔도뉴클레아제를 사용한다 (Esvelt, KM.; Wang, HH. (2013), Mol Syst Biol 9 (1): 641; Tan, WS.et al. (2012), Adv Genet 80: 37-97; Puchta, H.; Fauser, F. (2013), Int. J. Dev. Biol 57: 629-637).

. 돌연변이유발법

DNA 및 그들이 코딩하는 단백질은 새롭거나 또는 변경된 성질을 갖는 변이체 단백질 또는 효소를 생성시키기 위해 분자 생물학에 공지된 다양한 기술을 사용해 변형될 수 있다. 예를 들어, 무작위 PCR 돌연변이유발법 (참조: 예를 들어, Rice (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5467-5471); 또는 조합 다중 카세트 돌연변이유발법 (참조: 예를 들어, Crameri (1995) Biotechniques 18:194-196)이 있다.

대안적으로, 핵산, 예를 들어, 유전자는 무작위 또는 "확률적" 단편화 이후에 재조립될 수 있으며, 예를 들어 하기 문헌들을 참조한다: 미국 특허 제6,291,242호; 제6,287,862호; 제6,287,861호; 제5,955,358호; 제5,830,721호; 제5,824,514호; 제5,811,238호; 제5,605,793호.

대안적으로, 변형, 첨가 또는 결실은 에러-프론 PCR, 셔플링, 부위-지정 돌연변이유발법, 조립 PCR, 성 PCR 돌연변이유발법, 생체내 돌연변이유발법 (파지-보조 연속 진화, 생체내 연속 진화), 카세트 돌연변이유발법, 순환 앙상블 돌연변이유발법, 지수 앙상블 돌연변이유발법, 부위-특이적 돌연변이유발법, 유전자 재조랍, 유전자 부위 포화 돌연변이유발법 (GSSM), 합성 결찰 재조립 (SLR), 재조합, 순환 서열 재조합, 포스포티오에이트-변형 DNA 돌연변이유발법, 우라실-함유 주형 돌연변이유발법, 갭도입 듀플렉스 돌연변이유발법, 점 불일치 복구 돌연변이유발법, 복구-결실 숙주 균주 돌연변이유발법, 화학 돌연변이유발법, 방사능성 돌연변이유발법, 결실 돌연변이유발법, 제한-선택 돌연변이유발법, 제한-정제 돌연변이유발법, 인공 유전자 합성, 앙상블 돌연변이유발법, 키메라 핵산 다량체 생성, 및/또는 이들 및 다른 방법의 조합에 의해 도입된다.

대안적으로, "유전자 부위 포화 돌연변이유발법" 또는 "GSSM"은 미국 특허 제6,171,820호 및 제6,764,835호에 상술된 바와 같은 폴리뉴클레오티드로 점 돌연변이를 도입시키기 위해 축퇴성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 방법을 포함한다.

대안적으로, 합성 결찰 재조립 (SLR)은 비확률적으로 함께 올리고뉴클레오티드 빌딩 블록을 결찰시키는 방법을 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 제6,537,776호에 개시된 바와 같음).

대안적으로, 맞춤 다중-부위 조합 조립 (Tailored multi-site combinatorial assembly) ("TMSCA")은 단일 반응으로 적어도 2개의 돌연변이유발 비중복 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 다수 부위에서 다양한 돌연변이의 상이한 조합을 갖는 다수의 자손 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법이다 (PCT 공개 번호 WO 2009/018449에 기술된 바와 같음).

서열 정렬은 다음과 같은, 다수의 소프트웨어 도구를 사용해 생성될 수 있다:

- 니들만 및 분치 (Needleman and Wunsch) 알고리즘 - Needleman, Saul B. & Wunsch, Christian D. (1970). "A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins". Journal of Molecular Biology. 48 (3): 443-453.

이 알고리즘은 예를 들어 2개 서열의 전체 정렬을 수행하는, "NEEDLE" 프로그램에서 구현된다. NEEDLE 프로그램은 예를 들어, EMBOSS (European Molecular Biology Open Software Suite) 내에 함유된다.

- EMBOSS - 다양한 프로그램 컬렉션: The European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS), Trends in Genetics 16 (6), 276 (2000).

- BLOSUM (BLOcks SUbstitution Matrix) - 전형적으로 예를 들어 단백질 도메인의 보존된 영역의 정렬을 기반으로 생성된다 (Henikoff S, Henikoff JG: Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 1992 Nov 15;89(22):10915-9). 많은 BLOSUM 중 하나는 단백질 서열을 정렬할 때, 종종 많은 프로그램에 대한 "디폴트" 환경인 "BLOSUM62"이다.

- BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) - 대형 서열 데이터베이스에서 유사한 서열을 검색하기 위해 주로 사용되는 몇몇 개별 프로그램 (BlastP, BlastN,...)으로 이루어진다. BLAST 프로그램은 또한 국소 정렬을 생성시킨다.

전형적으로 개선된 형태 ("BLAST2")인, NCBI (National Center for Biotechnology Information)가 제공하는 "BLAST" 인터페이스가 사용된다: The "original" BLAST: Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J. (1990) "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215:403-410; BLAST2: Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402.

효소 변이체는 부모 효소와 비교했을 때 그들 서열 동일성으로 정의될 수 있다. 일반적으로 서열 동일성은 "% 서열 동일성" 또는 "% 동일성"으로 제공된다. 제1 단계에서 2개 아미노산 서열 간 동일성 퍼센트를 결정하기 위해서 쌍별 서열 정렬이 2개 서열 간에 생성되고, 2개 서열은 그들 전체 길이 상에서 정렬된다 (즉, 쌍별 전체 정렬). 정렬은 바람직하게 프로그램 디폴트 매개변수 (갭개방=10.0, 갭확장=0.5 및 매트릭스=EBLOSUM62)로 프로그램 "NEEDLE" (The European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS))을 사용하여, 니들만 및 분치 알고리즘을 구현하는 프로그램을 사용해 생성된다 (J. Mol. Biol. (1979) 48, p. 443-453). 본 발명의 목적을 위해 바람직한 정렬은 최고 서열 동일성을 결정할 수 있는 정렬이다.

하기 예는 2개 뉴클레오티드 서열을 예시하기 위한 것이지만, 동일한 계산이 단백질 서열에 적용된다:

Seq A: AAGATACTG 길이: 9 염기

Seq B: GATCTGA 길이: 7 염기

따라서, 더 짧은 서열이 서열 B이다.

그들 전체 길이 상에서 양쪽 서열을 보여주는 쌍별 전체 정렬을 생성하면 그 결과는 다음과 같다:

정렬에서 "I" 기호는 동일한 잔기 (DNA 경우 염기 또는 단백질 경우 아미노산 의미)를 표시한다. 동일한 잔기의 수는 6이다.

정렬에서 "-" 기호는 갭을 표시한다. Seq B 내에 정렬에 의해 도입된 갭의 수는 1이다. Seq B의 경계에서 정렬에 의해 도입된 갭의 수는 2이고, Seq A의 경계에서는 1이다.

그들 전체 길이 상에서 정렬된 서열을 보여주는 정렬 길이는 10이다.

본 발명에 따라서 이의 전체 길이 상에서 더 짧은 서열을 보여주는 쌍별 정렬의 생성은 결론적으로 다음과 같은 결과를 생성한다:

본 발명에 따라서 이의 전체 길이 상에서 서열 A를 보여주는 쌍별 정렬의 생성은 결론적으로 다음과 같은 결과를 생성한다.

본 발명에 따라서 이의 전체 길이 상에서 서열 B를 보여주는 쌍별 정렬의 생성은 결론적으로 다음과 같은 결과를 생성한다:

이의 전체 길이 상에서 더 짧은 서열을 보여주는 정렬 길이는 8이다 (하나의 갭이 더 짧은 서열의 정렬 길이에서 고려되어 존재함).

따라서, 이의 전체 길이 상에서 Seq A를 보여주는 정렬 길이는 9이다 (Seq A는 본 발명의 서열을 의미).

따라서, 이의 전체 길이 상에서 SeqB를 보여주는 정렬 길이는 8이다 (Seq B는 본 발명의 서열을 의미).

2개 서열 정렬 이후에, 제2 단계에서, 동일성 값은 정렬로부터 결정될 것이다. 이러한 설명의 목적을 위해서, 동일성 퍼센트는 %-동일성 = (동일한 잔기 / 이의 전체 길이 상에서 더 짧은 서열을 보여주는 정렬 영역의 길이) *100으로 계산된다. 따라서, 이 구현예에 따라 2개 아미노산 서열의 비교와 관련하여 서열 동일성은 이의 전체 길이 상에서 더 짧은 서열을 보여주는 정렬 영역의 길이로 동일한 잔기의 개수를 나누어서 계산된다. 이러한 값에 100을 곱해서 "%-동일성"이 제공된다. 상기 제공된 예에 따라서, %-동일성은 다음과 같다: (6 / 8) * 100 = 75%.

산탈렌 신타제의 변이체는 각각의 부모 폴리펩티드 분자의 아미노산 서열과 적어도 n 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있으며, n은 전체 길이 폴리펩티드 서열과 비교하여 50 내지 100, 바람직하게 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99이다.

산탈렌 신타제 변이체는 부모 효소와 비교했을 때 그들 서열 유사성에 의해 정의될 수 있다. 서열 유사성은 일반적으로 "% 서열 유사성" 또는 "%-유사성"으로 제공된다. 제2 단계로 서열 유사성을 계산하기 위해서, 서열 정렬은 상기 기술된 대로 생성시켜야 한다. 제2 단계에서, 유사성 퍼센트를 계산해야 하는 한편, 서열 유사성 퍼센트는 아미노산의 정해진 세트가 예를 들어, 그들 크기, 그들 소수성, 그들 전하, 또는 다른 특징들에 의해 유사한 성질을 공유한다는 것을 고려한다. 본 명세서에서, 하나의 아미노산을 유사한 아미노산으로 교환은 "보존성 돌연변이"라고 한다. 보존성 돌연변이를 포함하는 효소 변이체는 부모 효소의 효소 성질과 비교했을 때 일정 효소 성질이 실질적으로 유지되게 단백질 폴딩에 최소 효과를 갖는 것으로 보인다.

본 발명에 따른 %-유사성을 결정하기 위해서, 데이터베이스 검색 및 서열 정렬을 위한 가장 많이 사용되는 아미노산 유사성 매트릭스 중 하나인, 예를 들어 "NEEDLE" 프로그램 (상기 참조된 바와 같음)에 의해 사용되는 바와 같은 BLOSUM62 매트릭스에 따라서, 다음을 적용한다.

아미노산 A는 아미노산 S와 유사하고,

아미노산 D는 아미노산 E; N과 유사하고,

아미노산 E는 아미노산 D; K; Q와 유사하고,

아미노산 F는 아미노산 W; Y와 유사하고,

아미노산 H는 아미노산 N; Y와 유사하고,

아미노산 I는 아미노산 L; M; V와 유사하고,

아미노산 K는 아미노산 E; Q; R과 유사하고,

아미노산 L은 아미노산 I; M; V와 유사하고,

아미노산 M은 아미노산 I; L; V와 유사하고,

아미노산 N은 아미노산 D; H; S와 유사하고,

아미노산 Q는 아미노산 E; K; R과 유사하고,

아미노산 R은 아미노산 K; Q와 유사하고,

아미노산 S는 아미노산 A; N; T와 유사하고,

아미노산 T는 아미노산 S와 유사하고,

아미노산 V는 아미노산 I; L; M과 유사하고,

아미노산 W는 아미노산 F; Y와 유사하고,

아미노산 Y는 아미노산 F; H; W와 유사하다.

보존성 아미노산 치환은 기능성 단백질 예컨대 효소의 폴리펩티드 서열의 서열의 전체 길이 상에서 일어날 수 있다. 일 구현예에서, 이러한 돌연변이는 효소의 기능성 도메인과 관련되지 않는다. 일 구현예에서, 보존성 돌연변이는 효소의 촉매 중심과 관련되지 않는다.

그러므로, 본 설명에 따라서, %-유사성의 하기 계산이 적용된다:

%-유사성 = [ (동일 잔기 + 유사 잔기) / 이의 전체 길이 상에서 더 짧은 서열을 보이는 정렬 영역의 길이] *100. 따라서, 본 구현예에 따른 2개 아미노산 서열의 비교와 관련하여 서열 유사성은 유사 잔기의 개수가 더해진 동일 잔기의 개수를 이의 완전한 길이 상의 더 짧은 서열을 보이는 정렬 영역의 길이로 나누어서 계산한다. 이 값에 100을 곱해서 "%-유사성"이 제공된다.

각각의 부모 서열과 적어도 m% 유사한 보존성 돌연변이를 포함하는 효소로서, m인 전체 길이 폴리펩티드 서열과 비교하여 50 내지 100의 정수, 바람직하게 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99인 효소는 본질적으로 변화되지 않은 효소 성질, 예컨대 효소 활성을 갖는다고 예상된다.

본 명세서에서 사용되는 "구성체", "유전자 구성체" 또는 "발현 카세트" (상호교환적으로 사용)는 본 명세서에 기술된 바와 같은, 하나 이상의 조절 서열 (적어도 프로모터)에 작동적으로 연결된, 발현시키려는 적어도 하나의 관심 서열을 포함하는 DNA 분자이다. 전형적으로, 발현 카세트는 3개 엘리먼트: 프로모터 서열, 오픈 리딩 프레임, 및 일반적으로 진핵생물에서 폴리아데닐화 부위를 함유하는 3' 비번역 영역을 포함한다. 추가의 조절 엘리먼트는 전사뿐만 아니라 번역 인핸서를 포함할 수 있다. 인트론 서열은 또한 시토졸에서 축적되는 성숙한 메세지의 양을 증가시키기 위해서 5' 비번역 영역 (UTR) 또는 코딩 서열에 첨가될 수 있다. 당업자는 성공적으로 발현시키도록 발현 카세트에 존재해야만 하는 유전자 엘리먼트를 잘 알고 있다. 바람직하게, 발현 카세트를 형성하는 유전자 엘리먼트의 배열 또는 DNA의 적어도 일부분은 인공적이다. 발현 카세트는 벡터의 일부일 수 있거나 또는 숙주 세포의 게놈에 통합되어서 이의 숙주 세포의 게놈과 함께 복제될 수 있다. 발현 카세트는 관심 DNA 및/또는 단백질의 발현을 증가 또는 감소시킬 수 있다.

본 명세서에서 언급되는 용어 "도입" 또는 형질전환"은 전달에 사용되는 방법과 무관하게, 숙주 세포로 외생성 폴리뉴클레오티드의 전달을 포괄한다. 즉, 본 명세서에서 사용되는 용어 "형질전환"은 벡터, 셔틀 시스템, 또는 숙주 세포와 독립적이고, 당분야에 공지된 형질전환의 폴리뉴클레오티드 전달 방법뿐만 아니라 (참조: 예를 들어, Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY), 예컨대, 제한없이, 형질도입 또는 형질감염같은 임의의 추가 종류의 폴리뉴클레오티드 전달 방법을 포괄한다.

용어 "재조합 유기체"는 유래되는 야생형 유기체와 비교하여 변경, 변형 또는 상이한 유전자형을 나타내도록 유전자 변경, 변형 또는 조작된 진핵생물 유기체 (효모, 진균, 조류, 식물, 동물) 또는 원핵생물 미생물 (예를 들어, 박테리아)을 의미한다. 바람직하게, "재조합 유기체"는 외생성 핵산을 포함한다. "재조합 유기체", "유전자 변형 유기체" 및 "유전자이식 유기체"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 외생성 핵산은 DNA의 염색체외 조각 (예컨대 플라스미드)에 위치될 수 있거나 또는 유기체의 염색체 DNA에 통합될 수 있다. 재조합 진핵생물 유기체의 경우에, 사용되는 핵산(들)은 상기 유기체의 게놈에 존재하지 않거나, 또는 그로부터 유래되지 않거나, 또는 상기 유기체의 게놈에 존재하지만 상기 유기체의 게놈의 그들 천연 유전자좌에 존재하지 않고, 하나 이상의 내생성 및/또는 외생성 조절 엘리먼트의 조절 하에서 핵산이 발현되는 것이 가능한 것을 의미하는 것으로 이해한다.

정의에 따라서, 용어 "터펜"은 탄소 및 수소 및 터펜 화합물로 이루어진 오직 탄화수소만을 포함한다. 용어 "터펜 화합물"은 터펜, 및 유도체 예컨대 알콜, 알데히드, 케톤 및 산을 생성시키는 추가 작용기를 함유하는 터펜을 의미하지만, 관련 화합물 예컨대 4개 탄소 (C4) 알콜 부탄올 및 이소부탄올 또는 8개 탄소 알데히드 바닐린을 포함한다. 전형적인 터펜 화합물은 다음과 같다:

- 4개 탄소 원자 (C4)를 갖는 알콜, 예컨대 제한없이 부탄올 및 이소부탄올;

- 5개 탄소 원자 (C5)를 갖는 화합물, 예컨대 제한없이 헤미터펜 이소프렌 및 헤미터페노이드 프레놀 및 이소발레르산;

- 7개 또는 8개 탄소 페놀계 알데히드 예컨대 제한없이 바닐린;

- 터펜이거나 또는 터펜으로부터 유래된 10개 탄소 원자 (C10)를 갖는 화합물, 예컨대 제한없이 모노터펜 및 모노터페노이드 예컨대 제라니올, 터피네올, 리모넨, 미르센, 리날로올 또는 피넨;

- 터펜이거나 또는 터펜으로부터 유래된 15개 탄소 원자 (C15)를 갖는 화합물, 또는 C15로부터 유래된 화합물, 예컨대 제한없이 세스퀴터펜 및 세스퀴터페노이드 예컨대 후물렌, 파르네센, 파르네솔; 및

- 20개 탄소 원자 (C20)를 갖는 화합물, 25개 탄소 원자 (C25)를 갖는 화합물, 30개 탄소 원자 (C30)를 갖는 화합물, 35개 탄소 원자 (C35)를 갖는 화합물, 또는 터펜이거나 또는 터펜으로부터 유래된 40개 탄소 원자 (C40)를 갖는 화합물, 또는 C20, C25, C30, C35 또는 C40 터펜으로부터 유래된 화합물.

일 구현예에서, 터펜 화합물은 터펜; 유도체 예컨대 알콜, 알데히드, 케톤 또는 산을 생성하는 하나 이상의 추가 작용기를 함유하는 터펜; C4 알콜, 바람직하게 부탄올 또는 이소부탄올; 또는 바닐린 또는 이소바닐린으로 이해한다. 바람직하게 터펜 화합물은 5개, 10개 또는 15개 탄소 원자를 갖는 터펜 또는 그로부터 유래되는 화합물이다.

모노터펜 화합물와 관련하여, C10 화합물 제라닐 디포스페이트 (GPP)는 가수분해, 고리화, 및 산화환원을 포함한 일련의 연속 반응을 포함하는 모노터펜의 형성에서 직접 전구체이다.

2개 주요 유형의 모노터펜: 비환식 (또는 선형) 및 단환식 또는 이환식일 수 있는 환식이 존재한다. 비환식 모노터펜, 예컨대 시스-알파-오시멘 및 베타-미르센은 2,6-디메틸옥탄 유도체이다. 리모넨 및 시멘으로서, 전형적인 단환식 모노터펜은 이론적으로, 통상적으로 가변적인 이중 결합 모이어티를 함유하는, 이소프로필 치환기를 갖는 시클로헥산 유도체이다. 다른 한편으로, 알파-피넨 및 베타-피넨은 통상적인 유형의 이환식 모노터펜이다.

본 명세서에서 사용되는 "터펜 알콜"은 작용기로서 알콜 기를 포함하는 터펜 화합물을 의미한다. 많은 예가 당분야에 공지되어 있다.

본 명세서에서 사용되는 "모노터펜 알콜"은 작용기로서 알콜 기를 포함하는 모노터펜 (C10)을 의미한다. 모노터펜 알콜은 당분야에서 충분히 설명되어 있다.

본 명세서에서 사용되는 "세스퀴터펜 알콜"은 작용기로서 알콜 기를 포함하는 세스퀴터펜 (C15)을 의미한다. 세스퀴터펜 알콜은 당분야에 충분히 공지되어 있다.

터펜 알콜, 예를 들어 모노터펜 또는 세스퀴터펜 알콜은 당분야에 공지된 바와 같이 1차, 2차 또는 3차 알콜일 수 있다.

바람직한 1차 알콜은 제라니올, 시트로넬롤, 라반둘롤이고 바람직한 2차 알콜은 보르네올, 이소보르네올, 펜콜, 베르베놀, 카르베올, 멘톨이다. 또한 바람직하게는 네롤리돌, 산탈롤, 쿠베볼, 패출롤, 비사볼롤, 게르마크렌 D-올, 헤디카리올이 있다.

디터펜 알콜 예컨대 스클라레올이 또한 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다.

문헌에서 종종 언급되는 비환식 모노터펜 알콜, 또는 모노터페놀은 가변 이중 결합 모이어티 및 히드록실-작용성을 함유하는 2,6-디메틸옥탄 유도체이다. 이 부류의 가장 중요한 물질은 리날로올, 제라니올, 네롤, 시트로넬롤, 미르세놀, 및 디히드로미르세놀이다. 그들은 고대 시대부터 그들의 쾌적한 후각적 성질때문에 향료 제조에서 사용된다. 변형 유기체 또는 본 발명의 방법은 일 구현예에서 역시 이들 생산에서 사용될 수 있다.

정의에 따라서, 에스테르는 적어도 하나의 -OH (히드록실) 기가 -O-알킬 (알콕시) 기로 치환된 산 (유기 또는 무기)으로부터 유래되는 화학적 화합물이다. 그리하여 "터펜 에스테르"는 적어도 하나의 -OH (히드록실) 기가 -O-알킬 (알콕시) 기로 치환된 터펜 알콜이다.

본 명세서에서 사용되는 "모노터펜 에스테르"는 모노터펜 알콜로부터의 에스테르를 의미한다. 이 용어는 본 명세서에 정의된 바와 같은, 1차 모노터펜 알콜, 2차 모노터펜 알콜 또는 3차 모노터펜 알콜로부터의 에스테르를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 "세스퀴터펜 에스테르"는 세스퀴터펜 알콜로부터의 에스테르를 의미한다. 이 용어는 본 명세서에 정의된 바와 같은 1차 세스퀴터펜 알콜, 2차 세스퀴터펜 알콜 또는 3차 세스퀴터펜 알콜로부터의 에스테르를 포함한다.

본 발명은 하나 이상의 터펜 화합물에 대한 개선된 내성을 갖는 변형 유기체에 관한 것으로서, 변형 유기체는 다음으로 이루어진 하기 군으로부터 선택되는 야생형 변형 유기체와 비교하여 하나 이상의 변경을 갖는다:

i. 터펜 화합물의 존재 하에서 SEQ ID NO: 2의 단백질 또는 이의 상동체의 부재, 불활성화 또는 감소된 존재비, 및 SEQ ID NO: 3의 단백질 또는 이의 상동체의 부재, 불활성화 또는 감소된 존재비 및 SEQ ID NO: 2의 단백질 또는 이의 상동체의 돌연변이형 단백질의 존재로서, SEQ ID NO: 2의 단백질 또는 이의 상동체의 돌연변이형 단백질은 비변형 유기체의 SEQ ID NO: 2의 단백질 또는 이의 상동체와 단지 선호 순서로 처음 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48 또는 47 아미노산을 공유함;

ii. 터펜 화합물의 존재 하에서 SEQ ID NO: 2의 단백질 또는 이의 상동체의 부재, 불활성화 또는 감소된 존재비;

iii. 터펜 화합물의 존재 하에서 SEQ ID NO: 3의 단백질 또는 이의 상동체의 부재, 불활성화 또는 감소된 존재비;

iv. 터펜 화합물의 존재 하에서 SEQ ID NO: 2의 단백질 또는 이의 상동체의 부재 및 SEQ ID NO: 2의 단백질 또는 이의 상동체의 돌연변이형 단백질의 존재로서, SEQ ID NO: 2의 단백질 또는 이의 상동체의 돌연변이형 단백질은 SEQ ID NO: 2의 위치 48에 상응하는 위치에 돌연변이를 가짐;

v. 터펜 화합물의 존재 하에서 SEQ ID NO: 2의 단백질 또는 이의 상동체의 돌연변이형 단백질의 존재로서, SEQ ID NO: 2의 단백질 또는 이의 상동체의 돌연변이형 단백질은 SEQ ID NO: 2의 위치 48에 상응하는 위치에 돌연변이를 가짐;

vi. 터펜 화합물의 존재 하에서 비변형 유기체와 비교하여 SEQ ID NO: 1의 단백질 또는 이의 상동체의 증가된 수준 또는 증가된 활성으로서, 바람직하게 SEQ ID NO: 1의 상동체의 내생성 유전자는 결실되었고, SEQ ID NO: 1을 코딩하는 유전자 또는 이의 변이체의 재조합 발현을 갖고, 보다 더 바람직하게 SEQ ID NO: 1을 코딩하는 유전자 또는 이의 변이체의 재조합 발현은 저강도 내지 중간 강도 프로모터 또는 다른 제어 엘리먼트 하에 있음;

vii. 터펜 화합물의 존재 하에서 SEQ ID NO: 4의 단백질 또는 이의 상동체의 돌연변이형 단백질의 존재로서, SEQ ID NO: 4의 단백질 또는 이의 상동체의 돌연변이형 단백질은 SEQ ID NO: 4의 위치 74에 상응하는 위치에 돌연변이를 가짐;

viii. 터펜 화합물의 존재 하에서 SEQ ID NO: 5의 단백질 또는 이의 상동체의 돌연변이형 단백질의 존재, 또는 SEQ ID NO: 5의 단백질의 부재, 불활성화 또는 감소된 존재비로서, 바람직하게 SEQ ID NO: 5의 단백질 또는 이의 상동체의 돌연변이형 단백질은 a) SEQ ID NO: 5의 위치 291에 상응하는 위치에 돌연변이 및/또는 b) SEQ ID NO: 5의 위치 274 또는 그 이후에 상응하는 위치에 돌연변이를 갖고 돌연변이형 단백질은 SEQ ID NO:5의 단백질 또는 이의 상동체에 비해서 짧음;

ix. 터펜 화합물의 존재 하에서 SEQ ID NO: 6의 단백질 또는 이의 상동체의 돌연변이형 단백질의 존재로서, SEQ ID NO: 6의 단백질 또는 이의 상동체의 돌연변이형 단백질은 SEQ ID NO: 6의 위치 96에 상응하는 위치에 돌연변이 (바람직하게 돌연변이는 발린을 글루탐산으로 치환한 돌연변이임) 및/또는 SEQ ID NO: 6의 위치 67에 상응하는 위치에, 바람직하게 글리신을 세린으로 치환시킨 돌연변이를 가짐;

x. 터펜 화합물의 존재 하에서 SEQ ID NO: 6의 단백질 또는 이의 상동체의 부재, 불활성화 또는 감소된 존재비;

xi. 터펜 화합물의 존재 하에서 SEQ ID NO: 8의 단백질 또는 이의 상동체의 변형, 바람직하게 SEQ ID NO: 8의 단백질 또는 이의 상동체의 부재, 불활성화 또는 감소된 존재비;

xii. 터펜 화합물의 존재 하에서 SEQ ID NO: 9의 단백질 또는 이의 상동체의 변형, 바람직하게 SEQ ID NO 9의 단백질 또는 이의 상동체의 부재, 불활성화 또는 감소된 존재비;

xiii. 터펜 화합물의 존재 하에서 SEQ ID NO: 7의 단백질 또는 이의 상동체의 변형, 바람직하게 SEQ ID NO 7의 단백질 또는 이의 상동체의 부재, 불활성화, 증가된 활성 또는 감소된 존재비;

xiv. 이전의 I 내지 xiii의 임의 조합;

내성은 비변형 유기체와 비교하여 개선된다.

바람직하게, 변형 유기체는 터펜 화합물, 바람직하게 모노터펜 알콜로부터, 터펜 에스테르, 바람직하게 모노터펜 에스테르를 제조하기 위한 방법에서 적용된다.

본 발명에 따른 변형 유기체는 예를 들어, 하기 문헌 및 이후 이의 보충에 서 기술되고, 또한 CRISPR/CAS 등과 같은 기술을 포함하는, 당분야에 일반적으로 공지된 유기체를 돌연변이시키는 전형적인 방법 및/또는 표준 유전자 및 분자 생물학 기술을 기반으로 생산될 수 있다: Sambrook, J., and Russell, D.W. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (2001); 및 F.M. Ausubel et al , eds., "Current protocols in molecular biology", John Wiley and Sons, Inc., New York (1987).

변형 유기체는 박테리아 세포, 효모 세포, 진균 세포, 조류 세포, 시아노박테리아 세포, 인간 이외 동물 세포 또는 포유동물 세포 또는 식물 세포로부터 선택되는 임의 세포일 수 있다.

특히, 변형 유기체는 하기 유기체 중 어느 하나로부터 선택될 수 있다:

박테리아

박테리아 변형 유기체는 예를 들어, 속 에스케리치아 (Escherichia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 헬리코박터 (Helicobacter), 바실러스 (Bacillus), 락토바실러스 (Lactobacillus), 스트렙토코쿠스 (Streptococcus), 아미콜라톱시스 (Amycolatopsis), 로도박터 (Rhodobacter), 슈도모나스 (Pseudomonas), 파라코쿠스 (Paracoccus) 또는 락토코쿠스 (Lactococcus)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

그람 양성: 예컨대 바실러스 (Bacillus), 스트렙토마이세스 (Streptomyces)

유용한 그람 양성 박테리아 변형 유기체는 바실러스 세포, 예를 들어, 바실러스 알칼로피우스 (Bacillus alkalophius), 바실러스 아밀로리케파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 브레비스 (Bacillus brevis), 바실러스 서쿨란스 (Bacillus circulans), 바실러스 클라우시 (Bacillus clausii), 바실러스 코아굴란스 (Bacillus coagulans), 바실러스 피르무스 (Bacillus firmus), 바실러스 자우투스 (Bacillus Jautus), 바실러스 렌투스 (Bacillus lentus), 바실러스 리케니포르미스 (Bacillus licheniformis), 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium), 바실러스 푸밀루스 (Bacillus pumilus), 바실러스 스테아로써모필루스 (Bacillus stearothermophilus), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 및 바실러스 투린지엔시스 (Bacillus thuringiensis)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 가장 바람직하게, 원핵생물은 바실러스 세포, 바람직하게, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 푸밀루스, 바실러스 리케니포르미스, 또는 바실러스 렌투스의 바실러스 세포이다.

일부 다른 바람직한 박테리아는 악티노마이세탈레스 (Actinomycetales) 목의 균주, 바람직하게, 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 바람직하게 스트렙토마이세스 스페로이데스 (Streptomyces spheroides) (ATTC 23965), 스트렙토마이세스 써모비올라세우스 (Streptomyces thermoviolaceus) (IFO 12382), 스트렙토마이세스 리비단스 (Streptomyces lividans) 또는 스트렙토마이세스 무리누스 (Streptomyces murinus) 또는 스트렙토버티실룸 버티실리움 (Streptoverticillum verticillium) ssp. 버티실리움 (verticillium)을 포함한다. 다른 바람직한 박테리아는 로도박터 스파에로이데스 (Rhodobacter sphaeroides), 로도모나스 팔루스트리 (Rhodomonas palustri), 스트렙토코쿠스 락티스 (Streptococcus lactis)를 포함한다. 추가 바람직한 박테리아는 믹소코쿠스 (Myxococcus)에 속하는 균주, 예를 들어, 엠. 비레센스 (M. virescens)를 포함한다.

그람 음성: 이. 콜라이, 슈도모나스, 로도박터, 파라코쿠스

바람직한 그람 음성 박테리아는 에스케리치아 콜라이, 슈도모나스 sp., 바람직하게, 슈도모나스 푸로시니아 (Pseudomonas purrocinia) (ATCC 15958) 또는 슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas fluorescens) (NRRL B-11), 로도박터 캅술라투스 (Rhodobacter capsulatus) 또는 로도박터 스파에로이데스 (Rhodobacter sphaeroides), 파라코쿠스 카로티니파시엔스 (Paracoccus carotinifaciens) 또는 파라코쿠스 제아잔티니파시엔스 (Paracoccus zeaxanthinifaciens)이다.

진균

아스퍼질러스 (Aspergillus), 푸사리움 (Fusarium), 트리코더마 (Trichoderma)

변형 유기체는 진균 세포일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "진균"은 아스코마이코타 (Ascomycota), 바시디오마이코타 (Basidiomycota), 키트리디오마이코타 (Chytridiomycota), 및 자이고마이코타 (Zygomycota)를 비롯하여 우마이코타 (Oomycota) 및 데우테로마이코티나 (Deuteromycotina) 문 및 모든 유사분열 포자 진균을 포함한다. 아스코마이코타의 대표적인 그룹은 예를 들어, 뉴로스포라 (Neurospora), 유페니실리움 (Eupenicillium) (=페니실리움 (Penicillium)), 에머리셀라 (Emericella) (=아스퍼질러스 (Aspergillus)), 유로티움 (Eurotium) (=아스퍼질러스) 및 하기 나열된 진정한 효모를 포함한다. 바시디오마이코타의 예는 버섯류, 녹병균, 및 흑수병균을 포함한다. 키트리디오마이코타의 대표적인 그룹은 예를 들어, 알로마이세스 (Allomyces), 블라스토클라디엘라 (Blastocladiella), 코엘로모마이세스 (Coelomomyces), 및 수생 진균을 포함한다. 우마이코타의 대표적인 그룹은 예를 들어 사프로레그니오마이세토우스 (Saprolegniomycetous) 수생 진균 (물 곰팡이) 예컨대 아클리아 (Achlya)를 포함한다. 유사분열 포자 진균의 예는 아스퍼질러스 (Aspergillus), 페니실리움 (Penicillium), 칸디다 (Candida), 및 알테르나리아 (Alternaria)를 포함한다. 자이고마이코타의 대표적인 그룹은 예를 들어, 리조푸스 (Rhizopus) 및 무코르 (Mucor)를 포함한다.

일부 바람직한 진균은 데우테로마이코티나 아문, 하이포마이세테스 (Hyphomycetes) 강에 속하는 균주, 예를 들어, 푸사리움 (Fusarium), 후미콜라 (Humicola), 트리코더마 (Tricoderma), 마이로테시움 (Myrothecium), 버티실룸 (Verticillum), 아르트로마이세스 (Arthromyces), 칼다리오마이세스 (Caldariomyces), 울로클라디움 (Ulocladium), 엠벨리시아 (Embellisia), 클라도스포리움 (Cladosporium) 또는 드레스클레라 (Dreschlera), 특히, 푸사리움 옥시스포룸 (Fusarium oxysporum) (DSM 2672), 후미콜라 인솔렌스 (Humicola insolens), 트리코더마 레시 (Trichoderma resii), 마이로테시움 베루카나 (Myrothecium verrucana) (IFO 6113), 버티실룸 알보아트룸 (Verticillum alboatrum), 버티실룸 다리에 (Verticillum dahlie), 아르트로마이세스 라모수스 (Arthromyces ramosus) (FERM P-7754), 칼다리오마이세스 푸마고 (Caldariomyces fumago), 울로클라디움 카르타룸 (Ulocladium chartarum), 엠벨리시아 알리 (Embellisia alli) 또는 드레스클레라 할로데스 (Dreschlera halodes)를 포함한다.

다른 바람직한 진균은 바시디오마이코티나 아문, 바시디오마이세테스 강에 속하는 균주, 예를 들어, 코프리누스 (Coprinus), 파네로카에트 (Phanerochaete), 코리오루스 (Coriolus) 또는 트라메테스 (Trametes), 특히 코프리누스 시네레우스 (Coprinus cinereus) f. 마이크로스포루스 (microsporus) (IFO 8371), 코프리누스 마크로리주스 (Coprinus macrorhizus), 파네로카에테 크리소스포리움 (Phanerochaete chrysosporium) (예를 들어, NA-12) 또는 트라메테스 (Trametes) (이전에 폴리포루스 (Polyporus)라고 함), 예를 들어, 티. 베르시콜로르 (T. versicolor) (예를 들어, PR4 28-A)를 포함한다.

추가의 바람직한 진균은 자이고마이코티나 아문, 마이코라세아에 강에 속하는 균주, 예를 들어, 리조푸스 또는 무코르, 특히 무코르 히에말리스 (Mucor hiemalis)를 포함한다.

하기와 같은 효모가 또한 본 발명에서 사용될 수 있다:

피키아 (Pichia) 또는 사카로마이세스 (Saccharomyces). 진균성 변형 유기체는 효모 세포일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "효모"는 자낭포자 효모 (엔도마이세탈레스 (Endomycetales)), 담자포자 진균, 및 불완전 진균에 속하는 진균 (블라스토마이세테스 (Blastomycetes))을 포함한다. 자낭포자 효모는 스퍼모프토라세아에 (Spermophthoraceae) 및 사카로마이세타세아에 (Saccharomycetaceae) 과로 분류된다. 후자는 4개의 아과, 스키조사카로마이코이데아에 (Schizosaccharomycoideae) (예를 들어, 스키조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces) 속), 나드소니오이데아에 (Nadsonioideae), 리포마이코이데아에 (Lipomycoideae), 및 사카로마이코이데아에 (Saccharomycoideae) (예를 들어, 클루이베로마이세스, 피키아, 및 사카로마이세스 속)를 포함한다. T담자포자 효모는 류코스포리딤 (Leucosporidim), 로도스포리디움 (Rhodosporidium), 스포리디오볼루스 (Sporidiobolus), 필로바시디움 (Filobasidium), 및 필로바시디엘라 (Filobasidiella) 속을 포함한다. 불완전 진균에 속하는 효모는 2개 과, 스포로볼로마이세타세아에 (Sporobolomycetaceae) (예를 들어, 스포로볼로마이세스 (Sporobolomyces) 및 불레라 (Bullera) 속) 및 크립토코카세아에 (Cryptococcaceae) (예를 들어, 칸디다 속)로 분류된다.

진핵생물

진핵생물의 변형 유기체는 제한없이, 비-인간 동물 세포, 비-인간 포유동물 세포, 조류 세포, 파충류 세포, 곤충 세포, 또는 식물 세포를 포함한다.

바람직한 구현예에서, 변형 유기체는 하기로부터 선택되는 변형 유기체이다:

a) 그람 음성 박테리아 군의 박테리아 세포, 예컨대 로도박터 (예를 들어, 로도박터 스파에로이데스 또는 로도박터 캅술라투스 (Rhodobacter capsulatus), 파라코쿠스 (예를 들어, 피. 카로티니파시엔스 (P. carotinifaciens), 피. 제아잔티니파시엔스 (P. zeaxanthinifaciens)), 에스케리치아 또는 슈도모나스;

b) 그람 양성 박테리아의 군으로부터 선택되는 박테리아 세포, 예컨대 바실러스, 코리네박테리움 (Corynebacterium), 브레비박테리움 (Brevibacterium), 아마콜라토피스 (Amycolatopis);

c) 아스퍼질러스, 블라케슬레아 (Blakeslea), 페니실리움 (Peniciliium), 파피아 (Phaffia) (잔토필로마이세스 (Xanthophyllomyces)), 피키아, 사카로마이세스, 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 야로위아 (Yarrowia), 및 한세눌라 (Hansenula)의 군으로부터 선택되는 진균 세포;

d) 유전자이식 식물 세포 또는 유전자이식 식물 세포를 포함하는 배양물로서, 아라비돕시스 (Arabidopsis) spp., 니코티아나 (Nicotiana) spp, 시코룸 인티부스 (Cichorum intybus), 라쿠카 사티바 (lacuca sativa), 멘타 (Mentha) spp, 아르테미시아 안누아 (Artemisia annua), 괴경 형성 식물, 유지 작물, 예를 들어, 브라시카 (Brassica) spp. 또는 브라시카 나푸스 (Brassica napus), 과일을 생산하는 현화 식물 (속씨식물) 예컨대 제한없이 딸기 또는 라스베리 식물 및 나무로부터 선택되는 유전자이식 식물의 세포; 또는

e) 유전자이식 버섯 또는 유전자이식 버섯을 포함하는 배양물로서, 스키조필루 (Schizophyllum), 아가리쿠스 (Agaricus) 및 플레우로티시 (Pleurotisi)로부터 선택되는 것인 미생물.

유기체로부터의 보다 바람직한 변형 유기체는 에스케리치아, 사카로마이세스, 피키아, 로도박터, 슈도모나스 또는 파라코쿠스 속에 속하는 미생물 (예를 들어, 파라코쿠스 카로티니파시엔스, 파라코쿠스 제아잔티니파시엔스)로부터의 변형 유기체 및 보다 더 바람직하게는 이. 콜라이, 에스. 세레비지아에 (S. cerevisae), 로도박터 스파에로이데스, 로도박터 캅술라투스 또는 아미콜라토피스 sp.의 종의 것이다.

특히 바람직한 것은 로도박터 캅술라투스 및 로도박터 스파에로이데스, 또는 에스케리치아 콜라이의 군으로부터 선택되는 로도박터 변형 유기체이다.

본 발명의 추가 양태는 하기의 군으로부터 선택되는 돌연변이형 단백질에 대한 것이다:

i. SEQ ID NO: 2로 표시되는 단백질 또는 이의 상동체의 돌연변이된 변이체로서, 단백질은 오직 선호 순서로 비변형 유기체의 SEQ ID NO: 2의 단백질 또는 이의 상동체와 N-말단으로부터 처음 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48 또는 47 아미노산을 공유함.

ii. SEQ ID NO: 2의 위치 48에 상응하는 위치에 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2로 표시되는 단백질 또는 이의 상동체의 돌연변이된 변이체;

iii. SEQ ID NO: 4로 표시되는 단백질 또는 이의 상동체의 돌연변이된 변이체는 SEQ ID NO: 4의 위치 74에 상응하는 위치에 돌연변이를 가짐;

iv. a) SEQ ID NO: 5의 위치 291에 상응하는 위치에 돌연변이, 및/또는 b) SEQ ID NO: 5의 위치 274 또는 그 이후에 상응하는 위치에 돌연변이를 갖는, SEQ ID NO: 5의 단백질 또는 이의 상동체의 돌연변이된 변이체로서, 돌연변이된 단백질은 SEQ ID NO:5의 단백질 또는 이의 상동체에 비해서 짧음;

v. SEQ ID NO: 6의 위치 96에 상응하는 위치에 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 6의 단백질 또는 이의 상동체의 돌연변이된 변이체로서, 바람직하게 돌연변이는 발린을 글루탐산으로 치환한 돌연변이 및/또는 SEQ ID NO: 6의 위치 67에 상응하는 위치에서, 바람직하게 글리신을 세린으로 치환시킨 돌연변이임.

본 발명의 추가 구현예는 본 발명의 돌연변이형 단백질을 코딩하는 임의 핵산, 본 발명의 돌연변이형 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 카세트, 본 발명의 돌연변이형 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 본 발명의 돌연변이형 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포, 및 본 발명의 돌연변이형 단백질을 포함하는 재조합 비-인간 유기체에 관한 것이다.

바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 변형 유기체 또는 돌연변이형 단백질은 하나 이상의 터펜 화합물 및/또는 하나 이상의 터펜 에스테르의 제조에서 사용된다.

터펜 화합물 및/또는 터펜 에스테르를 제조하기 위한 본 발명의 방법은, 바람직하게 하기 단계를 포함한다: (a) 적절한 조건 하에서 본 발명의 변형 유기체를 배양시키는 단계, 및 (b) 터펜 화합물 및/또는터펜 에스테르를 단계 (a)의 변형 유기체로부터 수득하는 단계.

다른 바람직한 구현예에서, 변형 유기체는 본 발명의 방법을 수행하는데 적합하다.

예를 들어, 변형 유기체는 알콜 아실 트랜스퍼라제의 존재 하에서 모노터펜 알콜을 모노터펜 에스테르로 에스테르화시키는 단계를 포함하는, 모노터펜 에스테르를 제조하기 위한 방법에서 사용될 수 있다. 이를 위해서, 변형 유기체는 바람직하게 바람직한 알콜 아실 트랜스퍼라제를 이종적으로 발현시킨다. 모노터펜 알콜은 리날로올, 제라니올, 알파 터피네올, 감마 터피네올, 라반둘롤, 펜콜, 페릴릴 알콜, 멘톨 또는 베르베놀이고, 모노터펜 에스테르의 생산이 바람직하면, 이들 중 어느 하나 또는 이들의 혼합물이 알콜 아실 트랜스퍼라제의 기질로서 사용되는 것이 바람직하다. 모노터펜 알콜 기질은 바람직하게 유기체가 모노터펜 에스테르의 생산에 적합한 하나 또는 알콜 아실 트랜스퍼라제를 포함할 때, 변형 유기체에 의해 생산될 수 있고/있거나 외생적으로 변형 유기체에 첨가될 수 있다.

본 발명의 추가 양태는 비변형 유기체와 비교하여 변형 유기체의 하나 이상의 터펜 화합물에 대한 내성을 증가시키기 위한 방법으로서, 본 발명의 변형 유기체를 생성시키는 단계 임의로 상기 변형 유기체를 유지시키는 단계를 포함하다.

바람직한 구현예에서, 본 발명은 유기체를 사용하여 하나 이상의 터펜 화합물을 제조하는 방법으로서, 본 발명의 변형 유기체를 생성시키는 단계, 변형 유기체가 성장하고 상기 하나 이상의 터펜 화합물을 생산하기에 적합한 조건 하에서 터펜 화합물의 존재 하에서 상기 변형 유기체를 유지시키는 단계 및 임의로 하나 이상의 터펜 화합물을 상기 변형 유기체로부터 분리하는 단계를 포함한다.

바람직한 구현예에서 본 발명의 방법 및 변형 유기체는 하나 이상의 터펜 화합물의 제조에 관한 것이고, 적어도 하나의 터펜 화합물은 C4 및 C5 알콜이다.

본 발명의 방법, 용도 또는 변형 유기체에 있어서, 터펜 화합물은 2.0 이하, 바람직하게 1.5 이하의 logP 값을 갖고/갖거나, 적어도 1.0 g/ℓ, 바람직하게 1.5 g/ℓ 이상의 표준 조건 하에서 수중 용해도를 갖는다.

본 발명의 바람직한 구현예는 본 발명의 방법, 용도, 돌연변이형 단백질 또는 변형 유기체에 관한 것으로, 이소프레놀, 프레놀, 부탄올, 이소부탄올, 바닐린, 제라니올 및/또는 시트랄 (바람직하게 제라니알 및 네랄 둘 모두), 바람직하게 이소프레놀, 프레놀, 부탄올, 이소부탄올 및/또는 바닐린에 대한 내성이 비변형 유기체와 비교하여 증가된다.

추가 구현예는 본 발명의 방법, 용도 또는 변형 유기체로서, 변형 유기체는 a) SEQ ID NO: 3의 단백질 또는 이의 상동체를 코딩하는 유전자의 전체 또는 일부의 녹아웃 또는 결실, 또는 b) SEQ ID NO: 2의 단백질 또는 이의 상동체를 코딩하는 유전자의 전체 또는 일부의 녹아웃 또는 결실, 또는 c) 터펜 화합물의 존재 하에서 SEQ ID NO: 2의 단백질의 돌연변이형 단백질 또는 이의 상동체의 존재로서, SEQ ID NO: 2의 단백질의 돌연변이형 단백질 또는 이의 상동체는 비변형 유기체의 SEQ ID NO: 2의 단백질 또는 이의 상동체와 N-말단으로부터 오직 처음 50, 49, 48, 및 보다 더 바람직하게 처음 47 아미노산을 공유하는 것인 존재, 또는 a) 내지 c)의 임의 조합을 포함한다.

또 다른 구현예에서, 임의의 본 발명의 방법은 SEQ ID NO: 6의 단백질 또는 이의 상동체를 코딩하는 유전자의 발현의 하향 조절 단계, SEQ ID NO: 6의 단백질 또는 이의 상동체를 코딩하는 유전자의 결실 단계 또는 SEQ ID NO: 6의 단백질 또는 이의 상동체를 코딩하는 유전자의 녹-아웃 단계를 포함한다.

바람직한 구현예에서 본 발명의 비변형 유기체와 비교하여 변형 유기체의 바닐린에 대한 내성을 증가시키기 위한 방법에 관한 것으로서, 변형 유기체에서, SEQ ID NO: 2의 단백질과 선호 순서로 오직 처음 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48 또는 47 아미노산을 공유하는 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 발현하거나 또는 생성시키는 단계를 포함하고, 변형 유기체는 SEQ ID NO: 1 및/또는 2의 단백질 또는 이의 상동체가 부재하거나, 불활성이거나 또는 실질적으로 감소된 것을 추가 특징으로 갖는다.

발명은 또한 터펜의 존재 하에서 변형 유기체의 성장을 증가시키기 위한 하향조절된 SEQ IDNO: 2의 단백질 또는 이의 상동체의 용도를 포괄한다.

돌연변이 또는 하향조절된 SEQ ID NO: 2의 단백질 또는 이의 상동체는 바람직한 일 구현예에서, 프레임시프트, 바람직하게 SEQ ID NO: 2의 단백질과 비교하여 최종 단백질을 단축시키는 프레임시프트를 일으키는 SEQ ID NO: 2의 위치 48에 상응하는 히스티딘 잔기의 돌연변이를 갖는다.

다른 바람직한 구현예에서 SEQ ID NO: 1 내지 9 중 어느 하나의 서열은 각각의 단백질에 대해 표 3에 표시된 바와 같은 돌연변이를 보유하도록 돌연변이된다.

또한, 본 발명은

(i) 터펜 생합성 경로의 이종성 재구성;

(ii) 산업적 생산물, 바람직하게 풍미제 또는 향료, 생물연료, 살충제, 곤충 기피제 또는 항미생물제의 생산;

(iii) 모노터펜 알콜, 바람직하게 3차 모노터펜 알콜로부터 지방족 및/또는 방향족 모노터펜 에스테르의 생산을 위한, 본 발명의 변형 유기체 또는 돌연변이형 단백질의 용도를 포함한다.

본 발명은 또한 (i) 터펜 생합성 경로의 이종성 재구성; (ii) 산업적 생산물, 바람직하게 풍미제 또는 향료, 생물연료, 살충제, 곤충 기피제 또는 항미생물제의 생산; (iii) 모노터펜 알콜, 바람직하게 3차 모노터펜 알콜로부터 지방족 및/또는 방향족 모노터펜 에스테르의 생산; (iv) 발효에서 모노터펜 알콜을 해독하여, 상기 발효에 의한 모노터펜 생산의 증가를 위한, 본 발명의 변형 유기체 또는 돌연변이형 단백질, 본 발명의 핵산, 본 발명의 벡터 또는 유전자 구성체, 본 발명의 숙주 세포, 또는 본 발명의 유전자이식 비-인간 유기체의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한

(i) 터펜 생합성 경로의 이종성 재구성;

(ii) 산업적 생산물, 바람직하게 풍미제 또는 향료, 생물연료, 살충제, 곤충 기피제 또는 항미생물제의 생산;

(iii) 모노터펜 알콜, 바람직하게 3차 모노터펜 알콜로부터 지방족 및/또는 방향족 모노터펜 에스테르의 생산;

(iv) 미생물 예컨대 본 발명의 변형 유기체 및 박테리아 또는 진균 (예를 들어, 효모)의 혼합물 중에서 모노터펜 알콜을 해독하여서, 상기 미생물 혼합물에 의한 모노터펜 생산의 증가를 위한, 본 발명의 변형 유기체 또는 돌연변이형 단백질, 본 발명의 핵산, 본 발명의 벡터 또는 유전자 구성체, 본 발명의 숙주 세포, 또는 본 발명의 유전자이식 비-인간 유기체의 용도에 관한 것이다.

바람직한 3차 모노터펜 알콜은 리날로올 (S-리날로올 및/또는 R-리날로올), 알파 터피네올, 펜콜, 감마 터피네올, p-시멘-8-올, p-멘트-3-엔-1-올, p-멘트-8-엔-1-올, 4-카르보멘톨, 4-투자놀을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 양태는 본 발명의 방법 및 본 발명의 변형 유기체에 따른 모노터펜의 생산 및 이들의 모노터펜 에스테르로의 에스테르화에 의한 모노터펜 에스테르의 제조 방법이다. 이러한 에스테르화는 예를 들어, 본 발명에 따른 모노터펜을 위한 개선된 생산 잠재성의 동일 변형 유기체 내에서, 또는 동일하거나 또는 상이한 세포 또는 추출물로서 또는 단리형으로서 에스테르화 효소를 사용하는 후속 단계에서, 또는 바람직하게 모노터펜의 단리 및 정제 이후 화학적 에스테르화와 동시에 수행될 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 생산된 모노터펜 에스테르는 예를 들어 풍미제 또는 향료, 곤충 기피제, 살충제, 또는 항미생물제로서 사용될 수 있고, 또한 생물연료의 생산에 사용될 수 있거나, 또는 다른 화합물, 예를 들어, 다른 풍미제 또는 향료의 출발 물질로서 사용될 수 있다.

도면 설명

도 1은 하기 물질의 구조식을 도시한다: A - 이소프레놀 (3-메틸-3-부텐-1-올), B - 이소부탄올, C- 프레놀, D- 제라니올 및 E -바닐린

도 2: 성장이 50% 억제되는 이소부탄올 농도 (EC50) (65 mM)에서 단리된 균주의 성장.

도 3: 성장이 50% 억제되는 프레놀 농도 (EC50) (40 mM)에서 단리된 균주의 성장.

도 4: 진화 실험 동안 돌연변이 발생의 개요.

A: 돌연변이의 총 빈도 및 배양 중 돌연변이의 최초 발생 시점.

B: 적응 균주에서 돌연변이의 지속성. 지속성은 진화 시험 동안 발생 시점에 대해 교정된 돌연변이의 빈도이다.

도 5:

A: yghB 프로모터 영역 내 가상 조절 엘리먼트. 위쪽 가닥 및 아래 상보성 서열이 도시된다. 검은색 사각형은 오픈 리딩 프레임 (ORF)의 시작 및 출발 메티오닌 (Met)을 표시한다. 이러한 비번역 영역 (UTR)의 상류가 도시된다. 이 영역에서 -35 영역의 상류에 가능한 조절 모티프, 직접 반복부 -35 영역 하류의 반전 반복부가 예측된다. 검은색 화살표는 체크 무늬 박스로 표시된, 결실 영역 내 모티프, 및 반전 모티프에 대해 표시된다. 전사 인자 결합은 아마도 억제제로서 전사 활성을 억제한다.

B: 가상 결합 모티프의 공통 서열 (van Helden, Andre and Collado-Vides, 1998).

C: A에 도시된 프로모터 부분의 확대도: yghB ORF 상류의 결실 (진회색 막대) 및 보다 상세한 추정 조절 모티프 (회색 화살표)의 주석.

D: 적응 균주에서 yghB의 프로모터 영역 내 서열 변화. 위쪽 가닥은 야생형 서열 (P_yghB wt))을 나타내고, 아래쪽 가닥은 결실을 갖는 서열이다 (P_yghB del.). 체크무늬 박스는 아래에 도시된 것으로 야생형 프로모터 서열을 변화시킨 결실을 나타낸다. 검은색 사각형은 오픈 리딩 프레임 (ORF)의 시작 및 출발 메티오닌 (Met)을 표시한다. 이러한 UTR의 상류가 도시된다.

도 6: 야생형과 비교한 유의한 차등 발현 전사물. 상이한 DE-알고리즘에 대한 모든 3개 생물학적 샘플에서 유의하게 차등 발현된 유전자 (P<0.05). (A) 유의하게 과발현된 전사물 (log2>1.35). (B) 유의하게 하향조절된 전사물 (log2<-2.7).

도 7: 50 mM 이소프레놀에서 돌연변이체 rob H48fs 발현 균주의 상대적 적합도 (μ_strain/μ_wt).

도 8: 50 mM 이소프레놀에서 0 μM IPTG 유도한 돌연변이된 robH48fs 발현 rob 및 marC의 조합 녹-아웃 균주의 상대적 적합도 (μ_strain/μ_wt) .

도 9:

A: 7.5 g/ℓ에서 적응 균주 및 다양한 농도에서 본래 균주의 성장률 및 상이한 부탄올 농도에서 부탄올 독성에 대한 스크린 결과를 도시한다. 약어 Mut T6 A는 상기 본 명세서에 기술된 바와 같이 단리주 A의 T6 세대의 돌연변이형 균주를 정의한다.

B: 5 g/ℓ 부탄올에서 상이한 조작된 균주의 성장률 평가. 이 어세이에서 야생형 성장률은 0.25 1/h였다. yghB 및 rob H48fs는 유도없는 누수성 IPTG-유도성 프로모터로부터 발현되었다.

도 10:

A: 바닐린 내성 평가. 이 콜라이 야생형 균주를 상이한 바닐린 농도에서 성장시켰다. 1 g/ℓ 바닐린에서 또한 적응 균주의 성장률을 시험하였다. Mut T6 A는 상기 본 명세서에 기술된 바와 같은 단리주 A의 T6 세대의 돌연변이형 균주를 정의한다.

B: 1.5 g/ℓ 바닐린으로 상이한 조작된 균주의 성장률의 평가. 이 어세이에서 야생형 성장률은 0.23 1/h이었다. yghB 및 robH는 유도없이 누수성 IPTG-유도성 프로모터로부터 발현되었다.

도 11:

BW25113 균주에서 50 mM 이소프레놀에서 ΔrraA의 상대적 적합도 (μ_strain/μ_wt).

실시예

1. 결과

1.1 적응 균주에서 적응 방식의 조사

이소프레놀에 대한 적응 진화의 종료 시에, 이소프레놀에 대해 증가된 내성을 나타내는 몇몇 균주가 단리되었다. 이소프레놀에 대한 내성은 배플 밀봉 250 mL 플라스크에서 이소프레놀이 존재하는 M9 배지 중 확립된 성장 독성 어세이로 확인하였다. 내성 형질의 작용 방식을 조사하기 위해서, 유사한 성질의 화학물을 시험하였다.

종종 용매-유사 성질을 갖는 화학물이 막 기능을 방해하므로 표준 어세이, 프로피듐 아이오다이드 염색을 사용하여 진화적 적응 균주에서 이소프레놀 스트레스 하에 세포막을 특징규명하였다.

1.1.1 상이한 화학물에 대한 내성

내성 기전의 한계를 평가하기 위해서 3개의 추가적인 화학물에 대한 내성을 시험하였다. 이소프레놀, 프레놀, 분지형 알콜 이소부탄올 및 모노터펜 제라니올의 생물학적 이성질체를 시험하였다.

표 A: 일부 터펜의 특징

대략 65 mM의 최대 억제 절단 농도를 확립한 후에, 시퀀싱에도 역시 사용된 최종 적응 균주에 대한 이소프레놀의 내성을 시험하였다. 모든 균주는 이소부탄올에 대한 증가된 내성을 나타낸다. 내성 기전은 이소프레놀에 제한적이지 않고 이소부탄올도 충분히 내성이다. 적응 균주 중에서, 배양 A로부터 단리된 균주는 최고 내성을 나타낸데 반해서, 배양 C로부터 단리된 균주는 성장률의 더 적은 증가를 나타낸다. 이소부탄올은 이의 물리화학적 성질이 매우 유사한데, 즉 유사한 logP 값 및 수중 용해도를 갖는다.

다음 실험 세트에서, 우리는 야생형 균주의 프레놀 내성을 체계적으로 결정하였고 최대-프레놀 농도의 절반이 40 mM인 것으로 확인되었다. 프레놀 및 이소프레놀 간 구조적 유사성에도 불과하고, 오직 균주 단리주 A만이 프레놀에 대해 증가된 내성을 나타냈다. 단리주 C는 야생형 내성과 상이하지 않았고 균주 단리주 B는 40 mM 프레놀에서 감소된 성장률을 가졌다.

단리된 상이한 균주의 차등 내성은 동일한 이소프레놀-내성 표현형에도 불구하고 상이한 표현형을 암시할 수 있다.

마지막으로, 모노터펜 화합물 제라니올을 시험하였다. 모든 단리된 적응 균주는 제라니올에 대해서 고도로 상승된 감수성을 나타냈다. 이소프레놀 내성을 증가시키는 형질은 제라니올 독성으로부터 보호할 수 없고, 그 기전은 화합물을 더 유독하게 만드는 듯 하다. 적응 균주에서 이소프레놀 분해에 대한 증거를 발견하지 못하였으므로, 제라니올은 이들 균주에 의해 점점 더 분해되어서, 독성 분해 생산물이 축적될 가능성은 없는 듯하다. 오히려 내성 기전은 그 성분들이 제라니올의 독성 효과에 더 감수성이게 하는 방식으로 세포 성분의 구조를 변화시켜야 한다.

1.1.2 적응 균주의 막 투과성

logP가 1에 가까우면 이소프레놀은 막 투과성을 증가시켜서 독성 효과를 발휘할 수 있다 (Heipieper et al., 1994). 이를 시험하기 위해서, 프로피듐 아이오다이드 (PI) 염색을 사용하였다. 프로피듐 아이오다이드 염색은 사멸/생존 염색인데, 사멸 세포는 일반적으로 결함성 세포-막을 갖기 때문이고, 염색은 막을 횡단하여 세포의 DNA에 삽입될 수 있다. 이것은 프로피듐 아이오다이드 염색이 세포-막 손상을 검출하는데 적합하다는 의미이다.

미처리 야생형 세포는 대략 1.4*10³ 의 중간치 PI 매개 형광도를 보이고, 염색 절차의 양성 대조군으로 사용되는 염색 이전에 세포가 살균제 바실롤 AF로 처리되면 중간 형광도는 100배 증가된다. 50 mM 이소프레놀, 즉, 여전히 세포가 성장하는 중간 이소프레놀 농도와 인큐베이션된 이. 콜라이 세포는 생존 및 바실롤 처리 사멸 세포의 강도 사이에 위치하는 대략 1.3*10⁴ 의 중간 PI 강도를 갖는다. 이 개체군이 여전히 활동적으로 성장하므로, 이는 세포-막 무결성이 실제로 이소프레놀에 의해 손상되지만, 성장이 없어질 정도는 아님을 의미한다.

이소프레놀 처리가 더 높은 PI 염색으로 단일방식 이동을 일으킨다는 것은 특히 흥미롭다. 이소프레놀은 원칙적으로 또한 생존 박테리아의 사멸을 증가시킬 수 있고, 이것은 염색에 따라서 '생존' 및 '사멸'로 이소프레놀 처리된 세포의 이중방식 분할을 야기시키게 된다. 이는 이소프레놀이 세포-막을 탈안정화시킨다는 다른 표시이다.

다음으로, 적응 균주가 이소프레놀 처리와 어떻게 반응하는지를 조사하엿다. 단리주 A 내지 C는 야생형 이소프레놀 처리 세포와 비교하여 2.2 내지 3.4*10³ PI 형광 강도의 감소된 중간치를 가졌다. 그러나, PI- 형광은 야생형 미처리 세포와 비교하여 약간 증가된 채로 남았다. 이거은 진화적 적응 세포가 막 스트레스에 대처하고 부분적으로 막 무결성을 복원하여서, PI 염색의 투과성을 감소시키는 기전을 개발하였음을 의미한다.

1.2 표적 균주의 DNA-시퀀싱

관찰된 적응 기전, 즉 이소프레놀, 이소부탄올 및 프레놀에 대한 내성 및 이소프레놀 스트레스 하에서 감소된 막 투과성의 유전적 기반을 풀기 위해서, 몇몇 균주는 적응 진화 실험으로부터 단리하여 시퀀싱되었다.

표 1에 열거된 바와 같이, 균주는 64 내지 80 mM의 이소프레놀 농도 범위에서 32 내지 226 세대수 이후에 단리되었다. 각각의 3개 진화 배양의 저온-배양물을 이소프레놀을 함유하는 LB 한천 상에 스트리킹하였고, 5개의 가장 큰 균주를 이후에 이소프레놀 존재의 M9 중에서 그들 성장을 평가하였으며 가장 바른 배양물을 보존하였고 시퀀싱에 사용하였다. 적응 균주 이외에도, 야생형 배양물 하나를 시퀀싱을 위해 준비하였다.

표 1: 단리된 배양의 세대수 및 이소프레놀 농도

1.2.1 진화 실험에서 확인된 돌연변이

실험에서 확인된 돌연변이는 표 2에 열거된다. 이. 콜라이 MG 1655 야생형 균주는 상이한 변이체로 발생된다 (Freddolino, Amini and Tavazoie, 2012). 우리의 야생형 변애체는 갈락티톨 PTS의 일부인 재구성된 gatC 유전자, 및 기능성 glrR 글리세롤 3-포스페이트 억제제를 갖는다. 또한 반복부 REP321j에 변이가 존재한다.

표 2: 진화 실험에서 단리된 균주에서 발생된 돌연변이

돌연변이 획득의 시간 경과 및 게놈에서 그들 위치에 관한 개요를 제공하기 위해서, 결과는 개략적으로 도 4A에 제공된다. 실험 시작부터, 돌연변이의 수가 꾸준히 증가되지만, 나타났다가 다시 사라지는 돌연변이도 존재한다는 것을 이해할 수 있다. 돌연변이는 특정 유전자좌에 제한되는 것 같지는 않고 게놈 전반에 산재한다.

대부분의 돌연변이는 모든 시퀀싱된 게놈과 비교하여 10% 미만의 비교적 낮은 빈도로 존재한다 (도 4). 더 높은 빈도로 존재하는 4개 돌연변이가 존재한다. 이것은 각 돌연변이의 '지속성', 즉 진화 실험에서 남은 시점의 수에 대해 정규화된 빈도를 계산하면 분명해진다. 이것은 돌연변이가 시작 시에 발생되어 모든 배양물에 남으면, 지속성이 100%가 된다는 것을 의미한다. 돌연변이가 실험의 중간에서 발생되어서, 상실되지 않으면, 총 빈도는 50%이지만 지속성은 100%일 것이다. 결론적으로, 야생형에서 확인된 변이는 100%의 지속성을 갖지만, 그들 유전자는 분석에서 배제될 수 있다. 높은 지속성을 갖는 4개 돌연변이는 fabF F74C, marC M35stop, P _yghb Δ-35 및 rob H48프레임시프트이다.

1.2.2 fabF F74C 및 marC

고도로 지속되는 돌연변이 fabF F74C는 1-부탄올에 대한 이전의 돌연변이 실험에서 이미 설명되었다 (Haeyoung and Jihee, 2010). FabF는 β-케토아실-ACP 신타제 II를 코딩하고 지방산 생합성의 일부이다. 이 돌연변이는 야생형 FabF 활성과 비교하여 시스-바센산의 농도를 증가시킨다.

marC의 파괴된 형태는 이소부탄올에 대한 이. 콜라이 EcNR1의 적응 진화 실험에서 이전에 확인되었다 (Minty et al., 2011). marC는 보존된 막 단백질로서, 이 단백질의 결실은 이소부탄올 내성 표현형을 야기하였다. 우리의 진화 실험에서 존재하는 marC 유전자 내 가장 빈번한 돌연변이는 M35 이후에 중지 코돈의 도입으로서, 이것은 천연 단백질의 오직 대략 15%를 남긴다. 이러한 돌연변이는 marC 유전자의 기능을 없애는 듯 하지만, 절두형은 여전히 내성-이득을 가질 수 있다.

1.2.3 rob

다음의 고도로 중요한 표적은 rob 유전자 내 돌연변이이다. rob 유전자는 항상적으로 발현되는 조절인자이고 이의 레귤론은 marA/soxS 조절인자를 공유한다 (Rosenberg et al., 2003; Griffith et al., 2009). 레귤론은 항생제 내성, 수퍼옥시드 내성 및 유기 용매에 대한 내성에 관여한다 (Aono, 1998). rob의 과발현은 시클로헥산 및 n-헥산에 대해 내성을 부여하고, 결실은 이들 화합물에 감수성이게 만든다 (White et al., 1997). 우리의 시퀀싱 결과에서 2개 돌연변이는 G273 및 Y103 이후에 조기 중지 코돈을 도입하고, 가장 우세한 돌연변이는 H48 이후에 프레임시프트를 도입한다. H48 프레임시프트 돌연변이는 이의 헬릭스-턴-헬릭스 도메인 (Source: https://www.rcsb.org/pdb/단백질/P0ACI0), 즉, 단백질이 이의 DNA-결합 부위와 상호작용하는 부분에서 단백질을 파괴하여서, 아마도 불활성이게 만든다.

1.2.4 P _yghb Δ -35

높은 빈도의 마지막 돌연변이는 metC 및 yghB 사이의 유전자간 영역 내 돌연변이이다. metC 는 메티오닌 생합성 경로에 속하고, yghB 는 온도 및 항생제 내성에 관여하는 경막 단백질이다 (Kumar and Doerrler, 2014). yghB 는 이. 콜라이에서 DedA-단백질 패밀리에 속하고, yghB 및 yqjA (역시 DedA-패밀리에 속함)의 이중 결실은 온도 민감성을 야기하지만 mdfA , Na⁺-K⁺/H⁺ 안티포터의 과발현에 의해 복원될 수 있다.

지금까지 알려진 yghB 의 조절인자는 없지만, 컴퓨터 증거는 σ⁷⁰ 하우스키핑 시그마 인자에 의해 조절된다는 것을 시사한다. 돌연변이의 서열 분석은 야생형에서 -35 위치의 상류 부분이 결실로 인해 상실된다는 것을 밝혀준다. 이것은 억제성 프로모터에 대한 결합-부위를 결실시켜서 yghB 유전자의 발현을 탈조절시키고 아마도 yghB-mRNA 농도를 증가시키는 듯 하다. 도 5C를 참조한다.

1.2.5 유전자형-상관성

모든 다른 돌연변이는 실험에서 훨씬 낮은 지속성을 갖지만, 일부 표적 유전자, 예를 들어 plsX 유전자는 더 높은 빈도를 갖는 것으로 보인다. 돌연변이가 상이한 샘플 중 동일 유전자에서 발생되면, 그들은 동일한 표현형적 효과를 가질 수 있으므로 유전자 기능성에 동일한 효과를 갖는것으로 추정할 수 있다. 유전자 표현형에 대한 유전자-세트 및 유전자-표적이 어떻게 상관있는가를 확인하기 위해서, 상이한 표적-유전자 돌연변이를 구별하지 않고 오직 표적-유전자만을 고려하는 데이터세트를 단순화시켰고 주요 성분 분석을 수행하였다.

주요 성분 분석 (PCA-분석)을 수행하였다. 제1 및 가장 중요한 로딩 벡터에 대한 최고 영향은 이미 확인된 표적 fabF, rob, P _yghb 및 marC 이다. 제2 성분은 plsX, rraA 및 gltA 로 이루어진 유전자형을 한정한다. 예상한 바와 같이, 실험의 종료 (T7)시에 표현형은 제1 성분에 의해 우세하다.

1.2.6 PCA-성분 2 유전자형

흥미롭게도, 제2 유전자형 성분은 T4 및 T5의 배양 A에서 강력하게 존재한다. 이러한 표현형은 인지질 생합성 경로, 리보뉴클레아제 억제제 rraA 및 시트레이트 신타제 gltA 의 일부인, plsX 유전자 내 돌연변이로 이루어진다. plsX 유전자의 돌연변이는 세포의 지방산 조성을 변경시키는 fabF 돌연변이와 유사한 적응일 수 있다. plsX 는 정규 인지질-경로에 속하지 않지만 에스. 아우레우스에 존재하는 대체 경로에 상동성을 갖는다 (Yao and Rock, 2013). 대체 및 정규 경로가 상이한 지방산에 대해 상이한 선호도를 갖는다고 가정하면, 이러한 돌연변이는 세포막의 지방산 조성을 변화시킬 수 있다.

유전자형에서 나머지 2개 돌연변이는 에너지 물질대사 및 단백질 합성같은, 세포에 대한 이소프레놀의 보다 다면적인 효과와 상관있을 수 있다. gltA 내 돌연변이는 NADH의 억제 효과에 대한 시트레이트 신타제의 알로스테릭 반응에 영향을 미쳐서 (Duckworth et al., 2013), TCA-사이클을 탈조절시키고 에너지 물질대사에 영향을 미칠 수 있다. 또한 리보뉴클레아제 E 억제제 rraA 내 2개의 독립적인 돌연변이가 나타난다. 이 유전자의 기능 상실은 tRNA 및 rRNA 프로세싱에 영향을 미치지만, 또한 mRNA를 더 불안정하게 만들 수 있다. 실제로, V96E는 다소 보존된 잔기인 것으로 보인다 (Monzingo et al., 2003).

1.2.7 다른 돌연변이

제3 성분 trkH 및 iscR 내 2개의 우세한 돌연변이는 이소프레놀에 의한 막 스트레스로 인한 이온의 상실에 대한 반응일 수 있다 (Heipieper et al., 1994). iscR 은 철-황-클러스터 조절인자이고, 이 돌연변이는 철-황 클러스터 생물생성을 차등적으로 조절할 수 있다. 증가된 포타슘 유입은 용매 스트레스에 대한 슈도모나스 푸티다 P8의 기지 적응이고 (Heipieper et al., 1994), 유사한 기전이 포타슘 이온 수송체 내 돌연변이에서 역할을 하는 듯 하다 (Cao et al., 2011).

지방산 물질대사 유전자 내 돌연변이에 첨가하여, fabF 및 plsX 에서 인지질 생합성에 필요한 plsB 유전자에서 1회 발견되는 하나의 추가 돌연변이가 존재한다. yfgO 에도, marC 및 yghB 이외에, 돌연변이의 다른 막 단백질 표적이 존재한다.

흥미롭게도, 마지막 3개 균주-단리주 중 2개 (T7 B 및 C)는 포름알데히드 물질대사를 조절하는 frmR 억제인자 내 독립 돌연변이를 나타낸다. 포름알데히드 감수성을 이전 보고서에서 시험하였고, 높은 잔류 및 낮은 잔류 포름알데히드 함량을 갖는 이소프레놀 간에 차이가 존재하지 않지만, 이것은 포름알데히드의 축적이 결정정인, 장기간 적응에 해당하는 듯하다. 흥미롭게도, frmR 유전자 내 돌연변이를 갖는 균주는 프레놀에 더 높은 감수성을 갖는다.

1.3 이소프레놀 스트레스 반응의 RNA-시퀀싱 기반 분석

적응 균주가 이소프레놀 스트레스에 어떻게 반응하는 가는 그들 유전자형에 의해 결정되지만, 균주의 생리적 변화 및 조절 반응의 조합으로 인해 유전자형으로부터의 직접적인 분명하지 않은 2차 효과를 일으킬 수 있다. 이들 2차 효과는 궁극적으로 균주-조작을 위한 사소하지 않은 표적이다. 그를 확인하기 위해서 3개의 최종 적응 균주의 RNA-시퀀싱을 사용하고 이소프레놀-스트레스에 대응하여 야생형에 대해 적응 균주의 전사체를 비교하였다.

이러한 분석에서 차등 발현(DE)의 확인을 위한, 3개 표준 알고리즘, cuffdiff, edgeR 및 DESeq2가 사용되었다. 알고리즘은 4가지 주요한 점이 상이한데, 첫째로 미가공 판독 데이타는 일반적으로 교정이 필요하고; 이러한 교정은 복제물에서 가변적인 시퀀싱 깊이에 주로 기인한다. 두번째는 계측을 위한 기본 통계 모델인데, cuffdiff의 경우에 베타 음의 이항이 가정되는 반면, edgeR 및 DESeq2는 음의 이항 분포를 가정한다. 다음으로 알고리즘은 분포의 매개변수를 추정하는 방법이 상이하다. 각각의 분산의 매개변수는 데이터-지점으로부터 직접적으로 추정할 수 없는데, 이것은 일반적으로 희소 (예를 들어, 샘플 당 3개 생물학적 복제물)하기 때문이지만, 전체 데이터로부터 추론해야만 한다. 마지막으로, 상이한 유의성 검정을 이용하여 DE를 확인할 수 있다.

1.3.1 야생형과 비교한 적응 균주의 차등 발현

3개의 적응 균주의 유전자형이 매우 유사하므로, 우리는 가장 심오한 전사체 변화가 모든 3개 균주에서 발생되어야 한다고 판단하였다.

모든 3개의 사용된 알고리즘에서 상위 10개의 상향 및 하향 조절된 유전자가 (도 6)에 도시된다.

전사체 데이터의 속성 덕분에, 하향 조절은 확인하기 더 어려운데, 이것이 또한 정렬의 품질 및 높은 커버리지에 의존하기 때문이다. 상향 조절된 유전자 세트에서, 우리는 yghB-전사물의 강력한 과발현을 관찰하였다. 이것은 적응 균주의 게놈 데이터와 충분히 상응하는데, yghB 프로모터가 -35 영역 내 결실로 인해 하향조절되기 때문이다. 우리는 이제 결실 metC 의 상류 유전자에서 유의한 변화를 확인하였다.

상향 조절로부터의 다른 표적은 ala-ala 펩티드 엑스포터 alaE, 외막 포린 ompF, 발린 생합성 유전자 ilvG, ilvM 및 UV 및 X-선 내성에 관여하는 yahO 유전자이다. 다른 고도로 발현되는 유전자는 3개 알로기즘 중 하나에서만 유의하고 따라서 타당한 표적으로 간주되지 않는다.

1.3.2 지질 생합성 및 rob-레귤론의 차등 반응

실험에서의 많은 돌연변이가 지방산 생합성에서 표적이므로 차등 조절이 상응하는 경로에 존재하는지 궁금하였다.

야생형과 비교하여 전체 지방산 합성 유전자가 상향조절되는데, 가장 우세하게 fabH, fabB 및 clsB 이다. 흥미롭게도, 인지질-합성에서 핵심 단계를 촉매하는 psd 만이 하향조절된다. 그러나, 오직 psd 경우에 이러한 하향 조절은 모든 배양 및 모든 알고리즘에서 유의하고, fabB 상향조절은 오직 edgeR 알고리즘에서만 유의한다.

시퀀싱 데이터는 4개의 가장 중요한 돌연변이 표적 중 하나로서 rob-조절인자를 확인하였다. 유전자 데이터 단독으로부터, 돌연변이의 정확한 효과가 무엇인지 불분명하여, 우리는 돌연변이가 유해한 효과를 가진다고 가정하고, rob 가 활성인자로서 작용하므로, 이것은 rob-레귤론에서 유전자의 발현을 감소시킨다.

결과는 acnA, aldA 및 fumC 를 제외하고 모든 rob-레귤론에 속하는 모든 유전자 (ecocyc.org에 의해 명명)가 야생형과 비교하여 하향 조절된다는 것을 보여주었다. 이는 관찰된 rob-돌연변이가 유해한 효과를 갖고 활성인자의 결실이 레귤론-유전자의 후속 하향조절을 초래한다는, 가정을 뒷받침한다. rob-레귤론이 Sox 및 Mar 레귤론과 중복되므로, 상향조절이 나타나는 유전자는 다른 조절인자의 보다 강력한 제어 하에 있는 듯 하다. 가장 강한 하향 조절은 AcrAB-TolC 다수약물 유입 펌프 소형 단백질 acrZ 및 inaA, 산유도성 단백질의 일부에서 일어난다.

1.3.3 적응 균주 간 차등 발현

마지막으로, 우리는 그들 전사체에서 서로 간에 다른 상이한 돌연변이체가 어떻게 이소프레놀 스트레스에 반응하는가에 대해 궁금하였다. 한번에 모든 3개 데이터세트에서 차이점을 발견하기 위한 포괄적인 방법으로서, 우리는 야생형과 비교하는 각각의 단리된 균주의 차등적 발현 데이터의 PCA-분석을 수행하였다. 이러한 분석은 모든 3개 알고리즘에서 일관되게 3개 돌연변이체 균주에서 frmRAB 의 차등적 발현이 있다는 것을 보여준다. 상기 표시된 바와 같이, 오직 돌연변이체 균주 7B 및 7C는 증가된 프레놀 민감성과 상관있는 frmR 조절인자 내 돌연변이를 갖는다. 예로서, 3개 단리 균조에서 차등적 발현 경우에, edgeR 알고리즘에 의해 계산되는 균주간 차등 발현을 조사하였다. 실제로, frmRAB 의 발현은 균주 B 및 C 간에 상이하지 않지만, 균주 A와 비교하여 frmRAB 는 균주 B 및 C에서 상향조절된다. 이러한 데이터는 frmR 내 양쪽 돌연변이는 동일한 효과, 즉 frmRAB 오페론의 하향조절을 가져서, 야생형 및 균주 A와 비교하여 항상적 발현 또는 상향조절을 일으킨다는 것을 시사한다.

1.4 돌연변이의 재구성

1.4.1 게이오 녹-아웃 균주

우리는 쉽게 입수가능한 게이오 컬렉션으로부터 가장 유망한 유전자-표적의 녹-아웃 균주를 시험하여 최종 표현형에서 발견된 돌연변이의 조사를 시작하였다. 게이오 컬렉션은 게이오 컬렉션으로부터 유래되는 균주를 사용할 때 내성 시험에 대한 기준으로서 이후 사용되는 BW25113 배경에서 구현된다. MG1655와 비교하여 BW25113 균주는 아라비노스 및 람노스에 대한 영양요구성이다. 포도당이 우리의 성장 어세이에서 단독 탄소 공급원이므로, 이것은 내성 생리학에 영향을 미쳐서는 안된다.

야생형 BW25113은 MG1655에 비해서 이소프레놀 스트레스 하에서 약간 더 높은 성장률을 갖는 것으로 보이지만, 이러한 차이는 유의하지 않다. 조절인자 rob의 녹-아웃은 성장률을 약간 증가시키지만, 이러한 차이는 유의하지 않다. marC가 결실된 게이오 균주는 성장률을 유의하게 증가시킨다. 이는 이소부탄올 스트레스에 대한 이전 연구에서 수득된 결과와 일치된다 (Minty et al., 2011). yghB 유전자의 상류에서 발견되는 돌연변이는 유전자 발현을 증가시키고, 반대로 유전자의 결실은 내성에 음성적인 효과를 가져야 한다고 가정하였다. 실제로, 우리는 게이오 컬렉션의 yghB 결실 균주에서 이소프레놀 스트레스 하에 감소된 성장률을 관찰하였다.

1.4.2 yghB 재구성

yghB 의 발현을 증가시켜서 터펜에 대한 내성을 증가시키기 위해, yghB 에 대한 발현 벡터를 깁슨 클로닝으로 구축하였다. 플라스미드는 pUC 유래 기원을 갖고, 즉 고카피 플라스미드이다 (Hoschek, Buhler and Schmid, 2017). 발현은 고발현 trp 프로모터 및 lacUV5 프로모터로부터 유래되고 lacI 발현을 위한 하나의 lac1O 오퍼레이터를 함유하는 P _trc1O 프로모터에 의해 조절된다 (Brosius, Erfle and Storella, 1985). 전사를 제어하기 위해서, 플라스미드는 한 카피의 lacI 억제인자를 보유한다. 발현 플라스미드는 콜로니-PCR 및 시퀀싱으로 검증하였다. 숙주에서, 암피실린 또는 클로람페니콜 내성을 통해 선택하였고, 플라스미드는 yghB의 발현에 사용되는 IPTG 유도성 Ptrc1O 프로모터를 함유한다.

야생형 배경에서 yghB 과발현

이전 보고서에서 기술된 바와 같이, yghB mRNA 수준은 대략 14배 상향조절되고, 그러므로 우리는 MG1655 야생형에서 과발현 플라스미드로부터 yghB 의 추가 발현이yghB 의 돌연변이체-유사 발현 수준을 산출하고 내성 표현형을 복원한다고 가정하였다. 100 μM IPTG에 의한 완전 유도는 빈-벡터 대조군 균주와 비교하여 성장을 감소시키는 것으로 확인되었다. 유도가 없거나 또는 10 μM IPTG의 낮은 유도에서 yghB 과발현 균주는 적합도의 작지만 유의하지 않은 증가를 보인다.

1.4.2.1 marC 녹-아웃 배경에서 yghB 과발현

야생형 배경에서 yghB의 강력한 과발현은 긍정적인 적합도 이득을 갖지 않는다. 진화 실험의 돌연변이체 균주에서 yghB 돌연변이는 단독이 아니라 다른 돌연변이와 함께 발생된다. 단일 돌연변이가 부정적인 적합도 효과를 가지고 오직 다른 돌연변이만이 긍정적인 적합도 효과를 가지므로 (Minty et al., 2011) 이제까지 가장 강력한 적합도 효과를 갖는 돌연변이, 즉 marC 녹-아웃의 상황에서 yghB 과발현을 시험하고 싶었다. 이러한 목적을 위해서 우리는 게이오 컬렉션의 ΔmarC 균주에서 yghB 발현 플라스미드를 도입시켰다. marC 녹-아웃이 유의한 적합도 증가를 나타내지만, yghB 유도의 적합도 효과에 영향을 미치지는 않는다. 10 μM IPTG에 의한 최소 유도는 ΔmarC 균주와 비교하여 약간 적합도를 감소시키고, 100 μM IPTG에 의한 강한 유도는 야생형 균주 미만까지 marC-녹 아웃의 적합도를 감소시킨다. 지금까지 우리의 데이터는 yghB 과발현이 적합도에 오직 부정적인 효과만을 갖는다는 것을 의미한다. 우리는 우리의 발현 플라스미드가 기능성 YghB를 생산하고 yghB 녹-아웃 균주를 보완할 수 있는지 궁금하였다.

1.4.2.2 yghB 녹-아웃 배경에서 yghB 과발현

마지막으로, yghB 과발현 플라스미드는 게이오 컬렉션의 ΔyghB 균주로 형질전환되었다. yghB 의 녹-아웃은 적합도를 약 30% 감소시킨다. yghB 과발현 플라스미드로 보완된 녹-아웃 균주는 이소프레놀 스트레스에 다양한 반응을 보인다. 유도없이 보완된 균주의 적합도가 야생형 적합도를 약간 초과하지만, 이러한 적합도 증가는 유의하지 않다. 3 내지 10 μM IPTG에서 발현의 약한 유도는 기준 균주와 유사한 이소프레놀 내성을 초래한다. 이전 실험과 유사하게 50 μM의 강한 유도가 역시 내성을 감소시키다. yghB 플라스미드는 yghB 결핍 균주를 보완할 수 있지만, 오직 협소한 유도 용법에서만이다.

yghB 이상조절의 가정 근거

CRISPR gRNA 구성체의 계획 동안 우리는 -35 영역의 항류 프로모터 내 결실 부분이 -35 영역과 중복되는 직접적으로 반복 (1 bp 교환)되고 -35 영역 하류 반대 가닥 상에서 완벽하게 반복되는 서열 모티프를 함유한다는 것을 관찰하였다 (도 5A). MEME Suite의 TOMTOM 도구 (Gupta et al., 2007)를 사용하여, 우리는 유사한 결합 모티프를 갖는 유사한 조절인자로서 지방산 분해 조절인자 FadR 및 cAMP 수용체 단백질 CRP를 동정하였고, 원핵생물 모티프 중에서 일반적으로 바실러스 서브틸리스 NatR 조절인자는 가장 유사한 결합 모티프를 갖는다.

1.4.3 돌연변이체 단백질로 녹-아웃 보완

우리는 marC 및 rob 유전자에서 발견한 돌연변이가 아마도 기능 상실을 초래한다고 초기에 가정하였지만, 돌연변이형 단백질이 그들 기능의 일부를 보유하는지 여부 또는 상이한 기능성을 갖는지 여부 및 그리하여 이소프레놀 내성에 대해 긍정적 효과를 갖는지 여부는 불분명하다. 이를 시험하기 위해서 우리는 녹-아웃 배경에서 상응하는 돌연변이체 단백질을 발현시켰다.

1.4.3.1 marC

marC 유전자의 가장 빈번한 돌연변이는 위치 35에서 메티오닌 이후 중지 코돈 (M35stop)을 도입하여서 제1 경막 도메인 이후에 다백질을 유의하게 절두한다. 위치 35에 메티오닌 이후 중지를 갖는 marC의 형태의 발현을 위한 플라스미드가 표준 방법을 사용해 구축되었다. 플라스미드는 pUC 배경을 기반으로 하고, 암피실린 또는 클로람페니콜 내성을 통해 선택될 수 있고 marC M35stop의 발현을 위해 사용되는 IPTG 유도성 Ptrc10 프로모터를 함유한다.

상기 기술된 바와 같이 marC 녹-아웃 단독은 이소프레놀에 대한 증가된 내성을 갖는다. IPTG-유도성 marC M35stop 단백질 로 녹-아웃의 보완은 이소프레놀에 대한 내성을 더 증가시키지 않는다.

1.4.3.2 rob

전사 조절인자 rob는 위치 48에 히스티딘에서 프레임시프트에 의해 돌연변이된다. 이러한 결과로 107 아미노산 길이의 절두 단백질이 생성된다. 단백질 결합 HTH-모티프는 온전할 수 있지만, 단백질의 나머지는 본래 단백질과 유사성을 거의 공유하지 않는다. 이러한 프레임시프트 형태가 녹-아웃 배경에서 과발현될 때 임의 효과를 가질 수 있는가를 시험하기 위해서, robH48fs의 과발현을 위한 플라스미드를 표준 방법을 사용해 구축하였다. 플라스미드는 pUC 배경을 기반으로 하고, 암피실린 또는 클로람페니콜 내성을 통해 선택될 수 있고, rob H48fs의 발현을 위해 사용되는 IPTG 유도성 Ptrc1O 프로모터를 함유한다.

rob-유전자의 녹-아웃은 이소프레놀에 대해 내성의 미미한 증가를 일으킨다. 8은 rob H48fs를 함유하는 플라스미드의 도입이 내성을 더 증가시킨다는 것을 보여준다. 이러한 효과는 아마도 단백질 발현의 추가적인 물질대사 부담으로 인해서, 단백질이 강력하게 유도되면 다시 상실된다. 돌연변이체 Rob-단백질은 온전한 HTH-모티프로 인해서 이의 DNA-결합 능력을 보유할 수 있지만, 조절 기능은 아마도 C-말단 상호작용 도메인이 누락되므로 변경될 수 있다.

1.4.4 이중-녹-아웃의 내성 시험

하나의 재구성 돌연변이를 갖는 이. 콜라이 균주의 시험 이후에, 우리는 다수 유전자 돌연변이의 가능한 상위성 효과를 조사하고 싶었다. 이를 위해서, rob-녹 아웃에서 카나마이신 내성 카세트는 FLP 재조합을 통해 대체시켰다. 이거은 카나마이신 내성 카세트로 추가 녹-아웃의 도입을 촉진한다.

우리는 marC와 rob의 이중 녹-아웃의 조합 효과를 시험하였다. 양쪽 녹-아웃의 조합은 이소프레놀에 대한 증가된 내성을 갖는 균주를 생성시켰지만, 야생형 균주와 비교하여 적합도 증가는 marC의 단일 녹-아웃에 비해 낮았다. 또한 rob 단독 녹-아웃은 실제 돌연변이를 재구성하지 않는 것이 가능하고, 상기 도시된 바와 같이, 돌연변이된 Rob H48fs 단백질은 조절을 변경시키서 이소프레놀 내성에 유리하게 된다. 이를 시험하기 위해서, 우리는 rob 및 marC 의 이중 녹-아웃으로 돌연변이형 Rob H48fs 단백질을 발현하는 플라스미드를 도입시켰다. 실제로, 돌연변이체 단백질을 발현하는 플라스미드를 사용해, 내성이 marC 녹-아웃 단독과 비교하여 약간 증가된다.

1.5 본 발명의 숙주 세포 및 방법에서 내성의 증가의 광범위 적용가능성

1.5.1 부탄올

미생물에 대한 독성 효과의 다른 물질로서, 부탄올이 알려져 있다. 본 발명의 숙주 세포 및 방법의 광범위 적용가능성을 입증하여, 모든 4개 주요 돌연변이를 나타내는 돌연변이체 균주는 7.5 g/ℓ 부탄올에서 증가된 내성을 보였다 (최대 농도 절반에 대한 문헌 값) (도 9A).

우리의 실험 상황에서 실험 EC₅₀ 이 5 g/ℓ에 가깝다는 것을 알아서, 우리는 이후에 이 농도에서 가장 관련있는 돌연변이를 시험하였다 (도 9B). 이소프레놀 내성과 유사하게, 우리는 yghB 의 녹-아웃이 부탄올에 대한 내성을 감소시킨다는 것을 발견하였다. 누수성 발현 조건 (0 μM IPTG) 하에서 yghB 를 발현하는 yghB 발현 플라스미드로 yghB 녹아웃의 보완은 상대적 적합도를 약 11% 증가시킨다. 이소프레놀 내성으로부터 예상한 바와 같이, marC 의 녹-아웃은 부탄올에 대한 내성을 32% 증가시키고, 흥미롭게도, 또한 rob 녹-아웃은 내성을 약 25% 상승시킨다. 내성은 Δrob 배경에서 rob H48프레임시프트의 누수 발현에 의해 34% 까지 더 증가시킨다. 성장률이 41% 증가된 부탄올에 대한 최고 내성은 rob H48fs 발현으로 보완된 rob 및 marC 의 이중 녹아웃에서 관찰될 수 있다.

1.5.2 바닐린

바닐린은 많은 미생물에 대해 부정적 효과를 갖는 터펜과 일부 유사한 상업적으로 흥미로운 물질이다. 이 생산물에 대한 내성의 잠재적 적용성을 시험하기 위해서, 우리는 바닐린으로 야생형 이. 콜라이 MG1655의 성장률을 체계적으로 평가하였다 (도 10A). 시험된 농도 계획에서 우리는 완전한 성장 억제를 확인하지 못하였고 야생형 성장률의 1/3 까지 감소만을 확인하였다. 1 g/ℓ의 중간 바닐린 농도에서 이소프레놀 적응 돌연변이체 균주 (단리주 A, 제6 세대 MutT6A)는 유의하게 증가된 성장률을 보인다.

바닐린 경우 최대 성장 억제의 절반은 1 내지 1.5 g/ℓ에서 획득되었다. 비교 이유로 우리는 1.5 g/ℓ의 바닐린 농도에서 유의한 돌연변이를 시험하였다 (도 10B 참조). 다른 시험된 화학물과 대조적으로 yghB 녹-아웃은 바닐린 내성에 대해 긍정적인 효과를 가지고 성장률을 18% 증가시킨다. 추가적인 yghB 발현으로 이 균주의 보완은 추가 3% 더 빠른 성장의 미미한 효과만을 갖는다. 예상치않게 marC 의 녹-아웃은 바닐린 스트레스 하에서 유의한 긍정적인 효과를 갖지 않는다. 유사하게, rob 녹-아웃은 8%의 오직 미미한 증가만을 초래한다. 그러나, rob 녹-아웃이 돌연변이체 형태 rob H48fs 로 보완되면, 야생형과 비교하여 내성이 36% 까지 증가된다. 이 균주에 marC 녹-아웃의 첨가는 내성을 다시 28% 증가된 성장률까지 감소시킨다.

1.6 RNA-Seq 실험으로부터 표적의 스크리닝

적응 균주에 대한 이소프레놀 스트레스의 RNA-Seq 분석은 야생형과 비교하여 적응 균주에서 유의한 상향 및 하향 조절된 표적 유전자의 목록을 밝혀주었다. 하향 조절 표현형은 주로 녹-아웃 균주에 의해 모방될 수 있다. 이를 위해서, 우리는 그들 이소프레놀 내성에 대한 게이오-녹 아웃 라이브러리의 균주를 시험하였다.

5개 표적 유전자 glgS, rraA, menA, cspL 및 flu 중에서, 오직 rraA 녹-아웃만이 야생형과 비교하여 50 mM 이소프레놀에서 유의하게 증가된 성장률을 나타냈다.

2 논의

2.1 적응 진화 실험에서 발견된 돌연변이

우리는 질환 과정 동안 발생된 22개 돌연변이 세트를 초기에 확인하였다. 22 중에서, 4개 표적 유전자 및 돌연변이가 고도로 안정하였고 진화 실험에서 발생 시점으로부터 지속적이었다. 문헌 연구는rob 및 yghB 의 돌연변이가 이전에 용매 또는 알콜 내성에 연루되지 않았다는 것을 밝혀주었다. fabF 돌연변이는 이전에 부탄올 내성을 확인하였다 (Jeong et al., 2012).

marC 결실 돌연변이체는 이소부탄올 내성의 상황에서 연구되었지만 (Minty et al., 2011), 절두된 단백질 예컨대 MarC M35stop은 추가의 내성 효과를 갖는지 여부는 불분명하였다. 우리의 실험은 돌연변이된 MarC M35stop의 발현이 이소프레놀에 대한 추가 내성을 야기시키지 않는다는 것을 밝혀주었다. 그러므로, 아마도 marC 돌연변이는 유전자 결실로서 작용하고 우리의 진화 실험은 신규한 내성 기전을 밝히지는 못하였다.

우리는 또한 rraA 유전자에 돌연변이를 함유한 3개 균주를 단리하였고, RNA-Seq 데이터가 적응 균주에서 rraA 유전자의 강력한 하향 조절을 보였으므로, 이들 돌연변이가 또한 단백질 기능에 대해 유해한 효과를 갖는 것이 가능하다. 시험은 실제로 rraA 녹-아웃 균주가 증가된 이소프레놀 내성을 갖는다는 것을 밝혀주었다.

다른 구현예에서 단리된 균주 중 4개에서 나타난 신규한 plsX 돌연변이체는 본 발명의 방법 및 숙주 세포에서 상기 독성 물질 예컨대 터펜에 대한 내성을 증가시키는데 유용하다. 상이한 plsX 돌연변이체, PlsX E216G는 이소부탄올 내성 진화에서 발견되었지만 (Minty et al., 2011), 이의 기전 및 효과는 불분명하다.

표 3: 게놈-시퀀싱으로 확인된 주요 표적. 실험의 상세한 돌연변이 및 이의 빈도는 괄호에 제공된다. 세포 수준에 대한 돌연변이의 효과가 제공되고, 굵은체로 열거된 것들은 본 발명의 놀라운 발견을 표시한다.

2.2 yghB 프로모터 돌연변이

게놈 분석은 -35 영역에 근접하여, yghB 유전자의 상류에서, 15 bp가 모든 최종 균주 단리주에서 결실된 것으로 밝혀졌다. RNA-Seq에 의한 추가 조사는 모든 적응 균주에서 yghB 유전자의 발현이 야생형과 비교하여 14배 유의하게 상향조절된다는 것을 보여주었다. yghB 프로모터 서열의 정밀 조사는 2개 반복 서열 모티프에 의해 측접될 수 있다는 것을 확인하였다. 흥미롭게, 모티프의 상류 반복부는 돌연변이체 균주에서 결실된다. 이러한 모티프의 아키텍처는 가능한 DNA-결합 인자의 억제 효과를 시사한다. 추정 조절인자 결합 부위의 결실은 프로모터의 탈조절을 초래할 수 있어서 yghB 의 증가된 평균 발현을 초래할 수 있었다. 모티프가 문헌에 기술되지 않았으므로 추정 억제인자의 역할은 불분명한 채로 남아있다.

yghB 발현이 야생형에서 이소프레놀 스트레스 하에 억제되고 이 억제는 돌연변이체에서 완화되는 경우일 수 있다. 그러나, yghB 는 야생형에서 고도로 발현되고, 중간치 발현 값에 비해 대략 6배 더 높다. 다른 가정은 yghB 발현이 오직 이종적으로 억제되고 하위개체군의 이러한 이종성 억제는 프로모터 결실 돌연변이에 의해 완화된다는 것일 수 있다. 이러한 경우에서, 이소프레놀 스트레스 하에서 형광 현미경으로 yghB 프로모터 활성을 연구하는 것을 나타낸다.

이러한 돌연변이를 재구성하기 위한 초기 접근법은 과발현 플라스미드를 구축하는 것이다. 그러나, 야생형 배경에서 yghB 의 발현 및 강력한 유도만이 감소된 성장률을 초래하였다. yghB 가 유도없이, 즉 플라스미드의 누수성 발현에 의존하여, 발현되면, ΔyghB 배경에서 내성은 개선될 수 있다. 이것은 yghB 가 내성에 대한 비-선형 제한적 효과를 갖는다는 것을 시사하고, 즉, yghB 발현은 미세 조율된 발현 용법에서만 유리하고, 발현 수준은 강력한 발현 프로모터를 갖는 고카피 플라스미드가 사용되면 이 용법을 초과할 수 있다. 누수성 yghB 발현으로 ΔyghB 의 보완은 이소프레놀, 부탄올 및 바닐린에 대한 내성을 증가시켰다. 그러나, 바닐린 스트레스 하에서 역시 yghB 의 녹-아웃은 내성을 증가시켰다.

2.3 rob 돌연변이

단리된 균주에서 rob 유전자의 3개의 상이한 돌연변이가 확인되었다. 2개 돌연변이는 G273 및 Y103 이후에 단백질의 절두를 초래하고, 가장 우세한 돌연변이는 H48 이후에 프레임시프트를 초래하고 그 결과로 107 aa 길이 단백질을 생성시킨다. rob 유전자의 결실은 이소프레놀에 대한 내성에 대해 오직 경미한 효과를 가졌다. 돌연변이형 rob H48 프레임시프트로 rob 녹 아웃의 보완은 이소프레놀에 대한 내성을 유의하게 증가시킨다. rob H48 fs 를 갖는 이러한 녹-아웃 균주는 바닐린 및 부탄올에 대해 높은 내성을 야기시킨다. 돌연변이형 Rob H48fs 는 HTH DNA 결합 모티프의 일부분을 함유하여서 단백질은 여전히 DNA에 결합할 수 있지만 이의 C-말단 리시버 도메인과 분자 신호에 대해 반응하는 이의 능력을 상실한다 (Griffith et al., 2009).

2.4 조합 효과

진화 과정 중에서 새로운 돌연변이의 획득은 종종 소위 상위성 효과에 의해 보조되고, 즉, 조합된 2개 돌연변이의 적합도 이득은 단일 적합도 이득의 총합 (또는 생산물)을 초과한다. marC 및 rob 녹-아웃과 Rob H48fs 발현의 조합을 위해 이소프레놀 및 부탄올 내성에 대한 추가 적합도 이들을 발견하였지만, 이러한 조합은 임의의 상승적 효과를 보이지 않았다. 바닐린 독성의 경우에, Δrob rob H48fs 균주에 marC 녹-아웃의 첨가는 부정적 상위성 상호작용의 증거인, 적합도를 감소시켰다.

2.5 RNA-Seq로부터의 녹-아웃 표적

이소프레놀 스트레스 하에서 야생형 균주에 대한 적응 균주의 발현을 비교하는 우리의 RNA-Seq 실험에서, 우리는 적응 균주에서 고도의 상향 및 하향 조절된 유전자의 세트를 확인하였다. 차등 조절이 내성에 유리하면 상향 및 하향 조절의 분자 조작은 이러한 효과를 모방할 수 있었다. 이것은 분명하게 상기 도시된 바와 같은 yghB 의 상향조절의 경우이다. 적응 균주에서 표적 유전자의 극도의 하향 조절은 이로적으로 표적 유전자의 녹-아웃에 의해 획득되었다.

이러한 목적을 위해서, 이용가능한 녹-아웃 균주의 세트는 그들 이소프레놀 내성에 대해 시험되었다. 우리는 이소프레놀 내성에 유리한 표적 녹-아웃으로서 rraA 유전자를 확인하였다. 돌연변이체 균주에서 하향 조절이외에도, 우리는 또한 진화 실험의 초기 균주 단리주에서 2개 돌연변이를 관찰하였다. 녹-아웃 균주가 긍정적인 내성 효과를 획득하므로, 우리는 돌연변이체 RraA 단백질에서 아미노산 교환, V96-E 및 G67-S가 생체내 RraA 기능에 대해 부정적인 효과를 가질 수 있다고 가정한다. G67-S 돌연변이는 구조적 β-시트 엘리먼트에 인접하고 또한 다른 종에서도 존재한다. 보다 우세한 V96-E 돌연변이는 고도로 보존된 발린 잔기에 있고 RraA 기능에 핵심적일 수 있다 (Monzingo et al., 2003). RNase E의 억제제로서 rraA 의 부재는 mRNA 전사물의 수준을 다면적으로 감소시킨다 (Lee et al., 2003).

2.6 추가 화학물로 양성 돌연변이의 확장

본 발명의 숙주 세포 및 방법은 미생물 예컨대 이. 콜라이에서 증가된 이소프레놀 내성을 획득한다. 그러나, 본 발명의 숙주 세포 및 방법은 추가 화학물에 대한 미생물의 내성을 증가시킨다. 본 발명의 숙주 세포는 부탄올 및 또한 이소부탄올에 대해 더 높은 내성을 가지며 C4 및 C5 바디를 갖는 다른 알콜 또는 알데히드에 적용된다.

우리는 또한 모노터펜 화합물 제라니올에 대한 그들 내성에 대한 적응 균주를 시험하였지만, 우리는 그들 균주가 제라니올에 대해 증가된 감수성을 갖는다는 것을 발견하였다. 현재 내성 기전이 유사한 물리적 및 화학적 성질을 갖는 화합물에만 적용된다고 판단하였고, 그러므로 제라니올에 비해서 더 낮은 수 및 더 높은 logP 값을 갖는 시트랄 및 멘톨은 시험하지 않았다. 결론적으로, 우리는 내성 기전이 작용하는 제한적 물리적 및 화학적 성질을 결정하고 이소프레놀과 제라니올 사이의 중간 logP 값을 갖는 바닐린을 선택하고자 시도하였다. 우리는 바닐린 내성이 marC 가 바닐린 내성에서 역할을 하지 않는 것을 제외하고 본 발명의 숙주 세포 및 방법을 통해서 획득될 수 있다는 것을 발견하였다. Δrob 배경에서 돌연변이형 rob H48 fs 의 발현은 내성에 대해 강력한 긍정적 효과를 가졌다. yghB 는 또한 바닐린 내성에서 역할을 하지만, C4 및 C5 알콜과 상이한 방식으로 역할을 한다. yghB 의 녹-아웃이 이소프레놀 및 부탄올 내성에 대해 부정적인 효과를 갖는 반면 이것은 바닐린 내성에서 긍정적 효과를 갖는다.

하나의 내성 기전이 고도로 가변적인 물리적 및 화학적 성질을 갖는 광범위 화합물에 적용될 수 없다는 것은 분명하다. 그러나, 동일한 세포 표적, 예를 들어, 세포-막이 관여되면, 동일한 유전자가 상이한 방식이지만 내성 기전에 여전히 관여될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 독성 화합물의 세포 표적은 동일하고, 내성은 본 발명에 개시된 유전자의 미세 조율 발현 및 기능으로 획득될 수 있다. 이것은 막 스트레스 유도 화합물 경우에 하나의 막 유전자는 정확한 물리적 성질에 의존하여 과발현되거나 또는 하향조절될 필요가 있지만, 각 경우에 동일 표적 유전자가 적용될 수 있다는 것을 의미한다. 다른 구현예에서 툴박스 접근법은 또한 유도 진화 접근법에 대한 표적을 제시한다. 특별한 내성 기전에 관여하는 유전자는 에러-프론 PCR 접근법을 사용해 증폭될 수 있고 내성에 대한 그들 이득에 대해 선택될 수 있다.

표 3B: 물리적 성질 logP 및 수중 용해도 및 적응된 균주 또는 시험된 돌연변이의 내성을 갖는 화합물.

본 발명자는 이들 결과의 일부를 공개하였다 (참조: Babel and Kromer 2020)

3 실험 재료 및 방법

3.1 균주, 플라스미드 및 프라이머

표 4: 배경 균주

표 5: 구축된 균주

표 6: 플라스미드

표 7: 프라이머

이들은 SEQ ID NO: 10 내지 39로서 서열 목록에 포함된다.

3.2 균주 및 플라스미드 구축

3.2.1 발현 플라스미드

녹-아웃 균주는 상응하는 게이오 균주로부터 25 bp 중복을 갖는 내성 카세트의 증폭을 통해 구축하였다 (프라이머 3+4, 5+6 및 7+8). 상동성 25 bp 서열 및 카나마이신 내성을 보유하는 PCR 생산물은 표준 절차를 사용하여 이. 콜라이 MG1655를 형질전환시키는데 사용되었다 (Baba et al., 2006). 과발현을 위해서 플라스미드 표적 유전자는 pAH030 과발현 플라스미드에 대해 25 bp 상동성을 갖게 증폭하였다. 플라스미드는 SpeI 제한효소 부위를 사용해 선형화시켰고 관심 유전자를 함유하는 PCR-생산물을 깁슨 조립을 사용해 삽입시켰다 (Gibson et al., 2009).

3.2.2 녹-아웃 균주

녹-아웃 균주는 상응하는 게이오 컬렉션 균주로부터 단리된 DAN-단편을 사용해 제조되었다. 재조합은 표준 RED/ET 키트 (Genebridges Red/ET Kit, 2019)를 사용해 수행하였다.

3.3 미생물의 배양

3.3.1 화학적 한정 배지

이. 콜라이의 성장을 위해서 M9 배지 (Green and Sambrook, 2012)가 사용되었다. M9 10x는 7의 pH로 조정하였다.

표 8: M9 및 M9* 10x 농축 용액

표 9: 1 L US 미량 금속 (1000x)의 조성법

표 10: 1 L M9 또는 M9* 배지의 조성법

3.4 배양 계획 및 조건

3.4.1 진탕-플라스크 기반 진화

이. 콜라이를 37℃의 온도에서 인큐베이션하였다.

미생물은 적합한 화학적 한정 배지 상에서 스트리킹하였고 최적 온도에서 성장시켰다. 콜로니 형성이 관찰되면, 10 mL의 화학적 한정 배지에 콜로니를 접종하였고 100 mL 배플 플라스크 중에서 200 rpm의 진탕 속도로 Infors HT Multitron (Switzerland, Bottmingen) 또는 Ecotron (25 mm shaking throw)에서 인큐베이션하였다. 이 배양으로부터 25 mL 배플 플라스크 중 25 mL 배지의 밤샘 배양물을 접종하였고 16시간 동안 인큐베이션하여서, 배양은 다음 날에 대수기에 있었다.

다음 날에 Teflon ® 라이너 스크류 캡이 있는 250 mL 배플 플라스크 중 25 mL 배지에 0.2의 OD까지 접종하였고 200 rpm에서 인큐베이션하였다. 터페노이드 스트레스를 명시된 농도까지 첨가하였다. 세포 배양이 정지기에 도달하기 전에, 배양물의 일부를 터페노이드가 존재하는 신선한 플라스크 중 신선한 배지로 옮겼다. 평균 배양 성장률은 초기 OD 및 계대 전 배양 OD와 비교하여 결정하였다.

세포 배양을 계대하기 전에, 600 ㎕를 채취하여 600 ㎕의 50 % v/v 글리세롤 용액과 혼합하였다. 샘플을 -80℃에서 저장하였다.

표 11: 사용된 화학물

3.5 성장 데이터의 평가

성장률은 자연 로그로 각 실험의 OD-값을 변환하여 결정하였다. 성장의 선형 용법에서, 선은 데이터에 적합화시켰고 성장률과 동일한 기울기를 결정하였다. 성장률은 각 플라스크에 대해 개별적으로 결정하였고 각 조건의 성장률은 3개 생물학적 복제물의 평균 및 표준 편차로서 제공된다.

최대 성장률의 절반 (MIC₅₀)에 인접한 2개 데이터-점의 선형 보간이 최대 성장률 절반의 화합물 농도를 추정하는데 사용되었다. 성장률의 상응하는 표준-편차가 이용가능하면 MIC₅₀ 의 표준 오차를 오류 전파를 통해 계산하였다.

3.6 프로피듐 아이오딘 염색

프로피듐 아이오딘 염색을 위해서 세포를 250 mL 배플 밀봉 진탕-플라스크에서 적절한 이소프레놀 농도 하에 5시간 동안 성장시켰다. 각 조건 중에서 2 mL 샘플을 채취하였고 동일 부피의 0.85 % NaCl 용액에 재현탁시켰다. 음성 대조군으로서 야생형 샘플을 5분 동안 바실롤 AF와 인큐베이션시켰다. 역시 음성 대조군을 세척 후에, 샘플을 1.5*10⁷ 세포/mL의 농도까지 희석하였고 SYTO 9 50 μM 스톡-용액 (DMSO 중) 및 프로피듐 아이오딘 6 mM 스톡 용액 (DMSO 중)을 5 μM SYTO 9 및 6 μM PI의 최종 농도를 제공하도록 첨가하였다. SYTO 9 염색은 샘플 중 찌꺼기와 세포를 구별하기 위한 양성 염색으로서 사용하였다. 샘플은 적어도 20분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 측정 전에 샘플을 1.5*10⁶ 세포/mL의 농도까지 희석하였다. 샘플은 Beckman Coulter CytoFLEX 유세포측정기를 사용해 측정하였다. 프로피듐 아이오딘 염색은 488 nm 레이저 및 610/20 BP 필터로 여기를 검출하였고, SYTO 9는 524/40 BP 필터 및 동일한 여기 파장을 사용해 측정하였다.

3.7 DNA 및 RNA 시퀀싱

3.7.1 DNA 시퀀싱

3.7.1.1 샘플 제조

선택된 균주는 60 mM 이소프레놀이 보충된 5 mL LB 배지에서 밤새 성장시켰다 (돌연변이체 균주용). 게놈 DNA는 표준 방법을 사용해 단리하였다.

3.7.1.2 라이브러리 제조 및 시퀀싱

1. Covaris를 사용한 DNA 단편화 (바람직한 단편 크기: 300 bp)

2. MinElute 컬럼 (Qiagen)을 사용해 샘플 정제, 20 ㎕ EB 완충액에 용출

3. Illumina 라이브러리 구축:

매뉴얼에 따라서 Ovation Rapid DR 멀티플렉스 시스템 1-96 (NuGEN)을 사용해 인덱싱된 Illumina 라이브러리 제조

4. 라이브러리 증폭 및 크기 선택

라이브러리는 MyTaq (Bioline) 및 표준 Illumina 프라이머를 사용해 13 사이클 동안 증폭되었다. 크기 선택은 300 내지 500 bp 범위를 선택하여 Pippin Prep 시스템 (Sage Science)에서 수행되었다.

5. 최종 라이브러리 정제 단계 및 BioAnalyzer 및 Qubit를 통한 DNA 라이브러리의 품질 관리

6. 시퀀싱은 제조사 설명서에 따라서 Illumina NextSeq 500/550에서 수행되었다 - 2x150 bp 판독 길이 (Illumina)

3.7.1.3 데이터 분석

1. 판독 사전-처리

· Illumina bcl2fastq 2.17.1.14 소프트웨어를 사용한 각 시퀀싱 레인에 대한 모든 라이브러리의 역다중화 (폴더 'RAW'):

。1 또는 2 불일치 또는 N은 레인 상의 모든 라이브러리 간 바코드 거리가 허용될 때 바코드 판독에서 허용되었다

· 모든 미가공 판독치로부터 시퀀싱 어댑터 잔류물의 클리핑 (폴더 'AdapterClipped'):

。최종 길이 < 20 염기인 판독치는 폐기하였다

· 어댑터 클리핑된 Illumina 판독치의 품질 트리밍 (폴더 'QualityTrimmed'):

。N 함유 판독치 제거

。10 염기의 창 상에서 20의 최소 평균 Phred 품질 점수를 얻도록 3'-말단에서 판독치의 트리밍

。최종 길이 < 20 염기의 판독치는 폐기하였다

·모든 FASTQ 파일에 대한 FastQC 보고서 생성

·한번에 모든 샘플에 대한 모든 판독 계측치를 함유하는 read_counts.xlsx의 생성

2. 정렬 및 변이체 발견:

· BWA-MEM 버전 0.7.12 (http://bio-bwa.sourceforge.net/)을 사용해 기준 게놈에 대한 품질 트리밍된 판독치의 정렬 (폴더 'Alinments'):

。좌표-분류된 BAM 형식에서 샘플 당 하나의 정렬 파일

· Picard v1.92 MarkDuplicates (http://picard.sourceforge.net/)를 사용한 PCR 및 광학 복제물 판독의 마크업

· Freebayes v1.0.2-16 (https://github.com/ekg/freebayes#readme)를 사용한 샘플의 변이체 발견 및 유전자형 분석 (폴더 VariantAnalysis/[reference]/Freebayes'):

。2개 초과 불일치가 존재하는 판독치는 제외하였다

。MNP 및 복합 변이체를 제외하였다

。배수성은 1로 설정되었다

3.7.2 RNA 시퀀싱

3.7.2.1 샘플 제조

야생형 및 3개 최종 돌연변이체 균주는 상기 기술된 바와 같이 1.0의 OD까지 50 mM 이소프레놀과 함께 생물학적 삼중복제물로 성장시켰다 (25 mL 밀봉 플라스크). 다음으로 10 mL의 세포 배양을 0.8 μM 포어 크기의 Supor ® 800 Grid 필터를 사용해 진공 여과시켰다. 세포를 함유하는 필터를 700 ㎕ PGTX 용액을 함유하는 15 mL 팔콘 튜브에 넣었고 즉시 액체 질소에서 냉동하였다. 샘플은 추가 처리까지 -80℃에 저장하였다.

RNA를 추출하기 위해서 샘플을 때대로 와류시키면서 수조 중에 65℃에서 15분 동안 인큐베이션하였고 그 다음에 얼음에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 다음으로 700 ㎕의 클로로포름을 첨가하였고 10분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 샘플을 15분 동안 원심분리하였고, 상부 수성층을 새로운 바이알로 옮겼고 동일한 부피의 클로로포름을 첨가하였다. 혼합 후에 샘플을 추가 15분 동안 원심분리하였다. 상부 수성층 (대략 500 ㎕)을 새로운 바이알로 옮겼고 동일 부피의 이소프로판올과 혼합하였다. 이어서 혼합물을 -20℃에서 밤새 인큐베이션하였다.

다음 날에 혼합물을 30분 동안 4℃에서 12000 g으로 RNaseZAP로 세정된 원심분리기에서 원심분리되었다. 상청액을 제거하였고 펠렛을 조심스럽게 1 mL의 70% v/v 에탄올 용액을 세척하였다 (펠렛 재현탁없음). 12000 g 및 4℃에서 5분 동안 추가 원심분리 단계 이후에 펠렛을 대략 15분 동안 클린 벤치 하에서 공기로 건조하였다. 마지막으로, RNA는 RNAse-무함유 물 (40 ㎕)에 재현탁하였다. 샘플 농도는 Nanodrop을 사용해 결정하였다. Turbo DNA-무함유 키트 (Invitrogen)로 샘플의 처리 후 농도는 다시 결정하였고 샘플을 TAE 중 1.5% 아가로스 네이티브 겔 상에서 검사하였다. 샘플을 EZ-Vision Three 염색을 사용해 염색시켰다.

3.7.2.2 라이브러리 제조 및 시퀀싱

1. 전체 RNA의 품질 관리 검토는 Bioanalyzer를 사용해 수행하였다

2. 제조사 설명서에 따라서, 박테리아용 Ribo-Zero rRNA 제거 키트 (Illumina)를 사용해 rRNA 고갈

3. 제1 가닥 cDNA 합성 - NEBNext RNA 제1 가닥 합성 모듈 (New England Biolabs)을 매뉴얼에 따라 사용하였다

4. 제2 가닥 합성 - NEBNext RNA 제2 가닥 합성 모듈 (New England Biolabs)을 매뉴얼에 따라 사용하였다.

5. cDNA의 정제 및 농축 - 단계 5의 cDNA는 MinElute 컬럼 (Qiagen)을 사용해 정제하였고, 20 ㎕ EB 완충액에 용출하였다

6. Illumina 라이브러리 구축

Encore Rapid DR Multiplex 시스템 (Nugen)을 매뉴얼에 따라 라이브러리 제조에 사용하였다.

7. 라이브러리 증폭 및 크기 선택

라이브러리는 100 ㎕의 부피로 12 사이클 동안 MyTaq (Bioline) 표준 Illumina 프라이머를 사용해 증폭하였다. 크기 선택은 분취용 아가로스 겔에서 수행하고 300 내지 500 bp 단편을 선택하였다

8. RNA 라이브러리의 품질 관리는 Bioanalyzer 및 Qubit을 통해 수행하였다

9. 제조사 설명서에 따라서 Illumina NextSeq500/550 (1x75bp)에서 시퀀싱

3.7.2.3 데이터 분석

1. 데이터 사전-처리:

· Illumina bcl2fastq 2.17.1.14 소프트웨어를 사용한 각 시퀀싱 레인에 대한 모든 라이브러리의 역다중화 (폴더 'RAW'):

。1 또는 2 불일치 또는 N은 레인 상의 모든 라이브러리 간 바코드 거리가 허용될 때 바코드 판독에서 허용되었다

· 모든 미가공 판독치로부터 시퀀싱 어댑터 잔류물의 클리핑 (폴더 'AdapterClipped'):

。최종 길이 < 20 염기인 판독치는 폐기하였다

. RiboPicker 0.4.3 (http://ribopicker.sourceforge.net/)를 사용한 rRNA 서열의 필터링 (폴더 'RiboPicker')

·한번에 모든 샘플에 대한 모든 판독치 계측을 함유한 read_counts.xls의 생성

· 모든 FASTQ 파일에 대한 FastQC 보고서의 생성

2. 차등 발현 분석:

·STAR 2.4. (https://github.com/alexdobin/STAR/releases)으로 기준에 대해 정렬 (폴더 'Alignments')

· rRNA 또는 tRNA 영역에 대한 판독 정렬의 정렬-후 필터링 (폴더 'Alignments')

· htseq-count로 TopHat-정렬 판독치의 계측 (http://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq/) (폴더 'Alignments')

. edgeR 3.2.3 (http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html), DESeq 1.12.0 (http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq.html) 및 cuffdiff 2.1.1 (http://cufflinks.cbcb.umd.edu)를 사용하 차등 발현 분석 (폴더 'ExpressionAnalysis', 하위폴더 'edgeR', 'DESeq' 및 'cuffdiff'):

。통계 검정으로부터 미가공 p-값은 벤자미니-호흐버그 (Benjamini-Hochberg) 거짓 발견율 (FDR) 방법을 통해 다중 검정에 대해 조정되었다

본 발명은 이들 결과의 일부를 공개하였다 (참조: Babel and Kromer 2020)

4 참조

본 발명의 추가 양태

바람직하게 독성 물질 예컨대 터펜의 존재 하에서 성장률은 대조군, 즉 비변형 유기체와 비교하여 5%, 10% 또는 15%, 보다 바람직하게 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50 이상% 까지 증가된다.

보다 바람직하게, 독성 물질 예컨대 터펜의 존재 하에서 성장률은 1.1, 1.2, 1.25, 1.3, 1.4, 1.5, 1.75, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10의 팩터만큼 개선된다.

본 발명의 방법 및 변형 유기체에서 특히 유용한 것은 본 발명의 에스케리치아 콜라이의 변형에 상응하고, 바람직하게 SEQ ID NO:1 내지 9로 제공되는 단백질 또는 이와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성을 갖는 것을 코딩하는 유전자 내 개시된 변형에 상응하는 변형이다.

달리 표시하지 않으면, 본 명세서에서 사용되는 용어는 당해 기술 분야의 당업자에 의한 통상의 용법에 따라 이해되어야 한다. 본 명세서에 제공되는 용어의 정의이외에도, 분자 생물학의 공통 용어의 정의는 또한 하기 문헌에서 확인할 수 있다: Rieger et al., 1991 Glossary of genetics: classical and molecular, 5th Ed., Berlin: Springer-Verlag; 및 Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1998 Supplement).

본 명세서 및 청구항에서 사용되는 "한" 또는 "일"은 사용되는 문맥에 따라서, 하나 이상을 의미할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 예를 들어, "한 세포"에 대한 언급은 적어도 하나의 세포가 이용될 수 있다는 것을 의미할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 전문용어는 오직 특별한 구현예를 기술하기 위한 목적이고 제한하려는 의도가 없다는 것을 이해해야 한다.

클로닝, DNA 단리, 증폭 및 정제, DNA 리가제, DNA 중합효소, 제한 엔도뉴클레아제 등이 관여되는 효소 반응, 및 다양한 분리 기술에 대한 표준 기술은 당업자에게 공지되고 통상적으로 적용된다. 다수의 표준 기술은 하기 문헌들에 기술되어 있다: M. Green & J. Sambrook (2012) Molecular Cloning: a laboratory manual, 4th Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Online Library; Maniatis et al., 1982 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, N.Y.; Wu (Ed.) 1993 Meth. Enzymol. 218, Part I; Wu (Ed.) 1979 Meth Enzymol. 68; Wu et al., (Eds.) 1983 Meth. Enzymol. 100 and 101; Grossman and Moldave (Eds.) 1980 Meth. Enzymol. 65; Miller (Ed.) 1972 Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.; Old and Primrose, 1981 Principles of Gene Manipulation, University of California Press, Berkeley; Schleif and Wensink, 1982 Practical Methods in Molecular Biology; Glover (Ed.) 1985 DNA Cloning Vol. I and II, IRL Press, Oxford, UK; Hames and Higgins (Eds.) 1985 Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UK; and Setlow and Hollaender 1979 Genetic Engineering: Principles and Methods, Vols. 1-4, Plenum Press, New York.

본 명세서에서 달리 명시하지 않으면, 약어 및 명명법은 적용되는 경우에, 현장에서 표준으로 간주되고 본 명세서에 인용된 것과 같은 전문 저널에서 통상적으로 사용된다.

숙주 세포로 DNA 구성체 또는 벡터의 도입은 형질전환, 전기천공, 핵 미세주입, 형질도입, 형질감염 (예를 들어, 리포펙션 매개 또는 DEAE-덱스트린 매개 형질감염 또는 재조합 파지 바이러스를 사용한 형질감염), 칼슘 포스페이트 DNA 침전물과 인큐베이션, DNA-코팅된 유전자총에 의한 고속 충격, 및 원형질 융합같은 기술을 사용해 수행될 수 있다. 일반적인 형질전환 기술은 당분야에 공지되어 있다 (참조: 예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al. (eds) Chapter 9, 1987; Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, 1989; and Campbell et al, Curr. Genet. 16:53-56, 1989, 이들 전문은 특히 형질전환 방법에 대해서, 참조로 본 명세서에 각각 편입됨). 트리코더마에서 이종성 폴리펩티드의 발현은 하기 문헌에 기술되어 있다: 미국 특허 제6,022,725호; 미국 특허 제6,268,328호; 미국 특허 제7,262,041호; WO 2005/001036; Harkki et al., Enzyme Microb. Technol. 13:227-233, 1991; Harkki et al, Bio Technol 7:596-603, 1989; EP 244,234; EP 215,594; 및 Nevalainen et al, "The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous and Heterologous Genes," in Molecular Industrial Mycology, Eds. Leong and Berka, Marcel Dekker Inc., NY pp. 129 - 148, 1992, 이들은 그들 전문이, 특히 형질전환 및 발현 방법에 대해서, 참조로 본 명세서에 편입됨). 또한 아스퍼질러스 균주의 형질전환에 대해서 다음의 문헌들을 참조한다: Cao et al, (Sd. 9:991― 1001, 2000; EP 238023; 및 Yelton et al, Proceedings. Natl. Acad. Sci. USA 81:1470-1474, 1984 (이들 각각은 그들 전문이, 특히 형질전환 방법에 대해서 참조로 본 명세서에 편입됨). 도입된 핵산은 염색체 DNA에 통합될 수 있거나 또는 염색체외 복제 서열로서 유지될 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명은 터펜 화합물, 바람직하게 모노터펜 화합물에 대한 증가된 내성을 유기체 또는 숙주 세포에 전달하는 단리된 유전자 및/또는 이에 의해 코딩되는 단리된 단백질에 관한 것이다. 유전자 및 단백질의 변이체를 비롯하여 이의 변이체 및 본 명세서에 기술된 이러한 능력의 핵산에 혼성화하는 변이체가 포함되고, 본 발명의 이들 변이체 민 혼성화 서열은 적어도 실질적으로 본 발명의 핵산의 보호 효과만큼 높은 유기체 또는 숙주 세포로 터펜 화합물에 대한 보호 효과를 전달한다.

용어 "유전자"는 폴리펩티드 사슬을 생성시키는데 관여되는 DNA의 절편을 의미하고, 이것은 코딩 영역의 선행 및 후행 영역 (리더 및 트레일러)을 비롯하여 개별 코딩 절편 (엑손) 사이의 개재 서열 (인트론)을 포함한다. 전형적으로, 이것은 부모로부터 자손으로 전달되고 유기체의 표현형에 기여하는 유전 정보를 함유하는 DNA의 절편이다. 유기체의 형태 및 기능에 대한 유전자의 영향은 RNA (tRNA, rRNA, mRNA, 넌코딩 RNA)로의 전사를 통해서, 그리고 mRNA의 경우에 펩티드 및 단백질로의 번역을 통해서 매개된다.

본 명세서에 정의된 바와 같은 용어 "혼성화"는 실질적으로 상보성인 뉴클레오티드 서열이 서로에 어닐링되는 과정이다. 혼성화 과정은 전체적으로 용액 중에서 발생될 수 있고, 즉 상보성 핵산 둘 모두 용액 중에 있다. 혼성화 과정은 또한 매트릭스 예컨대 자성 비드, 세파로스 비드 또는 임의의 다른 수지에 고정된 상보성 핵산 중 하나와 일어날 수 있다. 더 나아가서 혼성화 과정은 고형 지지체 예컨대 니트로셀룰로스 또는 나일론 막에 고정되거나 또는 예를 들어, 규산질 유리 지지체에 대한 포토리소그라피에 의해 고정된 상보성 핵산 중 하나와 일어날 수 있다 (후자는 핵산 어레이 또는 마이크로어레이 또는 핵산 칩으로서 알려짐). 혼성화가 일어나게 하기 위해서, 핵산 분자는 일반적으로 열적으로 또는 화학적으로 변성되어서 이중 가닥이 2개 단일 가닥으로 용융되고/되거나 단일 가닥 핵산으로부터 헤어핀 또는 다른 2차 구조가 제거된다.

용어 "엄격성"은 혼성화가 일어나는 조건을 의미한다. 혼성화의 엄격성은 조건 예컨대 온도, 염 농도, 이온 강도 및 혼성화 완충액 조성물에 의해 영향받는다. 일반적으로, 저 엄격성 조건은 정해진 이온 강도 및 pH에서 특이적 서열에 대한 열 용융점에 비해 약 30℃ 미만인 것으로 선택된다. 중간 엄격성 조건은 온도가 Tm에 비해 20℃ 미만일 때이고, 고 엄격성 조건은 온도가 Tm에 비해 10℃ 미만일 때이다. 고 엄격성 혼성화 조건은 전형적으로 표적 핵산 서열에 대한 높은 서열 유사성을 갖는 혼성화 서열을 단리하기 위해 사용된다. 그러므로, 핵산은 서열이 빗나갈 수 있고 유전자 코드의 축퇴성 덕분에 실질적으로 동일한 폴리펩티드를 여전히 코딩한다. 그러므로, 중간 엄격성 혼성화 조건은 때때로 이러한 핵산 분자를 확인하는데 필요할 수 있다.

"Tm"은 표적 서열의 50%가 완벽하게 일치하는 프로브에 혼성화하는, 정해진 이온 강도 및 pH 하의 온도이다. Tm은 용액 조건 및 염기 조성 및 프로브의 길이에 의존적이다. 예를 들어, 더 긴 서열은 더 높은 온도에서 특이적으로 혼성화된다. 혼성화의 최대 속도는 Tm에 비해서 약 16℃ 내지 32℃ 미만에서 수득된다. 혼성화 용액 중 1가 양이온의 존재는 2개 핵산 가닥 사이의 정전기적 반발력을 감소시켜서 하이브리드 형성을 촉진하고; 이러한 효과는 0.4 M 이하의 소듐 농도에서 볼 수 있다 (더 높은 농도에서, 이러한 효과는 무시할만함). 포름아미드는 DNA-DNA 및 DNA-RNA 듀플렉스의 용융 온도를 각 퍼센트의 포름아미드에 대해 0.6 내지 0.7℃로 감소시키고, 50% 포름아미드의 첨가는 혼성화가 30℃ 내지 45℃에서 수행될 수 있게 허용하지만, 혼성화의 속도는 낮아질 수 있다. 염기쌍 불일치는 듀플렉스의 열 안정성 및 혼성화 속도를 감소시킨다. 평균적으로 큰 프로브 경우에, Tm은 염기 불일치% 당 약 1℃ 감소된다. Tm은 하이브리드의 유형에 의존하여, 하기 식을 사용해 계산될 수 있다:

· DNA-DNA 하이브리드 (Meinkoth and Wahl, Anal. Biochem., 138: 267-284, 1984):

T_m= 81.5℃ + 16.6xlog[Na⁺]^a + 0.41x%[G/C^b] - 500x[L^c]^-1 - 0.61x% 포름아미드

· DNA-RNA 또는 RNA-RNA 하이브리드:

T_m= 79.8 + 18.5 (log₁₀[Na⁺]^a) + 0.58 (%G/C^b) + 11.8 (%G/C^b)² - 820/L^c

· 올리고-DNA 또는 올리고-RNA^d 하이브리드:

<20 뉴클레오티드 경우: T_m= 2 (l _n)

20-35 뉴클레오티드 경우: T_m= 22 + 1.46 (l _n )

^a 또는 다른 1가 양이온으로서, 0.01-0.4 M 범위에서만 정확함.

^b 30% 내지 75% 범위에서 %GC에 대해서만 정확.

^c L = 염기쌍으로서 듀플렉스의 길이.

^d 올리고, 올리고뉴클레오티드; l _n, 프라이머의 유효한 길이 = 2Х(G/C의 no.)+(A/T의 no.).

비특이적 결합은 다수의 기지 기술 중 어느 하나, 예컨대, 예를 들어, 막을 단백질 함유 용액으로 차단, 혼성화 완충액에 이종성 RNA, DNA, 및 SDS의 첨가, 및 RNase의 처리를 사용해 제어될 수 있다. 비관련 프로브 경우에, 일련의 혼성화는 (i) 어닐링 온도의 점진적인 하락 (예를 들어, 68℃ 내지 42℃) 또는 (ii) 포름아미드 농도 (예를 들어, 50% 내지 0%)의 점진적인 하락 중 하나를 가변화하여 수행될 수 있다. 당업자는 혼성화 동안 변경될 수 있고 엄격성 조건을 유지하거나 또는 변화시키는 다양한 매개변수를 알고 있다.

혼성화 조건뿐만 아니라, 혼성화의 특이성은 전형적으로 또는 혼성화 후 세척의 작용에 의존적이다. 비특이적 혼성화로 인한 배경치를 제거하기 위해서, 샘플은 희석 염 용액으로 세척된다. 이러한 세척의 중요한 인자는 최종 세척 용액의 이온 강도 및 온도를 포함하고, 염 농도가 낮고 세척 온도가 높을수록, 세척의 엄격성은 더 높아진다. 세척 조건은 전형적으로 혼성화 엄격성에서 또는 그 이하에서 수행된다. 양성 혼성화는 배경치의 적어도 2배인 신호를 제공한다. 일반적으로, 핵산 혼성화 어세이 또는 유전자 증폭 검출 절차에 적합한 엄격성 조건은 상기 기재된 바와 같다. 더 높거나 또는 더 낮은 염격성 조건이 또한 선택될 수 있다. 당업자는 세척 동안 변경될 수 있고 엄격성 조건을 유지하거나 또는 변화시키는 다양한 매개변수를 알고 있다.

예를 들어, 50 뉴클레오티드 초과의 DNA 하이브리드에 대한 전형적인 고 엄격성 혼성화 조건은 1x SSC 중에 65℃ 또는 1x SSC 및 50% 포름아미드 중에 42℃에서 혼성화에 이어서, 0.3x SSC 중에 65℃에서 세척을 포괄한다. 50 뉴클레오티드 초과의 DNA 하이브리드를 위한 중간 엄격성 혼성화 조건의 예는 4x SSC 중에 50℃ 또는 6x SSC 및 50% 포름아미드 중에 40℃에서 혼성화에 이어서, 2x SSC 중에 50℃에서 세척을 포괄한다. 하이브리드의 길이는 핵산을 혼성화하기 위해 예상되는 길이이다. 기지 서열의 핵산이 혼성화될 때, 하이브리드 길이는 서열을 정렬시키고 본 명세서에 기술된 보존 영역을 확인하여 결정할 수 있다. 1ХSSC는 0.15 M NaCl 및 15 mM 소듐 시트레이트이고; 혼성화 용액 및 세척 용액은 5x 던하르트 (Denhardt) 시약, 0.5-1.0% SDS, 100 ㎍/mL 변성, 단편화 연어 정자 DNA, 0.5% 소듐 파이로포스페이트를 추가로 포함할 수 있다. 고 엄격성 조건의 다른 예는 0.1 SDS 및 임의로 5x 던하르트 시약, 100 ㎍/mL 변성, 단편화 연어 정자 DNA, 0.5% 소듐 파이로포스페이트를 포함하는 0.1x SSC 중에 65℃에서 혼성화에 이어서, 0.3x SSC 중에 65℃에서 세척이다.

엄격성의 수준을 결정하기 위한 목적을 위해서, 다음의 문헌들을 참조할 수 있다: Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York or to Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989 and yearly updates).

세포 또는 유기체와 관련하여 "재조합" (또는 유전자이식)은 세포 또는 유기체가 유전자 기술에 의해 도입시킨 외생성 폴리뉴클레오티드를 함유하는 것을 의미하고 폴리뉴클레오티드와 관련하여

(a) 폴리뉴클레오티드의 서열 또는 이의 일부분, 또는

(b) 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 프로모터와 작동적으로 연결된 하나 이상의 유전자 제어 서열, 또는

(c) a) 및 b) 둘 모두

가 그들 야생형 유전 환경에 위치하지 않거나 또는 변형된, 유전자 기술/재조합 DNA 기술에 의해 야기된 모든 구성을 의미한다.

용어 "단리된 핵산" 또는 "단리된 폴리펩티드"는 일부 예에서 각각 "재조합 핵산" 또는 "재조합 폴리펩티드"의 동의어로 간주되고 각각 이의 천연 유전 환경 또는 세포 환경에 위치하지 않고/않거나, 재조합 방법으로 변형된 핵산 또는 폴리펩티드를 의미한다는 것을 추가로 유의한다. 단리된 핵산 서열 또는 단리된 핵산 분자는 이의 천연 주변 또는 이의 천연 핵산 이웃이 아니지만, 다른 핵산 서열 또는 핵산 분자에 물리적으로 그리고 기능적으로 연결되는 핵산 구성체, 벡터 서열 또는 염색체의 일부로서 존재하는 것이다. 전형적으로, 단리된 핵산은 실험실 조건 하에서 세포로부터 RNA를 단리하는 단계 및 이를 카피-DNA (cDNA)로 전환시키는 단계에 의해 수득된다.

핵산, 단백질, 효소, 또는 유기체의 "부모" (또는 "기준" 또는 "주형") (또한 "부모 핵산", "기준 핵산", "주형 핵산", "부모 단백질" "기준 단백질", "주형 단백질", "부모 효소", "기준 효소", "주형 효소", "부모 유기체", "기준 유기체", 또는 "주형 유기체"라고도 함)는 부모의 "변이체"를 생성시키는 변화의 도입 (예를 들어, 하나 이상의 핵산 또는 아미노산 치환의 도입에 의함)을 위한 출발점이다. 따라서 "효소 변이체" 또는 "서열 변이체" 또는 "변이체 단백질" 같은 용어는 변형 또는 변이체 서열, 단백질, 효소, 또는 유기체를 각각의 변이체 서열, 단백질, 효소 또는 유기체에 대한 기원인 부모 서열, 단백질, 효소, 또는 유기체와 구별하는데 사용된다. 그러므로, 부모 서열, 단백질, 효소, 또는 유기체는 야생형 서열, 단백질, 효소, 또는 유기체, 및 추가 변이체의 개발에 사용되는 야생형 서열, 단백질, 효소, 또는 유기체의 변이체를 포함한다. 변이체 단백질 또는 효소는 일정 정도로 그들 아미노산 서열이 부모 단백질 또는 효소와 상이하지만, 변이체는 적어도 기능적 성질, 예를 들어 각각의 부모의 효소 성질을 유지한다. 일 구현예에서, 효소 성질은 각각의 부모 효소와 비교했을 때 변이체 효소에서 개선된다. 일 구현예에서, 변이체 효소는 각각의 부모 효소와 비교했을 때 적어도 동일한 효소 활성을 가지거나 또는 변이체 효소는 각각의 부모 효소와 비교했을 때 증가된 효소 활성을 갖는다.

변이체를 설명할 때, 하기 기술된 바와 같은 명명법이 사용된다: 본 발명 내에서 사용되는 단일 아미노산에 대한 약어는 용인되는 IUPAC 1 글자 또는 3 글자 아미노산 약어에 따른다. 하기 정의가 아미노산 변화의 문맥에서 변이체를 설명하지만, 핵산은 예를 들어, 뉴클레오티드의 치환, 결실, 및/또는 삽입에 의해서 유사하게 변형될 수 있다.

"치환"은 본래 아미노산에 이어서 아미노산 서열 내 위치의 번호와, 이어서 치환된 아미노산을 제공하여 기술된다. 예를 들어, 위치 120에서 히스티딘의 알라닌으로의 치환은 "His120Ala" 또는 "H120A"로 표시된다.

"결실"은 본래 아미노산에 이어서 아미노산 서열 내 위치의 번호와, 이어서 *를 제공하여 기술된다. 따라서, 위치 150에서 글리신의 결실은 "Gly150*" 또는 G150*"로 표시된다. 대안적으로, 결실은 예를 들어, "D183 및 G184의 결실"로 표시된다.

"삽입"은 본래 아미노산에 이어서 아미노산 내 위치의 번호와, 이어서 본래 아미노산 및 추가 아미노산을 제공하여 기술된다. 예를 들어, 글리신 옆에 리신의 위치 180에서 삽입은 "Gly180GlyLys" 또는 "G180GK"로서 표시된다. 하나 초과의 아미노산 잔기가 삽입될 때, 예컨대 예를 들어 Gly180 이후에 Lys 및 Ala이 삽입될 때, 이것은 Gly180GlyLysAla 또는 G180GKA로서 표시될 수 있다.

치환 및 삽입이 동일한 위치에서 일어나는 경우에, 이것은 S99SD+S99A 또는 짧게 S99AD로서 표시될 수 있다.

존재하는 아미노산 잔기와 동일한 아미노산 잔기가 삽입되는 경우에, 명명법의 축퇴성이 발생하는 것은 분명하다. 예를 들어, 글리신이 상기 예에서 글리신 이후에 삽입되면, 이것은 G180GG로 표시된다.

다수 변경을 포함하는 변이체는 "+"로 분리되는데, 예를 들어 "Arg170Tyr+Gly195Glu" 또는 "R170Y+G195E"는 위치 170 및 195에서 아르기닌 및 글리신의 각각 티로신 및 글루탐산으로의 치환을 나타낸다. 대안적으로, 다수 변경은 공간 또는 콤마로 분리될 수 있고, 예를 들어 각각 R170Y G195E 또는 R170Y, G195E일 수 있다.

상이한 변경이 위치에 도입될 수 있는 경우에, 상이한 변경은 콤마에 의해 분리되고, 예를 들어 "Arg170Tyr, Glu"는 위치 170에서 아르기닌의 각각 티로신 또는 글루탐산으로의 치환을 나타낸다. 대안적으로, 상이한 변경 또는 선택적 치환은 괄호 안에 표시될 수 있고, 예를 들어 Arg170[Tyr, Gly] 또는 Arg170{Tyr, Gly} 또는 짧게 R170 [Y,G] 또는 R170 {Y, G}일 수 있다.

변이체는 하나 이상의 변경, 동일 유형 중 어느 하나, 예를 들어, 모든 치환, 또는 치환, 결실, 및/또는 삽입의 조합을 포함할 수 있다. 변경은 핵산 또는 아미노산 서열에 도입될 수 있다.

일 구현예에서, 서열 변이체 (즉, 아미노산 서열 변이체 또는 핵산 서열 변이체)는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40 이상의 변경을 포함한다.

변이체는 각각 SEQ ID NO: 1 내지 9 10 또는 10 내지 1820 중 어느 하나와 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 및 폴리펩티드를 포함한다.

SEQ ID NO. 1 내지 9의 임의 서열로부터 선택되는 염기 서열을 이들 서열의 나머지에서 아미노산의 존재와 관련없이 치환시키기 위해서, 하기를 적용하며, 문자는 그들 공통 약어를 사용해 L 아미노산을 표시하고 괄호의 숫자는 치환의 선호도를 나타낸다 (더 높은 숫자가 더 높은 선호도를 나타냄): A는 S (1), C (0), G (0), T (0) 또는 V (0)로부터 선택되는 임의의 아미노산으로 치환될 수 있다. C는 A (0)로 치환될 수 있다. D는 E (2), N (1), Q (0) 또는 S (0)로부터 선택되는 임의의 아미노산으로 치환될 수 있다. E는 D (2), Q (2), K (1), H (0), N (0), R (0) 또는 S (0)로부터 선택되는 임의의 아미노산으로 치환될 수 있다. F는 Y (3), W (1), I (0), L (0) 또는 M (0)으로부터 선택되는 임의의 아미노산으로 치환될 수 있다. G는 A (0), N (0) 또는 S (0)로부터 선택되는 임의의 아미노산으로 치환될 수 있다. H는 Y (2), N (1), E (0), Q (0) 또는 R (0)로부터 선택되는 임의의 아미노산으로부터 선택될 수 있다. I는 V (3), L (2), M (1) 또는 F (0)로부터 선택되는 임의의 아미노산으로 치환될 수 있다. K는 R (2), E (1), Q (1), N (0) 또는 S (0)로부터 선택되는 임의의 아미노산으로 치환될 수 있다. L은 I (2), M (2), V (1) 또는 F (0)로부터 선택되는 임의의 아미노산으로 치환될 수 있다. M은 L (2), I (1), V (1), F (0) 또는 Q (0)로부터 선택되는 임의의 아미노산으로 치환될 수 있다. N은 D (1), H (1), S (1), E (0), G (0), K (0), Q (0), R (0) 또는 T (0)로부터 선택되는 임의의 아미노산일 수 있다. Q는 mE (2), K (1), R (1), D (0), H (0), M (0), N (0) 또는 S (0)로부터 선택되는 임의의 아미노산으로 치환될 수 있다. R은 K (2), Q (1), E (0), H (0) 또는 N (0)으로부터 선택되는 임의의 아미노산으로 치환될 수 있다. S는 A (1), N (1), T (1), D (0), E (0), G (0), K (0) 또는 Q (0)로부터 선택되는 임의의 아미노산으로부터 선택될 수 있다. T는 S (1), A (0), N (0) 또는 V (0)로부터 선택되는 임의의 아미노산으로 치환될 수 있다. V는 I (3), L (1), M (1), A (0) 또는 T (0)로부터 선택되는 임의의 아미노산으로 치환될 수 있다. W는 Y (2) 또는 F (1)로부터 선택되는 임의의 아미노산으로 치환될 수 있다. Y는 F (3), H (2) 또는 W (2)로부터 선택되는 임의의 아미노산으로 치환될 수 있다.

핵산 및 폴리펩티드는 태그 또는 도메인을 포함하도록 변형될 수 있다. 태그는 검출, 정제, 가용화 또는 고정화를 포함한 다양한 목적을 위해 이용될 수 있고, 예를 들어 바이오틴, 형광단, 에피토프, 메이팅 인자, 또는 조절 서열을 포함할 수 있다. 도메인은 임의 크기일 수 있고 바람직한 기능 (예를 들어, 증가된 안정성, 가용성, 활성 부여, 정제 단순화)을 제공하고 예를 들어 결합 도메인, 신호 서열, 프로모터 서열, 조절 서열, N-말단 연장부, 또는 C30 말단 연장부를 포함할 수 있다. 태그 및/또는 도메인의 조합이 또한 이용될 수 있다.

"효소 활성"은 효소에 의해 발휘되는 적어도 하나의 촉매 효과를 의미한다. 일 구현예에서, 효소 활성은 효소의 밀리그램 당 단위 (비활성) 또는 효소의 분자 당 분 당 전환되는 기질 (분자 활성)로서 표시된다.

서열의 정렬은 바람직하게 니들만 및 분치 (Needleman and Wunsch)의 알고리즘으로 수행된다 (Needleman and Wunsch algorithm - Needleman, Saul B. & Wunsch, Christian D. (1970). "A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two prteins". Journal of Molecular Biology. 48 (3): 443-453). 이 알고리즘은 예를 들어, 2개 서열의 전체 정렬을 수행하는, "NEEDLE" 프로그램으로 구현된다. NEEDLE 프로그램은 예를 들어, 다양한 프로그램 모음인, EMBOSS (European Molecular Biology Open Software Suite)에 함유된다 (The European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS), Trends in Genetics 16 (6), 276 (2000)).

유기체의 게놈에서 표적화된 변형을 위한 다수의 기술이 공지되어 있다. CRIPR 또는 CRISPR/CAS로서 알려진 기술이 가장 광범위하게 공지되어 있다:

CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 기술은 표적 유기체의 게놈을 변형시키기 위해서, 예를 들어, 게놈의 거의 임의 부위에 임의의 소정 DNA 단편을 도입시키거나, 게놈의 일부분을 바람직한 서열로 대체하거나 또는 표적 유기체의 게놈 내 소정 영역을 정확하게 결실시키기 위해서 사용될 수 있다. 이것은 전례없는 게놈 조작의 정확성을 허용한다.

CRISPR 시스템은 스트렙토코쿠스 속에 속하는 박테리아의 적응성 방어 기전으로서 처음 확인되었다 (WO2007/025097). 이들 박테리아 CRISPR 시스템은 침입한 바이러스 DNA 내에 존재하는 상보성 서열의 분해를 유도하기 위해서 절단 단백질과 복합체를 이룬 가이드 RNA (gRNA)에 의존한다. 다양한 진핵생물 유기체에서 유전자 조작을 위해 CRISPR 시스템의 적용이 확인되었다 (WO2013/141680; WO2013/176772; WO2014/093595). CRISPR/Cas 시스템에서 최초로 확인된 단백질인, Cas9는 2개의 넌코딩 RNA: CRSIPR RNA (crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA (tracrRNA)의 복합체에 의한 PAM (protospacer adjacent motif) 서열 모티프에 인접한 DNA 표적 서열로 가이드되는 대형 단량체 DNA 뉴클레아제이다. 또한, tracrRNA와 crRNA를 융합시켜 생성된 합성 RNA 키메라 (단일 가이드 RNA 또는 sgRNA)는 동등하게 기능성인 것으로 확인되었다 (WO2013/176772). Cas9와 별개의 DNA 뉴클레아제 예컨대 Cpf1, C2c1p 또는 C2c3p를 포함하는 다른 공급원으로부터의 CRISPR 시스템은 동일한 기능성을 갖는 것으로 설명되었다 (WO2016/0205711, WO2016/205749). 다른 저자는 뉴클레아제가 RNA 분자 대신에 DNA 분자에 의해 가이드되는 시스템을 기술한다. 이러한 시스템은 예를 들어 US2016/0046963에 개시된 바와 같은 AGO 시스템이다.

몇몇 연구 그룹은 CRISPR 절단 성질이 전례없이 용이하게 거의 모든 유기체의 게놈 내 표적 영역을 파괴시키는데 사용될 수 있다는 것을 발견하였다. 최근에 복구를 위한 주형의 제공이 거의 모든 부위에서 거의 모든 바람직한 서열로 게놈의 편집을 허용하여, CRISPR을 강력한 유전자 편집 도구로 변환시킨다는 것이 분명해졌다 (WO2014/150624, WO2014/204728). 복구를 위한 주형은 각각의 뉴클레아제에 의해서 표적 핵산에 이중가닥 파괴의 도입 이후에 각 주형에서 상동성 재조합을 허용하는 표적 영역에 상보성인 서열을 3' 및 5' 말단에 포함하는 도너 핵산으로서 처리된다.

소정 게놈 내에서 표적 영역 선택의 주요 한계는 CRISPR 관련 뉴클레아제가 이중가닥 파괴를 도입시키는 영역에 가까운 PAM 서열 모티프 존재의 필수성이다. 그러나, 다양한 CRISPR 시스템이 상이한 PAM 서열 모티프를 인식한다. 이것은 개별 표적 영역에 대해 가장 적합한 CRISPR 시스템의 선택을 가능하게 한다. 게다가, AGO 시스템은 PAM 서열 모티프를 전혀 요구하지 않는다.

이 기술은 예를 들어, 상이한 강도 또는 특이성의 프로모터와 표적 유전자의 상류 프로모터를 교환함으로써, 예를 들어 임의 유기체에서 유전자 발현의 변경을 위해 적용될 수 있다. 종래 개시된 다른 방법은 CRISPR 뉴클레아제 단백질을 뺀 뉴클레아제에 대한 활성화 또는 억제성 전사 인자의 융합을 기술한다. 이러한 융합 단백질은 표적 유기체에서 임의의 바람직한 프로모터로 융합 단백질의 전사 인자 모이어티를 가이드하는 하나 이상의 가이드 핵산과 함께 표적 유기체에서 발현될 수 있다 (WO2014/099744; WO2014/099750). 유전자의 녹아웃은 예를 들어 일반적으로 유전자 파괴를 초래하는 비-상동성-말단-연결 (NHEJ)을 유도하여서, 각각의 표적 유전자로 점 돌연변이 또는 결실을 도입시켜서 쉽게 획득될 수 있다 (WO2013/176772).

"변형 유기체"는 인간 개입에 의해서 변형, 단리, 선택 및/또는 길들여진 유기체이고 야생형에서 발생되었거나 또는 발생되는 유기체와 상이하다. 변형 유기체는 본 명세서에 정의된 바와 같은 재조합 유기체 및 숙주 세포를 비롯하여, 유전자 편입의 사용없이 또는 더 이상 재조합 엘리먼트없이, 예를 들어 돌연변이형 유기체를 생성시키는데 사용되는 CRISPR 기술없이 돌연변이된 유기체를 포함한다.

"숙주 세포"

숙주 유기체라고도 하는 숙주 세포는 박테리아 세포, 효모 세포, 진균, 조류 또는 시아노박테리아 세포, 비-인간 동물 또는 포유동물 세포, 또는 식물 세포로부터 선택되는 임의 세포일 수 있다. 당업자는 관심 서열을 함유하는 숙주 세포를 성공적으로 형질전환시키고, 선택하고, 전파시키도록 유전자 구성체 상에 존재시킬 수 있는 유전자 엘리먼트에 대해 잘 알고 있다.

일 구현예에서 숙주 세포 또는 숙주 유기체는 상호교환적으로 사용된다.

전형적인 숙주 세포는 박테리아, 예컨대 그람 양성: 바실러스, 스트렙토마이세스이다. 유용한 그람 양성 박테리아는 바실러스 세포, 예를 들어 바실러스 알칼로피우스, 바실러스 아밀로리케파시엔스, 바실러스 브레비스, 바실러스 서쿨란스, 바실러스 클라우시, 바실러스 코아굴란스, 파실러스 피르무스, 바실러스 이아우투스, 바실러스 렌투스, 바실러스 리케니포르미스, 바실러스 메가테리움, 바실러스 푸밀루스, 바실러스 스테아로써모필루스, 바실러스 서브틸리스, 및 바실러스 투린지엔시스를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 가장 바람직한 원핵생물은 바실러스 세포, 바람직하게 바실러스 서브틸리스, 바실러스 푸밀루스, 바실러스 리케니포르미스, 또는 바실러스 렌투스의 바실러스 세포이다. 일부 다른 바람직한 박테리아는 악티노마이세탈레스 목의 균주, 바람직하게, 스트렙토마이세스, 바람직하게 스트렙토마이세스 스페로이데스 (ATTC 23965), 스트렙토마이세스 써모비올라세우스 (IFO 12382), 스트렙토마이세스 리비단스 또는 스트렙토마이세스 무리누스 또는 스트렙토버티실룸 버티실리움 ssp. 버티실리움을 포함한다. 다른 바람직한 박테리아는 로도박터 스파에로이데스, 로도모나스 팔루스트리, 스트렙토코쿠스 락티스를 포함한다. 추가 바람직한 박테리아는 믹소코쿠스에 속하는 균주, 예를 들어, 엠. 비레센스를 포함한다.

추가의 전형적인 숙주 세포는 그람 음성: 이. 콜라이, 슈도모나스이고, 바람직한 그람 음성 박테리아는 에스케리치아 콜라이 및 슈도모나스 sp., 바람직하게, 슈도모나스 푸로시니아 (ATCC 15958) 또는 슈도모나스 플루오레센스 (NRRL B-11)이다.

추가로 전형적인 숙주 세포는 진균, 예컨대 아스퍼질러스, 푸사리움, 트리코더마이다. 미생물은 진균 세포일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "진균"은 아스코마이코타, 바시디오마이코타, 키트리디오마이코타, 및 자이고마이코타를 비롯하여 우마이코타 및 데우테로마이코티나 문 및 모든 유사분열 포자 진균을 포함한다. 아스코마이코타의 대표적인 그룹은 예를 들어, 뉴로스포라, 유페니실리움 (=페니실리움), 에머리셀라 (=아스퍼질러스), 유로티움 (=아스퍼질러스) 및 하기 나열된 진정한 효모를 포함한다. 바시디오마이코타의 예는 버섯류, 녹병균, 및 흑수병균을 포함한다. 키트리디오마이코타의 대표적인 그룹은 예를 들어, 알로마이세스, 블라스토클라디엘라, 코엘로모마이세스, 및 수생 진균을 포함한다. 우마이코타의 대표적인 그룹은 예를 들어 사프로레그니오마이세토우스 수생 진균 (물 곰팡이) 예컨대 아클리아를 포함한다. 유사분열 포자 진균의 예는 아스퍼질러스, 페니실리움, 칸디다, 및 알테르나리아를 포함한다. 자이고마이코타의 대표적인 그룹은 예를 들어, 리조푸스 및 무코르를 포함한다.

일부 바람직한 진균은 데우테로마이코티나 아문, 하이포마이세테스 강에 속하는 균주, 예를 들어, 푸사리움, 후미콜라, 트리코더마, 마이로테시움, 버티실룸, 아르트로마이세스, 칼다리오마이세스, 울로클라디움, 엠벨리시아, 클라도스포리움 또는 드레스클레라, 특히, 푸사리움 옥시스포룸 (DSM 2672), 후미콜라 인솔렌스, 트리코더마 레시, 마이로테시움 베루카나 (IFO 6113), 버티실룸 알보아트룸, 버티실룸 다리에, 아르트로마이세스 라모수스 (FERM P-7754), 칼다리오마이세스 푸마고, 울로클라디움 카르타룸, 엠벨리시아 알리 또는 드레스클레라 할로데스를 포함한다.

다른 바람직한 진균은 바시디오마이코티나 아문, 바시디오마이세테스 강에 속하는 균주, 예를 들어, 코프리누스, 파네로카에트, 코리오루스 또는 트라메테스, 특히 코프리누스 시네레우스 f. 마이크로스포루스 (IFO 8371), 코프리누스 마크로리주스, 파네로카에테 크리소스포리움 (예를 들어, NA-12) 또는 트라메테스 (이전에 폴리포루스라고 함), 예를 들어, 티. 베르시콜로르 (예를 들어, PR4 28-A)를 포함한다.

추가의 바람직한 진균은 자이고마이코티나 아문, 마이코라세아에 강에 속하는 균주, 예를 들어, 리조푸스 또는 무코르, 특히 무코르 히에말리스를 포함한다.

추가의 전형적인 숙주 세포는 효모이다. 예컨대 피키아 종 또는 사카로마이세스 종이다. 진균 숙주 세포는 효모 세포일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "효모"는 자낭포자 효모 (엔도마이세탈레스), 담자포자 진균, 및 불완전 진균에 속하는 진균 (블라스토마이세테스)을 포함한다. 자낭포자 효모는 스퍼모프토라세아에 및 사카로마이세타세아에 과로 분류된다. 후자는 4개의 아과, 스키조사카로마이코이데아에 (예를 들어, 스키조사카로마이세스 속), 나드소니오이데아에, 리포마이코이데아에, 및 사카로마이코이데아에 (예를 들어, 클루이베로마이세스, 피키아, 및 사카로마이세스 속)를 포함한다. 담자포자 효모는 류코스포리딤, 로도스포리디움, 스포리디오볼루스, 필로바시디움, 및 필로바시디엘라 속을 포함한다. 불완전 진균에 속하는 효모는 2개 과, 스포로볼로마이세타세아에 (예를 들어, 스포로볼로마이세스 및 불레라 속) 및 크립토코카세아에 (예를 들어, 칸디다 속)로 분류된다.

또한 전형적인 숙주 세포는 진핵생물 예컨대 인간 이외의 동물, 인간이외의 포유동물, 조류, 파충류, 곤충, 식물, 효모, 진균 또는 식물이다.

일 구현예에서 변형 유기체는 원핵생물 미생물이다.

바람직하게 본 발명에 따른 숙주 유기체 또는 변형 유기체는 그람 양성 또는 그람 음성 원핵생물 미생물일 수 있다.

유용한 양성 원핵생물 미생물은 바실러스 세포, 예를 들어, 바실러스 알칼로피우스, 바실러스 아밀로리케파시엔스, 바실러스 브레비스, 바실러스 서쿨란스, 바실러스 클라우시, 바실러스 코아굴란스, 바실러스 피르무스, 바실러스 자우투스, 바실러스 렌투스, 바실러스 리케니포르미스, 바실러스 메가테리움, 바실러스 푸밀루스, 바실러스 스테아로써모필루스, 바실러스 서브틸리스, 및 바실러스 투린지엔시스를 포함한다. 가장 바람직한, 원핵생물은 바실러스 세포, 바람직하게, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 푸밀루스, 바실러스 리케니포르미스 또는 바실러스 렌투스의 바실러스 세포이다. 일부 다른 바람직한 박테리아는 티노마이세탈레스 목의 균주, 바람직하게 스트렙토마이세스, 바람직하게 스트렙토마이세스 스페로이데스 (ATTC 23965), 스트렙토마이세스 써모비올라세우스 (IFO 12382), 스트렙토마이세스 리비단스 또는 스트렙토마이세스 무리누스 또는 스트렙토버티실룸 버티실리움 ssp. 버티실리움을 포함한다. 다른 바람직한 박테리아는 로도박터 스파에로이데스, 로도모나스 팔루스트리, 스트렙토코쿠스 락티스를 포함한다. 보다 바람직한 박테리아는 믹소코쿠스에 속하는 균주, 예를 들어, 엠. 비레센스를 포함한다.

추가의 전형적인 원핵생물 유기체는 그람 음성: 에스케리치아 콜라이, 슈도모나스이고, 바람직한 그람 음성 원핵생물 미생물은 에스케리치아 콜라이 및 슈도모나스 sp., 바람직하게, 슈도모나스 푸로시니아 (ATCC 15958) 또는 슈도모나스 플루오레센스 (NRRL B-11)이다.

가장 바람직하게 원핵생물 미생물은 에스케리치아 콜라이이다.

독성 물질 예컨대 터펜의 존재 하에서 성장의 증가 및 민감성 감소의 상황에서 용어 "증가하다", "개선하다" 또는 "증강시키다"는 상호교환적으로 사용되고 본 출원의 의미에서 본 명세서에 정의된 대조군과 비교하여 적어도 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10%, 바람직하게 적어도 15% 또는 20%, 보다 바람직하게 25%, 30%, 35% 또는 40% 증가를 의미한다.

미생물의 배양은 빈번하게 세포가 다양한 영양 공급원, 예컨대 탄소 공급원, 질소 공급원, 및 세포의 성장에 필요한, 제한없이, 아미노산, 비타민, 미네랄을 포함한 다른 영양분을 함유하는 배지에서 성장되는 것이 요구된다. 발효 배지는 예를 들어 WO 98/37179에 기술된 바와 같은 최소 배지일 수 있거나, 또는 발효 배지는 복합 질소 및 탄소 공급원을 포함하는 복합 배지일 수 있고, 복합 질소 공급원은 WO 2004/003216에 기술된 바와 같이 부분적으로 가수분해될 수 있다.

따라서, 발효 배지는 배양된 미생물의 성장에 필요한 성분을 포함한다. 일 구현예에서, 발효 배지는 질소 공급원, 인 공급원, 황 공급원 및 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분, 및 임의로 미량영양분, 예컨대 비타민, 아미노산, 미네랄 및 미량 원소로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 성분을 포함한다. 일 구현예에서, 발효 배지는 또한 탄소 공급원을 포함한다. 이러한 성분을 일반적으로 당분야에 충분히 공지되어 있다 (참조: 예를 들어, Ausubel, et al, Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons, 1995; Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, 1989 Cold Spring Harbor, N.Y.; Talbot, Molecular and Cellular Biology of Filamentous Fungi: A Practical Ap-proach, Oxford University Press, 2001; Kinghom and Turner, Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi, Cambridge University Press, 1992; 및 Bacillus (Biotechnology Handbooks) by Colin R. Harwood, Plenum Press, 1989). 소정 세포 유형을 위한 배양 조건은 또한 과학 문헌 및/또는 세포 공급원 예컨대 미국 생물 자원 센터 (American Type Culture Collection) (ATCC) 및 진균 유전자 자원 센터 (Fungal Genetics Stock Center)에서 확인할 수 있다.

질소의 공급원으로서, 무기 및 유기 질소 화합물이 개별적으로, 및 조합하여 사용될 수 있다. 적합한 유기 질소 공급원은 단백질-함유 물질, 예컨대 제한없이, 식물 단백질 조제물, 대두 가루, 옥수수 가루, 완두콩 가루, 옥수수 글루텐, 면 가루, 땅콩 가루, 감자 가루, 고기 및 카세인, 젤라틴, 유청, 어분, 효모 단백질, 효모 추출물, 트립톤, 펩톤, 박토-트립톤, 박토-펩톤, 미생물 세포, 식물, 고기 또는 동물 사체 처리 폐기물, 및 이의 조합을 포함한, 미생물, 동물 또는 식물 세포로부터의 추출물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 무기 질소 공급원은 암모늄, 니트레이트, 및 나이트라이트, 및 이의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일 구현예에서, 발효 배지는 질소 공급원을 포함하고, 질소 공급원은 복합 또는 한정 질소 공급원 또는 이의 조합이다. 일 구현예에서, 복합 질소 공급원은 제한없이, 감자 단백질, 대두 단백질, 옥수수 단백질, 땅콩, 면 단백질, 및/또는 완두콩 단백질, 카세인, 트립톤, 펩톤 및 효모 추출물 및 이의 조합을 포함한, 식물 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 한정 질소 공급원은 암모니아, 암모늄, 암모늄 염, (예를 들어, 암모늄 클로라이드, 암모늄 나이트레이트, 암모늄 포스페이트, 암모늄 술페이트, 암모늄 아세테이트), 우레아, 나이트레이트, 나이트레이트 염, 나이트라이트, 및 제한없이 글루타메이트를 포함한 아미노산, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일 구현예에서, 발효 배지는 적어도 하나의 탄소 공급원을 더 포함한다. 탄소 공급원은 복합 또는 한정 탄소 공급원 또는 이의 조합일 수 있다. 다양한 당 및 당-함유 물질이 탄소의 적합한 공급원이고, 당은 상이한 중합 단계로 존재할 수 있다. 복합 탄소 공급원은 당밀, 옥수수 침지액, 사탕수수당, 덱스트린, 전분, 전분 가수분해물, 및 셀룰로스 가수분해물, 및 이의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 한정 탄소 공급원은 탄수화물, 유기산, 및 알콜을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일 구현예에서, 한정 탄소 공급원은 포도당, 프룩토스, 갈락토스, 자일로스, 아라비노스, 수크로스, 말토스, 락토스, 글루코네이트, 아세트산, 프로피온산, 락트산, 포름산, 말산, 시트르산, 푸마르산, 글리세롤, 이노시톨, 만니톨 및 솔비톨, 및 이의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일 구현예에서, 한정 탄소 공급원은 20% 이하, 10% 이하, 또는 5% 이하의 불순물을 포함할 수 있는, 시럽의 형태로 제공된다. 일 구현예에서, 탄소 공급원은 제한없이 고 프룩토스 옥수수 시럽을 포함하는, 사탕무 시럽, 사탕수수 시럽, 옥수수 시럽이다. 복합 탄소 공급원은 당밀, 옥수수 침지액, 덱스트린, 및 전분, 또는 이의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 바람직한 구현예에서 한정 탄소 공급원은 포도당, 프룩토스, 갈락토스, 자일로스, 아라비노스, 수크로스, 말토스, 덱스트린, 락토스, 글루코네이트 또는 이의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

일 구현예에서, 발효 배지는 또한 제한없이, 포스페이트 염을 포함하는 인 공급원, 및/또는 제한없이 술페이트 염을 포함하는 황 공급원을 포함한다. 일 구현예에서, 발효 배지는 또한 염을 포함한다. 일 구현예에서, 발효 배지는 제한없이 알칼리 금속 염, 알칼리토 금속 염, 포스페이트 염 및 술페이트 염을 포함하는, 하나 이상의 무기 염을 포함한다. 일 구현예에서, 하나 이상의 염은 NaCl, KH₂PO₄, MgSO₄, CaCl₂, FeCl₃, MgCl₂, MnCl₂, ZnSO₄, Na₂MoO₄ 및 CuSO₄를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일 구현예에서, 발효 배지는 또한 제한없이, 티아민 클로라이드, 바이오틴, 비타민 B12를 포함하는, 하나 이상의 비타민을 포함한다. 일 구현예에서, 발효 배지는 또한 제한없이 Fe, Mg, Mn, Co, 및 Ni를 포함하는 미량 원소를 포함한다. 일 구현예에서, 발효 배지는 Na, K, Ca, Mg, Mn, Fe, Co, Cu, 및 Ni로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 염 양이온을 포함한다. 일 구현예에서, 발효 배지는 제한없이 Ca 및 Mg을 포함한, 하나 이상의 2가 또는 3가 양이온을 포함한다.

일 구현예에서, 발효 배지는 또한 소포제를 포함한다.

일 구현예에서, 발효 배지는 또한 세포의 선별 마커가 내성을 제공하는, 제한없이, 암피실린, 테트라사이클린, 카나마이신, 하이그로마이신, 블레오마이신, 클로람페니콜, 스트렙토마이신 또는 플레오마이신을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 항생제 또는 제초제를 포함하는 선택제를 포함한다.

발효는 회분식, 반복 회분식, 유가식, 반복 유가식 또는 연속 발효 공정으로서 수행될 수 있다. 유가식 공정에서, 하나 이상의 구조적 및/또는 촉매적 요소, 예컨대 탄소 또는 질소 공급원을 포함하는 일부분 또는 어떠한 것도 발효 시작 전에 배지에 첨가되지 않고, 하나 이상의 구조적 및/또는 촉매적 요소를 포함하는 화합물의 각각 전부 또는 나머지 부분은 발효 과정 동안 공급된다. 공급에 선택된 화합물은 발효 공정에 함께 공급될 수 있거나 또는 서로 분리될 수 있다. 반복 유가식 또는 연속 발효 공정에서, 완전한 출발 배지가 추가로 발효 동안 공급된다. 출발 배지는 공급물(들)과 함께 또는 별도로 공급될 수 있다. 반복 유가식 공정에서, 생물량을 포함하는 발효 액체배지 중 일부는 규칙적인 시간 간격으로 제거되는 반면, 연속 공정에서, 발효 액체배지의 일부분의 제거는 연속적으로 일어난다. 그리하여 발효 공정은 회수된 발효 액체배지의 양에 상당하는 신선한 배지의 일부분으로 보충된다.

많은 세포 배양물은 탄소 공급원, 예컨대 포도당을 발효 동안 세포 배양물 중 기질 공급물로서 도입한다. 따라서, 일 구현예에서, 미생물을 배양하는 방법은 탄소 공급원을 포함하는 공급물을 포함한다. 탄소 공급원을 함유하는 공급물은 본 명세서에 상술되는 바와 같은 한정 또는 복합 탄소 공급원, 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다.

발효 시간, pH, 전도성, 온도, 또는 다른 특별한 발효 조건은 당분야에 공지된 표준 조건에 따라서 적용될 수 있다. 일 구현예에서, 발효 조건은 관심 단백질의 최대 수율을 수득하도록 조정된다.

일 구현예에서, 발효 동안 발효 액체배지의 온도는 30℃ 내지 45℃이다.

일 구현예에서, 발효 배지의 pH는 pH 6.5 내지 9로 조정된다.

일 구현예에서, 발효 배지의 전도성은 pH 조정 이후에 0.1 - 100 mS/cm이다.

일 구현예에서, 발효 시간은 1 - 200시간 동안이다.

일 구현예에서, 발효는 발효 배지를 교반 및/또는 진탕하면서 수행된다. 일 구현예에서, 발효는 50 - 2000 rpm에서 발효 배지를 교반하면서 수행된다.

일 구현예에서, 산소는 제한없이, 0 내지 3 bar의 공기 또는 산소의 가스 주입을 포함하여, 제한없이 가스 주입 또는 교반 및/또는 진탕을 포함하여, 배양 동안 발효 배지에 첨가된다. 일 구현예에서, 발효는 산소 포화 하에서 수행된다.

일 구현예에서, 발효 배지 및 발효 배지를 사용하는 방법은 산업적 규모의 발효를 위한 것이다. 일 구현예에서, 본 설명의 발효 배지는 적어도 20리터, 적어도 50리터, 적어도 300리터, 또는 적어도 1000리터의 배양 배지를 갖는 임의의 배양에 유용할 수 있다.

일 구현예에서, 발효 방법은 제한없이, 적어도 2 g 단백질 (건조물)/kg 미처리 발효 배지, 적어도 3 g 단백질 (건조물)/kg 미처리 발효 배지, 적어도 5 g 단백질 (건조물)/kg 미처리 발효 배지, 적어도 10 g 단백질 (건조물)/kg 미처리 발효 배지, 또는 적어도 20 g 단백질 (건조물)/kg 미처리 발효 배지의 양으로 발현되는 관심 단백질을 포함하여, 비교적 높은 수율로 관심 단백질의 생산을 위한 것이다.

내성은 실질적인 수준에서 이의 정상 기능, 예를 들어 정상 또는 어느 정도 감소된 속도로 유기체의 성장을 수행하는 유기체의 능력으로서 이해해야 한다. 독성 물질 예컨대 터펜은 그들 독성 및 용량에 의존하여, 실질적으로 감소된 성장 또는 성장의 중지를 일으킬 수 있거나 또는 심지어 유기체를 사멸시킬 수 있다. 독성 물질 예컨대 터펜에 대해 개선된 내성은 유기체에 대해서 정상적으로 보다 심각한 효과를 갖는 용량에서 유기체가 더욱 잘 수행할 수 있게 허용한다.

바람직한 구현예에서 단백질 X의 상동체는 단백질 X가 본래 발견되는 유기체와 다른 유기체에서 단백질 X에 대한 서열 및/또는 기능에서 상응하는 하나 이상의 단백질(들)이다.

관심 단백질의 활성은 상기 단백질의 정상 생물학적 기능으로서 이해되어야 한다. 불활성화는 상기 활성이 동일한 정상 수준까지 존재하는 것이 아니라, 실질적으로 하락되거나 또는 전체적으로 부재하는 것으로 이해해야 한다. 정상 수준에서 상기 관심 단백질의 존재비는 역시 정상 생물학적 기능에 요구된다. 상기 관심 단백질의 존재비가 실질적으로 감소되면, 생물학적 기능 및 그리하여 전체 활성은 감소된다. 예를 들어, 이를 코딩하는 유전자가 비-기능성이 되었거나, 부분적으로 또는 전체로 결실되었거나, 녹-아웃되었거나 또는 이의 발현이 방지되었기 때문에, 관심 단백질(들)이 부재하면, 생물학적 기능은 조만간 폐기되거나 또는 더 이상 유기체에 존재하지 않는다.

바람직한 구현예에서 터펜 화합물은 도 1에 도시된, 2.0 이하, 바람직하게 1.5 이하의 logP 값 및/또는 적어도 1.0 g/ℓ, 바람직하게 1.5 g/ℓ 이상의 수중 용해도를 갖는 C4 및 C5 알콜 물질 및/또는 임의의 이들 화합물: 이소프레놀, 프레놀, 부탄올, 이소부탄올, 바닐린이다.

다른 구현예에서 터펜 화합물은 제라니올, 시트랄, (-)-카르본, 리날로올, 파르네솔, 리모넨 및 멘톨을 포함한다.

바람직한 구현예에서 본 발명의 방법에서 유용하고/하거나 터펜에 대해 증가된 내성을 갖는 유기체는 그 유기체에서 SEQ ID NO: 2의 단백질 또는 SEQ ID NO: 2의 상동체와 처음 47 아미노산을 공유하지만, 앞쪽으로 SEQ ID NO: 2의 위치 48에 상응하는 아미노산으로부터 임의의 실질적 동일성을 공유하지 않거나, 또는 SEQ ID NO: 2의 비변형된 상동체 또는 SEQ ID NO: 2의 위치 1 내지 47에 상응하는 아미노산 이후 부분에서 SEQ NO: 2과 비교하여 단축된 것인 단백질을 포함하다.

SEQUENCE LISTING <110> BASF SE <120> Increasing terpene tolerance of host cells <130> 191584WO01 <160> 39 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 219 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <223> >yghB <400> 1 Met Ala Val Ile Gln Asp Ile Ile Ala Ala Leu Trp Gln His Asp Phe 1 5 10 15 Ala Ala Leu Ala Asp Pro His Ile Val Ser Val Val Tyr Phe Val Met 20 25 30 Phe Ala Thr Leu Phe Leu Glu Asn Gly Leu Leu Pro Ala Ser Phe Leu 35 40 45 Pro Gly Asp Ser Leu Leu Ile Leu Ala Gly Ala Leu Ile Ala Gln Gly 50 55 60 Val Met Asp Phe Leu Pro Thr Ile Ala Ile Leu Thr Ala Ala Ala Ser 65 70 75 80 Leu Gly Cys Trp Leu Ser Tyr Ile Gln Gly Arg Trp Leu Gly Asn Thr 85 90 95 Lys Thr Val Lys Gly Trp Leu Ala Gln Leu Pro Ala Lys Tyr His Gln 100 105 110 Arg Ala Thr Cys Met Phe Asp Arg His Gly Leu Leu Ala Leu Leu Ala 115 120 125 Gly Arg Phe Leu Ala Phe Val Arg Thr Leu Leu Pro Thr Met Ala Gly 130 135 140 Ile Ser Gly Leu Pro Asn Arg Arg Phe Gln Phe Phe Asn Trp Leu Ser 145 150 155 160 Gly Leu Leu Trp Val Ser Val Val Thr Ser Phe Gly 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Met Val Ala Tyr Tyr Ala Gly Gln Leu 50 55 60 Val Met Asp Thr Phe Gly Ile Ser Ile Pro Gly Leu Arg Ile Ala Gly 65 70 75 80 Gly Leu Ile Val Ala Phe Ile Gly Phe Arg Met Leu Phe Pro Gln Gln 85 90 95 Lys Ala Ile Asp Ser Pro Glu Ala Lys Ser Lys Ser Glu Glu Leu Glu 100 105 110 Asp Glu Pro Ser Ala Asn Ile Ala Phe Val Pro Leu Ala Met Pro Ser 115 120 125 Thr Ala Gly Pro Gly Thr Ile Ala Met Ile Ile Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 Val Arg Gln Ser Ser Thr Phe Ala Asp Trp Val Leu Met Val Ala Pro 145 150 155 160 Pro Leu Ile Phe Phe Leu Val Ala Val Ile Leu Trp Gly Ser Leu Arg 165 170 175 Ser Ser Gly Ala Ile Met Arg Leu Val Gly Lys Gly Gly Ile Glu Ala 180 185 190 Ile Ser Arg Leu Met Gly Phe Leu Leu Val Cys Met Gly Val Gln Phe 195 200 205 Ile Ile Asn Gly Ile Leu Glu Ile Ile Lys Thr Tyr His 210 215 220 <210> 4 <211> 413 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <223> >fabF <400> 4 Met Ser Lys Arg Arg Val Val Val Thr Gly Leu Gly Met Leu Ser Pro 1 5 10 15 Val Gly Asn Thr Val Glu Ser Thr Trp Lys Ala Leu Leu Ala 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240 Leu Glu Glu Tyr Glu His Ala Lys Lys Arg Gly Ala Lys Ile Tyr Ala 245 250 255 Glu Leu Val Gly Phe Gly Met Ser Ser Asp Ala Tyr His Met Thr Ser 260 265 270 Pro Pro Glu Asn Gly Ala Gly Ala Ala Leu Ala Met Ala Asn Ala Leu 275 280 285 Arg Asp Ala Gly Ile Glu Ala Ser Gln Ile Gly Tyr Val Asn Ala His 290 295 300 Gly Thr Ser Thr Pro Ala Gly Asp Lys Ala Glu Ala Gln Ala Val Lys 305 310 315 320 Thr Ile Phe Gly Glu Ala Ala Ser Arg Val Leu Val Ser Ser Thr Lys 325 330 335 Ser Met Thr Gly His Leu Leu Gly Ala Ala Gly Ala Val Glu Ser Ile 340 345 350 Tyr Ser Ile Leu Ala Leu Arg Asp Gln Ala Val Pro Pro Thr Ile Asn 355 360 365 Leu Asp Asn Pro Asp Glu Gly Cys Asp Leu Asp Phe Val Pro His Glu 370 375 380 Ala Arg Gln Val Ser Gly Met Glu Tyr Thr Leu Cys Asn Ser Phe Gly 385 390 395 400 Phe Gly Gly Thr Asn Gly Ser Leu Ile Phe Lys Lys Ile 405 410 <210> 5 <211> 356 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <223> >plsX <400> 5 Met Thr Arg Leu Thr Leu Ala Leu Asp Val Met Gly Gly Asp Phe Gly 1 5 10 15 Pro Ser Val Thr 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Ala Leu Val Asp Ala Glu Leu Ala Arg 65 70 75 80 Leu Ala Val Gln Asn Glu Trp Glu Gly Leu Val Ile Tyr Gly Ala Val 85 90 95 Arg Gln Val Asp Asp Leu Glu Glu Leu Asp Ile Gly Ile Gln Ala Met 100 105 110 Ala Ala Ile Pro Val Gly Ala Ala Gly Glu Gly Ile Gly Glu Ser Asp 115 120 125 Val Arg Val Asn Phe Gly Gly Val Thr Phe Phe Ser Gly Asp His Leu 130 135 140 Tyr Ala Asp Asn Thr Gly Ile Ile Leu Ser Glu Asp Pro Leu Asp Ile 145 150 155 160 Glu <210> 7 <211> 483 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <223> >trkH <400> 7 Met His Phe Arg Ala Ile Thr Arg Ile Val Gly Leu Leu Val Ile Leu 1 5 10 15 Phe Ser Gly Thr Met Ile Ile Pro Gly Leu Val Ala Leu Ile Tyr Arg 20 25 30 Asp Gly Ala Gly Arg Ala Phe Thr Gln Thr Phe Phe Val Ala Leu Ala 35 40 45 Ile Gly Ser Met Leu Trp Trp Pro Asn Arg Lys Glu Lys Gly Glu Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Glu Gly Phe Leu Ile Val Val Leu Phe Trp Thr Val Leu 65 70 75 80 Gly Ser Val Gly Ala Leu Pro Phe Ile Phe Ser Glu Ser Pro Asn Leu 85 90 95 Thr Ile Thr Asp Ala Phe Phe Glu Ser Phe Ser Gly Leu Thr Thr Thr 100 105 110 Gly Ala Thr Thr Leu Val Gly Leu Asp Ser Leu Pro His Ala Ile Leu 115 120 125 Phe Tyr Arg Gln Met Leu Gln Trp Phe Gly Gly Met Gly Ile Ile Val 130 135 140 Leu Ala Val Ala Ile Leu Pro Ile Leu Gly Val Gly Gly Met Gln Leu 145 150 155 160 Tyr Arg Ala Glu Met Pro Gly Pro Leu Lys Asp Asn Lys Met Arg Pro 165 170 175 Arg Ile Ala Glu Thr Ala Lys Thr Leu Trp Leu Ile Tyr Val Leu Leu 180 185 190 Thr Val Ala Cys Ala Leu Ala Leu Trp Phe Ala Gly Met Asp Ala Phe 195 200 205 Asp Ala Ile Gly His Ser Phe Ala Thr Ile Ala Ile Gly Gly Phe Ser 210 215 220 Thr His Asp Ala Ser Ile Gly Tyr Phe Asp Ser Pro Thr Ile Asn Thr 225 230 235 240 Ile Ile Ala Ile Phe Leu Leu Ile Ser Gly Cys Asn Tyr Gly Leu His 245 250 255 Phe Ser Leu Leu Ser Gly Arg Ser Leu Lys Val Tyr Trp Arg Asp Pro 260 265 270 Glu Phe Arg Met Phe Ile Gly Val Gln Phe Thr Leu Val Val Ile Cys 275 280 285 Thr Leu Val Leu Trp Phe His Asn Val Tyr Ser Ser Ala Leu Met Thr 290 295 300 Ile Asn Gln Ala Phe Phe Gln Val Val Ser Met Ala Thr Thr Ala Gly 305 310 315 320 Phe Thr Thr Asp Ser Ile Ala Arg Trp Pro Leu Phe Leu Pro Val Leu 325 330 335 Leu Leu Cys Ser Ala Phe Ile Gly Gly Cys Ala Gly Ser Thr Gly Gly 340 345 350 Gly Leu Lys Val Ile Arg Ile Leu Leu Leu Phe Lys Gln Gly Asn Arg 355 360 365 Glu Leu Lys Arg Leu Val His Pro Asn Ala Val Tyr Ser Ile Lys Leu 370 375 380 Gly Asn Arg Ala Leu Pro Glu Arg Ile Leu Glu Ala Val Trp Gly Phe 385 390 395 400 Phe Ser Ala Tyr Ala Leu Val Phe Ile Val Ser Met Leu Ala Ile Ile 405 410 415 Ala Thr Gly Val Asp Asp Phe Ser Ala Phe Ala Ser Val Val Ala Thr 420 425 430 Leu Asn Asn Leu Gly Pro Gly Leu Gly Val Val Ala Asp Asn Phe Thr 435 440 445 Ser Met Asn Pro Val Ala Lys Trp Ile Leu Ile Ala Asn Met Leu Phe 450 455 460 Gly Arg Leu Glu Val Phe Thr Leu Leu Val Leu Phe Thr Pro Thr Phe 465 470 475 480 Trp Arg Glu <210> 8 <211> 162 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <223> >iscR <400> 8 Met Arg Leu Thr Ser Lys Gly Arg Tyr Ala Val Thr Ala Met Leu Asp 1 5 10 15 Val Ala Leu Asn Ser Glu Ala Gly Pro Val Pro Leu Ala Asp Ile Ser 20 25 30 Glu Arg Gln Gly Ile Ser Leu Ser Tyr Leu Glu Gln Leu Phe Ser Arg 35 40 45 Leu Arg Lys Asn Gly Leu Val Ser Ser Val Arg Gly Pro Gly Gly Gly 50 55 60 Tyr Leu Leu Gly Lys Asp Ala Ser Ser Ile Ala Val Gly Glu Val Ile 65 70 75 80 Ser Ala Val Asp Glu Ser Val Asp Ala Thr Arg Cys Gln Gly Lys Gly 85 90 95 Gly Cys Gln Gly Gly Asp Lys Cys Leu Thr His Ala Leu Trp Arg Asp 100 105 110 Leu Ser Asp Arg Leu Thr Gly Phe Leu Asn Asn Ile Thr Leu Gly Glu 115 120 125 Leu Val Asn Asn Gln Glu Val Leu Asp Val Ser Gly Arg Gln His Thr 130 135 140 His Asp Ala Pro Arg Thr Arg Thr Gln Asp Ala Ile Asp Val Lys Leu 145 150 155 160 Arg Ala <210> 9 <211> 91 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <223> >frmR <400> 9 Met Pro Ser Thr Pro Glu Glu Lys Lys Lys Val Leu Thr Arg Val Arg 1 5 10 15 Arg Ile Arg Gly Gln Ile Asp Ala Leu Glu Arg Ser Leu Glu Gly Asp 20 25 30 Ala Glu Cys Arg Ala Ile Leu Gln Gln Ile Ala Ala Val Arg Gly Ala 35 40 45 Ala Asn Gly Leu Met Ala Glu Val Leu Glu Ser His Ile Arg Glu Thr 50 55 60 Phe Asp Arg Asn Asp Cys Tyr Ser Arg Glu Val Ser Gln Ser Val Asp 65 70 75 80 Asp Thr Ile Glu Leu Val Arg Ala Tyr Leu Lys 85 90 <210> 10 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> >yghB expr fwd <400> 10 ggataacaat ttcacacata ctagtcgctg ttccacagga aagtcc 46 <210> 11 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> >yghB expr rev <400> 11 ctttcgtttt atttgatgcc tggtacctag gccgggaacg gggaaaatcg 50 <210> 12 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> >rob del fwd <400> 12 aattacctga tgtcaggtgc tcgttgttga aaggatgagg atattttatg 50 <210> 13 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> >rob del rev <400> 13 gacgcccctg cattagatga gctgcagcgt taacgacgga tcggaatcag 50 <210> 14 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> >marC fwd <400> 14 cttatacttt tcgctgataa cccagataca caggataaca accaccaatg 50 <210> 15 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> >marC rev <400> 15 aatagttgaa aggcccattc gggccttttt taatggtacg ttttaatgat 50 <210> 16 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> >yghB del fwd <400> 16 gtacaatagg cagataaagg cttaaacgct gttccacagg aaagtccatg 50 <210> 17 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> >yghB del rev <400> 17 cggtacagca accgggaacg ggaaaatcgt caggcgttac agtatttttt 50 <210> 18 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> >fabF del fwd <400> 18 tctttttgtc ccactagaat cattttttcc ctccctggag gacaaacgtg 50 <210> 19 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> >fabF del rev <400> 19 gaccttttat aagggtggaa aatgacaact tagatctttt taaagatcaa 50 <210> 20 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> >plsX del fwd <400> 20 tttccccagg caactgggga aagaccaaac cgggcggcga cgataccttg 50 <210> 21 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> >plsX del rev <400> 21 caaactgcga gttcgctggc agcgtcctgc taccgcagag ttccgctttt 50 <210> 22 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> >rob H fwd <400> 22 ggataacaat ttcacacata ctagtcctga tgtcaggtgc tcgtt 45 <210> 23 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> >rob H rev <400> 23 ctttcgtttt atttgatgcc tggtacctag gtcacgaata ccaaaggcgc tcca 54 <210> 24 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> >marC35 fwd <400> 24 ggataacaat ttcacacata ctagttacac aggataacaa ccaccaatg 49 <210> 25 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> >marC35 rev <400> 25 ctttcgtttt atttgatgcc tggtacctag gtcagttgcc tgccaggcca a 51 <210> 26 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> >P yghB delta Homology fwd <400> 26 tttattgtga aaagtcttaa attgtcgtcc cggacgattc aggagtacaa 50 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> >P yghB del Hom Amp - rev <400> 27 cagcgtggca aacatgacaa 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> >P yghB del Hom Amp - fwd <400> 28 tctgattgcc gatctggacg 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> >P yghB del check - rev <400> 29 cagcagcgta cggacaaatg 20 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> >P yghB del check - fwd <400> 30 tcttaaattg ttgcgtcccg g 21 <210> 31 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> >P yghB CRISPR 20 nt rev <400> 31 ctatttctag ctctaaaacg gatcaaggcg tcccgg 36 <210> 32 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> >P yghB CRISPR 20 nt fwd <400> 32 taatacgact cactatagcg tccgggacgc cttg 34 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> >Datsenko k1 <400> 33 cagtcatagc cgaatagcct 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> >Datsenko k2 <400> 34 cggtgccctg aatgaactgc 20 <210> 35 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> >rraA Keio 1 <400> 35 atagcgcgat atactgaaaa ttctcgcagc aactgaatgt taagcctatg 50 <210> 36 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> >rraA Keio 2 <400> 36 aaaaaaggca ccttgcggtg cctttcttat cattcaatat ccagcggatc 50 <210> 37 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> >YghB Check Short Rev <400> 37 gcgtttaagc ctttatctgc ct 22 <210> 38 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> >YghB Check Short Fwd <400> 38 acttttggac aattttgcag acat 24 <210> 39 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> >Pyghb 50 bp Homology <400> 39 ttattgtgaa aagtcttaaa ttgttgcgtc ccggacgatt caggagtaca 50

Claims (15)

1. 하나 이상의 터펜 화합물에 대해 개선된 내성을 갖는 변형 유기체로서, 야생형 변형 유기체과 비교하여 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변경을 갖는 것이고, 내성은 비변형 유기체와 비교하여 개선되는 것인 변형 유기체:
   i. 하나 이상의 터펜 화합물의 존재 하에서 SEQ ID NO: 2의 단백질 또는 이의 상동체의 부재, 불활성화 또는 감소된 존재비 및 SEQ ID NO: 3의 단백질 또는 이의 상동체의 부재, 불활성화 또는 감소된 존재비 및 SEQ ID NO: 2의 단백질 또는 이의 상동체의 돌연변이형 단백질의 존재로서, SEQ ID NO: 2의 단백질 또는 이의 상동체의 돌연변이형 단백질은 비변형 유기체의 SEQ ID NO: 2의 단백질 또는 이의 상동체와 오직 처음 47 아미노산을 공유함;
   ii. 하나 이상의 터펜 화합물의 존재 하에서 SEQ ID NO: 2의 단백질 또는 이의 상동체의 부재, 불활성화 또는 감소된 존재비;
   iii. 하나 이상의 터펜 화합물의 존재 하에서 SEQ ID NO: 3의 단백질 또는 이의 상동체의 부재, 불활성화 또는 감소된 존재비;
   iv. 하나 이상의 터펜 화합물의 존재 하에서 SEQ ID NO: 2의 단백질 또는 이의 상동체의 부재 및 SEQ ID NO: 2의 단백질 또는 이의 상동체의 돌연변이형 단백질의 존재로서, SEQ ID NO: 2의 단백질 또는 이의 상동체의 돌연변이형 단백질은 SEQ ID NO: 2의 위치 48에 상응하는 위치에 돌연변이를 가짐;
   v. 하나 이상의 터펜 화합물의 존재 하에서 SEQ ID NO: 2의 단백질 또는 이의 상동체의 돌연변이형 단백질의 존재로서, SEQ ID NO: 2의 단백질 또는 이의 상동체의 돌연변이형 단백질은 SEQ ID NO: 2의 위치 48에 상응하는 위치에 돌연변이를 가짐;
   vi. 하나 이상의 터펜 화합물의 존재 하에서 비변형 유기체와 비교하여 SEQ ID NO: 1의 단백질 또는 이의 상동체의 증가된 수준 또는 증가된 활성으로서, 바람직하게 SEQ ID NO: 1의 상동체에 대한 내생성 유전자는 결실되었고 SEQ ID NO: 1 또는 이의 변이체를 코딩하는 유전자의 재조합 발현이 있고, 보다 더 바람직하게 SEQ ID NO: 1 또는 이의 변이체를 코딩하는 유전자의 재조합 발현은 저강도 내지 중간 강도 프로모터 또는 다른 제어 엘리먼트 하에 있음;
   vii. 하나 이상의 터펜 화합물의 존재 하에서 SEQ ID NO: 4의 단백질 또는 이의 상동체의 돌연변이형 단백질의 존재로서, SEQ ID NO: 4의 단백질 또는 이의 상동체의 돌연변이형 단백질은 SEQ ID NO: 4의 위치 74에 상응하는 위치에 돌연변이를 가짐;
   viii. 하나 이상의 터펜 화합물의 존재 하에서 SEQ ID NO: 5의 단백질 또는 이의 상동체의 돌연변이형 단백질의 존재, 또는 SEQ ID NO: 5의 단백질의 부재, 불활성화 또는 감소된 존재비로서, 바람직하게 SEQ ID NO: 5의 단백질 또는 이의 상동체의 돌연변이형 단백질은 a) SEQ ID NO: 5의 위치 291에 상응하는 위치에 돌연변이, 및/또는 b) SEQ ID NO: 5의 위치 274 또는 그 이후에 상응하는 위치에 돌연변이를 갖고, 돌연변이형 단백질은 SEQ ID NO: 5의 단백질 또는 이의 상동체에 비해 짧음;
   ix. 하나 이상의 터펜 화합물의 존재 하에서 SEQ ID NO: 6의 단백질 또는 이의 상동체의 돌연변이형 단백질의 존재로서, SEQ ID NO: 6의 단백질 또는 이의 상동체의 돌연변이형 단백질은 SEQ ID NO: 6의 위치 96에 상응하는 위치에 돌연변이를 갖고, 바람직하게 돌연변이는 발린을 글루탐산으로 치환한 돌연변이, 및/또는 바람직하게 글리신을 세린으로 치환한, SEQ ID NO: 6의 위치 67에 상응하는 위치에서의 돌연변이임;
   x. 하나 이상의 터펜 화합물의 존재 하에서 SEQ ID NO: 6의 단백질 또는 이의 상동체의 부재, 불활성화 또는 감소된 존재비;
   xi. 하나 이상의 터펜 화합물의 존재 하에서 변형된 SEQ ID NO: 8의 단백질 또는 이의 상동체, 바람직하게 SEQ ID NO: 8의 단백질 또는 이의 상동체의 부재, 불활성화 또는 감소된 존재비;
   xii. 하나 이상의 터펜 화합물의 존재 하에서 변형된 SEQ ID NO: 9의 단백질 또는 이의 상동체, 바람직하게 SEQ ID NO: 9의 단백질 또는 이의 상동체의 부재, 불활성화 또는 감소된 존재비;
   xiii 하나 이상의 터펜 화합물의 존재 하에서 변형된 SEQ ID NO: 7의 단백질 또는 이의 상동체, 바람직하게 SEQ ID NO: 7의 단백질 또는 이의 상동체의 부재, 불활성화, 증가된 활성 또는 감소된 존재비;
   xiv. 이전 i 내지 xiii의 임의 조합.
2. 비변형 유기체와 비교하여 변형 유기체의 하나 이상의 터펜 화합물에 대한 내성을 증가시키기 위한 방법으로서, 제1항에 따른 변형 유기체를 생성시키는 단계 및 임의로 상기 변형 유기체를 유지시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
3. 유기체를 사용하여 하나 이상의 터펜 화합물을 제조하기 위한 방법으로서, 제1항에 따른 변형 유기체를 생성시키는 단계, 변형 유기체를 성장시키고 상기 하나 이상의 터펜 화합물을 생산하기에 적합한 조건 하에서 하나 이상의 터펜 화합물의 존재 하에서 상기 변형 유기체를 유지시키는 단계 및 임의로 하나 이상의 터펜 화합물을 상기 변형 유기체로부터 분리시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 변형 유기체는 a) SEQ ID NO: 3의 단백질 또는 이의 상동체를 코딩하는 유전자의 일부분 또는 전체에서 녹-아웃 또는 결실, b) SEQ ID NO: 2의 단백질 또는 이의 상동체를 코딩하는 유전자의 일부분 또는 전체에서 녹-아웃 또는 결실, 또는 c) 하나 이상의 터펜 화합물의 존재 하에서 SEQ ID NO: 2의 단백질 또는 이의 상동체의 돌연변이형 단백질의 존재로서, SEQ ID NO: 2의 단백질 또는 이의 상동체의 돌연변이형 단백질은 비변형 유기체의 SEQ ID NO: 2의 단백질 또는 이의 상동체와 오직 처음 47 아미노산만을 공유하는 것인 존재, 또는 a) 내지 c)의 임의 조합을 포함하는 것인 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, SEQ ID NO: 6의 단백질 또는 이의 상동체를 코딩하는 유전자의 발현의 하향조절, SEQ ID NO: 6의 단백질 또는 이의 상동체를 코딩하는 유전자의 결실, 또는 SEQ ID NO: 6의 단백질 또는 이의 상동체를 코딩하는 유전자의 녹아웃 단계를 포함하는 것인 방법.
6. 모노터펜 에스테르를 제조하기 위한 방법으로서, 제3항 내지 제5항 중 어느 하나의 항의 방법에 따라 하나 이상의 모노터펜을 생산하는 단계, 및 적어도 하나의 모노터펜을 모노터펜 에스테르로 에스테르화시키는 단계, 및 임의로 하나 이상의 모노터펜 에스테르를 분리하는 단계를 포함하는 것인 방법.
7. 비변형 유기체와 비교하여 변형 유기체의 바닐린에 대한 내성을 증가시키기 위한 방법으로서, 변형 유기체에서 SEQ ID NO: 2의 단백질과 오직 처음 47 아미노산을 공유하는 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 발현 또는 생성시키는 단계를 포함하고, 변형 유기체는 SEQ ID NO: 1 및/또는 2의 단백질 또는 이의 상동체가 부재하거나, 불활성이거나 또는 실질적으로 감소된 것을 추가 특징으로 갖는 것인 방법.
8. 하나 이상의 터펜 화합물, 바람직하게 하나 이상의 터펜 또는 하나 이상의 터펜 에스테르의 존재 하에서 변형 유기체의 성장을 증가시키기 위한 탈조절된 SEQ ID NO: 2의 단백질 또는 이의 상동체의 용도.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 돌연변이형 또는 탈조절된 SEQ ID NO: 2의 단백질 또는 이의 상동체는 SEQ ID NO: 2의 위치 48에 상응하는 히스티딘 잔기의 돌연변이를 가져서 프레임시프트, 바람직하게 SEQ ID NO: 2의 단백질과 비교하여 최종 단백질을 단축시키는 프레임시프트를 생성시키는 것인 방법, 용도, 또는 변형 유기체.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, SEQ ID NO: 1 내지 9 중 어느 하나의 서열은 각 단백질에 대해 표 3에 표시된 바와 같은 돌연변이를 보유하도록 돌연변이된 것인 방법, 용도, 또는 변형 유기체.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 이소프레놀, 프레놀, 부탄올, 이소부탄올, 바닐린, 제라니올, 산탈렌, 발렌센, 스클라레올, 아르테미신산 알콜, 아르테미신산 및/또는 시트랄에 대한 내성이 비변형 유기체와 비교하여 증가된 것인 방법, 용도, 돌연변이형 단백질 또는 변형 유기체.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 이소프레놀, 프레놀, 부탄올, 이소부탄올 및/또는 바닐린에 대한 내성이 비변형 유기체와 비교하여 증가된 것인 방법, 용도, 돌연변이형 단백질 또는 변형 유기체.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 적어도 하나의 터펜 화합물은 2.0 이하, 바람직하게 1.5 이하의 logP 값을 갖는 것인 방법, 용도 또는 변형 유기체.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서, 적어도 하나의 터펜 화합물의 수중 용해도는 적어도 1.0 g/ℓ, 바람직하게 1.5 g/ℓ 이상인 방법, 용도 또는 변형 유기체.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 있어서, 적어도 하나의 터펜 화합물은 모노터펜 알콜 또는 C4 및 C5 알콜인 방법, 용도 또는 변형 유기체.

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