MXPA06005530A

MXPA06005530A - Expresion en trichoderma de enzimas hidrolizantes de almidon granular y procedimiento para producir glucosa a partir de sustratos de almidon granular.

Info

Publication number: MXPA06005530A
Application number: MXPA06005530A
Authority: MX
Inventors: Bruce A Strohm
Original assignee: Genencor Int
Priority date: 2003-11-21
Filing date: 2004-11-18
Publication date: 2006-08-17
Also published as: US20080108125A1; US7262041B2; EP1685244A2; US7335503B2; KR20070019961A; US20050208623A1; ATE550424T1; AU2009203191A1; US20120156329A1; US8323932B2; US20130122569A1; EP1698692A3; WO2005052148A2; BRPI0416762A; CN102174490A; EP1698692A2; JP2007512813A; SI1685244T1; CN1875099B; EP1685244B8

Abstract

La presente invencion se relaciona con celulas hospedadoras micoticas filamentosas y particularmente con celulas hospedadoras Trichoderma utiles para la produccion de enzimas hidrolizantes de almidon granular heterologo que tienen actividad de glucoamilasa (GSHE). Ademas, la invencion se relaciona con un metodo para producir un jarabe de glucosa que comprende poner en contacto una suspension de almidon granular que se obtiene a partir de un sustrato de almidon granular simultaneamente con una a amilasa y una GSHE a una temperatura igual o inferior a la temperatura de gelatinizacion del almidon granular para obtener una composicion de un jarabe de glucosa.

Description

EXPRESIÓN EN TRICHODERMA DE ENZIMAS HIDROLIZANTES DE ALMIDÓN GRANULAR Y PROCEDIMIENTO PARA PRODUCIR GLUCOSA A PARTIR DE SUSTRATOS DE ALMIDÓN GRANULAR CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con células hospedadoras micóticas filamentosas útiles para la expresión de enzimas heterólogas hidrolizantes de almidón granular que tienen actividad de glucoamilasa (GSHE) . La invención se relaciona además con el uso de las GSHE en métodos para producir jarabe de glucosa y otros productos finales a partir de sustratos de almidón granular gue comprende poner en contacto un sustrato de almidón granular, en o por debajo de la temperatura de gelatinización del azúcar granular, simultáneamente con una amilasa licuante de almidón y una GSHE. La invención se relaciona además con composiciones de enzima que comprenden la GSHE y amilasa licuante de almidón.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La fermentación industrial utiliza de manera predominante glucosa como una materia prima para la producción de una multitud de proteínas, enzimas, aminoácidos, alcoholes, ácidos orgánicos, sustancias farmacéuticas y otras sustancias químicas . En muchas aplicaciones, la glucosa es producida por conversión Ref.: 171960 enzimática de sustrato de carbono tales como biomasa y almidón. El almidón, el cual se encuentra abundantemente en plantas verdes, se acumula como granulos microscópicos que varían de diámetro desde 0.5 hasta 175 micrómetros. La naturaleza cristalina parcial de estos granulos de almidón imparte insolubilidad en agua fría. Como un resultado, la solubilización de granulos de almidón en agua requiere una cantidad considerable de energía térmica para romper la estructura cristalina del granulo lo que resulta en la solubilización de almidón parcialmente hidrolizado. Se han utilizado numerosos procedimientos de solubilización y estos incluyen sistemas de calentamiento directo e indirecto tal como calentamiento directo por inyección de vapor (véase, por ejemplo, Starch Chemistry and Technology, eds R. L. histler et al., 2da edición; 1984 Academic Press Inc., Orlando, FL; Starch Cenversion Technology, Eds. G. M. A. Van Beynum et al., Food Science and Technology Series, arcel Dekker Inc., NY; and The Alcohol Textbook, 3rd Ed. , Eds. K. Jacques, T. P. Lyons and D. R. Kelsall, 1999, Nottingham University Press, UK) . En general se han utilizado dos etapas enzimáticas para la hidrólisis de almidón a glucosa. La primera etapa es una etapa de licuefacción y en la segunda etapa es una etapa de sacarificación. En la etapa de licuefacción, los granulos de almidón insoluble se suspenden en agua, se gelatinizan con calor y se hidrolizan por una a amilasa termoestable (EC.3.2.1.1, a (1-4) -glucan glucanohidrolasa) en presencia de calcio agregado para producir una masa de dextrinas . La masa resultante generalmente se enfría a aproximadamente 60 a 65 °C. En la etapa de sacarificación, las dextrinas solubles (azúcares) se hidrolizan adicionalmente a dextrosa (glucosa) por una enzima que tiene actividad de glucoamilasa (EC 3.2.1.3 a (1,4) -glucan glucohidrolasa) . La glucosa después se puede utilizar como un producto final o se puede utilizar como un precursor que va a ser convertido en otros productos finales deseados importantes comercialmente tales como fructosa, sorbitol, etanol, ácido láctico, intermediarios de ácido ascórbico (ASA, por sus siglas en inglés) y 1,3-propanodiol . A finales de la década de 1950, las glucoamilasas derivadas Aspergillus niger fueron comercializadas y estas enzimas mejoraron de manera significativa la conversión de almidón a glucosa. Otra mejora significativa se produjo en la década de 1970. Se pudo derivar y comercializar de Bacillus licheniformis (USP 3,912,590) una a amilasa termoestable que tiene una termoestabilidad, estabilidad a pH mejoradas y una menor dependencia a calcio. Se han adaptado procedimientos industriales adicionales por la industria edulcorante de almidón para el procedimiento de licuefacción de enzima (USP 5,322,778).

Algunos de estos procedimientos incluyen un procedimiento de baja temperatura (105-110°C durante 5-8 min) con menores requerimientos de vapor y un procedimiento de alta temperatura (148°C +/- 5°C durante 8-10 seg) , lo cual mejora la gelatinización de los granulos de almidón lo que resulta en características mejoradas de filtración y calidad del sustrato de almidón licuado (Shetty, et al., (1988) Cereal Foods World 33:929-934) . Aunque se ha establecido bien la enzima de los procedimientos de licuefacción de almidón, las mejoras con respecto a las pérdidas por rendimiento, costos de procesamiento, consumo de energía, ajustes de pH, umbrales de temperatura, requerimiento de calcio y las concentraciones de almidón retrogrado pueden ser deseables. En particular, es bien sabido que la a amilasa residual de la etapa de licuefacción, bajo condiciones de sacarificación, tiene un efecto perjudicial en la eficacia del procedimiento y que la a. amilasa residual puede ser inactivada antes de sacarificación por glucoamilasas . La inactivación generalmente es acompañada por disminución del pH del almidón licuado a un pH de 4.2 a 4.5 a 95°C. Otra desventaja del procedimiento de licuefacción es la isomerización alcalina de grupos reductores . La isomerización alcalina resulta en la formación de un disacárido, maltulosa (4-a-D-glucopiranosil-D-fructosa) . La maltosa disminuye el rendimiento de glucosa debido a que es resistente a la hidrólisis por glucoamilasas y a amilasas . Además, es difícil de controlar la formación de productos de reacción por reversión catalizados por glucoamilasas activas a una concentración elevada de glucosa. Las glucoamilasas de Aspergillus niger generalmente son termoestables bajo condiciones típicas de sacarificación. Por lo tanto, una cantidad sustancial de la actividad de glucoamilasa puede permanecer después de la reacción de sacarificación. Las soluciones a algunos de los problemas como se discuten en la presente han sido sugeridas por diversos investigadores. Por ejemplo, Leach et (USP 4,113,509 y USP 3,922,196) describe un procedimiento para convertir almidón granular (refinado) en un hidrolizado soluble al incubar el almidón granular con a amilasa bacteriana a una temperatura inferior a la temperatura de gelatinización del almidón. Después se utiliza ß amilasa para hidrólisis con el fin de producir jarabe con alta concentración de maltosa. La solicitud de patente Europea No. 0350737 A2 describe un procedimiento para producir jarabe de maltosa por hidrólisis de un almidón granular (purificado) a partir de maíz, trigo, papa y remolacha a 60°C sin la etapa de licuefacción convencional (gelatinización seguida por licuefacción a alta temperatura) utilizando una a amilasa de Bacillus stearothermophilus.

Un procedimiento de etapas múltiples para convertir almidón granular (crudo) a glucosa utilizando glucoamilasa demuestra que la capacidad de hidrolización del almidón crudo ha sido descrito previamente (USP 4,618,579). No obstante, solo 60% del almidón se hidroliza, lo cual después resulta en un procedimiento de reciclado extenso. No solo sería ventajoso una mejora en los procedimientos convencionales para conversión de almidón granular sino también sería deseable proporcionar procedimientos que resulten en una expresión y producción aumentadas de las enzimas utilizadas hasta ahora. Por ejemplo, las glucoamilasas que tienen actividad hidrolizante de almidón granular con características mejoradas tales como una actividad específica aumentada, intervalos de pH diferentes y/o niveles de glucosilación diferentes pueden ser particularmente ventajosos para uso en la conversión de almidón industrial . La presente invención no solo satisface parte de estas necesidades sino que también resulta en un incremento en la eficacia para producir diversos productos finales que se obtienen a partir de la hidrólisis de almidón.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Una modalidad de la presente invención se relaciona con un procedimiento de una etapa para convertir almidón granular a glucosa al hidrolizar almidón granular en por debajo de la temperatura de gelatinización del sustrato de almidón granular, al poner en contacto simultáneamente el sustrato de almidón no gelatinizado con una a amilasa de acción endo y una enzima sacarificante que tiene actividad de glucoamilasa, y de manera más específica que tiene actividad hidrolizante de almidón granular. La presente invención encuentra utilidad y una mejora con respecto a los procedimientos de la técnica anterior en por lo menos una de las siguientes maneras : a) tanto la a amilasa como la glucoamilasa tienen actividad hidrolizante de almidón granular y son activas durante la sacarificación; b) el sustrato de almidón se utiliza en forma granular y el almidón es hidrolizado; c) se utiliza un pH único para solubilización y sacarificación del almidón granular; d) el período de tiempo de sacarificación es más corto utilizando almidón granular en comparación con el tiempo de sacarificación utilizando sustrato de almidón licuado; e) se obtiene un jarabe con alta concentración de glucosa, con un contenido reducido de azúcares superiores en comparación con el jarabe de glucosa que se obtiene a partir del sustrato de almidón licuado; f) se reduce la pérdida de glucosa para formación de maltulosa; g) se eliminan o minimizan las reacciones de Milliard; h) es menor el riesgo de una formación de un polímero de almidón positivo al yodo (Blue-Sac) después de sacarificación debido a formación de almidón retrograda a partir del cocinado al chorro; i) se elimina la adición de calcio a la suspensión de almidón; y j) se mejora la filtración debido a que el almidón hidrolizado no tapará el sistema de filtración. Los métodos y composiciones abarcados por la invención ofrecen un medio más económico y eficaz para producir alimentación de glucosa para las sustancias químicas industriales y de especialidad. En un aspecto de la invención se proporciona una cepa micótica filamentosa transformada con un polinucleótido heterólogo que codifica para una enzima hidrolizante de almidón granular que tiene actividad de glucoamilasa (GSHE) . 'V Una cepa micotica filamentosa preferida es una cepa de Trichoderma y de manera más específica una cepa de T. reesei, la cual exprese y secreta GSHE al medio de cultivo. En algunas modalidades de este aspecto, la invención pertenece a un método para producción de un GSHE en una célula hospedadora filamentosa la cual comprende transformar las células hospedadoras micóticas filamentosas con una construcción (plásmido recombinante) de ADN que comprende un promotor que tiene una actividad transcipcional en la célula hospedadora micótica filamentosa unida operablemente a un polinucleótido heterólogo que codifica para una GSHE, cultivar la célula hospedadora micótica filamentosa transformada en un medio de cultivo adecuado para permitir la expresión de GSHE y producir la GSHE. En otras modalidades, el polinucleótido heterólogo que codifica para GSHE se deriva de una cepa de Humicola grísea o una cepa de Aspergillus awamori . En otras modalidades, la GSHE tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia con la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 3, o por lo menos 90% de identidad con la SECUENCIA DE IDENTIDAD NÚMERO: 6. En modalidades adicionales se recupera la GSHE producida por la célula hospedadora recombinante . En un segundo aspecto, la invención incluye un caldo de fermentación producido a partir de un cultivo de Trichoderma reesei recombinante, en donde la T. reesei comprende un polinucleótido heterólogo que codifica para GSHE que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia con la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 3, o por lo menos 90% de identidad de secuencia con la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO : 6. En un tercer aspecto, la invención pertenece a un procedimiento de una etapa para producir un jarabe de glucosa a partir de un sustrato de almidón granular, el procedimiento comprende: a) poner en contacto una suspensión de un sustrato de almidón granular que tiene un contenido de sólido seco (ds) de 10-55%, simultáneamente con una a amilasa y una enzima hidrolizante de almidón granular que tiene actividad de glucoamilasa (GSHE) a una temperatura igual o por debajo de la temperatura de gelatinización del sustrato de almidón, y b) permitir que la a amilasa y la GSHE actúen por un período de tiempo suficiente para hidrolizar el almidón granular para obtener un jarabe de glucosa. En una modalidad, por lo menos 95% del almidón granular es hidrolizado. En una segunda modalidad, el rendimiento del jarabe de glucosa es de por lo menos 90% en peso. En una tercera modalidad, el contenido de sólido seco del sustrato de almidón granular está entre aproximadamente 15 y 40%. En una cuarta modalidad, el período de tiempo para hidrolizar el almidón granular está en el intervalo de aproximadamente 5 horas a 100 horas. En una quinta modalidad, la a amilasa es una enzima que tiene EC 3.2.1.1. En una sexta modalidad, la a amilasa se deriva de un Bacillus y particularmente una cepa de B . stearothermophilus . En modalidades adicionales, la a amilasa se deriva de una cepa recombinante de Bacillus . En una séptima modalidad, la GSHE es una glucoamilasa derivada de una cepa de Humicola grísea var. thermoidea o una cepa Aspergillus awamori var. kawachi . En una octava modalidad, la GSHE es una glucoamilasa derivada de una cepa recombinante de Trichoderma y particularmente una cepa T. reesei la cual expresa un gen heterólogo que codifica para la GSHE de Humicola grísea o una GSHE de Aspergillus awamori var. kawachi . En una novena modalidad, el procedimiento comprende además separar el jarabe de glucosa, particularmente por filtración. En una décima modalidad, la glucosa del jarabe de glucosa se convierte adicionalmente a fructosa. En una décima primera modalidad, la temperatura del procedimiento de una etapa se lleva a cabo entre aproximadamente 50 y aproximadamente 70°C. En una décima segunda modalidad, el pH del procedimiento se lleva a cabo a un pH de 4.5 a 6.5. En un cuarto aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento de una etapa para producir un jarabe de glucosa a partir de un sustrato de almidón de maíz granular, el procedimiento comprende: (a) poner en contacto una suspensión de sustrato de almidón granular que tiene un contenido sólido seco (ds, por sus siglas en inglés) de 25-45% simultáneamente con amilasa derivada de un Bacillus y una glucoamilasa que tiene actividad hidrolizante de almidón granular la cual se deriva de una fuente micótica, a una temperatura de aproximadamente 55 a 65 °C y un pH de aproximadamente 5.0 a 6.0 y permitir que la OÍ amilasa y la glucoamilasa que tiene actividad hidrolizante de almidón granular actúen por un período de tiempo suficiente para hidrolizar el almidón granular para obtener un jarabe de glucosa. En una modalidad, por lo menos 80% del almidón granular se hidroliza y el rendimiento de jarabe de glucosa es de por lo menos 90% en peso. En una segunda modalidad, la glucoamilasa es una GSHE derivada de una Trichoderma reesei recombinante la cual expresa un polinucleótido heterólogo que codifica para GSHE de Humicola grísea o una GSHE de Aspergillus awamori var. kawachi . En un quinto aspecto, la invención se relaciona con un método de hidrolización de almidón granular que comprende poner en contacto una suspensión de almidón granular que tiene un contenido de sólido seco de 20-55% simultáneamente con una amilasa y una glucoamilasa que tiene una actividad hidrolizante de almidón granular que se obtiene de una cepa Trichoderma que comprende un polinucleótido heterólogo que codifica para una GSHE derivada de Humicola grísea y que permite a la amilasa y la glucoamilasa actuar por un período de tiempo suficiente para hidrolizar el almidón granular. En una modalidad, por lo menos 90% del almidón granular es hidrolizado. En una segunda modalidad, el almidón granular es almidón de maíz o almidón de trigo. En una tercera modalidad, la GSHE se proporciona a la suspensión en una concentración de entre aproximadamente 0.5 a 1.0 unidades GSHE de GA humicola/g de almidón; la a amilasa se proporciona a la suspensión en una concentración de entre aproximadamente 0.1 a 0.5 kg/MT de almidón, el pH de la suspensión se ajusta a aproximadamente pH 4.5 a 6.0; y la temperatura de la suspensión se ajusta a aproximadamente 55 a 65°C. En un sexto aspecto, la invención se relaciona con un método para producir un jarabe de glucosa que comprende poner en contacto un sustrato de almidón granular simultáneamente con una amilasa y una enzima hidrolizante de almidón granular (GSHE, por sus siglas en inglés) , en donde la GSHE es secretada de una cepa micótica filamentosa, la cepa micótica comprende un polinucleótido heterólogo que codifica para una GSHE derivada de una cepa Humicola y que tiene la secuencia de aminoácidos de por lo menos 90% de identidad de la SECUENCIA DE IDENTIDAD NUMERO: 3 para obtener un jarabe de glucosa. En una modalidad, la glucosa se convierte adicionalmente a un producto final deseado. En un séptimo aspecto, la invención se relaciona con una composición enzimática que comprende una a amilasa y una glucoamilasa que tiene actividad hidrolizante de almidón granular. En una modalidad, la o¡ amilasa se deriva de el género Bacillus y la GSHE se deriva de GSHE de Humicola grísea. En una segunda modalidad, la GSHE se deriva de una cepa Trichoderma sometida a ingeniería genética para incluir un polinucleótido que codifica para GSHE de Humicola grísea . En una tercera modalidad, el pH de la composición está entre pH 4.5 y 6.5. En una cuarta modalidad, la a amilasa se deriva de una cepa de B . stearothermophilus . En una modalidad adicional, la proporción de a amilasa respecto a GSHE en la composición de enzima es de 15:1 a 1:15. En un octavo aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para la producción de un jarabe basado en almidón con alta concentración de fructosa que comprende convertir el jarabe de glucosa obtenido por un método abarcado por la invención en un jarabe basado en fructosa. En un noveno aspecto, la invención se relaciona con un método para producir un producto final en donde el jarabe de glucosa obtenido por un método abarcado por la invención se somete a fermentación. En algunas modalidades de este aspecto, el producto final es un alcohol y preferiblemente etanol. En modalidades adicionales de este aspecto, la fermentación se lleva a cabo simultáneamente con la etapa de contacto, y en otras modalidades la fermentación se lleva a cabo por separado y secuencialmente a la etapa de contacto. En modalidades adicionales, el producto de fermentación se separa del caldo de fermentación. En un décimo aspecto, la invención se relaciona con un método para producir almidón residual al separar el jarabe de glucosa producido de acuerdo con el método de la invención y retener la composición que comprende almidón residual . En una modalidad, el almidón residual se utiliza para la producción de productos finales. En una segunda modalidad, el almidón residual se recicla y se pone en contacto simultáneamente con una GSHE y una a amilasa a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización del almidón granular.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LAS FIGURAS La figura 1 proporciona la secuencia de ADN genómico que codifica para la enzima hidrolizante de almidón granular nativa de H. grísea var. thermoidea que tiene actividad glucoamilasa (GSHE, por sus siglas en inglés) (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 1) . Los intrones putativos están en negrillas y subrayados . La figura 2A proporciona una secuencia de señal y la secuencia madura de aminoácidos para la GSHE de H. grisea var. thermoidea (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 2) . La secuencia de señal putativa está en negrillas y subrayada. La figura 2B proporciona la secuencia madura de aminoácidos para la GSHE de H. grisea var. thermoidea (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 3) . La figura 3 proporciona una ilustración del plásmido pTrex3g_N13, el cual se utiliza para la expresión del ácido nucleico que codifica para la GSHE de Humicola grisea el cual contiene sitios Xbal que flanquean al vector de expresión micótico, en donde: a) el promotor cbhl es el promotor de celobiohidrolasa de Trichoderma reesei , b) H. grisea glal es el polinucleótido que codifica para la GSHE de Humicola grisea de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 3, c) el terminador cbhl es el terminador de celobiohidrolasa de Trichoderma reesei , y d) amdS es el gen marcador de acetamidasa de Aspergillus nidulans . Las figuras 4A-4E proporcionan la secuencia nucleotídica (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚEMRO: 11) (10738 pares de bases) del plásmido pTrex3g_N13 de la figura 3. La figura 5 proporciona un gen de SDS-PAGE que indica la expresión de GSHE de H. grisea var. thermoidea en una corrida de fermentación representativa para clones de Trichoderma reesei como se describe en el ejemplo 1. El carril 1 representa el marcador de peso molecular comercial, SeeBlue (Invitrogen) ; el carril 2 es un testigo o blanco; el carril 3 presenta la expresión de rGSHE a las 48 horas; el carril 4 muestra la expresión de rGSHE a las 56 horas; y el carril 5 muestra la expresión de rGSHE a las 64 horas. La figura 6 proporciona la secuencia de ADN genómico que codifica para GSHE de Aspergillus awamori var. kawachi (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO 4) . Los intrones putativos están en negrillas y subrayados . La figura 7A proporciona la secuencia de señal y la secuencia madura de aminoácidos para GSHE de A. awamori var. kawachi (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 5) . La secuencia de señal está en negrillas y subrayada. La figura 7B proporciona la secuencia madura de aminoácidos para GSHE de Aspergillus awamori var. kawachi (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 6) . Las figuras 8A y 8B ilustran la estabilidad de pH como porcentaje de actividad residual para GSHE de Humicola grisea var. thermoidea nativa (nGSHE, por sus siglas en inglés) y GSHE de H. grisea var. thermoidea expresada (RGSHE, por sus siglas en inglés) en un hospedador de T. reesei (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 3), como se describe en el ejemplo 1. La figura 9 ilustra la hidrólisis de almidón de maíz medida como mg de glucosa/mg de proteína con respecto al tiempo para la GSHE de Humicola grisea var. thermoidea y la GSHE de H. grisea var. thermoidea expresada en el huésped recombinante de Trichoderma reesei , como se describe en el ej emplo 1. la figura 10 proporciona un gel de SDS-PAGE que indica la expresión de GSHE Aspergillus awamori var. kawachi en una corrida de fermentación representativa para clones de Trichoderma reesei como se describen en el ejemplo 2. El carril 1 representa el marcador de peso molecular comercial SeeBlue (Invitrogen) ; el carril 2 presenta la expresión de rGSHE a las 162 horas, y el carril 3 es un control, el cual muestra al hospedador Trichoderma reesei no transformado a las 162 horas. La figura 11 es un diagrama general que ilustra una modalidad del procedimiento de la invención para la producción de glucosa de baja energía a partir de sustratos de almidón granulares . Las figuras 12A-12D ilustran una micrografía electrónica de exploración de un granulo de almidón de maíz típico antes de su exposición a un procedimiento de la invención: (a) y las micrografías electrónicas de exploración (b-d) de almidón residual después de la exposición al procedimiento abarcado por la invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En algunos aspectos, la presente invención se basa en técnicas y métodos sistemáticos utilizados en el campo de la ingeniería genética y la biología molecular. Los siguientes recursos incluyen descripciones de la metodología general útil de acuerdo con la invención: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed. , 1989); Kreigler, Gene Transfer and Expression; A Laboratory Manual (1990) and Ausubel et al., Eds. Current Protocols in Molecular Biology (1994) . A menos que se indique de otra manera en la presente, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado al entendido comúnmente por una persona habitualmente experta en la técnica a la cual pertenece la invención. Singleton, et al . , Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2D ED., John Wiley and Sons, New York (1994) and Hale & Markham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991) proporcionan a una persona experta con un diccionario general de muchos de los términos utilizados en esta invención. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente se puede utilizar en la práctica o en pruebas de la presente invención, los métodos y materiales preferidos son los que se describen. La invención ahora se describirá con detalle a modo de referencia únicamente utilizando las siguientes definiciones y ejemplos. Todas las patentes y publicaciones, incluyendo todas las secuencias descritas dentro de tales patentes y publicaciones, a las que se haga referencia en la presente se incorporan de manera expresa como referencia. Los intervalos numéricos son incluyentes y los números definen el intervalo. A menos que se indique de otra manera, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en una orientación 5' a 3'; las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha desde su orientación amino a carboxi, respectivamente . Los encabezados que se proporcionan en la presente no son limitaciones de los diversos aspectos o modalidades de la invención, los cuales pueden ser retenidos como referencia para la especificación en su totalidad.

A. Definiciones Como se utiliza en la presente, el término "almidón" se refiere a cualquier material constituido de carbohidratos polisacáridos complejos de plantas, constituidos de amilosa y/o amilopectina con la fórmula (CsH10?5)?, en donde X puede ser cualquier número. En particular, el término se refiere a cualquier material basado en plantas que incluye pero que no se limita a granos, pastos, tubérculos y raíces, y de manera más específica a las plantas de trigo, cebada, maíz, centeno, arroz, sorgo, leguminosas, casava, mijo, papa, remolacha y tapioca. El término "almidón granular" se refiere a almidón no cocinado (crudo) , el cual no ha sido sometido a gelatinización. El término "gelatinización de almidón" significa solubilización de una molécula de almidón para formar una suspensión viscosa. El término "temperatura de gelatinización" se refiere a la temperatura más baja a la cual comienza la gelatinización de un sustrato de almidón. La temperatura exacta depende del sustrato de almidón específico y además puede depender de la variedad particular de especie vegetal de la cual se obtenga el almidón así como de las condiciones de crecimiento. El término "DE" o "equivalente de dextrosa" es un estándar de la industria para medir la concentración de azúcares reductores totales, calculados como D-glucosa, en una base en peso seco. El almidón granular no hidrolizado tiene un DE que es esencialmente 0 y la D-glucosa tiene un DE de 100. El término "jarabe de glucosa" se refiere a una composición acuosa que contiene sólidos de glucosa. En una modalidad, el jarabe de glucosa incluirá por lo menos 90% de D-glucosa y en otra modalidad el jarabe de glucosa incluirá por lo menos 95% de D-glucosa. En algunas modalidades se utilizan intercambiablemente los términos "glucosa", "jarabe de glucosa" y "dextrosa" . El término "contenido de azúcar total" se refiere al contenido de azúcar total presente en una composición de almidón. El término "contenido de sólidos secos (ds) " se refiere a los sólidos totales de una suspensión (en %) , en una base en peso seco. El término "Brix" se refiere a una escala de hidrómetro bien conocida para medir el contenido de azúcar de una solución a una temperatura dada. La escala Brix mide el número de gramos de sacarosa presentes por 100 gramos de solución de azúcar acuosa (el contenido de sólidos solubilizado total) . Las mediciones Brix se realizan frecuentemente mediante el uso de un hidrómetro o refractómetro . El término "enzima licuante de almidón" se refiere a una enzima que lleva a cabo la fluidización de almidón granular. Los ejemplos de enzimas licuantes de almidón incluyen las a amilasas (E.C. 3.2.1.1). El término "amilasas" se refiere a enzimas que catalizan la hidrólisis de almidones. El término "a-amilasa (E.C. clase 3.2.1.1)" se refiere a enzimas que catalizan la hidrólisis de enlaces a-1,4-glucosidicos. Estas enzimas también han sido descritas como aquellas que llevan a cabo la exo o endo idrólisis de enlaces 1,4-a-D-glucosidicos en polisacáridos que contienen unidades de D-glucosa unidas 1,4-OÍ. Otro término utilizado para describir estas enzimas es glucogenasa. Las enzimas ejemplares incluyen a-l,4-glucano 4-glucanohidrasa glucanohidrolasa . Los términos "enzima de sacarificación" y "glucoamilasa", utilizados de manera intercambiable en la presente, se refieren a la clase amiloglucosidasa de enzimas (EC. 3.2.1.3, glucoamilasa, a-1, 4-D-glucan glucohidrolasa) .

Estas son enzimas de acción exo, las cuales liberan residuos glucosilo a partir de los extremos no reductores de moléculas de amilosa y amilopectina. Las enzimas también hidrolizan enlaces OÍ-1,6 y -1,3, aunque a velocidades mucho menores que los enlaces a-1,4. El término "enzima hidrolizante de almidón granular (GSHE, por sus siglas en inglés)" o "una enzima que tiene actividad hidrolizante de almidón granular" , como se utiliza en la presente, se refiere específicamente a una enzima que tiene actividad glucoamilasa y que tiene la capacidad de hidrolizar almidón en forma granular. Las GSHE preferidas son aquellas derivadas de hongos filamentosos en donde la GSHE es endógena o exógena a la célula micótica filamentosa. Una GSHE preferida es la GSHE nativa derivada de Humicola grisea var. thermoidea . Otra GSHE preferida se deriva de Aspergillus awamori var. kawachi . Una GSHE particularmente preferida es una GSHE recombinante que es una GSHE que se expresa en una cepa hospedadora que ha sido sometida a ingeniería genética para incluir un polinucleótido heterólogo que codifica para GSHE. En algunas modalidades preferidas, la GSHE se expresa como una enzima extracelular. El término "hidrólisis de almidón" se refiere a la separación de enlaces glucosidicos con la adición de moléculas de agua. El término "grado de polimerización (DP, por sus siglas en inglés) " se refiere al número (n) de unidades de anhidroglucopiranosa en un sacárido dado. Los ejemplos de DPI son los monosacáridos tales como glucosa y fructosa. Los ejemplos de DP2 son los disacáridos tales como maltosa y sacarosa. Un DP4+ (>DP3) indica polímeros con un grado de polimerización mayor de 3. El término "poner en contacto" se refiere a la colocación de las enzimas respectivas en proximidad suficientemente cercana al sustrato respectivo para permitir que las enzimas conviertan el sustrato en el producto final . Los expertos en la técnica reconocerán que las soluciones de mezclado de la enzima con los sustratos respectivos pueden llevar a cabo el contacto. El término "conversión enzimática" en general se refiere a la modificación de un sustrato por la acción de las enzimas. El término, como se utiliza en la presente, también se refiere a la modificación de un sustrato de almidón granular por la acción de una enzima. En una modalidad preferida, la conversión enzimática de un sustrato de almidón granular resultará en un jarabe de glucosa. El término "suspensión" se refiere a una mezcla acuosa que contiene granulos insolubles de almidón. El término "glucosilación" se refiere a la modificación post transcripcional de una proteína mediante la adición de porciones carbohidrato, en donde el carbohidrato no está unido a N o unido a 0 lo que resulta en una glucoproteína. Una porción de carbohidrato unido a N de una glucoproteína está unido por un enlace glucosidico al nitrógeno ß-amida de un residuo asparagina. Un carbohidrato unido en O, está unido por un enlace glucosidico a una proteína a través del grupo hidroxi de un residuo serina o treonina. El término"recombinante" cuando se utiliza con referencia, por ejemplo a una célula, ácido nucleico, proteína o vector, indica que la célula, ácido nucleico, proteína o vector han sido modificados por la introducción de un ácido nucleico heterólogo o proteína o la alteración del ácido nucleico o proteína nativas o que la célula se deriva de una célula modificada de esta manera. Así, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula o que expresan genes nativos que de otra manera se expresan de manera anormal, se expresan de manera insuficiente o no se expresan de manera alguna. El término "GSHE recombinante" , "GSHE que se expresa de manera recombinante" y "GSHE que se produce de manera recombinante" se refiere a una secuencia de proteína GSHE madura que se produce en una célula hospedadora a partir de un polinucleótido heterólogo. El símbolo "r" se puede utilizar para indicar que es recombinante. La secuencia proteínica de rGSHE excluye una secuencia de señal . En una modalidad, GSHE de Humicola grisea var. thermoidea se expresa en una cepa de Trichoderma reesei y se indica como "rH-GSHE" .

El término "GSHE nativa" y "nGSHE" significa una GSHE la cual es derivada de un organismo hospedador microbiano diferente del hospedador micótico del cual se desea la expresión de GSHE recombinante . Las GSHE nativas preferidas se derivan de la cepa Humicola grisea o una cepa de Aspergillus awamori . Los términos "proteína" y "polipéptido" se utilizan de manera intercambiable en la presente. En la presente se utilizan los códigos convencionales de una letra o de tres letras para los residuos aminoácidos . Una "secuencia de señal" significa una secuencia de aminoácidos unida a la porción N terminal de una proteína, lo que facilita la secreción de la forma madura de la proteína hacia el exterior de la célula. La definición de una secuencia de señal es la funcional . La forma madura de la proteína extracelular carece de la secuencia de señal la cual se separa durante el procedimiento de secreción. Un "gen" se refiere a un segmento de ADN que está involucrado en la producción de un polipéptido y que incluye regiones que preceden y que siguen a las regiones codificantes así como secuencias intermedias (intrones) entre segmentos codificantes individuales (exones) . El término "ácido nucleico" abarca ADN, ARN, de cadena sencilla o de cadena doble y modificaciones químicas del mismo. Los términos "ácido nucleico" y "polinucleótido" se pueden utilizar de manera intercambiable en la presente. Debido a que el código genético está degenerado, se puede utilizar uno o más de un codon para codificar para un aminoácido particular y la presente invención abarca polinucleótidos los cuales codifican para una secuencia particular de aminoácidos. Un "vector" se refiere a una secuencia polinucleotídica diseñada apara introducir ácidos nucleicos en uno o más tipos de células. Los vectores incluyen vectores de clonación, vectores de expresión, vectores lanzadera, plásmidos, partículas de fago, casetes y similares. Un "vector de expresión" como se utiliza en la presente, significa una construcción (plásmido recombinante) de ADN que comprende una secuencia de ADN la cual está unida operablemente a una secuencia de control adecuada capaz de llevar a cabo la expresión del ADN en un hospedador adecuado. Tales secuencias de control pueden incluir un promotor para llevar a cabo la trascripción, una secuencia operadora opcional para controlar la trascripción, una secuencia que codifica para los sitios de unión de ribosomas adecuados en el ARNm, mejoradores o alargadores y secuencias las cuales controlan la finalización de la trascripción y traducción. Un "promotor" es una secuencia reguladora que está involucrada en la unión de ARN polimeraza para iniciar la trascripción de un gen. El promotor puede ser un promotor inducible o un promotor constitutivo. Un promotor preferido utilizado en la invención es cbhl de Trichoderma reesei , el cual es un promotor inducible. El término "bajo control transcripcional" es un término bien entendido en la técnica que indica que la trascripción de una secuencia polinucleotídica, habitualmente una secuencia de ADN, depende de sí está unida operable a un elemento el cual contribuye al inicio o que promueve la trascripció . El término "bajo control traduccional" es un término bien entendido en la técnica que indica un proceso regulador que se produce después de que se ha formado el ARNm. Como se utiliza en la presente, cuando se describen proteínas y genes que las codifican, el término para el gen no está con mayúsculas y está en cursivas, por ejemplo, el gen que codifica para la GSHE de Humicola grisea se puede indicar como glal . El término para la proteína generalmente no está en cursivas y la primera letra está en mayúsculas, es decir, la proteína codificada por el gen glal puede ser indicado como Glal. El término "unido operablemente" se refiere a una yuxtaposición en donde los elementos están en una distribución que permiten que después estén relacionados funcionalmente. Por ejemplo, un promotor está unido operablemente a una secuencia codificante sí controla la trascripción de la secuencia. El término "marcador selectivo" se refiere a un gen capaz de expresar en un hospedador que permite la facilidad de selección de aquellos hospedadores que contienen un ácido nucleico o vector introducido. Los ejemplos de marcadores seleccionables incluyen, pero no se limitan a sustancias antimicrobianas (por ejemplo higromicina, bleomicina o cloranfenicol) o genes que confieren una ventaja metabólica tal como una ventaja nutricional sobre las células hospedadoras . El término "derivado" abarca los términos "originado de ", "obtenido o que se puede obtener de", y "aislado de" . Una "cepa hospedadora" o una "célula hospedadora" significa un hospedador adecuado para un vector de expresión o una construcción de ADN que comprende un polinucleótido que codifica para una GSHE de acuerdo con la invención. Específicamente, las cepas hospedadoras son células micóticas filamentosas. En una modalidad preferida de la invención, una "célula hospedadora" significa tanto células como protoplastos creados a partir de las células de una cepa micótica filamentosa y particularmente el género Trichoderma o el género Aspergillus . El término "hongos filamentosos" se refiere a todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumicotina (véase, Alexopoulos, C. J. (1962) , Introductory Mycology, New York: Wiley) . Estos hongos están caracterizados por un micelio vegetativo con una pared celular constituida de quitina, celulosa y otros polisacáridos complejos. Los hongos filamentosos de la presente invención son morfológica, fisiológica y genéticamente distintos de las levaduras. El crecimiento vegetativo por hongos filamentos es por elongación de la hifa y el catabolismo de carbono es aeróbico obligado. En la presente invención, la célula micótica filamentosa de origen puede ser una célula de la especie, pero sin que se limite a Trichoderma, por ejemplo Trichoderma reesei , (previamente clasificada por T. longibrachiatum y actualmente conocida como Hypocrea j ecorina) , Trichoderma viride, Trichoderma koningii , Trichoderma harzianum; género Penicillium, género Humicola que incluye Humicola insolens y Humicola grisea; género Chrysosporium, que incluye C. lucknowense,- género Gliocladium; género Aspergillus que incluye A . oryzae, A . nidulans, A . niger y A. awamori ; género Fusarium, género Neurospora; género Hypocrea y género Emericella . Con referencia véase también Innis et al., (1985) Sci. 228:21-26. Como se utiliza en la presente, el término "Trichoderma" o "género Trichoderma" se refiere a cualquier cepa micótica la cual previamente haya sido clasificada como Trichoderma o que actualmente se clasifique como Trichoderma . El término "cultivar" se refiere a hacer crecer una población de células microbianas bajo condiciones adecuadas en un medio líquido o sólido. En una modalidad, el cultivo se refiere a la bioconversión fermentativa de un sustrato de almidón granular a jarabe de glucosa u otros productos finales deseados (típicamente en un recipiente o reactor) . Los términos "heterólogos" o "exógenos" con referencia a un polinucleótido o proteína se refieren a un polinucleótido o proteína que no se encuentra de manera natural en una célula hospedadora. En algunas modalidades, la proteína es una proteína industrial importante comercialment . Se pretende que el término abarque proteínas que estén codificadas por genes que se encuentren de manera natural, genes mutados y/o genes sintéticos. Los términos "homólogo" o "endógeno" con referencia a un polinucleótido o proteína se refieren a un polinucleótido o proteína que se encuentra de manera natural en una célula hospedadora. Los términos "recuperados" , "aislado" y "separado" , como se utilizan en la presente, se refieren a una molécula, proteína, célula, ácido nucleico, aminoácido o carbohidrato que se separa de por lo menos un componente con el cual se encuentra asociado de manera natural . Como se utiliza en la presente, los términos "transformado" , "transformado de manera estable" o "transgénico" con referencia a una célula significa que la célula tiene una secuencia de ácido nucleico no nativo (heterólogo) integrado en su genoma o como un plásmido episómico que se mantiene a través de múltiples generaciones. Como se utiliza en la presente, el término "expresión" se refiere al procedimiento por medio del cual se produce un polipéptido en base en la secuencia de ácido nucleico de un gen. El procedimiento incluye trascripción y traducción. El término "introducido" en el contexto de insertar una secuencia de ácido nucleico en una célula significa "transfección" o "transformación" o "transducción" e incluye la referencia a la incorporación de una secuencia de ácido nucleico en una célula eucariótica o procariótica en donde la secuencia de ácido nucleico se puede incorporar en el genoma de la célula (por ejemplo, cromosoma, plásmido, plástido (plástidio) o ADN mitocondrial) convertido en un replicón autónomo o que se expresa de manera transitoria (por ejemplo, ARNm transfectado) . Como se utiliza en la presente, el término "actividad específica" significa una unidad de enzima definida como el número de moles de sustrato convertido a producto por una preparación de enzima por unidad de tiempo, bajo condiciones específicas. La actividad específica se expresa como unidades (U) /mg de proteína.

Como se utiliza en la presente, "actividad enzimática" se refiere a la acción de una enzima sobre su sustrato. Como se utiliza en la presente, el término "unidad de enzima" se refiere a la cantidad de enzima que convierte 1 mg de sustrato por minuto a producto de sustrato en condiciones óptimas de ensayo. Por ejemplo, en una modalidad, el término unidad de enzima hidrolizante de almidón granular (U de GSHE) se define como la cantidad de GSHE que se requiere para producir 1 mg de glucosa por minuto a partir de almidón granular bajo condiciones de ensayo de, por ejemplo, 50°C a pH 4.5. Por ejemplo, en una modalidad, el término unidad de enzima a amilasa (UA) se define como la cantidad de a amilasa la cual hidroliza 1 micromole sustrato de almidón en 1 minuto bajo condiciones de ensayo estándar de pH 5.2 y 40°C. Los términos "producto final" o "producto final deseado" se refiere a cualquier producto de molécula derivado de una fuente de carbono la cual es convertida enzimáticamente a partir del sustrato de almidón granular. Preferiblemente, el producto final es glucosa o un jarabe de glucosa. La glucosa después se puede utilizar como precursor para otros productos finales deseados. El término " almidón residual", como se utiliza en la presente, se refiere a los productos secundarios o componentes remanentes del procedimiento de hidrólisis de almidón granular de la invención cuando se separa la composición que comprende el jarabe de glucosa u otros productos finales. El almidón residual incluye almidón insoluble remanente que queda en la composición después de la separación. Una "etapa de reciclado de almidón residual" se refiere al reciclado de almidón residual en un recipiente o reactor, el cual incluye una GSHE y una OÍ amilasa. El término "rendimiento" se refiere a la cantidad de producto final o productos finales deseados producidos utilizando los métodos de la presente invención. En algunas modalidades preferidas, el rendimiento es mayor que el producido utilizando métodos conocidos en la técnica. En algunas modalidades, el término se refiere al volumen del producto final y en otra modalidad el término se refiere a la concentración del producto final . Como se utiliza en la presente un "microorganismo etanologénico" se refiere a un microorganismo con la capacidad de convertir un azúcar u oligosacárido a etanol. Un microorganismo etanologénico es etanologénico en virtud de su capacidad de expresar una o más enzimas que, individual o juntas, convierten azúcar a etanol. En el presente contexto, el término "polipéptido sustancialmente puro" significa una preparación polipeptídica la cual contiene como máximo 10% en peso de otro material polipeptídico con el cual se encuentra asociado de manera nativa (se prefieren en porcentajes menores de otro material polipeptídico, por ejemplo, un máximo de 8% en peso, un máximo de 6% en peso, un máximo de 5% en peso, un máximo de 4% en peso, un máximo de 3% en peso, un máximo de 2% en peso, un máximo de 1% en peso y un máximo de 0.5% en peso) . Por lo tanto, se prefiere que el polipéptido sustancialmente puro sea por lo menos 92% puro, es decir, que el polipéptido constituya por lo menos 92% en peso del material polipeptídico total presente en la preparación, y se prefieren porcentajes superiores tales como por lo menos 94% puro, por lo menos 95% puro, por lo menos 96% puro, por lo menos 97% puro, por lo menos 98% puro, por lo menos 99% puro y por lo menos 99.5% puro. Los polipéptidos descritos en la presente preferiblemente están en una forma sustancialmente pura. En particular, se prefiere que los polipéptidos descritos en la presente estén en "forma esencialmente pura" , es decir, que la preparación polipeptídica esté esencialmente libre de otro material polipeptídico con el cual se asocie de manera nativa. Esto se puede llevar a cabo, por ejemplo, al preparar el polipéptido por medios de métodos recombinantes bien conocidos . El término "ATCC" se refiere a American Type Culture Collection que se encuentra en Manassas, VA 20108 (ATCC, www/atcc.org) . El término "NRRL" se refiere al Agricultural Research Service Culture Collection, National Center for Agricultural Utilization Research (y previamente conocido como USDA Northern Regional Research Laboratory) , Peoría, ILL. Los términos "un" "uno" y "el" incluyen referencias también al plural , a menos que en el contexto lo indique claramente en otro sentido. Como se utiliza en la presente, el término "que comprende" y sus asociados se utilizan en su sentido incluyente; es decir, equivalentes al término "que incluye" y sus relacionados correspondientes .

B. Modalidades Preferidas Sustratos de almidón Un sustrato de almidón granular para ser procesado en los métodos de la invención se puede obtener de cualquier parte de planta que incluye tallos, granos, raíces y tubérculos . Las f entes vegetales particularmente preferidas incluyen maíz; trigo; centeno; sorgo; arroz; mijo; cebada; cassava; legumbres tales como fríjoles y chícharos; papas; camotes; plátanos y tapioca. El almidón puede ser almidón crudo altamente refinado o materia prima de procedimientos de refinería de almidón. Se contemplan especialmente sustratos de almidón como almidón de maíz y almidón de trigo. Aquellos con habilidad general en la técnica tendrán conocimiento de los métodos disponibles los cuales pueden ser utilizados para preparar sustratos de almidón granular para uso en los métodos abarcados por la invención. Algunos de estos métodos disponibles incluyen molido seco o granos de cereal completos utilizando molinos de mastillo y molinos de rodillo así como el molido en húmedo. Están disponibles comercialmente diversos almidones. Por ejemplo, los almidones de maíz están disponibles de Cerestar, Sigma y Katayama Chemical Industry Co. (Japón) ; los almidones de trigo están disponibles de Sigma; los almidones de camote están disponibles de Wako Puré Chemical Industry Co . (Japón) ; y el almidón de papa está disponible de Nakaari Chemical Pharmaceu ical Co . (Japón) . Aunque no se desea limitar la invención de manera alguna, la tabla 1 a continuación proporciona una guía general al nivel de almidón encontrado en algunos granos de cereal comunes . Como lo sabrá bien una persona habitualmente experta en la técnica, la concentración de almidón en un grano puede variar en base en factores tales como el genotipo y el ambiente .

TABLA 1 Contenido de almidón de los diversos granos The Alcohol Textbook, 3j Ed. K. Jacques et al., Eds. 1999, Nottingham University Press, pg. 11.

En algunas modalidades de estos métodos abarcados por la invención, el sustrato de almidón granular es suspendido (generalmente con agua) y la suspensión comprende: i) aproximadamente 10 a aproximadamente 55% de contenido de sólidos secos, ii) aproximadamente 20 a aproximadamente 50% de contenido de sólidos secos; iii) aproximadamente 25 a aproximadamente 45% de contenido de sólidos secos; iv) aproximadamente 30 a aproximadamente 45% del contenido de sólidos secos; v) aproximadamente 30 a aproximadamente 40% del contenido de sólidos secos y vi) aproximadamente 30 a 35% de contenido de sólidos secos.

OÍ amilasas En algunas de las modalidades abarcadas por la invención, la a amilasa es una enzima microbiana que tiene un E. C. número, E. C. 3.2.1.1-3 y en particular E. C. 3.2.1.1. En algunas modalidades, la a amilasa es una a amilasa bacteriana termoestable. Las OÍ amilasas adecuadas pueden ser las que se encuentran de manera natural así como las OÍ amilasas recombinantes y mutantes. En modalidades particularmente preferidas, la a amilasa se deriva de la especie Bacillus. La especie Bacillus preferida incluye B. subtilis, B. stearothermophilus, B. lentus, B. lincheniformis, B. coagulans y B. amyloliquefaciens (USP 5,763,385; USP 5,824,532; USP 5,958,739; USP 6,008,026 y USP 6,361,809). Las OÍ amilasas particularmente preferidas se derivan de cepas de Bacillus B. stearothermophilus, B. amyloliquef ciens y B. licheniformis . También se proporciona referencia a cepas que tienen ATCC 39709; ATCC 11945; ATCC 6598; ATCC 6634; ATCC8480; ATCC 9945A y NCIB 8059. Las a amilasas disponibles comercialmente contempladas para uso en las composiciones y métodos de la invención incluyen: SPEZYME AA; SPEZYME FRED; GZYME G997 (Genencor International Inc.) y TERMAMYL 120-L, LC, SC y SUPRA (Novozyme Biotech) . Como lo entienden los expertos en la técnica, la cantidad de amilasa utilizada en las composiciones y métodos de la presente invención dependerá de la actividad enzimática de la a amilasa. En general, una cantidad de aproximadamente 0.01 a 5.0 kg de a amilasa se agrega a una tonelada métrica (MT) de materia prima (sustrato de almidón granular) . Esta cantidad es aproximadamente equivalente a 0.06 AU/g ds a 30 AU/g ds con una GZYME 997. En algunas modalidades, la OÍ amilasa se agrega en una cantidad de aproximadamente 0.05 a 5.0 kg; aproximadamente 0.05 a 2.5 kg; aproximadamente 0.1 a 2.5 kg; aproximadamente 0.1 a 2.0 kg; aproximadamente 0.1 a 1.5 kg; aproximadamente 0.1 a 1.0 kg; aproximadamente 0.5 a 5.0 kg y aproximadamente 0.5 a 2.0 kg por tonelada métrica. Estos valores son aproximadamente iguales a 0.3 a 30 AU/g ds; 0.3 a 15 AU/g ds; 0.6 a 15 AU/g ds; 0.6 a 12 AU/g ds; 0.6a 9 AU/g ds; 0.6 a 6 AU/g ds; 3 a 30 AU/g ds y también 3 a 12 AU/g ds con una GZYME 997. En modalidades adicionales se utilizan otras cantidades, por ejemplo, de manera general se agrega una cantidad de entre aproximadamente 0.01 a 1. Okg de GZYME 997 o SPEZYME FRED (Genencor International inc . ) a una tonelada métrica de almidón. En otras modalidades, la enzima se agrega en una cantidad entre aproximadamente 0.05 a 1.0 kg; entre aproximadamente 0.1 a 0.6 kg; entre aproximadamente 0.2 a 0.6 kg y entre aproximadamente 0.4 a 0.6 kg de GZYME 997 o SPEZYME FRED por tonelada métrica de almidón.

Enzimas hidrolizantes de almidón granular que tienen actividad de glucoamilasa Las glucoamilasas (E. C. 3.2.1.3) son enzimas que remueven unidades de glucosas sucesivas de los extremos no reductores del almidón. La enzima puede hidrolizar los enlaces glucosídicos tanto lineales como ramificados del almidón, amilosa y amilopectina. Aunque la glucoamilasa puede estar derivada de bacterias, plantas y hongos, las glucoamilasas preferidas abarcadas por la presente se derivan de cepas de hongos . Las glucoamilasas secretadas de hongos de los géneros Aspergillus, Rhizopus, Humicola y Mucor se han derivado de cepas de hongos que incluyen Aspergillus niger, Aspergillus awamori , Rhizopus niveus, Rhizopus oryzae, Mucor miehe, Humicola grisea, Aspergillus shirousami y Humicola (Thermomyces) laniginosa (véase Boel et al. (1984) EMBO J. 3:1097-1102; WO 92/00381; WO 00/04136; Chen et al., (1996) Prot. Eng. 9:499-505; Taylor et al., (1978) Carbohidrate Res. 61:301-308 y Jensen et al., (1988) Can. J. Microbiol. 34:218-223) . Las enzimas que tienen actividad de glucoamilasa utilizadas comercialmente se producen, por ejemplo de Aspergillus niger (nombre comercial, OPTIDEX L-400 y G ZYME G990 4X de Genencor International Inc.) modelo especie Rhizopus (nombre comercial CU. CONC. de Shin Nihon Chemicals, Japón y nombre comercial GLUCZYME de Amano Pharmaceuticals, Japón) . Un grupo particular de enzimas que tienen actividad glucoamilasa son una o .varias enzimas hidrolizantes de almidón granular GSHE (véase Tosi et al., (1993) Can. J. Microbiol. 39:846-855). Las GSHE no solo tienen actividad de glucoamilasa sino que también son capaces de hidrolizar almidón granular (crudo) . Se han recuperado las GSHE de células micóticas tales como el género Humicola, el género Aspergillus y el género Rhizopus . Se ha descrito una GSHE de Rhizopus oryzae en Ashikari et al., (1986) Agrie. Biol. Chem. 50:957-964 y USP 4,863,864. Se ha descrito una GSHE de Humicola grisea en Allison et al., (1992) Curr. Genet. 21:225-229 y en la patente Europea No. 171218. El gen que codifica para esta enzima también se conoce en la técnica como grlal . Se ha descrito una GSHE de Aspergillus awamori var. kawachi por Hayashida et al., (1989) Agrie. Biol. Chem 53:923-929. Se ha descrito una GSHE de Aspergillus shirousami por Shibuya et al., (1990) Agrie. Biol. Chem. 54:1905-1914. En una modalidad se ha derivado GSHE de una cepa de Humicola grisea, particularmente una cepa de Humicola grisea var . thermoidea (véase USP 4,618,579). En algunas modalidades preferidas, la GSHE se recupera de hongos que incluyen ATCC 16453, NRRL 15219, NRRL 15220, NRRL 15221, NRRL 15222, NRRL 15223, NRRL 15224 y NRRL 15225 así como cepas alteradas genéticamente de los mismos (EP 0 171218) . En una modalidad, se puede derivar una GSHE de una cepa de Aspergillus awamori , particularmente una cepa de A. awamori var. kawachi (véase Hayashida et al., (1989) Agrie. Biol. Chem. 53:923-929). En otra modalidad, una GSHE puede mostrar una actividad a un pH máximo dentro de un intervalo de pH de 4 a 7.5 y dentro de un intervalo de pH de 5.0 a 7.5 y una actividad máxima en el intervalo de temperatura de 50 a 60°C. En una modalidad, la GSHE tiene por lo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 93%, 95%, 97%, 98%, y 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 3. En otra modalidad, la GSHE comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 3. En otras modalidades, la GSHE que comprende a la secuencia de aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 3 o una GSHE que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia con la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3 es codificada por un polinucleótido que tiene por lo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 93%, 95%, 97%, 98%, y 99% de identidad de secuencia con la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1. En otra modalidad, la GSHE tiene por lo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 93%, 95%, 97%, 98%, y 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 6. En otra modalidad, la GSHE comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 6. En otras modalidades, la GSHE que comprende a la secuencia de aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 6 o una GSHE que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia con la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 6 es codificada por un polinucleótido que tiene por lo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 93%, 95%, 97%, 98%, y 99% de identidad de secuencia con la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4. Un polinucleótido o polipéptido que tiene cierto porcentaje (por ejemplo 80%, 85%, 90%, o 99%) de identidad de secuencia con otra secuencia significa que cuando se alinean, el porcentaje de bases de residuos aminoácidos son los mismos cuando se compraran las dos secuencias . Esta alineación y el por ciento de homología o identidad se puede determinar utilizando cualquier programa de elementos de programación (software) conocido en la técnica, por ejemplo aquellos descritos en Current Protocols in Molecular Biology (ausubel et al., eds 1987 suplemento 30, sección 7.7.18). Los programas preferidos incluyen el programa GCG Pileup, FASTA y BLAST. Otro programa de alineación preferido es ALIGN Plus y TFASTA.

Una persona experta en la técnica reconocerá que las secuencias abarcadas por la invención también están definidas por la capacidad para hibridizar bajo condiciones de hibridación rigurosas con las secuencias GSHE ejemplificadas (por ejemplo SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1 o SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4) . Un ácido nucleico es susceptible de ser hibridizado a otra secuencia de ácido nucleico con una forma de cadena única del ácido nucleico el cual puede reasociarse a otro ácido nucleico bajo condiciones apropiadas de temperatura y fuerza iónica de solución. La hibridación y las condiciones de lavado son bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook (1989) supra, particularmente los capítulos 9 y 11) . En algunas modalidades, las condiciones rigurosas corresponden a una Tm de 65°C y O.lxSSC, SDS 0.1%. En una modalidad adicional, una enzima GSHE se puede derivar de una cepa de Rhizopus . Tal enzima derivada de la cepa Koji de R. niveus (vendida bajo el nombre comercial "CU CONC") o la enzima de Rhizopus vendida bajo el nombre comercial GLUCZYME. En una modalidad preferida, la GSHE utilizada en un método o composición abarcada por la invención es una GSHE que se expresa de manera recombinante que se obtiene de una cepa de hongos filamentosos, la cual ha sido sometida a ingeniería genética para suprimir un polinucleótido heterólogo que codifica para un GSHE derivada de una fuente diferente de una cepa hospedadora. En algunas modalidades la cepa micótica filamentosa es una cepa de los géneros : Aspergillus , Trichoderma, Fusarium o Penicillium. Los hongos hospedadores preferidos particularmente incluyen A. nidulans, A. awamori , A. oryzae, A. aculeatus, A . niger, A . japonicus, Y. reesei , T. viride, F. oxysporum y F. solani . Las cepas de Aspergillus se describen en Ward et al., (1993) Appl, Microbiol. Biotechnol. 39 : 738-743 y Goedegebuur et al., (2002) Curr. Gene 41:89-98. En una modalidad más preferida, el hospedador es una cepa Trichoderma y particularmente una cepa T. reesei . Las cepas de T. reesei se conocen y los ejemplos no limitantes incluyen ATCC No. 13631, ATCC No. 26921, ATCC No. 56764, ATCC No. 56765, ATCC No. 56767 y NRRL 15709. En algunas modalidades preferidas, la cepa hospedadora es un derivado de RL-P37. RL-P37 se describe en Sheir-Neiss et al., (1984) Appl. Microbiol. Biotechnol .20 : 46-53. Una cepa hospedadora la cual expresa rGSHE puede haber sido manipulada previamente a través de ingeniería genética. En algunas modalidades, diversos genes del hospedador micótico han sido inactivados . Estos genes incluyen, por ejemplo, genes que codifican para enzimas celulósicas tales como endoglucanasas (EG) y exocelobiohidolasas (CBH) (por ejemplo, cbhl , cbhl , egll , esr22 y egl3) . La patente de E . U . A. No. 5,650,322 describe cepas derivadas de RL-P37 que tienen supresiones en el gen cbhl y el gen cbh2 . En algunas modalidades, el hospedador micótico ha sido sometido a ingeniería genética para comprender un polinucleótido que codifica para una GSHE derivada de Humicola grisea . En una modalidad, la rGSHE tendrá por lo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 93%, 95%, 97%, 98%, y 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3. En otras modalidades, un polinucleótido que codifica para la GSHE de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3 tendrá por lo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, y 98% de identidad de secuencia con la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1. En una modalidad particularmente preferida, la GSHE se expresa en una cepa de Trichoderma reesei y la proteína producida tiene por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, y 98% de identidad de secuencia con la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3. En otras modalidades, el hospedador micótico ha sido sometido a ingeniería genética para expresar un polinucleótido que codifica una GSHE derivada de Aspergillus awamori . En una modalidad, la rGSHE tendrá por lo menos 50%, 55%, 60%, 65% , 10%, 75%, 80%, 85%, 90%, 93%, 95%, 97%, 98%, y 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 6.

En otras modalidades, un polinucleótido que codifica para la GSHE de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 6 tendrá por lo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, y 98% de identidad de secuencia con la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4. En una modalidad particularmente preferida, la GSHE se expresa en una cepa de Trichoderma reesei y la proteína producida tiene por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, y 98% de identidad de secuencia con la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 6. En algunas modalidades, el nivel dé glucosilación de GSHE expresada de manera recombinante es diferente al nivel de glucosilación de la GSHE nativa correspondiente (por ejemplo, GSHE la cual originalmente se deriva de H. grisea o A . awamori y que tiene un nivel diferente de glucosilación en comparación con el nivel de glucosilación de GSHE expresada en Trichoderma) . En una modalidad, el nivel de glucosilación es diferente incluso si la rGSHE tiene por lo menos 80%, 85%, 90%, o 95% de identidad de aminoácidos con la GSHE nativa correspondiente. En algunas modalidades, una rGSHE expresada en Trichoderma y particularmente una cepa de T reesei tiene un nivel de glucosilación diferente en comparación con el nivel de la nGSHE correspondiente. En otras modalidades, el nivel de glucosilación es superior mientras que en otras modalidades es menor. Por ejemplo, el nivel de glucosilación de rGSHE puede ser de por lo menos 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% o 65% menor que el nivel de glucosilación de la nGSHE correspondiente . En otras modalidades, el nivel de glucosilación de una rGSHE expresada puede ser por lo menos 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 225% o 250% mayor que el nivel de la nGSHE correspondiente. En otra modalidad, la GSHE producida de manera recombinante de acuerdo con la invención tiene una estabilidad mayor a niveles de pH menores en comparación con la GSHE nativa correspondiente a niveles de temperatura óptimos. De manera más específica, una rGSHE que se expresa en Trichoderma, la cual originalmente se deriva de Humicola grisea var . thermoidea tiene una estabilidad mayor a niveles de pH de 3.5 a 4.0 en comparación con una nGSHE correspondiente a una temperatura de 45-55°C. Bajo ciertas condiciones la estabilidad de rGSHE y particularmente la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1 de H. grísea var . thermoidea expresada en Trichoderma reesei es más del doble de nivel de estabilidad de nGSHE.

Vectores y transformación micótica: De acuerdo con la invención, se construye una construcción de ADN que comprende un polinucleótido que codifica para una GSH? abarcada por la invención, para transferir GSHE a una célula hospedadora. De esta manera, un polinucleótido de GSHE, el cual puede ser expresado en forma de enzima se puede introducir en una célula hospedadora utilizando un vector, particularmente un vector de expresión el cual comprende una secuencia reguladora unida operablemente a una secuencia codificante para GSHE. El vector puede ser cualquier vector el cual, cuando se introduce en una célula hospedadora micótica se integra en el genoma de la célula hospedadora y se replica. Se hace referencia al Fungal Genetics Stock Center Catalogue of Strains ( ww.FGSC. net) para una lista de vectores.

Además, los ejemplos de vectores de expresión adecuados se pueden encontrar en Sambrook et al., (1989) supra, y Ausubel (1987) supra y de manera más específica se hace referencia a van den Hondel et al. (1991) en Bennett y Lasure Eds. MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGÍ, Academic Press pp. 396-428. Particularmente los vectores útiles incluyen pFB6, pBR322, PUC18, pUClOO y pENTR/D. En algunas modalidades, un ácido nucleico que codifica para una GSHE se une operablemente a un promotor adecuado, el cual muestra actividad transcripcional en la célula hospedadora micótica. El promotor se puede derivar de genes que codifican para proteínas homologas o heterólogas a la célula hospedadora. Preferiblemente, el promotor es útil en un hospedador de Trichoderma y los ejemplos no limitantes adecuados de promotores incluyen cbhl , cbtí? , egll , egl2 . En una modalidad, el promotor es uno que es nativo para la célula hospedadora. Por ejemplo, cuando T. reesei es el hospedador, el promotor puede ser un promotor nativo de T. reesei . En una modalidad preferida, el promotor es T. reesei cbhl , el cual es un promotor inducible y ha sido depositado en GenBank bajo el número de acceso D86235. Un promotor inducible es un promotor que es activo bajo regulación ambiental o de desarrollo. En otra modalidad, el promotor es uno que es heterólogo para la célula hospedadora micótica. Otros ejemplos de promotores útiles incluyen promotores de genes para glucoamilasa de A. awamori y A. niger (véase Nunberg et al., (1984) Mol. Cell Biol. 4:2306-2315 y Boel et al., (1984)' EMBO J. 3:1581-1585). Además, los promotores del gen para xlnl de T reesei y el gen para celobiohidrolasa 1 pueden ser útiles (EPA 137280A1) . En algunas modalidades, la secuencia codificante para GSHE está unida operablemente a una secuencia señal . El ADN que codifica para la secuencia de señal preferiblemente es aquel el cual se relaciona de manera natural con el gen para GSHE que se va a expresar. Preferiblemente, la secuencia de señal es codificada por un gen de Humicola grisea o Aspergillus awamori el cual codifica para una GSHE. De manera más preferible la secuencia de señal tiene por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 97% y por lo menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia de señal presentada en la figura 2A y 6A. En modalidades adicionales, una secuencia de señal y una secuencia promotora que comprende una construcción de ADN o un vector que se va a introducir en una célula hospedadora micótica se derivan de la misma fuente. Por ejemplo, en algunas modalidades, la secuencia de señal es la secuencia de señal de cd l la cual está unida operablemente a un promotor cdhl . En algunas modalidades, el vector de expresión también incluye una secuencia de terminación. En una modalidad, la secuencia de terminación y la secuencia promotora se derivan de la misma fuente'. En otra modalidad, la secuencia de terminación es homologa a la célula hospedadora. Una secuencia terminadora particularmente adecuada es cjb l derivada de la cepa Trichoderma y particularmente T. reesei . Otros terminadores micóticos útiles incluyen el terminador del gen para glucoamilasa de A. niger o A awamori (Nunberg et al. (1984) supra, y Boel et al . , (1984) supra) . En algunas modalidades, un vector de expresión incluye un marcador seleccionable. Los ejemplos de marcadores seleccionables preferidos incluyen aquellos los cuales confieren resistencia antimicrobiana (por ejemplo higromicina y fleomicina) . Los marcadores selectivos nutricionales también encuentran uso en la presente invención e incluyen a aquellos marcadores conocidos en la técnica como amdS, argB y pyr . Los marcadores útiles en sistemas de vector para transformación de Trichoderma se describen en Finkelstein, capítulo 6 en BIOTECHNOLOGY OF FILAMENTOUS FUNGÍ, Finkelstein et al. Eds. Butterworth-Heinemann, Boston, MA (1992), capítulo 6 y Kinghorn et al. (1992) APPLIED MOLECULAR GENETICS OF FILAMENTOUS FUNGÍ, Blackie Academic and Professional, Capman y Hall, Londres. En una modalidad preferida, el marcador selectivo es el gen amdS, el cual codifica para la enzima acetamidasa lo que permite que las células transformadas en acetamida como una fuente de nitrógeno (véase, Kelley et al., )1985) EMBO J. 4_475-479 y Penttila et al., (1987) Gene 61:155-164). Un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica para una GSHE puede ser cualquier vector que sea capaz de replicarse de manera autónoma en un organismo hospedador micótico dado o de integración en el ADN del hospedador. En algunas modalidades, un vector de expresión es un plásmido. En modalidades preferidas, se contemplan dos tipos de vectores de expresión para obtener la expresión de los genes . El primer vector de expresión comprende secuencias de ADN en las cuales el promotor, la región codificante para GSHE y el terminador se originan, todos, del gen que se va a expresar. En algunas modalidades, se obtiene un corte del gen al suprimir secuencias no deseadas de ADN (por ejemplo codificación para dominios no deseados) para dejar el dominio que se exprese bajo el control de sus propias secuencias reguladoras transcripcionales y traduccionales . El segundo tipo de vector de expresión es preensamblado y contiene secuencias que se requieren para transcripción de alto nivel y un marcador seleccionable. En algunas modalidades, la región codificante para un gen para GSHE o una parte del mismo se inserta dentro de un vector de expresión de propósito general tal como el que se encuentra bajo el control transcripcional del promotor de construcciones de expresión y secuencias terminadoras . En algunas modalidades, los genes o partes de los mismos se inserta hacia el extremo 3 ' del promotor cj l fuerte . Los métodos utilizados para ligar un vector que comprende un polinucleótido que codifica para una GSHE, un promotor, un terminador y otras secuencias y para insertarlos en un vector adecuado son bien conocidas en la técnica. La formación de enlaces o enlazado generalmente se lleva a cabo por ligación de sitios de restricción convenientes. Sí tales sitios no existen se utilizan enlaces oligonucleotídicos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional (véase Sambrook (1989) supra, y Bennett y Lasure, MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGÍ, Academic Press, San Diego (1991) páginas 70-76. Adicionalmente, se puede construir un vector utilizando técnicas de recombinación conocidas (por ejemplo Invitrogen Life Technologies Gateway Technology) . Cuando se desea obtener una célula hospedadora micótica que tenga uno o más genes inactivados, se pueden utilizar métodos conocidos (véase la Patente de E. U. A. No. 5,246,853; patente de E. U. A. No. 5,475,101 y WO 92/06209). La inactivación del gen se puede llevar a cabo por supresión completa o parcial, por inactivación insercional o por cualquier otro medio que vuelva a un gen no funcional para su propósito deseado (de manera tal que se evita que el gen exprese una proteína funcional) . Cualquier gen del género Trichoderma o de otro hospedador micótico filamentoso el cual haya sido clonado se puede suprimir, por ejemplo cbhl , cbh2 , egll y egl2 . En algunas modalidades, la supresión del gen se lleva a cabo al insertar una forma del gen deseado que se va a inactivar dentro de un plásmido, por métodos conocidos. La supresión del plásmido después se corta en uno o varios sitios de enzimas de restricción apropiados, internos a la región codificante del gen deseado y la secuencia codificante del gen o parte de la misma se sustituye con un marcador seleccionable, las secuencias de ADN flanqueantes del locus del gen que se va a suprimir permanecen en cualquiera de los lados del mercado (preferiblemente de manera aproximada entre 0.5 y 2.0 kb) . Un plásmido de supresión apropiado generalmente tendrá sitios de enzimas de restricción únicos presentes en la misma para permitir que el fragmento que contiene el gen suprimido, incluyendo las secuencias de ADN flanqueante y el gen marcador seleccionable que se va a separar como una pieza lineal única. La introducción de una construcción de ADN o vector en una célula hospedadora incluye técnicas tales como transformación; electroporación; microinyección nuclear; transducción; transfección que incluye lipofección mediada y transfección mediada por DEAD-dextrina; incubación con precipitado de ADN de fosfato de calcio; bombardeo de alta velocidad con microproyectiles recubiertos con ADN; y fusión de protoplastos . Las técnicas de transformación general se describen en Ausubel et al., (1987), supra, capítulo 9 y Sambrook (1989) supra. De manera más específica, los métodos de transformación para hongos filamentosos se describen en Campbell et al., (1989) Curr. Genet. 16:53-56. Específicamente, para llevar a cabo la expresión de proteína heteróloga en Trichoderma se hace referencia al documento USP 6,022,725; USP 6,268,328; Harkki et al. (1991); Enzyme Microb. Technol. 13:227-233; Harkki et al., (1989) Bio Technol. 7:596-603; EP 244, 234; y EP 215,594. También se hace referencia a Nevalainen et al., "The Molecular Biology of Trichoderma and i ts Application to the Expression of Both Homologous and Heterologous Genes", en MOLECULAR INDUSTRIAL MYCOLOGY, Eds. Leong and Berka, Marcel Dekker Inc., NY (1992) pp. 129-148. También se hace referencia a Cao et al., (2000) Sci. 9:991-1001 para la transformación de cepas de Aspergillus . Los transformantes genéticamente estables preferibles se pueden construir con sistemas de vector por medio de los cuales el ácido nucleico que codifica para GSHE se integra de manera estable en un cromosoma de la cepa hospedadora. Los trans ormantes después se pueden purificar por técnicas conocidas. En un ejemplo no limitante, los transformantes estables que incluyen un marcador amdS se distinguen de los transformantes inestables por su velocidad de crecimiento más rápida y la formación de colonias circulares es uniforme, en vez de contorno rugoso sobre un medio de cultivo sólido que contiene acetamida. De manera adicional, en algunos casos se lleva a cabo una prueba adicional de estabilidad al hacer crecer los transformantes sobre un medio no selectivo sólido (es decir, que carece de acetamida) cosechando las esporas de este medio de "cultivo y al determinar el porcentaje de estas esporas las cuales posteriormente germinarán y crecerán el medio selectivo que contiene acetamida. De manera alternativa se pueden utilizar otros métodos conocidos en la técnica para seleccionar transformantes . En una modalidad específica, la preparación del género Trichoderma para transformación involucra la preparación de protoplastos a partir de micelios micóticos (véase Campbell et al., (1989) Curr. Genet. 16:53-56). En algunas modalidades, los micelios se obtienen a partir de esporas vegetativas germinadas y tratadas con una enzima que digiere la pared celular, lo que resulta en los protoplastos. Los protoplastos después se protegen por la presencia de un estabilizante osmótico en el medio de suspensión. Estos estabilizantes incluyen sorbitol, manitol, cloruro de potasio, sulfato de magnesio y similares. Habitualmente, la concentración de estos estabilizantes varía entre 0.8 M y 1.2 M. Es preferible utilizar aproximadamente una solución 1.2 M de sorbitol en el medio de suspensión. La captación de ADN en la cepa del género Trichoderma hospedadora depende de la concentración del ion calcio. Generalmente se utiliza CaCl2 entre aproximadamente 10 mM y CaCl2 50 mM en una solución de captación. Además de la necesidad del ion calcio en la solución de captación, otros artículos generalmente incluidos son un sistema amortiguador tal como un amortiguador TE (Tris 10 Mm, pH 7.4; EDTA 1 mM) o MOPS lOmM, amortiguador pH 6.0 (ácido morfolinopropansulfónico) y polietilenglicol (PEG) . Se considera que el polietilenglicol actúa fusionando las membranas celulares y de esta manera permite que los contenidos del medio se suministren al citoplasma de la cepa del género Trichoderma y el ADN plasmídico se transfiere al núcleo. Esta fusión con frecuencia deja copias múltiples del ADN plasmídico integrado suavemente en el cromosoma del hospedador. Habitualmente una suspensión que contiene los protoplastos del género Trichoderma o las células que se han sometido a un tratamiento de permeabilidad a una densidad de 105 a 107/ml, preferiblemente 2 x 10s/ml es la que se utiliza en la transformación. Un volumen de 100 µl de estos protoplastos o células en una solución apropiada (por ejemplo sorbitol 1.2 M; CaCl2 50 mM) se mezclan con el ADN deseado. Generalmente se agrega una concentración elevada de PEG a la solución de captación. Se pueden agregar a la suspensión de protoplastos desde 0.1 a 1 volumen de PEG 4000 25%. No obstante, es preferible agregar aproximadamente 0.25 volúmenes de la suspensión de protoplastos . También se pueden agregar aditivos tales como sulfóxido de dimetilo, heparina, espermidina, cloruro de potasio y similares a la solución de captación y ayudar en la transformación. Están disponibles procedimientos similares para otras células hospedadoras micóticas. Véase, por ejemplo, las patentes de E. U. A. Nos. 6,022,725 u 6,268,328, cuyos contenidos se incorporan en la presente como referencia. De manera general, la mezcla después se incuba a aproximadamente 0°C por un período de entre 10 y 30 minutos. Después se agrega a la mezcla PEG adicional para mejorar adicionalmente la captación del gen deseado a la secuencia de ADN. El PEG 4000 25% generalmente se agrega en volúmenes de 5 a 15 veces el volumen de la mezcla de transformación; no obstante, pueden ser adecuados volúmenes mayores o menores. El PEG 4000 25% preferiblemente es aproximadamente 10 veces el volumen de la mezcla de transformación. Después de que se agrega PEG, la mezcla de transformación después se incuba ya sea a temperatura ambiente o sobre hielo antes de la adición de sorbitol y una solución de CaCl2. La suspensión de protoplastos después se agrega adicionalmente a las alícuotas fundidas de un medio de crecimiento. Este medio de crecimiento permite el crecimiento únicamente de transformantes .

Cultivo Celular Las células hospedadoras apropiadas generalmente se cultivan en un medio estándar que contiene sales fisiológicas y nutrientes, tales como los descritos en Pourquie, J. et al., BIOCHEMISTRY AND GENETICS OF CELLULOSE DEGRADATION, eds. Aubert, J. P. et al., Academic Press, pp. 71-86, 1988 and limen, M. et al., (1997) Appl . Environ . Microbiol . 63:1298-1306. también se hace referencia a los medios preparados comercialmente comunes tales como caldo de extracto de malta de levadura (YM) , caldo Luria Bertani (LB) y caldo de dextrosa Sabouraud (SD) .

Las condiciones de cultivo también son estándar, por ejemplo los cultivos se incuban a aproximadamente 28°C en un medio apropiado en cultivos de agitación o fermentadores hasta que se obtienen las concentraciones deseadas de la expresión de GSHE. Las condiciones de cultivo preferidas para los hongos filamentosos dados pueden encontrarse en la literatura científica y/o a partir de la fuente de los hongos tal como la American Type Culture Collection y el Fungal Genetics Stock Center (www. FGSC.net) . Después de que se ha establecido el crecimiento micótico, se exponen las células a condiciones eficaces para provocar o para permitir la expresión de una GSHE y particularmente una GSHE como se define en la presente. En casos en donde una secuencia codificante para GSHE está bajo el control de un promotor inducible, el agente inductor, por ejemplo un azúcar, sal metálica o antibióticos se agregan al medio a una concentración eficaz para inducir la expresión de GSHE.

Usos Industriales de rGSHE-fermentaciones En algunas modalidades de la presente invención, las células micóticas que expresan GSHE heterólogo se hacen crecer bajo condiciones de fermentación en lotes o continua. Una fermentación en lotes clásicas es un sistema cerrado, en donde la composición del medio es estable al inicio de la fermentación y no se somete a alteraciones artificiales durante la fermentación. Por lo tanto, al inicio de la fermentación se inocula el medio con uno o varios organismos deseados. En este método, se permite que la fermentación se produzca sin la adición de componente alguno al sistema. Típicamente, la fermentación por lotes califica como un "lote" con respecto a la adición de la fuente de carbón y con frecuencia se realizan intentos por controlar factores tales como el pH y la concentración de oxígeno. El metabilito y las composiciones de biomasa del sistema de lote cambian constantemente hasta el momento en que se detiene la fermentación. Dentro de los cultivos de lote, las células avanzan hasta la fase de retraso estática hasta una fase logarítmica de crecimiento elevada y finalmente a una fase estacionaria en donde la velocidad de crecimiento disminuye o se detiene. Sí no se tratan, las células en la fase estacionaria finalmente mueren. En general, las células en fase logarítmica son responsables de la gran cantidad de producción de producto final . Una variación del sistema de lote estándar es el sistema de "fermentación de alimentación de lote" , el cual también encuentra uso con la presente invención. En esta variación de un sistema de lote típico, el sustrato se agrega en incrementos conforme avanza la fermentación. Los sistemas de lote de alimentación se utilizan cuando la represión del catabolito es adecuada para inhibir el metabolismo de las células y cuando es deseable tener cantidades limitadas de sustrato en el medio. La medición de la concentración del sustrato real en los sistemas de lote de alimentación es difícil y por lo tanto se calcula en base en los cambios de factores mensurables tales como pH, oxígeno disuelto y la presión parcial de gases de desperdicio tales como C02. Las fermentaciones por lote y por lote de alimentación son comunes y bien conocidas en la técnica. La fermentación continua es un sistema abierto en donde se agrega continuamente un medio de fermentación definido a un biorreactor y se extrae simultáneamente para procesamiento una cantidad igual de medio acondicionado. La fermentación continua generalmente mantiene los cultivos a una densidad elevada constante en donde las células principalmente están en crecimiento en fase logarítmico . La fermentación continua permite la modulación de un factor o de cualquier cantidad de factores que afecten el crecimiento celular y/o la concentración del producto final . Por ejemplo, en una modalidad, un nutriente limitante tal como una fuente de carbono o una fuente de nitrógeno se mantiene a una velocidad fija y se permite que todos los demás parámetros se moderen. En otros sistemas, un número de factores que afectan el crecimiento pueden ser alterados continuamente mientras se mantienen constante la concentración celular, medida por la turbidez del medio. Los sistemas continuos se esfuerzan en mantener condiciones de crecimiento en estado estable. Por lo tanto, la pérdida de células debido a que el medio es extraído debe ser equilibrada contra la velocidad de crecimiento celular en la fermentación. Los métodos para modular nutrientes y factores de crecimiento para procedimientos de fermentación continua así como las técnicas para maximizar la velocidad de formación de producto son bien conocidas en la técnica de microbiología industrial .

Identificación de la Actividad de GSHE Con el fin de evaluar la expresión de un GSHE por una línea celular que ha sido transformada con un polinucleótido heterólogo que codifica para una GSHE abarcada por la invención, se pueden llevar a cabo ensayos a nivel de proteína, a nivel de ARN o mediante el uso de bioensayos funcionales en particular para la actividad de glucoamilasa y/o la producción. En general, los ensayos utilizados para analizar la expresión de una GSHE incluyen transferencia Northern, punteado (análisis de ADN o ARN) , RT-PCR (siglas en inglés para reacción en cadena de polimerasa y transcriptas inversa) o hibridación in situ, utilizando una sonda marcada apropiadamente (en base en la secuencia codificante de ácido nucleico) así como la transferencia Southern convencional y la autoradiografía . Además, la producción y/o expresión de una GSHE se puede medir en una muestra directamente, por ejemplo, mediante ensayos que midan directamente azúcares reductores tales como glucosa en el medio de cultivo y por ensayos para medir la actividad, expresión y/o producción de glucoamilasa. Los sustratos útiles para realizar ensayos de la actividad de GSHE incluyen sustratos de almidón granular. Por ejemplo, se puede determinar la concentración de glucosa por cualquier método conveniente por ejemplo mediante la utilización del equipo reactivo de glucosa No. 15-UV (Sigma Chemical Co . ) o un instrumento tal como el Technicon Autoanalyzer . También se hace referencia al equipo de glucosa oxidasa y los equipos de glucosa hexosa disponibles comercialmente de Instrumentation Lab. (Lexington, MA) . Se puede determinar la actividad de glucoamilasa por el método de ácido 3 , 5-dinitrosalicilico (DNS, por sus siglas en inglés) (véase Goto et al., (1994) Biosci . Biotechnol. Biochem. 58:49-54) . En un ejemplo no limitante, una rGSHE tiene la capacidad de hidrolizar almidón granular en una suspensión de sólidos de almidón 15% en agua a una solución de sacáridos de por lo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% , 97%, 98% y 99% en peso de glucosa, en una base de sustancia seca. En una modalidad de la invención, la GSHE expresada por un hospedador recombinante será mayor de 1 gramo de proteína por litro (g/1) de medio de cultivo. Preferiblemente en algunas modalidades, el hospedador es un hospedador de Trichoderma o de Aspergillus . En algunas modalidades, la cantidad de GSHE expresada por el hospedador de Trichoderma recombinante será mayor de 2 g/1 de medio de cultivo . En otras modalidades, la cantidad de GSHE expresada por un hospedador de Trichoderma recombinante será mayor de 5 g/1 de medio de cultivo. En otras modalidades adicionales, la cantidad de GSHE expresada por un hospedador de Trichoderma recombinante será mayor de 10 g/1 de medio de cultivo. La cantidad de GSHE expresada en algunos casos puede ser mayor de 20 g/1, mayor de 25 g/1, mayor de 30 g/1 y mayor de 50 g/1 de medio de cultivo. Además, la proteína de expresión puede ser evaluada por métodos inmunológicos tales como tensión inmunohistoquímica de células, secciones de tejido o inmunoensayo de medio de cultivo de tejido, por ejemplo mediante transferencia Western o ELISA. Tales inmunoensayos pueden ser utilizados cualitativa o cuantitativamente para evaluar la expresión de una GSHE. Los detalles de tales métodos se conocen por aquellos expertos en la técnica y están disponibles comercialmente muchos reactivos para llevar a la práctica tales métodos . Los ensayos ejemplares incluyen ELISA, inmunoensayos competitivos, radioinmunoensayos, transferencia Western, ensayos de inmunofluorescencia indirecta y similares. En general, los anticuerpos disponibles comercialmente y/o los equipos se pueden utilizar para el inmunoensayo cuantitativo del nivel de expresión de una GSHE.

Métodos para purificar GSHE En general, una GSHE (nGSHE o rGSHE) producida en un cultivo celular se secreta al medio y puede ser purificada o aislada, por ejemplo, al separar los componentes no deseados del medio de cultivo celular. En algunos casos, se puede producir una GSHE en una forma celular que requiera recuperación de un usado celular. En tales casos la enzima se purifica de las células en las cuales se produce utilizando técnicas utilizadas de manera habitual por aquellos expertos en la técnica. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a cromatografía de afinidad (Tilbeurgh et al . , (1984) FEBS Lett. 16:215); métodos cromatográficos de intercambio iónico (Goyal et al., (1991) Biores. Technol. 36:37; Filess et al., (1983) Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 17:314; Bhikhabhai et al., (1984) J. appl. Biochem. 6:336; y Ellouz et al., (1987) Chromatography 396: 307) que incluyen materiales que utilizan intercambio iónico con una elevada potencia de resolución (Medve et al., (1998) J. Chromatography A 808: 153; cromatografía de interacción hidrofóbica (Tomaz and Queiroz, (1999) J. Chromatography A 865:123; división bifásica (Brumbauer, et al., (1999) Bioseparation 7:287); precipitación con etanol; CLAP en fase inversa; cromatografía sobre sílice o sobre una resina de intercambio catiónico tal como DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación con sulfato de amonio y filtración en gel utilizando, por ejemplo, Sephadex G-75. El grado de purificación deseado variará en base en el uso de la GSHE. En algunas modalidades, la purificación no será necesaria. En algunas modalidades, la GSHE que se expresa de manera recombinante es de un hospedador de Trichoderma . En otras modalidades, los hospedadores de Trichoderma expresan un polinucleótido heterólogo, el cual codifica para una GSHE de la cepa Humicola grisea, particularmente una cepa de Humicola grisea var. thermoidea . En otras modalidades, la Trichoderma expresa una GSHE recombinante en donde el polinucleótido heterólogo codifica para una GSHE que tiene por lo menos 50% de identidad de secuencia con la secuencia de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO. 3. En algunas modalidades, el hospedador Trichoderma expresa un polinucleótido heterólogo el cual codifica para una GSHE para una cepa Aspergillus awamori, particularmente una cepa de A . awamori var. kawachi. En otras modalidades, la Trichoderma expresa una GSHE recombinante en donde el polinucleótido heterólogo codifica para una GSHE que tiene por lo menos 50% de identidad de secuencia de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 6. Composición y condiciones de Procedimiento Cuando la GSHE es suministrada en un extracto libre de células o se suministra en un medio de cultivo (caldo de fermentación) el cual incluye células micóticas que expresan y secretan GSHE, el sustrato de almidón granular, preferiblemente en forma de suspensión se pone en contacto con la GSHE y la a amilasa de manera esencialmente simultánea (denominada en la presente como simultáneamente) para hidrolizar el almidón granular y producir un jarabe de glucosa. La hidrólisis del almidón granular es un procedimiento de una etapa. Se puede agregar una GSHE a una composición que comprende . ámilasa y un sustrato de almidón granular en una cantidad de entre aproximadamente 0.01 a 10.0 U de GSHe/g de almidón en sólidos secos de una suspensión ajustada a 10-55% de sólidos secos. En algunas modalidades, la GSHE se agrega en una cantidad de entre aproximadamente 0.01 y 5.0 U de GSHE/g; aproximadamente 0.01 y 2.0 U de GSHE/g; aproximadamente 0.01 y 1.5 U de GSHE/g; aproximadamente 0.05 y 1.5 U de GSHE/g; aproximadamente 0.1 y 5.0 U de GSHE/g; aproximadamente 0.1 y 1.0 de U de GSHE/g; aproximadamente 0.25 y 2.5 U de GSHE/g; aproximadamente 0.5 y 5.0 U de GSHE/g; y aproximadamente 0.5 y 1.0 U de GSHE/g de dicha solución. También en algunas modalidades preferidas, el GSHE se agrega en una cantidad de entre aproximadamente 0.05 y 1.5 U de GSHE/g de dicha solución, también entre 0.1 y 2.0 U de GSHE/g y también entre aproximadamente 0.1 y 1.0 U de GSHE/g. En modalidades adicionales, se agrega una GSHE a una composición de suspensión de almidón granular esencialmente de manera simultánea con OÍ amilasa en donde la suspensión se ajusta de 10 a 55% ds, de manera preferible 20-45% ds y también 25-45% ds . En algunas modalidades, la a amilasa que comprende la composición se agrega en un intervalo de aproximadamente 0.01 a 1.0 kg de GZYME 997 por tonelada métrica de almidón. En una modalidad, el sustrato de almidón granular se pone en contacto con una GSHE en donde la GSHE está disponible como un filtrado libre de células (de manera tal que la GSHE está aislada del medio de cultivo) . En otra modalidad, el sustrato de almidón granular se pone en contacto con una GSHE, en donde la GSHE está disponible en un medio de cultivo que contiene la GSHE secretada y células micóticas. Preferiblemente, la GSHE se secretará de Trichoderma reesei que contiene un polinucleótido heterólogo que codifica para un polipéptido que tiene actividad hidrolizante de almidón granular y por lo menos 90%, por lo menos 95% y por lo menos 98% de identidad de secuencia con la secuencia de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 6. Los métodos de la invención se llevan a cabo a una temperatura igual o por debajo de la temperatura de gelatinización del almidón granular del sustrato. En algunas modalidades, el método se lleva a cabo a una temperatura de por lo menos aproximadamente 25°C, 30°C, 35°C, 40°C, 45°C, 50°C, 55°C, 60°C, 65°C, 70°C y 75°C. En otras modalidades, el método se lleva a cabo a una temperatura menor de aproximadamente 65°C y también menor de aproximadamente. 60°C. En otras modalidades, el método se lleva a cabo a una temperatura de entre aproximadamente 30°C y 65 °C; también entre aproximadamente 35°C y 65°C; entre aproximadamente 40 °C y 65°C; entre aproximadamente 45°C y 65°C; y entre aproximadamente 50°C y 65°C. La temperatura exacta utilizada de acuerdo con el método depende del sustrato de almidón específico y además puede depender de la variedad vegetal particular. En algunas modalidades, cuando el maíz es el sustrato de almidón granular, la temperatura se lleva a cabo entre aproximadamente 55°C y 65°, y de manera más particular entre 60 °C y 65°C. La tabla 2 ilustra los intervalos de temperatura de gelatinización de almidón generales para diversos almidones. La tabla se ha compilado de diversas fuentes y de ninguna manera significa que limite la invención, sino que se proporciona como una guía.

TABLA 2 Intervalo de Temperatura para la gelatinización de almidones (J. J. M. Swinkels pg 32-38 in STARCH CONVERSIÓN TECHNOLOGY, Eds Van Beynum et al., (1985) Marcel Dekker Inc. New York and The Alcohol Textbook 3 ED. A reference for the beverage, fuel and industrial alcohol industries, Eds Jacques et al., (1999) Nottingham University Press, UK) El intervalo de pH en el cual los métodos de la invención se llevan a cabo es el intervalo de aproximadamente pH 3.0 a pH 6.5; además, se utilizan en los métodos los intervalos de 3.5 a pH 6.5; el intervalo de pH 4.0 a pH 6.5; y el intervalo de pH 4.5 a pH 6.0. El intervalo de pH depende en cierta medida de las enzimas específicas y una persona experta en la técnica puede ser capaz de determinar el mejor intervalo de pH para llevar a cabo los métodos, sin experimentación indebida. En algunas modalidades, cuando el maíz es el sustrato, el intervalo de pH es de aproximadamente pH 4.5 a pH 6.0 y también de aproximadamente pH a 5.0 a pH 5.5. En algunas modalidades, por lo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% de los sólidos secos del almidón granular se convierten en una composición de jarabe de glucosa. En algunas modalidades, el sustrato de almidón granular se hidroliza completamente. En algunas modalidades, por lo menos 90% del sustrato de almidón granular se hidroliza en un período de tiempo de 24 horas. En otras modalidades, por lo menos 95% del sustrato de almidón granular se hidroliza en un período de tiempo de 24 horas. En otras modalidades, el jarabe de dextrosa producido de acuerdo con la invención será de aproximadamente 32 a 46% ds de jarabe que contiene por lo menos 90% de glucosa. En algunas modalidades, el período de tiempo que se requiere para hidrolizar el almidón granular para producir jarabe de glucosa es de aproximadamente 2 a 100 horas. En algunas modalidades, el período de tiempo es de aproximadamente 5 a 100 horas. En otras modalidades, el período de tiempo es de aproximadamente 10 a 100 horas. En otras modalidades adicionales, el período de tiempo es de 5 a 50 horas. En otras modalidades, el período de tiempo es de por lo menos aproximadamente 10 horas, pero menos de aproximadamente 50 horas. En modalidades preferidas, el procedimiento de una etapa se llevará a cabo en 2 a 100 horas y, en algunas modalidades, el procedimiento se llevará a cabo de 5 a 50 horas. Preferiblemente, el rendimiento de glucosa en la composición solubilizada (por ciento de glucosa de los sólidos secos solubilizados totales) es de por lo menos aproximadamente 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95.5%, 96%, 96,5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99% y 99.5%. De manera más preferible, el rendimiento es de por lo menos aproximadamente 95% y de manera mucho más preferible, el rendimiento es de por lo menos aproximadamente 96%. Las cantidades exactas de los componentes abarcados por la composición y los métodos de la invención dependen de la combinación de enzimas aplicadas así como el tipo de almidón granular procesado. En algunas modalidades, la proporción de unidades a amilasa respecto a unidades GSHE (o¡ amilas : GSHE) estará en el intervalo de 15:1 a 1:15 y en algunas modalidades en el intervalo 10:1 a 1:10. En otras modalidades, la proporción estará en el intervalo de 5:1 a 1:5 y en modalidades adicionales, la OÍ amilasa: GSHE estará entre 4:1 a 1:4. En modalidades preferidas, la proporción será de aproximadamente 2:1 a 1:4 y de manera más preferible de aproximadamente 2:1 a 1:2. El procedimiento de una etapa abarcado por la invención puede incluir la adición de ingredientes adicionales sin reducir la eficacia de la hidrólisis del almidón granular. Estos ingredientes adicionales incluyen, pero no se limitan a otras enzimas tales como celulasas, proteasas, pululanasas, hemicelulasa, xilanasas y similares. La glucosa producida de acuerdo con el método de la invención se puede separar de la mezcla de reacción por métodos conocidos en la técnica. Algunos de estos métodos incluyen centrifugación, métodos de filtración convencional y preferiblemente procedimientos de separación por membrana. También se menciona el uso de sistemas de membrana de ultrafiltración. En una modalidad preferida, el jarabe de glucosa se separa por filtración utilizando una membrana de ultrafiltración con limite de peso molecular (MWCO, por sus siglas en inglés) . Estas membranas son conocidas en la técnica. En algunas modalidades, la membrana puede ser de 1,000 a 1,000,000 de MWCO. En otras modalidades, la membrana de separación puede ser una membrana de tipo de microfiltro de 0.1 a 1.0.

Conversión adicional de glucosa a productos finales deseados En un método abarcado por la invención, el jarabe de glucosa es el producto final preferido. No obstante, la glucosa se puede purificar adicionalmente para proporcionar dextrosa cristalina por métodos conocidos .

La glucosa también se puede convertir a otros productos finales deseados . La conversión de glucosa a otros productos finales deseados se puede llevar a cabo por cualquier método adecuado tal como métodos enzimáticos o químicos. En una modalidad, la conversión se lleva a cabo por bioconversión de glucosa al poner en contacto glucosa que se obtiene de acuerdo con la invención con un microorganismo capaz de convertir la glucosa en un producto final. La etapa de contacto puede ser una etapa secuencial, en donde el jarabe de glucosa producido por el método de la invención después se pone en contacto con un microorganismo para producir un producto final, o la etapa de contacto puede ser una etapa simultánea, en donde el sustrato de almidón granular se pone en contacto con la GSHE y la enzima o; amilasa en combinación con un microorganismo capaz de convertir el jarabe de glucosa producido por la conversión de enzima, en un producto final. El microorganismo puede ser un microorganismo de tipo silvestre, mutado o recombinante. En algunas modalidades, los productos finales deseados son fructosa, intermediarios de ácido ascórbico (ASA, por sus siglas en inglés) tales como gluconato, 2-ceto-D-gluconato, 2 , 5-diceto-D-gluconato, ácido 2-ceto-L-gulonico, ácido idónico, ácido eritorbico y ácido ascórbico; etanol, 1,3-propanodiol, glutamato monosodico, aminoácidos, azúcares, alcoholes, ácidos orgánicos e índigo.

Cuando la fructosa es el producto final deseado, el jarabe de glucosa obtenido de acuerdo con la presente invención se puede convertir enzimáticamente a un jarabe de fructosa por una glucosa isomerasa. En algunas modalidades, la glucosa isomerasa está inmmovilizada. Las glucosas isomerasas contempladas incluyen aquellas disponibles comercialmente tal como G ZYMEMRG993 líquida y GENSWEET"11 (Genencor International, Inc.) y SWEETZYME T (Novozyme) (véanse, por ejemplo, las patentes de E. U. A. No. 3,939,041 y la patente de E. U. A. No. 4,687,742). Cuando los intermediarios de ASA y ASA son los productos finales deseados, el jarabe de glucosa que se obtiene de acuerdo con la presente invención se puede bioconvertir enzimáticamente a gluconato utilizando, por ejemplo, glucosa deshidrogenasa (o enzimas glucosa oxidasa-catalasa) . El gluconato se puede oxidar a 2 , 5-diceto-D-gluconato (DKG, por sus siglas en inglés) por una DKG reductasa. Se puede reducir DKG a ácido 2-ceto-L-gulonico (KLG, por sus siglas en inglés) por una KLG reductasa. KLG después se puede convertir a ASA. Los métodos para convertir glucosa a ASA e intermediarios de ASA son bien conocidos (véase, por ejemplo, la patente de E. U. A. No. 4,945,052, la patente de E. U. A. No. 5,008,193; la patente de E. U. A. No. 5,817,490 y la patente de E. U. A. No. 6,358,715). Cuando el producto final deseado es 1,3-propanodiol, la glucosa obtenida de acuerdo con la invención se puede poner en contacto con E. coli u otros microorganismos recombinantes (véase, por ejemplo, la patente de E. U. A. No. 6,013,494, la patente de E. U. A No. 5,356,812) . Cuando el producto final deseado es etanol, la glucosa se puede poner en contacto ya sea de manera secuencial o simultánea con un microorganismo etanologénico tal como la levadura saccharomyces cerevisiae para obtener etanol (véase, por ejemplo, la patente de E. U. A. No. 4,316,956). Los ejemplos adicionales de microorganismos etanologénicos los cuales pueden ser utilizados en los métodos de la invención son aquellos que expresan alcohol deshidrogenasa y piruvato descarboxilasa tal como Zymmomonas mobilis (véanse, por ejemplo, las patentes de E. U. A. Nos. 5,028,539; 5,424,202; 5,487,989 y 5,514,583). Para completar la fermentación con levadura, el etanol debe ser recuperado, por ejemplo, por destilación y se puede utilizar para productos de etanol potable, de combustible e industriales. Los productos secundarios de la fermentación incluyen materiales líquidos y sólidos que pueden ser separados y utilizados adicionalmente. Por ejemplo, el material sólido recuperado, tal como grano seco de destilación (DDG, por sus siglas en inglés) y la mezcla de los DDS con productos secundarios líquidos para formar grano seco de destilería con sustancias solubles (DDGS, por sus siglas en inglés) se pueden utilizar como un tienso para animales. El uso de levadura para la producción de etanol durante la fermentación y producción de etanol se discute adicionalmente en THE ALCOHOL TEXTBOOK, A REFERENCE FOR THE BEVERAGE, FUEL AND INDUSTRIAL ALCOHOL INDUSTRIES, 3a edición, Editores k. A. Jacques et al., 1999, Nottingham University Press, Reino Unido . En algunas modalidades de la invención, cuando el jarabe de glucosa se separa de la mezcla de reacción, por ejemplo, mediante centrifugación o filtración como se menciona en lo anterior, la composición restante incluirá almidón residual . El producto secundario de almidón residual puede ser utilizado en diversas aplicaciones, por ejemplo, el almidón residual puede ser reciclado y utilizado como un componente en un método de acuerdo con la invención; el almidón residual se puede utilizar como materia prima de carbono en fermentaciones adicionales; el almidón residual se puede utilizar en un procedimiento convencional de hidrólisis de almidón y el almidón residual se puede utilizar como un ingrediente para formulaciones de alimentos. Una modalidad preferida de la invención comprende poner en contacto simultáneamente un sustrato de almidón granular con una GSHE y una OÍ amilasa a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización del almidón granular para hidrolizar el almidón granular para obtener un jarabe de glucosa, separar el jarabe de glucosa de la mezcla de reacción para obtener un componente de jarabe de glucosa y un componente de producto secundarios el cual incluye almidón residual. En algunas modalidades, de acuerdo con la invención, cuando el almidón residual se recicla en una etapa de reciclado y se utiliza en el método abarcado por la invención, el almidón residual simultáneamente se pondrá en contacto con una composición que comprende una GSHE y una amilasa a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización del sustrato de almidón granular. El componente de almidón residual puede incluir enzimas que han sido retenidas por la membrana de separación y/o GSHE y enzimas de a. amilasa que se acaban de agregar al reactor. En algunas modalidades, la etapa de reciclado en combinación con la etapa de contacto simultáneo se puede repetir numerosas veces y adicionalmente se puede llevar a cabo bajo condiciones de reciclado continuo en donde el jarabe de glucosa se separa por medios conocidos en la técnica. El tiempo de contacto de los diversos componentes en un reactor o recipiente puede ser el mismo que el indicado en lo anterior, que es de 2 a 100 horas. En algunas modalidades preferidas, el tiempo de residencia puede ser de entre 5 y 50 horas .

En la modalidad de etapa de reciclado, el almidón residual se puede reciclar para obtener jarabe de glucosa. En un ejemplo no limitante, una suspensión de almidón granular (es decir, una suspensión de almidón de maíz que tiene 38-42% ds) se puede hidrolizar con GSHE de Humicola (es decir, 1.0 U de GSHE/g) y SPEZYME etil (es decir, 0.6 AU/g) a una temperatura de aproximadamente 58-62 °C y un pH de 5.0 a 6.0 durante 20-24 horas, en donde por lo menos 55% del almidón de maíz se hidroliza para producir un jarabe de glucosa que tiene por lo menos 90% de glucosa. El almidón residual se puede recuperar y resuspender y combinar con una segunda ronda de GSHE y OÍ amilasa. En la segunda ronda, aproximadamente por lo menos 90% del almidón se hidroliza lo que proporciona por lo menos 90% de glucosa. El jarabe de glucosa después se puede evaporar por medios conocidos en la técnica, tales como vacío y después se puede utilizar como un tienso de glucosa. En la modalidad de etapa de reciclado, el almidón residual puede ser reciclado para obtener productos finales diferentes de glucosa. Por ejemplo, cuando el producto final' es etanol, el sustrato de almidón granular se pone en contacto ya sea de manera separada o de modo secuencial o simultáneo con GSHE, a amilasa y un organismo etanologénico para hidrolizar el almidón granular y para producir etanol, el etanol se puede recuperar por destilación y el material remanente, el cual incluye un material tanto sólido como líquido que incluye almidón residual se puede reciclar y utilizar con GSHE y la a amilasa en etapas adicionales de manera tal que el reciclado se lleva a cabo bajo condiciones de reciclado continuo.

PARTE EXPERIMENTAL En la descripción y la sección experimental que sigue, se aplican las siguientes abreviaturas: rH-GSHE (GSHE de Humicola grisea var. thermoidea que se expresa en Trichoderma reesei) ; % en peso (por ciento en peso) , °C (grados centígrados) ; rpm (revoluciones por minuto) ; H20 (agua) ; dH20 (agua desionizada) ; bp (pares de bases) ; kb (kilo pares de bases) ; kD (kilodaltons) ; gm (gramos) ; µg (microgra os) ;mg (miligramos) ; ng (nanogramos) ; µl (microlitros) ; ml (mililitros) ; mm (milímetros) ; nm (nanometros) ; µm (micrómetros) ; M (molar) ; mM (milimolar) ; µM (micromolar) ; U (unidades) ; V (voltios) ; MW (peso molecular) ; seg (segundos) ; min (minuto/minutos) ; h (hora/horas) ; PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida) ; Di (desyonizado) ; amortiguador de ftalato (ftalato de sodio en agua, 20 mM, pH 5.0); Cerestar (Cerestar, Inc., a Cargill Inc., Minneapolis, MN) ; AVICELL^ (FMC Corporation) ; SDS (dodeciisulfato de sodio); Tris (tris (hidroximetil) aminometano) ; p/v (peso respecto a volumen) ; v/v (volumen respecto a volumen) ; Genencor (Genencor International, Inc., Palo Alto, CA) ; Shin Nihon (Shin Nihon, Japón) .

Métodos Generales Sustratos de almidón - Se utilizan en los ejemplos que se proporcionan en lo siguiente almidón de maíz, almidón de trigo y almidón de tapioca purificado y/o refinado Análisis de oligosacáridos - La composición de los productos de reacción de oligosacáridos se miden por el método de cromatografía líquida de alta presión (Beckman System Gold 32 Karat Fullerton, California, USA) equipado con una columna CLAP (rezex 8 u8% H, Monosaccharides) que se mantiene a 50 °C acoplada con un detector de índice de reflacción (Rl, por sus siglas en inglés) (ERC-7515A, Rl Detector de The Anspec Company, Inc.) . Se utiliza ácido sulfúrico diluido 0.01 N como la fase móvil a un caudal de 0.6 ml por minuto. Se inyectan en la columna veinte µl de solución 4.0%. La columna se separa en base en el peso molecular de los sacáridos. Por ejemplo, una designación de DPI es un monosacárido tal como glucosa; una designación de DP2 es un disacárido tal como maltosa, una designación DP3 es un trisacárido tal como maltotriosa y la designación "DP4+" es un oligosacárido que tiene un grado de polimerización (DP, por sus siglas en inglés) de 4 o mayor. Solubilización relativa de los sólidos - Se utiliza un procedimiento de cocinado por chorro de baja temperatura convencional para solubilizar el almidón (USP 3,912,590). El BRIX medido se toma como solubilización 100% del almidón bajo los parámetros definidos de proporción de almidón respecto a agua. En un procedimiento típico de cocinado por chorro, se suspenden 150 gramos de almidón en 350 gramos de agua lo que constituye una suspensión de almidón al 30%. Después se ajusta el pH a pH 5.8 utilizando NaOH 10%. Se agrega a amilasa termoestable SPEZYME FRED (Genencor International Inc.) a 0.4 kg/MT, ds y se calienta en un cocinador de chorro que se mantiene a 105°c durante 8 minutos. El almidón gelatinizado se hidroliza adicionalmente a 95°C durante 90 min. Se extrae una alícuota del hidrolizado y se centrifuga. El sobrenadante claro se utiliza para medir el BRIX (refractómetro ABBE, American Optical Corporation, Scientific Instrument División, Buffalo, New York) . El BRIX para almidón solubilizado 100% para un sustrato de almidón diferente a 30% ds se proporciona en la tabla 3 y se utiliza para calcular el porcentaje de solubilización relativa de almidón bajo diferentes condiciones de tratamiento. De manera alternativa, BRIX para solubilización 100% bajo condiciones diferentes se determina al incubar 5 ml de una alícuota con 10 microlitros de SPEZYME FRED (Genencor International Inc.) a 95 durante 5 min. La muestra tratada a alta temperatura se mantiene a 85°C durante 2 horas. Los sólidos insolubles se separan por centrifugación y se mide el BRIX del sobrenadante claro.

TABLA 3 BRIX para sustrato de almidón cocinado por chorro de enzima a suspensión 30% EJEMPLOS Se proporcionan los siguientes ejemplos con el fin de demostrar e ilustrar adicionalmente algunas modalidades preferidas y respectos de la presente invención y no se consideran como limitantes del alcance de la misma. En realidad, se contempla que estas enseñanzas encuentren uso para optimizar adicionalmente los sistemas de procedimiento que se describen en la presente.

EJEMPLO 1 Expresión del gen para GSHE de Humicola grisea var. thermoidea en trichoderma reesei A. Clonación del gen para GSHE de Humicola grisea var. thermoidea Se extrae ADN genómico (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1) de micelios de Scytalidium thermophilum congelado (ATCC 16453, anarmórfico, H. grisea var. thermoidea) . Los micelios congelados se muelen en hielo seco en un molino de café y se extrae el ADN por el protocolo EasyDNA (Invitrogen) . Se agrega una extracción adicional de cloroformo/fenol/alcohol isoamilico al protocolo estándar.

Los cebadores de PCR se diseñan, en base en la secuencia de base de datos NCBI acceso #M89475. El cebador directo contiene un motivo para la clonación direccional en el vector pENTR/D (invitrogen) . La secuencia del cebador RSH003Í es CAACATGCATACCTTCTCCAAGCTCCTC (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO. 7) , y la secuencia para el cebador RSH004r es TTAACGCCACGAATCATTCA CCGTC (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO. 8) . El producto de PCR se clona en pENTR/D de acuerdo con el protocolo del sistema Gateway Invitrogen. El vector después se transforma en E. coli Top 10 químicamente competente (Invitrogen) con selección con kanamicina. El ADN plasmídico de varios clones se somete a digestión de restricción para confirmar el inserto de tamaño correcto. El inserto glal se secuencia (Sequetech, Mountain View, CA) de diversos clones. El ADN plasmídico de un clon, pENTR/D_N13 se agrega a la reacción de clonasa LR (sistema Gateway Invitrogen) con el ADN vector de destino pTrex3g/ amdS. La recombinación, en la reacción de clonasa LR, sustituye a los genes CmR y ccdB del vector de destino con la grlal de H. grisea del vector pENTR/D. Este =rlal insertado direccionalmente de recombinación entre el promotor cjbhl y el terminador del vector de destino. Las secuencias del sitio de recombinación de 48 y 50 pares de bases permanecen hacia el extremo cinco prima y hacia el extremo tres prima, respectivamente, de glal . Una alícuota de la reacción de clonasa LR se transforma en E . coli ToplO químicamente competente y se hace crecer durante la noche con selección de carbenicilina. El ADN plasmídico, de varios clones, se digiere con enzimas de restricción apropiadas para confirmar el tamaño de inserto correcto. El ADN plasmídico del clon pTrex3g_N13 (véase las figuras 3 y 4) se digiere con Xbal para liberar el cásete de expresión que incluye el promotor cbhl: grlal : terminador amdS. Este cásete de 6. 6 kb se purifica por extracción en gel de agarosa utilizando técnicas estándar y se transforma en una cepa de T reesei derivada de la cepa QM6a disponible de manera pública, como se describe adicionalmente en lo siguiente . El cásete se secuencia por Sequetech, Mountain View, CA y el ADN para GSHE se ilustra en la figura 1 (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1) y la secuencia de aminoácidos que se ilustra en la figura 2 (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 2 y 3) .

B. Transformación de T. reesei Se inoculan aproximadamente 2 cm2 de una placa de micelios esporulados (que crecen en una placa PDA durante 5 días a 30°C) en 50 ml de caldo YEG (5 g/1 de extracto de levadura más 20 g/1 de glucosa) en un matraz de agitación con 4 refractores de 250 ml y se incuba a 37°C durante 16-20 horas a 200 rpm. Los micelios se recuperan por transferencia del volumen líquido en tubos cónicos de 50 ml y se centrifuga a 2500 rpm durante 10 minutos. Se decanta el sobrenadante. El sedimento de los micelios se transfiere a una botella de filtro CA Corning de 0.22 micrómetros de 250 ml que contiene 40 ml de solución de ß-D-glucanasa filtrada y se incuba a 30°c, 200 rpm durante 2 horas para generar protoplastos para transformación. Los protoplastos se cosechan por filtración a través de una miracloth estéril en un tubo cónico de 50 ml . Se sedimenta por centrifugación a 2000 rpm durante 5 minutos y se aspira. El sedimento de protoplastos se lava una vez con 50 ml de sorbitol 1.2 M, se sedimentan por centrifugación, se aspiran y se lavan con 25 ml de sorbitol/CaCl2. Los protoplastos se cuentan y después se sedimentan a 2000 rpm durante 5 min, el sobrenadante se decanta y el sedimento de protoplastos se resuspende en una cantidad de sorbitol/CaCl suficiente para generar una concentración de protoplastos de 1.25 x 108 protoplastos por ml, lo que genera una solución de protoplastos . Se colocan alícuotas de hasta 20 µg de ADN vector de expresión (en un volumen no mayor de 20 µl) en tubos cónicos de 15 ml y los tubos se colocan en hielo. Después se agregan 200 µl de la suspensión de protoplastos junto con 50 µl de solución PEG a cada alícuota de transformación. Los tubos se mezclan suavemente y se incuban en hielo durante 20 min. Se agregan 2 ml de solución PEG a los tubos de alícuota de transformación y estos se incuban a temperatura ambiente durante 5 minutos . Se agrega la solución de 4 ml de sorbitol/CaCl2 a los tubos (lo que genera un volumen total de 6.2 ml) . La mezcla de transformación se divide en 3 alícuotas, cada una contiene aproximadamente 2 ml . Se genera una mezcla de superposición al agregar cada una de estas 3 alícuotas a tres tubos de agar superior fundido (que se mantiene fundido a retener a 50°C) y esta mezcla de superposición se vierte en una placa de transformación. Las placas de transformación después se incuban a 30°C hasta por siete días. La transformación se realiza con selección de amdS. Las placas de acetamida/sorbitol y agar superior se utilizan para la transformación. El agar superior se prepara por la misma receta de agar sorbitol/acetamida que las placas, excepto que se utiliza agarosa con un punto de fusión bajo en lugar de agar noble. Los transformantes se purifican por transferencia de las colonias aisladas a medio selectivo fresco que contiene acetamida (es decir, agar sorbitol/acetamida, sin sorbitol) . Con referencia a los ejemplos, las soluciones se preparan como sigue. 1) Se elaboran 40 ml de solución ß-D-glucanasa en sorbitol 1.2 M y se incluyen 600 mg de ß-D-glucanasa (interSpex Products Inc., San Mateo, CA) y 400 mg de MgS04«7H20. 2) 200 ml de mezcla de PEG que contiene 50 g de PEG 4000 (BDH Laboratory Supplies Poole, Inglaterra) y 1.47 g de CaCl2*2H20 se constituye en dH20. 3) Sorbitol/CaCl2 contiene sorbitol 1.2 M y CaCl2 50 mM. 4) Agar Acetamida/sorbitol: Parte 1 - Se ajustan a pH 5.5 0.6 g de acetamida (Aldrich, 99% sublime), 1.68 g de CsCl, 20 g de glucosa, 20 g de KH2P04, 0.6 g de MgS04«7H2o, 0.6 de CaCl2*2H20, 1 ml 1000 x sales (véase abajo) a un volumen de 300 ml con dH20, y se esteriliza por filtración. Parte II - 20 g de agar noble y 218 g de sorbitol se llevan a un volumen de 700 mis con dH20 y se esterilizan. Se agrega la parte II a la parte I de un volumen final de 1 L. 5) Se combinan 1000 x sales - 5 g de FeS04«7H20, 1.6 g de MnS0*H20, 1.4 g de ZnS04*7H20, 1 g de CoCl2*6H20 y el volumen se lleva a l l con dH20. La solución se esteriliza por filtración. C. Fermentación de T reesei transformado con el gen para GSHE de H. grisea var. thermoidea En general, se sigue el protocolo de fermentación como se describe en Foreman et al., (Foreman et al. (2003) J. Biol. Chem 278:31988-31997). De manera más específica, se realizan fermentaciones por duplicado para cada una de las cepas mostradas en la figura 5. Una cantidad de 0.8 1 de medio mínimo Vogels (Davis et al., (1970) Methods in Enzymology 17A, pg 79-143 and Davis, rowland, NEUROSPORA, CONTRIBUTIONS OF A MODEL ORGANISM, Oxford University Press, (2000)) que contiene glucosa 5% se inocula con 1.5 ml de suspensión de esporas congeladas. Después de 48 horas, cada cultivo se transfiere a 6.2 1 del mismo medio en un fermentador Biolafitte de 14 1. El fermentador se deja funcionando a 25°C, 750 rpm y un flujo de aire de 8 litros estándar por minuto. Una hora después de que se ha agotado la glucosa inicial, se inicia la alimentación de lactosa 25% (p/p) Y se alimenta de manera limitante en carbono para evitar la acumulación de lactosa. Las concentraciones de glucosa y lactosa se supervisan utilizando el equipo de ensayo de glucosa oxidasa o un equipo de ensayo de glucosa hexocinasa con ß-galactosidasa agregada para separar lactosa, respectivamente (Instrumentation laboratory Co., Lexington, MA) . Las muestras se obtienen a intervalos regulares para supervisar el avance de la fermentación. Las muestras recolectadas se centrifugan en un tubo de centrífuga de 50 ml a 3/4 de velocidad en una centrífuga clínica International ?quipment Company (Needham Heights, MA) . Los sobrenadante de muestra se corren en geles 4-12% de BIS-TRIS SDS-PAGE, bajo condiciones reductoras con MOPS (ácido morfolinpropanosulfonico) SDS de amortiguador de corrimiento y amortiguador de muestra LDS . Los resultados que se proporcionan en la figura 5. Los carriles 3 , 4 y 5 ilustran una banda de rGSHE de 68 kD en diferentes períodos de tiempo. D. Ensayo de la actividad de GSHE a partir de clones transformados de Trichoderma reesei Actividad enzimática - Se determina la actividad de GSHe como miligramos (mg) de azúcares reductores liberados (medidos como equivalentes de glucosa) por minuto (min) durante una incubación de 5 ml de almidón de maíz granular 10% en un amortiguador de acetato 0.1 M, pH 4.5, 50°C con una alícuota de la preparación de enzima. Una unidad de GHSE se define como 1.0 mg de azúcar reductor liberado por min bajo las condiciones de ensayo.

GSHE nativa (nGSHE) de Humicola grisea var, thermoidea y GSHE recombinante producida de T. reesei se purifica por técnicas estándar utilizando cromatografía de interacción hidrofobica usando fenil-Sepharose (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) seguido por cromatografía de intercambio iónico utilizando SP-Sepharose (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . La GSHe recombinante expresada inicialmente por los clones de T. reesei incluye dos fracciones de proteína pico en aproximadamente concentraciones iguales . Estos picos se etiquetan como rGSHEl y rGSHE2. Los dos picos difieren en masa por 1500D y por 0.3 unidades de pH, medido por desorpción e ionización láser asistida por matrix (MALDI-TOF) en un espectrómetro de masas voyageur (Applied Biosystems, Foster City, CA) y un gel de enfoque isoeléctrico (SERVA Electrophoresis, GmbH, Heidelberg, Alemania) , de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Tanto rGSHEl como rGSHE2 tienen la misma actividad específica a la medida por el ensayo hidrolizante de almidón crudo y las mediciones de proteína utilizando nel equipo de ensayo de proteínas MicroBCA (Pierce, Rockford, IL) y el porcentaje de coeficiente de extinción de solución (A280 0.1% = 1.963) . Después de un período de tiempo, medido en aproximadamente 72horas después de la expresión inicial de rGSHE, únicamente se representa una forma de rGSHE (rGSHE3) (véase la tabla 4) .

TABLA 4 El % de carbohidratos (CHO) de las GSHE se determina por hidrólisis acida utilizando ácido trifluoroacético 4 N a 100 °C durante 5 h y las mediciones se realizan de los azúcares reductores liberados utilizando hidrazida de ácido parahidroxibenzoico. Cuando se expresa inicialmente, la glucoasilación de rGSHEl y rGSHE2 es de 2.70% de los carbohidratos totales. No obstante, después de 72 horas, el nivel de glucosilación de rGSHE3 encontrado en el medio es de 0.57% de CHO total. El nivel de glucosilación de GSHE nativa es de 1.12%. E. Comparación de GSHe nativa de ?. grisea var. thermoidea y GHSE de H. grisea var. thermoidea, que se expresa de manera recombinante, en Trichoderma reesei (1) Se determina la estabilidad de pH a partir de pH 3 a 7. Las muestras recolectadas de GSHE producido de manera recombinante como se describe en lo anterior y las muestras de GSHE nativa se diluyen a concentraciones de proteína iguales con amortiguador acetato 20 mM a ph 4.5. Las reacciones se llevan a cabo en amortiguadores de citrato 100 mM/NaOH a 50 °C durante 30 minutos a niveles de pH de 3 a 7.

Se agrega posteriormente 1.0 ml de la reacción a 5 ml de almidón de maíz 10% (cargill Foods, Minneapolis, MN) en acetato 100 mM, pH 4.5, en tubos de muestra. Los tubos se agitan a 50 °c durante 20 minutos. Después se agregan 0.5 ml de NaOH 2.0%. Los tubos se centrifugan y se realizan ensayos de 0.5 ml de sobrenadante para determinar los azúcares reductores utilizando el ensayo de ácido dinitro salicílico (DNS, por sus siglas en inglés) (Goto et al., (1994) supra). Los resultados del ensayo se muestran en la figura 8A. La GSHE producida de manera recombinante muestra aproximadamente 80% de actividad residual a pH 3.5. En comparación, la GSHE nativa correspondiente presenta únicamente aproximadamente 20% de actividad residual. A pH 4.0, tanto GSHE producida de manera recombinante como GSHE nativa muestran aproximadamente 82% de actividad residual y a pH 5.5 ambas enzimas presentan entre aproximadamente 90 a 100% de actividad residual. La estabilidad también se mide a pH 7.5 a 10.5 utilizando los métodos como se describen en lo anterior. No obstante, el amortiguador es amortiguador de acido bórico 100 mM/NaOH. Como se muestra en la figura 8B, a pH 7.5, ambas enzimas presentan aproximadamente 100% de actividad residual. A pH 8.5, GSHE producida de manera recombinante presenta aproximadamente 82% de actividad residual y GSHE nativa presenta aproximadamente 90% de actividad residual. A pH 9.5, el porcentaje de actividad residual de GSHE producida de manera recombinante es sustancialmente menor que GSHE nativa (10%, en comparación con 72%, respectivamente) . (2) Perfil de la actividad como una función de la temperatura La estabilidad a la temperatura se determina a pH de 5.75. Utilizando esencialmente los mismos procedimientos a lo descrito en lo anterior para los estudios de estabilidad de pH, las muestras de enzima se diluyen a concentraciones de proteína iguales en amortiguador de acetato 100 mM y después 1.0 ml de las enzimas diluidas se exponen a un baño maría a una temperatura de 40°C, 50°C, 60°C y 70°C durante 10 minutos y se realizan ensayos como se describe en loa anterior en los estudios de estabilidad de pH. Los resultados se presentan en la tabla 5. TABLA 5 % de actividad residual significa la diferencia en porcentaje con referencia a 100%, a pH 4.0 El perfil de la actividad como una función de la temperatura de GSHE producido de manera recombinante es similar al de GSHE nativa correspondiente. (3) . Hidrólisis de almidón de maíz granular por nGSHE y rGSHE . Tanto GSHE nativa de H. grisea var. thermoidea (nGSHE) así como H. grisea var. thermoidea que se expresa de manera recombinante (rGSHE) en Trichoderma reesei se diluyen a concentraciones de proteína iguales en amortiguador acetato pH 4.5. se agrega 1 ml de la dilución a una suspensión de almidón de maíz 10% (Cargill Foods, Minneapolis, MN) en amortiguador acetato pH 4.5 20 mM y se agita a 350 rpm a 50°C. En los intervalos de tiempo designados se extraen 100 µl de la suspensión y se agregan a 10 µl de NaOH 2%. La muestra se centrifuga y el sobrenadante se somete a ensayo para determinar glucosa (mg de glucosa/ mg de proteína) utilizando el reactivo glucosa oxidasa en un analizador clínico Monarch (Instrumentation Laboratory, Lexington, MA) . Como se muestra en la figura 9, la hidrólisis del almidón de maíz es ligeramente menor para rGSHE en comparación con nGSHE .

EJEMPLO 2 Expresión del gen para GSHE en Aspergillus awamori var kawachi en Trichoderma reesei .

A. Clonación del gen para GSHE de Aspergillus awamori . var kawachi Se extrae ADN genómico de micelios congelados de una cepa de A . awamori var. kawachi , de acuerdo con los métodos descritos en el ejemplo 1. Las secuencias cebadoras de PCR se diseñan en base en la secuencia publicada de la GAI glucoamilasa de A . awamori var. kawachi (Hayashida, et al . (1989) Agrie . Biol . . Chem. 53:923-929). Esta GAI es una GSHE. Se utilizaron los siguientes cebadores: el cebador RSHIOf que tiene la secuencia: CAC CAT GTC GTT CCG ATC TCT TCT C (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 9), la cual incluye el motivo de clonación direccional Gateway (Invitrogen) CACC y el cebador RSHllr que tiene la secuencia, CTA CCG CCA GGT GTC GGT CAC (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 10) . La secuencia de ADN se proporciona en la figura 6 (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4) . La secuencia polipeptídica GSHE codificada, que incluye el péptido señal, se proporciona en la figura 7A (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5) y la secuencia de la proteína madura se proporciona en la figura 7B (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 6) . El producto de PCR de 2.16 kilobases se purifica en gel (Equipo de Purificación en Gel, Qiagen) y se clona en pENTR/D (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo de sistema Gateway. El vector después se transforma en E. coli ToplO químicamente competente (Invitrogen) con selección con kanamicina. El ADN plasmídico de varios clones se digiere por restricción para confirmar el inserto de tamaño correcto. El inserto del gen para GAI se secuencia (Sequetech, Mountain View, CA) de varios clones (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4) . El ADN plasmídico de un clon, pENTR/D_Ak33xx#l, se agrega a la reacción de clonasa LR (Sistema Invitrogen Gataway) con el ADN vector de destino pTrex3g/amd£. La recombinación, en la reacción de clonasa LR sustituye a los genes CmR y ccdB del vector de destino con GAI de A . kawachi del vector pENTR/D. Esta recombinación de GAI insertada direccionalmente entre el promotor cbiiJ y el terminador del vector de destino. Las secuencias del sitio de recombinación AttB de 48 y 50 pares de bases permanecen hacia el extremo 5' y hacia el extremo 3', respectivamente, de la glucoamilasa. Se hace referencia a la figura 3, en donde grlal de H. grisea ha sido sustituido por GAI de A . kawachi en este ejemplo. Se transforman 2 µl de la reacción de clonasa LR en E. coli ToplO químicamente competente y se hacen crecer durante la noche con selección con carbenicilina. El ADN plasmídico de varios clones se digiere con Xbal para confirmar el tamaño del inserto. El ADN plasmídico del clon pTrex3g_Akxx#3 se digiere con Xbal para liberar el cásete de expresión que incluye al promotor de cbhl: GAI : terminador cbhI:amdS. Este cásete de 6.7 kilobases se purifica por extracción con agarosa utilizando técnicas estándar y se transforma en una cepa de T. reesei derivada de la cepa disponible públicamente QM6a.

B. Transformación de T. reesei con el gen para GSHE de A . awamori var. kawachi Una suspensión de esporas de Trichoderma reesei se dispersa en el centro de aproximadamente 6 cm de diámetro de una placa de transformación MABA (150 µl de una suspensión con 5 x 107 - 5 x 108 esporas/ml) . La placa después se seca al aire en una campana biológica. Cribas de detención (y sujetadores de microportador (BioRad 165-2336) y sujetadores de microportador (BioRad 1652322) se humedecen en etanol 70% y se secan al aire. Se coloca desecante DriRite en cajas de Petri pequeñas (6 cm Pirex) y se tapan con papel filtro Whatman. El retenedor de microportador contiene al microportador (BioRad 165-2335) y se coloca aplanado en la parte superior del papel filtro y se sustituye la tapa de la caja de Petri. Se prepara una suspensión de partículas de tungsteno al agregar 60 mg de partículas de tungsteno M-10 (microportador, 0.7 micrómetros, Biorad#1652266) a un tubo Eppendorf. Se agrega 1 ml de etanol (100%) . El tungsteno se somete a remolino en la solución de etanol y se permite que se enjuague durante 15 minutos. El tubo Eppendorf se somete a microcentrífuga brevemente a velocidad máxima para sedimentar el tungsteno. El etanol se decanta y se lava tres veces con agua destilada estéril . Después de que el lavado con agua se decanta por tercera vez, el tungsteno se resuspende en 1 ml de glicerol 50% estéril. El tungsteno se prepara fresco cada dos semanas . La reacción de transformación se prepara al agregar 25 µl de tungsteno suspendido a un tubo Eppendorf de 1.5 ml para cada transformación. Se realizan adiciones subsecuentes en orden, de 0.5-5 µl de ADN (0.2-1 µg/µl) , 25 µl de C1C12 2.5M y 10 µl de espermidina 0.1M. La reacción se somete a remolino continuamente durante 5-10 minutos, manteniendo el tungsteno suspendido . El tubo Eppendorf después se somete a centrífuga brevemente y se decanta. El sedimento del tungsteno se lava con 200 µl de etanol 70%, se somete a centrífuga brevemente para sedimentado y se decanta. El sedimento se lava con 200 µl de etanol 100%, se somete a centrífuga brevemente para sedimentar y se decanta. El sedimento de tungsteno se resuspende, por pipetado, en 24 µl de etanol 100%. El tubo Eppendorf se coloca en un baño de agua ultrasónico durante 15 segundos y se transfieren alícuotas de 8 µl al centro de los microportadores desecados. Se deja que los microportadores se sequen en las cajas de Petri desecadas. Se enciende un tanque de He a 10 MPa (1500 psi) . Se utilizan discos de ruptura de 7.6 MPa (1100 psi) (BioRad 165-2329) en el Modelo PDS-1000/He de Biolistic Partióle Delivery System (BioRad) . Cuando la solución de tungsteno está seca, se insertan una criba de detención y el sujetador de macroportador dentro del PDS-1000. Una placa de MABA, que contiene las esporas objetivo de T. reesei , se coloca 6 cm por debajo de la criba de detención. Se extrae un vacío de 737 mm Hg (29 pulgadas) de Hg en la cámara y se mantiene. Se enciende el sistema de suministro de partículas He Biolistic. La cámara se ventila y la placa MABA se retira para incubación, 28°C durante 5-7 días. Con referencia al Ejemplo 2, las soluciones se preparan como sigue . Agar Biolistic amdS modificado (MABA, por sus siglas en inglés) Por litro Parte I, elaborar en 500 ml de dH20 lOOOx de sales 1 ml Agar Noble 20 g pH a 6.0, esterilizar Parte II, elaborar en 500 ml de dH20 Acetamida 0.6 g CsCl 1.68 g Glucosa 20 g KH2P04 15 g MgS04 • 7H20 0.6 g CaCl2 • 2H20 0.6 g pH a 4.5, esterilizar con filtro de 0.2 micrómetros; dejar en un horno a 50 °C para que se caliente, agregar la mezcla de la parte I, placas de vertido.

Sales lOOOx Por litro FeSo4 • 7H20 5 g MnS04 • H20 1.6 g ZnS04 • 7H20 1.4 g CoCl2 • 6H20 1 g esterilizar con filtro de 0.2 micrómetros Se determina la expresión de rGSHE (GSHE de A . awamori var. kawachi expresado en T. reesei) como se describe en lo anterior para la expresión de H. grisea var. thermoidea en el Ejemplo 1. El nivel de expresión se determina que es mayor de 1 g/1 (datos no mostrados) . La figura 10 proporciona los resultados de un gel de SDS-PAGE que ilustra la expresión de GSHE Aspergillus awamori var. kawachi en el hospedador T. reesei .

EJEMPLO 3 Solubilización e hidrólisis de diferentes sustratos de almidón granular por OÍ amilasa. En un experimento típico, se suspenden 150 gramos de almidón granular en 350 gramos de agua destilada. Después de mezclar, se ajusta el pH a pH 5.5 utilizando NaOH 6 N. Se agrega la OÍ amilasa (GZYME G997 a 1.0 kg/MT de almidón, ds) a la suspensión de almidón y se incuba con agitación constante en un baño maría que se mantiene a 60°C. Las muestras se extraen en intervalos de tiempo diferentes para medir Brix. La muestra retirada a las 24 horas es la que se utiliza para determinar la composición de azúcar utilizando CLAR (tabla 6) .

TABLA 6 Los resultados que se presentan en la tabla 6 muestran diferencias significativas en la solubilización de los sustratos de almidón granular. El trigo tiene el porcentaje más alto de sólidos solubilizados y el maíz tiene el porcentaje más bajo. No se observaron diferencias significativas en la composición de azúcar después de 24 horas . EJEMPLO 4 Solubilización e hidrólisis de sustratos de almidón granular por a amilasa (G ZYME G 997) y rH-GSHE. En un experimento típico se agregan 350 g de agua por separado a 150 gramos de cada uno de almidón de maíz granular, almidón de trigo granular y almidón de tapioca granular y se ajusta el pH a 5.5 utilizando NaOH 6N. La suspensión se mantiene en un baño maría, el cual se mantiene a 60°C con agitación continua para mezclado uniforme. Después de estabilización de la temperatura se agrega a cada suspensión de almidón OÍ amilasa como G Zyme 997 (0.1 kg/MT de almidón, ds) y rH-GSHE (1.0 unidades de GSHE/gramo de almidón ds) a cada suspensión de almidón, y se continúa la incubación. Las muestras se toman en intervalos de tiempo diferentes, se centrifugan y se verifica Brix. Las muestras de las 24 horas se analizan para determinar la composición de azúcar. Se calcula la solubilización relativa del almidón granular al comparar el Brix del procedimiento de cocinado a chorro y se hace referencia en la tabla 7.

TABLA 7 El efecto combinado de G Zyme G 997 y rH-GSHE resulta en una solubilización casi completa del sustrato de almidón granular bajo condiciones moderadas en comparación con la temperatura elevada actual en el proceso de cocinado a chorro. El análisis de las muestras de las 24 horas muestra un rendimiento de glucosa mayor de 96.5%.

EJEMPLO 5 Solubilización e hidrólisis de almidón de maíz granular por glucoamilasas que tienen actividad hidrolizante de almidón granular. Las glucoamilasas disponibles comercialmente que presentan actividad hidrolizante de almidón granular de Aspergillus niger (OPTIDEX L-400 y G Zyme G 990 4X from Genencor International Inc) , y Rhizopus niveus (CU. CONC. from Shin Nihon Chemicals, Japón) se comparan con rH-GSHE como se describe en lo anterior, en el ejemplo 1. La actividad hidrolizante de almidón granular de estos productos se mide utilizando el ensayo que se describe en lo anterior.

TABLA 8 En un experimento típico, una suspensión de almidón de maíz granular 30% en agua destilada (150 gramos de almidón en 350 gramos de agua destilada) se preparan y se ajusta el pH a pH 5.5 utilizando NaOH 6 N. Se agrega G Zyme G 997 a 0.1 kg/MT de almidón ds y la suspensión de almidón se mantiene en un baño aría que se mantiene a 60 °C. A cada suspensión de almidón que contiene G Zyme G 997 se agregan diferentes glucoamilasas a una dosificación igual, es decir, 1.5 unidades de GSHE/gramo de almidón, ds y se incuba a 60 °C. Se extrae una alícuota en intervalos de tiempo diferentes y se centrífuga. El sobrenadante transparente se utiliza para medir el Brix. La muestra incubada durante 2, 6, 22.5 y 49 horas se analiza por CLAR para determinar la composición total de azúcar y los resultados se presentan en la tabla 9.

TABLA 9 Se agregan las glucoamilasas a una dosis de 1.5 U de GSHE/g a una suspensión inicial que tiene 0.1 kg/MT ds de OÍ amilasa.

EJEMPLO 6 Efecto de pH en la solubilización de almidón de maíz granular (suspensión 35%) durante la incubación con OÍ amilasa (G Zyme G 997) y rH-GSHE. En un experimento típico se agregan 372 gramos de agua a 178 gramos de almidón de maíz. La suspensión se agita bien para mezclado uniforme y el pH de la suspensión se ajusta a pH 4.0, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5 y 7.0 utilizando NaOH 6 N. Las muestras después se mantienen en un baño maría que se mantiene a 60 °C. Después de equilibrio de la temperatura, se agregan a la suspensión Zyme G 997 a 0.1 kg/MT de almidón y rH-GSHE como se describe en el ejemplo 1 (1.0 unidades de GSHE/g de almidón) . La suspensión se agita continuamente durante la incubación y las muestras se toman después de una hora para determinar el Brix (Tabla 10) .

TABLA 10 La solubilización máxima se produce a pH 5.0 y pH 5.6. Se produce una reducción significativa en la solubilización del almidón de maíz granular por debajo de pH 5.0 y pH 5.5 a 60 °C indica ya sea una actividad menor o inactivación de las enzimas.

EJEMPLO 7 Efecto de la temperatura en la solubilización de almidón de maíz granular (suspensión 32%) durante la incubación con OÍ amilasa y rH-GSHE. En un experimento típico se agregan 372 gramos de agua a 178 gramos de almidón de maíz. La suspensión se agita bien para mezclado uniforme y se ajusta el pH de la suspensión a pH 5.5 utilizando NaOH 6 N. Las muestras después se mantienen en un baño maría que se mantiene a 55 °C, 60 °C y 65 °C. Después de equilibrio de la temperatura, se agregan a Zyme G 997 a 0.1 kgs/MT de almidón y rH-GSHE como se describe en el ejemplo 1 (1.0 unidades de GSHE/g de almidón). La suspensión se agita continuamente durante la incubación y se mide el Brix después de 1 hora (Tabla 11) .

TABLA 11 La solubilización de almidón de maíz granular se incrementa al aumentar la temperatura en presencia de G Zyme G997 y rH-GSHE. No obstante, el análisis por CLAR del carbohidrato solubilizado por encima de los 65°C indica inactivación de rH-GSHE como se vuelve evidente por una concentración menor de contenido de glucosa. El incremento en el contenido de sólidos disueltos a una temperatura mayor (>65°C) es debido principalmente al efecto de licuefacción de G Zyme G997 sobre el almidón de maíz granular a temperaturas superiores .

EJEMPLO 8 Efecto de las concentraciones de G Zyme G997 y rH-GSHE en la solubilización e hidrólisis de almidón de maíz granular. En diferentes matraces se agita bien para un mezclado uniforme 178 g de almidón de maíz granular en 372 g de agua. Se ajusta el pH de la suspensión a pH 5.5. Se incuban dos concentraciones diferentes de G Zyme G997, 0.1 Kgs/MT de almidón y 0.5 kgs/MT, con rH-GSHE a 0.25, 0.5 y 1.0 unidades de GSHE/g ds de almidón a 60°C. Las muestras se extraen en intervalos de tiempo diferentes y se utilizan para medir el Brix y la composición de azúcar total (tablas 12A y 12B) .

TABLA 12A Concentración de Enzima Porcentaje de Solubilización Relativa G Zyme G997 rHGSHE kgs/MT de Unidades de almidón GSHE/g de almidón 3 h 6 h 9 h 12 h 24 h 30 h 0.1 0.25 50.9 59.3 70.2 75.1 85.8 88.6 0.1 0.50 54.3 72.9 80.4 85.2 94.0 96.8 0.1 1.0 60.7 80.4 88.6 92.1 98.1 100 0.5 0.25 60.9 71.9 77.6 83.3 91.2 94.0 0.5 0.5 66.9 79.5 85.8 89.9 97.2 99.4 0.5 1.0 76.7 87.4 92.4 95.3 99.1 99.7 Los resultados en la tabla 12A indican que el incremento de la dosificación de G Zyme G997 a partir de 0.1 Kgs/MT de almidón a 0.5 kg/MT de almidón resulta en una solubilización más rápida del almidón granular. Pero a ambas concentraciones se produce más de 95% de solubilización de almidón granular en 24 horas en presencia de 1.0 unidades GSHE de rH-GSHE. El efecto de la concentración de rH-GSHE en la solubilización de almidón granular en presencia de G Zyme G997 aumenta de manera notable al incrementar la dosificación de concentración. Los resultados anteriores muestran claramente que ninguna de las enzimas, G Zyme G997 o rH-GSHE solas, pueden solubilizar totalmente el almidón granular. No obstante, la solubilización completa del almidón granular se produce cuando las enzimas se agregan juntas.

La composición de carbohidratos (azúcar) del almidón de maíz granular solubilizado (suspensión 32%) durante la incubación del almidón de maíz granular con G Zyme G997 y rH-GSHE a 12, 24 y 30 horas, a pH de 5.5 y 60 °C se analiza por CLAR y se hace referencia a la tabla 12B.

TABLA 12B Los resultados en la tabla 12B ilustran que una combinación apropiada de OÍ amilasa de Bacillus stearothermophilus y rH-GSHE pueden satisfacer una variedad de demandas en la producción comercial de edulcorantes de azúcar y sustancias bioquímicas directamente a partir de almidón granular sin aplicar un procedimiento de cocinado convencional de alta temperatura. Las altas concentraciones de OÍ amilasa aceleran la velocidad de solubilización de almidón granular, pero una concentración más alta de rH-GSHE resulta en concentraciones altas de productos de reacción de inversión que resultan en concentraciones significativamente bajas de azúcar superior.

EJEMPLO 9 Comparación sobre la hidrólisis de sustrato de almidón de maíz licuado con enzima (sustrato de almidón soluble) y sustrato de almidón de maíz granular (insoluble) por preparaciones de glucoamilasa. En un experimento típico se licúa almidón de maíz (32% ds) a pH 5.6 utilizando el procedimiento de cocinado a chorro de baja temperatura (105°C, 8 min) seguido por hidrólisis a 95 °C durante 90 min. Se agrega SPEZYME FRED (Genencor International Inc) a 0.4 kg/MT de almidón, ds en el proceso de licuefacción. El pH del sustrato de almidón licuado de SPEZYME FRED se ajusta a pH 4.2 y se agrega glucoamilasa (OPTIDEX L-400) a 0.22 GAU/g ds . La hidrólisis se lleva a cabo a 60 °C. Se extraen muestras a intervalos de tiempo diferentes y se analizan por CLAR para determinar el tiempo que se necesita para alcanzar el rendimiento máximo de glucosa. Se prepara una suspensión de almidón de maíz granular a 32% ds en agua destilada, y se ajusta el pH de la suspensión a pH 5.5 utilizando NaOH ÍN. El matraz después se mantiene en un baño maría que se mantiene a 60 °C y se agrega G Zyme G997 a 0.1 kg/MT ds y se agrega rH-GSHE a 1.0 unidades de GSHE/gramo ds y la muestra se incuba a 60 °C con agitación constante. Las muestras se extraen en intervalos de tiempo diferentes para medir el Brix y el rendimiento de glucosa (tabla 13) .

TABLA 13 La hidrólisis del almidón soluble licuado por glucoamilasa requiere un tiempo más prolongado para alcanzar un rendimiento máximo de glucosa en comparación con la hidrólisis de almidón granular insoluble. En el tiempo máximo para alcanzar el rendimiento máximo de glucosa, la concentración de glucosa por almidón granular en comparación con el almidón soluble licuado es mayor con azúcares significativamente menores a DP4+ (96.8 y 0.2, en comparación con 95.2 y 1.3) . Un rendimiento más alto de glucosa, el potencial para un tiempo de sacarificación más corto y una eliminación total de la etapa de cocinado a chorro con alta temperatura diferencia la aplicación de la combinación de amilasa y la enzima GSHE de la presente invención.

EJEMPLO 10 Efecto de la concentración de almidón de maíz granular en la solubilización e hidrólisis de almidón durante la incubación con G Zyme G997 (0.1 Kg/MT) y rH-GSHE (1.0 unidades de GSHE/g) . Se preparan concentraciones diferentes de suspensión de almidón de maíz granular en agua destilada, es decir, 32%, 35%, 38%, 40% y 42%. Se ajusta el pH de la suspensión a pH 5.5. Las muestras se mantienen en un baño maría que se mantiene a 60°C y se agita continuamente para mezclado uniforme. Se agregan a la suspensión G Zyme G997 (0.1 kg/MT de ds) y rH-GSHE que se obtiene del ejemplo 1 (1.0 unidades de GSHE/g ds) . Se extrae una muestra alícuota en intervalos de tiempo diferentes durante la incubación para medir el Brix y la composición de azúcar (tabla 14) .

TABLA 14 % DS % DS de Perfil de % de carbohidratos Ensayo inicial muestra Horas DP>3 DP3 DP2 DPI 32 0.41 0 32 21.31 2.5 32 26.84 7 1.56 0.35 1.71 96.38 32 33.55 24 0.28 0.39 3.30 96.03 32 34.50 48 0.49 0.40 3.83 95.28 2 35 0.49 0 2 35 22.57 2.5 2 35 28.57 7 1.24 0.35 1.81 96.60 2 35 34.50 24 0.33 0.71 4.16 94.80 2 35 36.91 48 0.21 0.68 4.71 94.40 3 38 0.62 0 3 38 23.89 2.5 3 38 29.67 7 1.38 0.33 1.84 96.45 3 38 35.76 24 0.31 0.38 3.21 96.11 3 38 38.64 48 0.48 0.56 4.76 94.19 4 40 0.34 0 4 40 27.78 2.5 4 40 30.47 7 1.36 0.35 1.94 96.35 4 40 36.58 24 0.38 0.50 2.79 96.33 4 40 39.71 48 0.22 0.70 4.77 94.31 5 42 0.48 0 5 42 25.31 2.5 5 42 31.64 7 1.23 0.34 2.00 96.43 5 42 37.94 24 0.63 0.35 3.09 95.93 5 42 40.82 48 0.40 1.29 6.57 91.74 Los resultados muestran que se puede alcanzar más de 96% de jarabe de glucosa dentro de 24 horas de la sacarificación con sólidos disueltos en una concentración tal elevada como 36%. El rendimiento de glucosa de más de 96% a una concentración de sólidos mayores de 35% se alcanzan cuando se utiliza un almidón granular insoluble en el procedimiento de sacarificación.

EJEMPLO 11 Como se presentó en lo anterior y como se conoce en la técnica, el proceso de conversión de almidón enzima-enzima para jarabe con alta concentración de glucosa consiste en la producción de un licuoefacto soluble al someter un sustrato de almidón insoluble a un proceso de licuefacción de alta temperatura utilizando a amilasa termoestable. Es una práctica normal en el comercio enactivar la actividad de amilasa residual antes de la sacarificación por glucoamilasa para reducir la pérdida de rendimiento de glucosa debido a la presencia de amilasa activa. La inactivación de la actividad residual de a amilasa normalmente se lleva a cabo al disminuir el licuefacto a pH 4.2 a 95°C. La alta temperatura y el pH de 4.5 resultan en inactivación completa de la a amilasa. De este modo, estudiamos el efecto del rendimiento de glucosa con y sin OÍ amilasa activa durante la sacarificación del almidón licuado a pH 5.5 En un experimento típico, la forma licuada soluble de almidón de maíz se produce utilizando G Zyme G997 (0.4 kg/MT de almidón) como enzima licuante bajo condiciones de proceso de cocinado con chorro (almidón 32% ds a 105°C durante 8 minutos, seguido por 95°C durante 90 min) . Una porción del almidón licuado se calienta adicionalmente para inactivar la actividad de a amilasa residual. La sacarificación del almidón licuado con y sin actividad de o; amilasa residual se sacarifica adicionalmente (32% ds) a pH 5.5, 60°C utilizando rH-GSHE como se describe en el ejemplo 1 a 0.5 unidades de GSHE/g. Las muestras se extraen a intervalos diferentes de tiempo y se analizan para rendimiento de glucosa utilizando CLAR (tabla 15) .

TABLA 15 Los resultados en la tabla 15 demuestran que la presencia de actividad de amilasa de G Zyme G997 durante la sacarificación del sustrato de almidón soluble (licuoefacto) por glucoamilasa resulta en un rendimiento menor de glucosa. Mientras tanto, la a amilasa mejora la hidrólisis del sustrato de almidón insoluble (granular) por glucoamilasa lo que resulta en una concentración sustancialmente elevada de glucosa.

EJEMPLO 12 Producción de jarabe de glucosa y almidón residual a partir del hidrólisis del almidón de maíz. En un recipiente de reactor, 800 g de almidón de maíz granular en 1200 g de agua se agitan bien para mezclado uniforme para obtener una suspensión. Se ajusta el pH de la suspensión a pH 5.5 con NaOH 4 N. Se agregan a 60°C G ZYME G997 (0.1 kg/MT de almidón) y Humicola grisea var . theromidea expresada en Trichoderma reesei (rH-GSHE) a 1.0 U de GSHE/g de almidón. Las muestras se extraen en diversos intervalos de tiempo y se utilizan para medir el Brix y la composición de azúcar total (tabla 16) . TABLA 16 Después de obtener más de 90% de solubilización de almidón granular en un tiempo de reacción de 10 horas, la composición de azúcar, medida por CLAR del almidón de maíz granular solubilizado se obtiene como se ilustra en la tabla 17.

TABLA 17 Después de un tiempo de reacción de 10 h se detiene la hidrólisis al ajustar el pH a 3.5 con H2S04 4N. La mezcla de jarabe contiene más de 96% de dextrosa a más de 30% de sólidos disueltos. La mezcla se filtra a 60 °C mediante la utilización de un cartucho de membrana de ultrafiltración de corte de peso molecular 500,000 (MWCO) (AG Technology, MA) . El almidón residual después se puede reciclar lo cual reduce significativamente los costos de capital y de operación que se necesitan en la producción de jarabe de glucosa. Una muestra del almidón residual se seca y examina para determinar su estructura por microscopía electrónica de barrido (SEM de emisión de campo frío S-5000 (Tokio, Japón) ) y se compara con almidón granular típico antes de su exposición a enzimas, de acuerdo con el método de la invención (figura 12) . Las muestras secas se montan en extremos cortos de muestra SEM utilizando cinta de carbono adhesiva con pegamento en ambos lados . Cualquier exceso de muestra se separa por sopleteado con aire comprimido. Las muestras después se montan en un ángulo de aproximadamente 30° en un sistema de recubrimiento al alto vacío modular Bal-Tec Med 020 (Liechtenstein) y se recubren por dispersión con 10 nn de platino (Pt) mientras se hacen girar a 60 rpm. Estos ajustes aseguran que los granulos recubren de manera uniforme todos los lados . El espesor del recubrimiento es despreciable en comparación con el tamaño de las características que resultan de la acción enzimática de los granulos de almidón. El voltaje de aceleración varía de 2-5 kV y la ampliación es de 500 - 15,000x. La micrografía de la figura 12a muestra un granulo de almidón típico antes de su exposición a una composición de enzima y método de la invención. La superficie es uniforme y homogénea y la única característica perspectible es una fractura fina debido al recubrimiento de platino metálico. Una vez expuesta a la combinación de enzima y método de la invención, cambia la morfología de superficie de los granulos . Como se observan en las micrografías b - d de la figura 12, se horadan perforaciones redondas grandes en los granulos debido a la digestión de enzima del sustrato de granulo de almidón. Los orificios varían en diámetro y varían en profundidad, y reflejan una población de granulos de almidón en diferentes etapas cinéticas de reacción enzimática. Algunos granulos tienen únicamente un número pequeño de orificios y algunos están cubiertos casi completamente de orificios (micrografía b) . Algunos granulos también están rebanados a la mitad mostrando una sección transversal del interior digerido (micrografías c y d) . La micrografía d) presenta la digestión del granulo hasta su finalización, que muestra un fragmento de la cubierta fuera hueca . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocidos por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un método para producir una enzima hidrolizante de almidón granular que tiene actividad de glucoamilasa (GSHE, por sus siglas en inglés) en una célula hospedadora micótica filamentosa, caracterizado porque comprende : a) transformar una célula hospedadora micótica filamentosa con una construcción de ADN que comprende un promotor que tiene actividad transcripcional en la célula hospedadora micótica filamentosa unida operablemente a un polinucleótido heterólogo que codifica para una GSHE, b) cultivar la célula hospedadora micótica filamentosa transformada en un medio de cultivo adecuado para permitir la expresión de la GSHE, y c) producir la GSHE.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además recuperar la GSHE producida.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polinucleótido heterólogo que codifica para la GSHE se deriva de una cepa de Humicola grisea o una cepa de Aspergillus awamori .

4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la GSHE tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 6.

5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la célula hospedadora micótica filamentosa es una célula de Trichoderma .

6 . El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque un nivel de glucosilación de la GSHE expresada a partir de la célula hospedadora micótica filamentosa transformada es menor que el nivel de glucosilación de la GSHE expresada en un hospedador micótico nativo .

7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la activad enzimática a nivel de pH de 3.0 a 4.0 es mayor para la GSHE producida en la célula hospedadora micótica filamentosa transformada en comparación con la GSHE producida de manera correspondiente a partir de un hospedador micótico nativo.

8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la célula hospedadora micótica transformada se cultiva bajo condiciones de fermentación continua.

9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la hospedadora micótica transformada se cultiva bajo condiciones de fermentación por lote.

10. Una célula recombinante de Trichoderma caracterizada porque comprende un polinucleótido heterólogo que codifica para una enzima hidrolizante de almidón granular que tiene actividad de glucoamilasa (GSHE) .

11. La célula recombinante de Trichoderma, de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque el polinucleótido heterólogo se deriva de una cepa de Humicola grisea o de una cepa de Aspergillus awamori .

12. Un medio de fermentación caracterizado porque comprende una enzima hidrolizante de almidón granular que tiene actividad de glucoamilasa (GSHE) producida a partir de un cultivo de Trichoderma reesei , en donde Trichoderma reesei comprende un polinucleótido heterólogo que codifica para una GSHE que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia de aminoácidos con la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3 o con la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 6.

13. Un procedimiento para producir jarabe de glucosa a partir de una suspensión de almidón granular, el procedimiento caracterizado porque comprende poner en contacto un sustrato de almidón granular simultáneamente con el medio de fermentación de conformidad con la reivindicación 12 y una amilasa derivada de una cepa de Bacillus a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización del almidón granular y permitir que la amilasa y GSHE actúen por un período de tiempo entre 2 y 100 horas para hidrolizar el almidón granular para obtener un jarabe de glucosa.

14. Una composición de enzima que tiene actividad hidrolizante de almidón granular caracterizada porque comprende una a amilasa y una glucoamilasa que tiene actividad hidrolizante de almidón granular (GSHE, por sus siglas en inglés) , en donde la proporción de la a amilasa respecto a GSHE está entre 15 : 1 y 1 : 15.

15. La composición de enzima de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque la proporción de amilasa respecto a GSHE es de 10 :1 a 1 : 10.

16. Un procedimiento de una etapa para producir un jarabe de glucosa a partir de una suspensión de almidón granular, el procedimiento está caracterizado porque comprende : poner en contacto una suspensión de almidón granular obtenida a partir de un sustrato de almidón granular simultáneamente con una a amilasa y una glucoamilasa que tiene actividad hidrolizante de almidón granular (GSHE, por sus siglas en inglés) a una temperatura igual o inferior a la temperatura de gelatinización del almidón granular, y permitir que la a amilasa y la GSHE actúen por un período de tiempo suficiente para hidrolizar el almidón granular para obtener una composición que comprende un jarabe de glucosa.

17. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el sustrato de almidón granular se obtiene de maíz, trigo, cebada o arroz.

18. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el sustrato de almidón granular es almidón de maíz que se obtiene a partir de un grano completo.

19. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el sustrato de almidón granular es molido en seco o molido en húmedo.

20. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la suspensión de almidón granular tiene un contenido de sólidos seco de 15 -55%.

21. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la suspensión de almidón granular tiene un contenido de sólido seco de 15 -45%.

22. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la temperatura es menor de 65°C y mayor de 50°C.

23. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la temperatura es menor de 65 °C y mayor de 55°C.

24. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el período de tiempo suficiente para hidrolizar el almidón granular es de 2 a 100 horas .

25. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la etapa de contacto se lleva a cabo a un pH de 5.0 a 6.0.

26. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la a amilasa se deriva de Bacillus .

27. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la cantidad de a amilasa por tonelada métrica de almidón está en el intervalo de 0.05 a 5.0 kg .

28. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la cantidad de OÍ amilasa por tonelada métrica de almidón está en el intervalo de 0.05 a 2.0 kg.

29. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la GSHE se obtiene a partir de la expresión heteróloga de un polinucleótido que codifica para una GSHE que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3 o SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 6.

30. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la cantidad de GSHE está en el intervalo de 0.01 a 10.0 U de GSHE/g de sólidos secos de almidón.

31. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la cantidad de GSHE está en el intervalo de 0.1 a 5.0 unidades de GSHE/g de sólidos secos de almidón.

32. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la cantidad de GSHE está en el intervalo de 0.25 a 2.5 unidades de GSHE/g de sólidos secos de almidón.

33. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque por lo menos 90% del almidón granular es hidrolizado en las siguientes 24 horas.

34. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque comprende además recuperar el jarabe de glucosa.

35. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el jarabe de glucosa es recuperado por separación por filtración.

36. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque comprende además convertir el jarabe de glucosa al producto final deseado.

37. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el producto final deseado es un jarabe de fructosa.

38. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el producto final deseado es etanol .

39. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el producto final deseado es una glucosa cristalizada.

40. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque el almidón residual se obtiene como un producto secundario de la separación de jarabe de glucosa.

41. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque comprende además reciclar el almidón residual al poner en contacto el almidón residual con la GSHE y amilasa a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización del almidón granular.

42. El almidón residual caracterizado porque se obtiene de conformidad con el procedimiento de la reivindicación 40.

43. Un procedimiento para la producción de jarabe con una base de almidón con una alta concentración de fructosa, caracterizado porque comprende convertir enzimáticamente el jarabe de glucosa que se obtiene de conformidad con el procedimiento de la reivindicación 16 a un jarabe de fructosa.

44. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque la etapa de conversión incluye el uso de una glucosa isomerasa.

45. Un procedimiento para la producción de una composición de almidón residual caracterizado porque comprende: poner en contacto un sustrato de almidón granular, de conformidad con la reivindicación 16 para producir una composición que comprende un jarabe de glucosa y separar el jarabe de glucosa de la composición para obtener una mezcla que incluye almidón residual .

46. Un método de utilización de almidón residual caracterizado porque se obtiene de conformidad con la reivindicación 45 en un procedimiento de sacarificación de almidón.

47. Un procedimiento para la producción de etanol, caracterizado porque comprende someter el jarabe de glucosa producido de conformidad con la reivindicación 16 a fermentación con un microorganismo etanolgénico.

48. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque la fermentación se lleva a cabo por separado y secuencialmente a la etapa de contacto .

49. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque la fermentación se lleva a cabo simultáneamente con la etapa de contacto.

50. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque comprende además recuperar el etanol de la fermentación.