KR20100118973A - 이소프렌을 생성하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

이소프렌을 생성하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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고팔 케이 초타니
페르난도 발레
캐롤 피오레시
칼 제이 산포드
조셉 씨 매콜리프
프랭크 제이 페헤르
아론 에스 푸하라
안드레이 미아스니코브
일라나 에스 알도르
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Abstract

본 발명은 배양된 세포로부터 이소프렌을 생성하는 방법을 특징으로 한다. 본 발명은 또한 이들 배양된 세포를 포함하는 조성물을 제공한다.

Description

이소프렌을 생성하기 위한 조성물 및 방법 {COMPOSITIONS AND METHODS FOR PRODUCING ISOPRENE}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2007년 12월 13일에 출원한 미국 가출원 제 61/013,574 호에 대해 우선권을 주장한다. 상기 출원의 본문은 그 전문이 본원에 참고문헌으로 포함된다.
본 발명은 일반적으로, 배양된 세포에서 이소프렌을 생성하기 위한 방법 및 이러한 배양된 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
이소프렌 (2-메틸-1,3-부타디엔)은 다양한 합성 중합체, 가장 특히 합성 고무에 대한 중요한 출발 물질이다. 이소프렌은 다양한 미생물, 식물 및 동물 종류에 의해 자연적으로 생성된다. 특히, 이소프렌의 생합성에 대한 두 가지 경로가 확인되었다: 메발로네이트 (MVA) 경로 및 비-메발로네이트 (DXP) 경로 (도 19A 및 19B). 그러나, 자연 발생적 유기체로부터의 이소프렌의 수율은 상업적으로 주목받지 못하고 있다. 1년 당 약 800,000 톤의 시스-폴리이소프렌이 이소프렌의 중합에서 생성되며; 이러한 폴리이소프렌의 대부분은 타이어 및 고무 산업에서 사용된다. 이소프렌은 또한 신발류, 기계 제품, 의료 제품, 스포츠 상품 및 라텍스와 같은 기타 제품에서 합성 엘라스토머로서 사용하기 위해 공중합된다.
최근, 타이어 및 고무 산업은 천연 및 합성 고무의 사용을 바탕으로 한다. 천연 고무는 고무 나무 또는 아프리카의 열대 우림에서 발견되는 식물의 유액성 즙에서 수득된다. 합성 고무는 주로 부타디엔 중합체를 기초로 한다. 이들 중합체에 대하여, 부타디엔은 에틸렌 및 프로필렌 제조로부터 공동-생성물로서 수득된다.
이소프렌이 석유 분류에 의해 수득될 수 있는 한편, 이러한 물질의 정제는 값이 비싸고 시간 소비적이다. 탄화수소의 C5 스트림의 석유 크래킹은 단지 약 15% 이소프렌을 생성해낸다. 따라서, 이소프렌을 생성하기 위한 보다 경제적인 방법이 필요하다. 특히, 확고한 상업적 공정의 요구를 충족하기에 충분한 속도, 역가 및 순도로 이소프렌을 생성하는 방법이 바람직하다. 또한, 비싸지 않은 출발 물질로부터 이소프렌을 생성하기 위한 시스템이 바람직하다.
발명의 요약
한 측면에서는, 본 발명은 이소프렌을 생성하는 배양물 내 세포를 특징으로 한다. 일부 구현예에서는, 본 발명은 이소프렌의 세포/시간의 습식 중량에 대해 약 400 nmol 초과의 이소프렌/세포 g을 생성하는 (nmol/gwcm/시간) 배양물 내 세포를 제공한다. 일부 구현예에서는, 세포는 (i) 이소프렌 신타아제 폴리펩티드를 인코딩하고 (ii) 프로모터에 작동가능하게 연결되는 이종 핵산을 갖는다. 일부 구현예에서는, 세포는 비제한적으로 탄수화물 (예를 들어, 자일로오스 또는 글루코오스), 아세테이트, 글리세롤, 글리세린, 디하이드록시아세톤, 1-탄소원, 오일, 동물성 지방, 동물성 오일, 지방산, 지질, 인지질, 글리세롤지질, 모노글리세리드, 디글리세리드, 트리글리세리드, 재생가능 탄소원 (예를 들어, 가수분해된 바이오매스 (biomass) 탄소원), 폴리펩티드 (예를 들어, 미생물 또는 식물 단백질 또는 펩티드), 효모 추출물, 효모 추출물로부터의 성분, 또는 전술한 것 중 둘 이상의 임의 조합과 같은 탄소원을 포함하는 배양 배지에서 배양된다.
일부 구현예에서는, 본 발명은 약 0.1 mg/L브로쓰/시간 초과의, 이소프렌의 평균 체적 생산성을 갖는 배양물 내 세포를 제공한다. 일부 구현예에서는, 본 발명은 약 0.5 mg/L브로쓰/시간 초과의, 이소프렌의 피크 체적 생산성을 갖는 배양물 내 세포를 제공한다. 일부 구현예에서는, 세포는 (i) 이소프렌 신타아제 폴리펩티드를 인코딩하고 (ii) 프로모터에 작동가능하게 연결되는 이종 핵산을 갖는다. 일부 구현예에서는, 세포는 비제한적으로 탄수화물 (예를 들어, 자일로오스 또는 글루코오스), 아세테이트, 글리세롤, 글리세린, 디하이드록시아세톤, 1-탄소원, 오일, 동물성 지방, 동물성 오일, 지방산, 지질, 인지질, 글리세롤지질, 모노글리세리드, 디글리세리드, 트리글리세리드, 재생가능 탄소원 (예를 들어, 가수분해된 바이오매스 탄소원), 폴리펩티드 (예를 들어, 미생물 또는 식물 단백질 또는 펩티드), 효모 추출물, 효모 추출물로부터의 성분, 또는 전술한 것 중 둘 이상의 임의 조합과 같은 탄소원을 포함하는 배양 배지에서 배양된다.
일부 구현예에서는, 본 발명은 세포 배양 배지에서 약 0.002% 초과의 탄소를 이소프렌으로 변환시키는 배양물 내 세포를 제공한다. 일부 구현예에서는, 세포는 (i) 이소프렌 신타아제 폴리펩티드를 인코딩하고 (ii) 프로모터에 작동가능하게 연결되는 이종 핵산을 갖는다. 일부 구현예에서는, 세포는 비제한적으로 탄수화물 (예를 들어, 자일로오스 또는 글루코오스), 아세테이트, 글리세롤, 글리세린, 디하이드록시아세톤, 1-탄소원, 오일, 동물성 지방, 동물성 오일, 지방산, 지질, 인지질, 글리세롤지질, 모노글리세리드, 디글리세리드, 트리글리세리드, 재생가능 탄소원 (예를 들어, 가수분해된 바이오매스 탄소원), 폴리펩티드 (예를 들어, 미생물 또는 식물 단백질 또는 펩티드), 효모 추출물, 효모 추출물로부터의 성분, 또는 전술한 것 중 둘 이상의 임의 조합과 같은 탄소원을 포함하는 배양 배지에서 배양된다.
일부 구현예에서는, 본 발명은 이소프렌 신타아제 폴리펩티드를 인코딩하는 이종 핵산을 포함하는 배양물 내 세포를 제공한다. 일부 구현예에서는, 세포는 (i) 이소프렌 신타아제 폴리펩티드를 인코딩하고 (ii) 프로모터에 작동가능하게 연결되는 이종 핵산을 갖는다. 일부 구현예에서는, 세포는 비제한적으로 탄수화물 (예를 들어, 자일로오스 또는 글루코오스), 아세테이트, 글리세롤, 글리세린, 디하이드록시아세톤, 1-탄소원, 오일, 동물성 지방, 동물성 오일, 지방산, 지질, 인지질, 글리세롤지질, 모노글리세리드, 디글리세리드, 트리글리세리드, 재생가능 탄소원 (예를 들어, 가수분해된 바이오매스 탄소원), 폴리펩티드 (예를 들어, 미생물 또는 식물 단백질 또는 펩티드), 효모 추출물, 효모 추출물로부터의 성분, 또는 전술한 것 중 둘 이상의 임의 조합과 같은 탄소원을 포함하는 배양 배지에서 배양된다.
한 측면에서는, 본 발명은 본원에서 이소프렌을 생성하기 위해 기재된 임의 세포를 사용하는 방법과 같은, 이소프렌을 생성하는 방법을 특징으로 한다. 일부 구현예에서는, 상기 방법은 약 400 nmol/gwcm/시간 초과의 이소프렌을 생성하기에 충분한 조건 하에서 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서는, 상기 방법은 또한 세포에 의해 생성된 이소프렌을 회수하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서는, 상기 방법은 세포에 의해 생성된 이소프렌을 정제하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서는, 상기 방법은 이소프렌을 중합하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서는, 세포는 (i) 이소프렌 신타아제 폴리펩티드를 인코딩하고 (ii) 프로모터에 작동가능하게 연결되는 이종 핵산을 갖는다. 일부 구현예에서는, 세포는 비제한적으로 탄수화물 (예를 들어, 자일로오스 또는 글루코오스), 아세테이트, 글리세롤, 글리세린, 디하이드록시아세톤, 1-탄소원, 오일, 동물성 지방, 동물성 오일, 지방산, 지질, 인지질, 글리세롤지질, 모노글리세리드, 디글리세리드, 트리글리세리드, 재생가능 탄소원 (예를 들어, 가수분해된 바이오매스 탄소원), 폴리펩티드 (예를 들어, 미생물 또는 식물 단백질 또는 펩티드), 효모 추출물, 효모 추출물로부터의 성분, 또는 전술한 것 중 둘 이상의 임의 조합과 같은 탄소원을 포함하는 배양 배지에서 배양된다.
한 측면에서는, 본 발명은 본원에서 이소프렌을 생성하기 위해 기재된 임의 세포를 사용하는 방법과 같은, 이소프렌을 생성하는 방법을 특징으로 한다. 일부 구현예에서는, 상기 방법은 약 0.1 mg/L브로쓰/시간 초과의, 이소프렌의 평균 체적 생산성을 야기하는 조건 하에 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서는, 상기 방법은 약 0.5 mg/L브로쓰/시간 초과의, 이소프렌의 피크 체적 생산성을 야기하는 조건 하에 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서는, 상기 방법은 또한 세포에 의해 생성된 이소프렌을 회수하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서는, 상기 방법은 세포에 의해 생성된 이소프렌을 정제하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서는, 상기 방법은 이소프렌을 중합하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서는, 세포는 (i) 이소프렌 신타아제 폴리펩티드를 인코딩하고 (ii) 프로모터에 작동가능하게 연결되는 이종 핵산을 갖는다. 일부 구현예에서는, 세포는 비제한적으로 탄수화물 (예를 들어, 자일로오스 또는 글루코오스), 아세테이트, 글리세롤, 글리세린, 디하이드록시아세톤, 1-탄소원, 오일, 동물성 지방, 동물성 오일, 지방산, 지질, 인지질, 글리세롤지질, 모노글리세리드, 디글리세리드, 트리글리세리드, 재생가능 탄소원 (예를 들어, 가수분해된 바이오매스 탄소원), 폴리펩티드 (예를 들어, 미생물 또는 식물 단백질 또는 펩티드), 효모 추출물, 효모 추출물로부터의 성분, 또는 전술한 것 중 둘 이상의 임의 조합과 같은 탄소원을 포함하는 배양 배지에서 배양된다.
일부 구현예에서는, 상기 방법은 세포 배양 배지에서 약 0.002% 초과의 탄소를 이소프렌으로 변환시키기에 충분한 조건 하에 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서는, 상기 방법은 또한 세포에 의해 생성된 이소프렌을 회수하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서는, 상기 방법은 세포에 의해 생성된 이소프렌을 정제하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서는, 상기 방법은 이소프렌을 중합하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서는, 세포는 (i) 이소프렌 신타아제 폴리펩티드를 인코딩하고 (ii) 프로모터에 작동가능하게 연결되는 이종 핵산을 갖는다. 일부 구현예에서는, 세포는 비제한적으로 탄수화물 (예를 들어, 자일로오스 또는 글루코오스), 아세테이트, 글리세롤, 글리세린, 디하이드록시아세톤, 1-탄소원, 오일, 동물성 지방, 동물성 오일, 지방산, 지질, 인지질, 글리세롤지질, 모노글리세리드, 디글리세리드, 트리글리세리드, 재생가능 탄소원 (예를 들어, 가수분해된 바이오매스 탄소원), 폴리펩티드 (예를 들어, 미생물 또는 식물 단백질 또는 펩티드), 효모 추출물, 효모 추출물로부터의 성분, 또는 전술한 것 중 둘 이상의 임의 조합과 같은 탄소원을 포함하는 배양 배지에서 배양된다.
본 발명의 임의의 측면의 일부 구현예에서는, 배양물 내 세포는 초과로 또는 약 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 5,000, 10,000, 12,500, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 75,000, 100,000, 125,000, 150,000, 188,000 nmol/gwcm/시간 이상으로 이소프렌을 생성한다. 일부 구현예에서는, 배양물 내 세포는 초과로 또는 약 0.1, 1.0, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1100, 1200, 1300, 1,400, 1,500, 1,600, 1,700, 1,800, 1,900, 2,000, 2,100, 2,200, 2,300, 2,400, 2,500, 2,600, 2,700, 2,800, 2,900, 3,000, 3,100, 3,200, 3,300, 3,400, 3,500 이상의 이소프렌 mg/브로쓰 L/시간 (mg/L브로쓰/시간, 브로쓰의 부피에는 세포 및 세포 배지의 부피가 포함됨)의, 이소프렌의 평균 체적 생산성을 갖는다. 일부 구현예에서는, 배양물 내 세포는 초과로 또는 약 0.5, 1.0, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1100, 1200, 1300, 1,400, 1,500, 1,600, 1,700, 1,800, 1,900, 2,000, 2,100, 2,200, 2,300, 2,400, 2,500, 2,600, 2,700, 2,800, 2,900, 3,000, 3,100, 3,200, 3,300, 3,400, 3,500, 3,750, 4,000, 4,250, 4,500, 4,750, 5,000, 5,250, 5,500, 5,750, 6,000, 6,250, 6,500, 6,750, 7,000, 7,250, 7,500, 7,750, 8,000, 8,250, 8,500, 8,750, 9,000, 9,250, 9,500, 9,750, 10,000, 12,500, 15,000 이상의 이소프렌 mg/브로쓰 L/시간 (mg/L브로쓰/시간, 브로쓰의 부피에는 세포 및 세포 배지의 부피가 포함됨)의, 이소프렌의 피크 체적 생산성을 갖는다. 본 발명의 임의 측면의 일부 구현예에서는, 배양물 내 세포는 세포 배양 배지에서 초과로 또는 약 0.002, 0.005, 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.12, 0.14, 0.16, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6, 2.0, 2.2, 2.4, 2.6, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 11.0, 12.0, 13.0, 14.0, 15.0, 16.0, 17.0, 18.0, 19.0, 20.0, 21.0, 22.0, 23.0, 23.2, 23.4, 23.6, 23.8, 24.0, 25.0, 30.0, 31.0, 32.0, 33.0, 35.0, 37.5, 40.0, 45.0, 47.5, 50.0, 55.0, 60.0, 65.0, 70.0, 75.0, 80.0, 85.0, 90.0 몰% 이상의 탄소를 이소프렌으로 변환시킨다. 본 발명의 임의 측면의 일부 구현예에서는, 배양물 내 세포는 세포/시간의 습식 중량에 대해 초과로 또는 약 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 5,000, 10,000, 100,000 이상의 이소프렌 ng/세포 g (ng/gwcm/시간)으로 이소프렌을 생성한다. 본 발명의 임의 측면의 일부 구현예에서는, 배양물 내 세포는 초과로 또는 약 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 5,000, 10,000, 50,000, 100,000 이상의 이소프렌 mg/브로쓰 L (mg/L브로쓰, 브로쓰의 부피에는 세포 및 세포 배지의 부피가 포함됨)로 이소프렌의 누적 역가 (총량)를 생성한다. 이소프렌 생성의 기타 예시적 속도 및 이소프렌 생성의 총량은 본원에 개시된다.
본 발명의 임의 측면의 일부 구현예에서는, 세포는 IDI 폴리펩티드를 인코딩하는 이종 핵산을 추가로 포함한다. 본 발명의 임의 측면의 일부 구현예에서는, 세포는 IDI 폴리펩티드를 인코딩하는 내인성 핵산의 카피의 삽입물을 추가로 포함한다. 본 발명의 임의 측면의 일부 구현예에서는, 세포는 DXS 폴리펩티드를 인코딩하는 이종 핵산을 추가로 포함한다. 본 발명의 임의 측면의 일부 구현예에서는, DXS 폴리펩티드를 인코딩하는 내인성 핵산의 카피의 삽입물을 추가로 포함한다. 본 발명의 임의 측면의 일부 구현예에서는, 세포는 IDI 폴리펩티드 및 DXS 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 추가로 포함한다. 본 발명의 임의 측면의 일부 구현예에서는, 한 핵산은 이소프렌 신타아제 폴리펩티드, IDI 폴리펩티드 및 DXS 폴리펩티드를 인코딩한다. 본 발명의 임의 측면의 일부 구현예에서는, 한 벡터는 이소프렌 신타아제 폴리펩티드, IDI 폴리펩티드 및 DXS 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서는, 상기 벡터는 항생제 내성 핵산과 같은 선택 마커를 포함한다.
본 발명의 임의 측면의 일부 구현예에서는, 이종 이소프렌 신타아제 핵산은 중간 또는 높은 카피 플라스미드에 포함된 T7 프로모터와 같은 T7 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 본 발명의 임의 측면의 일부 구현예에서는, 이종 이소프렌 신타아제 핵산은 중간 또는 높은 카피 플라스미드에 포함된 Trc 프로모터와 같은 Trc 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 본 발명의 임의 측면의 일부 구현예에서는, 이종 이소프렌 신타아제 핵산은 낮은 카피 플라스미드에 포함된 Lac 프로모터와 같은 Lac 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 본 발명의 임의 측면의 일부 구현예에서는, 이종 이소프렌 신타아제 핵산은 내인성 알칼리 세린 프로테아제 프로모터와 같은 내인성 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서는, 이종 이소프렌 신타아제 핵산이 선택 마커 없이 세포의 염색체에 융합된다.
본 발명의 임의 측면의 일부 구현예에서는, 적어도 일부의 세포가 연속 배양 (희석하지 않는 연속 배양과 같은)에서 이종 이소프렌 신타아제 핵산을 적어도 또는 약 5, 10, 20, 40, 50, 60, 65회 이상의 세포 분열 동안 유지시킨다. 본 발명의 임의 측면의 일부 구현예에서는, 이소프렌 신타아제, IDI 또는 DXS 핵산을 포함하는 핵산은 또한 항생제 내성 핵산과 같은 선택 마커를 포함한다.
본 발명의 임의 측면의 일부 구현예에서는, 세포는 MVA 경로 폴리펩티드 (사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae), 메타노사르키나 마제이 (Methanosarcina mazei) 또는 엔테로코쿠스 파에칼리스 (Enterococcus faecalis)로부터의 MVA 경로 폴리펩티드와 같은)를 인코딩하는 이종 핵산을 추가로 포함한다. 본 발명의 임의 측면의 일부 구현예에서는, 세포는 MVA 경로 폴리펩티드 (사카로마이세스 세레비지에, 메타노사르키나 마제이 또는 엔테로코쿠스 파에칼리스로부터의 MVA 경로 폴리펩티드와 같은)를 인코딩하는 내인성 핵산의 카피의 삽입물을 추가로 포함한다. 본 발명의 임의 측면의 일부 구현예에서는, 세포는 이소프렌 신타아제, DXS 및 MVA 경로 핵산을 포함한다. 본 발명의 임의 측면의 일부 구현예에서는, 세포는 이소프렌 신타아제 핵산, DXS 핵산, IDI 핵산 및 MVA 경로 핵산 (IDI 핵산에 추가로)을 포함한다.
본 발명의 임의 측면의 일부 구현예에서는, 이소프렌 신타아제 폴리펩티드는 푸에라리아 (Pueraria) (예를 들어, 푸에라리아 몬타나 (Pueraria montana)) 또는 포풀루스 (Populus) (예를 들어, 포풀루스 트레물로이데스 (Populus tremuloides), 포풀루스 알바 (Populus alba (P. alba)), 포풀루스 니그라 (Populus nigra), 포풀루스 트리코카르파 (Populus trichocarpa) 또는 하이브리드, 포풀루스 알바 x 포풀루스 트레물라 (Populus tremula))와 같은 식물로부터의 자연 발생적 폴리펩티드이다.
본 발명의 임의 측면의 일부 구현예에서는, 세포는 그람-양성 세균 세포(예를 들어, 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 세포와 같은 바실러스 세포, 또는 스트렙토마이세스 리비단스 (Streptomyces lividans), 스트렙토마이세스 코에리콜로르 (Streptomyces coelicolor), 스트렙토마이세스 알부스 (Streptomyces albus) 또는 스트렙토마이세스 그리세우스 (Streptomyces griseus) 세포와 같은 스트렙토마이세스 세포)와 같은 세균 세포이다. 본 발명의 임의 측면의 일부 구현예에서는, 세포는 그람-음성 세균 세포 (예를 들어, 에스케리키아 콜리 (Escherichia coli, 대장균) 세포와 같은 에스케리키아 세포, 또는 판토에아 시트레아 (Pantoea citrea) 세포와 같은 판토에아 세포)이다. 일부 구현예에서는, 대장균 세포는 대장균 FadR atoC 돌연변이체 세포이다. 일부 구현예에서는, 대장균 세포는 ybhE (또한 pgl로서 알려짐)를 발현한다 (예를 들어 항시적으로 발현). 본 발명의 임의 측면의 일부 구현예에서는, 세포는 필라멘트성 진균 세포 (예를 들어, 트리코데르마 레에세이 (Trichoderma reesei) 세포와 같은 트리코데르마 세포, 또는 아스페르길루스 오리자에 (Aspergillus oryzae) 및 아스페르길루스 니게르 (Aspergillus niger)와 같은 아스페르길루스 세포) 또는 효모 세포 (예를 들어, 야로위야 리포리티카 (Yarrowia lipolytica) 세포와 같은 야로위야 세포)와 같은 진균 세포이다.
본 발명의 임의 측면의 일부 구현예에서는, 미생물 폴리펩티드 탄소원은 효모 또는 세균으로부터의 하나 이상의 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 임의 측면의 일부 구현예에서는, 식물 폴리펩티드 탄소원은 콩, 옥수수, 카놀라, 자트로파, 야자, 땅콩, 해바라기, 코코넛, 겨자, 평지씨, 목화씨, 야자 핵 (palm kernel), 올리브, 잇꽃, 참깨 또는 아마인으로부터의 하나 이상의 폴리펩티드를 포함한다.
한 측면에서는, 본 발명은 폴리이소프렌을 포함하는 타이어를 제공한다. 일부 구현예에서는, 폴리이소프렌은 (i) 본원에 기재된 임의의 조성물 또는 방법으로부터 이소프렌을 중합하거나 (ii) 본원에 기재된 임의의 조성물 또는 방법에서 회수된 이소프렌을 중합하여 생성된다. 일부 구현예에서는, 폴리이소프렌은 시스-1,4-폴리이소프렌을 포함한다.
한 측면에서는, 본 발명은 본 발명의 임의의 조성물 또는 방법에 의해 제조된 생성물 (예를 들어 타이어)을 특징으로 한다.
본원에 기재된 다양한 구현예의 특성 중 하나, 일부 또는 전부가 조합되어 본 발명의 다른 구현예를 형성할 수 있음이 이해될 것이다. 본 발명의 이러한 측면 및 기타 측면은 당업자에게 명백할 것이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 증가된 양의 이소프렌의 생성을 위한 방법 및 조성물을 특징으로 한다. 특히, 이들 조성물 및 방법은 이소프렌 생성 속도를 증가시키고, 생성된 이소프렌의 총량을 증가시킨다. 예를 들어, 4.8 x 104 nmol/gwcm/시간의 이소프렌을 생성하는 세포 배양 시스템이 만들어졌다 (표 1). 이들 시스템의 효율은 세포 배양 배지로부터 세포가 소비하는 탄소의 약 23.6 몰% 수율 (10.7 중량% 수율)의 이소프렌으로의 변환 (탄소 수율%)에 의해 입증된다. 실시예 및 표 2에서 나타내는 바와 같이, 브로쓰 ℓ 당 약 60.5 g의 이소프렌이 발생되었다. 이소프렌은 1.88 x 105 nmol/OD/시간의 피크 특이적 속도 (1.88 x 105 nmol/gwcm/시간)에서 생성되었다. 필요하다면, 본원에 기재된 것들과 같은 다른 조건을 사용하여 더 큰 양의 이소프렌을 수득할 수 있다. 일부 구현예에서는, 재생가능 탄소원이 이소프렌의 생성에 사용된다. 본 발명의 조성물 및 방법은, 세포 당 높은 이소프렌 수율, 높은 탄소 수율, 높은 이소프렌 순도, 높은 생산성, 낮은 에너지 사용, 낮은 제조 가격 및 투자 비용, 및 최소의 부반응을 허용하기 때문에 바람직하다. 이러한 이소프렌 생성을 위한 효율적이고 대규모인 생합성 공정은 합성 이소프렌계 고무에 대한 이소프렌 공급원을 제공하며, 천연 고무를 사용하는 것에 대해 바람직하고 낮은 비용 대체물을 제공한다.
하기에 추가로 토의되는 바와 같이, 세포에 의해 생성된 이소프렌의 양은 이소프렌 신타아제 폴리펩티드 (예를 들어, 식물 이소프렌 신타아제 폴리펩티드)를 인코딩하는 이종 핵산을 세포에 도입함으로써 크게 증가될 수 있다. 이소프렌 신타아제 폴리펩티드는 디메틸알릴 디포스페이트 (DMAPP)를 이소프렌으로 변환시킨다. 실시예에서 나타내는 바와 같이, 이종 푸에라리아 몬타나 (Pueraria Montana) (쿠주) 또는 포풀루스 알바 (Populus alba) (포플러) 이소프렌 신타아제 폴리펩티드는 에스케리키아 콜리 (Escherichia coli, 대장균), 판토에아 시트레아 (Pantoea citrea), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 야로위야 리포리티카 (Yarrowia lipolytica) 및 트리코데르마 레에세이 (Trichoderma reesei)와 같은 다양한 숙주 세포에서 발현되었다. 실시예에서 나타내는 바와 같이, 이종 메타노사르키나 마제이 (Methanosarcina mazei) (M. 마제이) 메발로네이트 키나아제 (MVK)는 대장균과 같은 숙주 세포에서 발현되어 이소프렌 생성을 증가시켰다. 이들 세포 모두는 이종 이소프렌 신타아제 폴리펩티드를 갖지 않는 상응하는 세포들보다 더 많은 이소프렌을 생성하였다. 표 1 및 2에서 설명하는 바와 같이, 본원에서 기재된 방법을 사용하여 다량의 이소프렌이 생성된다. 예를 들어, 이종 이소프렌 신타아제 핵산을 갖는 B. 서브틸리스 세포는 이종 핵산을 갖지 않는 상응하는 대조군 B. 서브틸리스 세포보다 14ℓ 발효기에서 약 10배 더 많은 이소프렌을 생성한다 (표 2). 발효기 내에서 대장균에 의한 브로쓰의 ℓ 당 이소프렌 (mg/L, 브로쓰의 부피에는 세포의 부피 및 세포 배지의 부피가 모두 포함됨) 60.5 g, 및 B. 서브틸리스에 의한 30 mg/L의 생성은 유의한 양의 이소프렌이 생성될 수 있다는 것을 나타낸다 (표 2). 필요하다면, 이소프렌의 양을 추가적으로 증가시키는데 사용될 수 있는 본원에 기재된 다른 조건 또는 보다 더 큰 규모에서 이소프렌을 생성할 수 있다. 벡터를 표 1 및 2에 열거하고, 실험적 조건을 하기 및 실시예 부분에서 보다 상세히 기재한다.
표 1: 본 발명의 방법 및 세포 배양물을 사용하는 진탕 플라스크로부터의 이소프렌의 예시적 수율
이소프렌 생성을 측정하기 위한 검정법을 실시예 1, II 부분에서 기재한다. 상기 검정을 위해, 진탕 플라스크로부터 하나 이상의 시간 지점에서 샘플을 제거하고 30분 동안 배양하였다. 상기 샘플에서 생성된 이소프렌의 양을 이후 측정하였다. 이소프렌 생성의 특이적 속도 및 상부공간 농도를 표 1에 열거하고 본원에서 추가적으로 기재한다.
[표 1]
Figure pct00001
* 1:19의 액체 대 상부공간 부피 비율로 밀봉 상부공간 바이알에서 1시간 동안 배양된, 1의 OD60O의 1 ㎖에 대해 정상화됨.
표 2: 본 발명의 방법 및 세포 배양물을 사용하는 발효기에서의 이소프렌의 예시적 수율
이소프렌 생성을 측정하기 위한 검정법을 실시예 1, II 부분에서 기재한다. 상기 검정을 위해, 발효기의 배출 기체 (off-gas) 샘플을 취하고 이소프렌의 양에 대해 분석하였다. 피크 상부공간 농도 (발효 동안 가장 높은 상부공간 농도), 역가 (브로쓰의 ℓ 당 생성된 이소프렌의 누적 총량) 및 이소프렌 생성의 피크 특이적 속도 (발효 동안 가장 높은 특이적 속도)를 표 2에 열거하고 본원에서 추가적으로 기재한다.
[표 2]
Figure pct00002
**1 vvm (분 당 1 L브로쓰 당 1 부피 배출 기체)의 배출 기체 유속에 대해 정상화됨.
추가적으로, 이종 이소프렌 신타아제 핵산을 함유하는 세포에 의한 이소프렌 생성은 세포에 의해 발현되는 1-데옥시-D-자일루로오스-5-포스페이트 신타아제 (DXS) 폴리펩티드 및/또는 이소펜테닐 디포스페이트 이성화효소 (IDI) 폴리펩티드의 양을 증가시킴으로써 증강될 수 있다. 예를 들어 DXS 핵산 및/또는 IDI 핵산은 세포에 도입될 수 있다. DXS 핵산은 이종 핵산, 또는 내인성 핵산의 이중 카피일 수 있다. 유사하게, IDI 핵산은 이종 핵산, 또는 내인성 핵산의 이중 카피일 수 있다. 일부 구현예에서는, DXS 및/또는 IDI 폴리펩티드의 양은 내인성 DXS 및/또는 IDI 프로모터 또는 조절 부위를 DXS 및/또는 IDI 핵산의 더 큰 전사를 야기하는 다른 프로모터 및/또는 조절 부위로 대체함으로써 증가된다. 일부 구현예에서는, 세포는 이소프렌 신타아제 폴리펩티드를 인코딩하는 이종 핵산 (예를 들어 식물 이소프렌 신타아제 핵산) 및 이소프렌 신타아제 폴리펩티드를 인코딩하는 내인성 핵산의 이중 카피를 모두 함유한다.
인코딩된 DXS 및 IDI 폴리펩티드는 이소프렌의 생합성을 위한 DXP 경로의 일부이다 (도 19A). DXS 폴리펩티드는 피루베이트 및 D-글리세르알데히드-3-포스페이트를 1-데옥시-D-자일루로오스-5-포스페이트로 변환시킨다. 어떠한 특정 이론에도 얽매이지 않는 것으로 의도되지만, DXS 폴리펩티드의 양을 증가시키는 것은 DXP 경로를 통한 탄소의 흐름을 증가시켜 더 많은 이소프렌 생성을 야기하는 것으로 믿어진다. IDI 폴리펩티드는 이소펜테닐 디포스페이트 (IPP) 및 디메틸 알릴 디포스페이트 (DMAPP)의 상호변환을 촉진한다. 어떠한 특정 이론에도 얽매이지 않는 것으로 의도되지만, 세포 내의 IDI 폴리펩티드의 양을 증가시키는 것은 IPP의 양을 증가시켜 이는 DMAPP로 변환되고, 다음에는 이소프렌으로 변환되는 것으로 믿어진다.
예를 들어, 쿠주 (kudzu) 이소프렌 신타아제, S. 세레비지에 (S. cerevisiae) IDI, 및 대장균 DXS 핵산을 갖는 대장균 세포의 발효가 이소프렌을 생성하는데 사용된다. 이소프렌의 수준은 15시간의 기간에 걸쳐 50 내지 300 ㎍/L로 가변적이다 (실시예 7, VII 부분). 또 다른 예로서, M. 마제이 메발로네이트 키나아제 (MVK), P. 알바 이소프렌 신타아제, 상위 MVA 경로 및 융합된 하위 MVA 경로를 갖는 대장균 세포의 발효가 이소프렌을 생성하는데 사용된다. 이소프렌의 수준은 67시간의 기간에 걸쳐 32 내지 35.6 g/L로 가변적이다 (실시예 10, III 부분).
또 다른 예에서, M. 마제이 메발로네이트 키나아제 (MVK), P. 알바 이소프렌 신타아제, pgl 과발현 (RHM111608-2), 상위 MVA 경로 및 융합된 하위 MVA 경로를 갖는 대장균의 발효가 이소프렌을 생성하는데 사용된다. 이소프렌의 수준은 40시간의 기간에 걸쳐 33.2 g/L 내지 40.0 g/L, 또는 59시간의 기간에 걸쳐 48.6 g/L 내지 60.5 g/L로 가변적이다 (실시예 13, (ii) 부분).
일부 구현예에서는, 이종 또는 특별 내인성 이소프렌 신타아제, IDI 및 DXS 핵산의 존재는 세포가 오직 하나 또는 둘의 이들 이종 또는 특별 내인성 핵산을 갖는 상응하는 세포와 비교하여 보다 재생가능하게 성장하거나 더 길게 생존하도록 유발한다. 예를 들어 이종 이소프렌 신타아제, IDI 및 DXS 핵산을 함유하는 세포는 오직 이종 이소프렌 신타아제 및 DXS 핵산을 갖거나 오직 이종 이소프렌 신타아제 핵산만을 갖는 세포보다 더 양호하게 성장한다. 또한 이종 이소프렌 신타아제, IDI 및 DXS 핵산은 세포에 과량의 독성을 일으키지 않고 세포에서 발현될 수 있는 다량의 폴리펩티드를 제시하는, 대장균에서 유지된 높은 카피 플라스미드 상의 강력한 프로모터에 성공적으로 작동가능하게 연결된다. 특정 이론에 얽매이지 않는 것으로 의도되지만, 이종 또는 특별 내인성 이소프렌 신타아제 및 IDI 핵산의 존재는 이종 또는 특별 내인성 DXS 핵산이 세포 내에 존재하기만 한다면 축적되는 하나 이상의 잠재적 독성 중간체의 양을 감소시킬 수 있는 것으로 믿어진다.
일부 구현예에서는, 이종 이소프렌 신타아제 핵산을 함유하는 세포에 의한 이소프렌의 생성은 세포에 의해 발현되는 MVA 폴리펩티드의 양을 증가시킴으로써 증대된다 (도 19A 및 19B). 예시적 MVA 경로 폴리펩티드는 하기 폴리펩티드 중 임의의 것을 포함한다: 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라아제 (AA-CoA 티올라아제) 폴리펩티드, 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA 신타아제 (HMG-CoA 신타아제) 폴리펩티드, 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA 환원효소 (HMG-CoA 환원효소) 폴리펩티드, 메발로네이트 키나아제 (MVK) 폴리펩티드, 포스포메발로네이트 키나아제 (PMK) 폴리펩티드, 디포스포메발로네이트 데카르복실라아제 (MVD) 폴리펩티드, 포스포메발로네이트 데카르복실라아제 (PMDC) 폴리펩티드, 이소펜테닐 포스페이트 키나아제 (IPK) 폴리펩티드, IDI 폴리펩티드, 및 둘 이상의 MVA 경로 폴리펩티드의 활성을 갖는 폴리펩티드 (예를 들어, 융합 폴리펩티드). 예를 들어, 하나 이상의 MVA 경로 핵산이 세포에 도입될 수 있다. 일부 구현예에서는, 세포는 AA-CoA 티올라아제, HMG-CoA 신타아제 및 HMG-CoA 환원효소 핵산을 포함하는 상위 MVA 경로를 함유한다. 일부 구현예에서는, 세포는 MVK, PMK, MVD 및 IDI 핵산을 포함하는 하위 MVA 경로를 함유한다. 일부 구현예에서는, 세포는 AA-CoA 티올라아제, HMG-CoA 신타아제, HMG-CoA 환원효소, MVK, PMK, MVD 및 IDI 핵산을 포함하는 전체 MVA 경로를 함유한다. 일부 구현예에서는, 세포는 AA-CoA 티올라아제, HMG-CoA 신타아제, HMG-CoA 환원효소, MVK, PMDC, IPK 및 IDI 핵산을 포함하는 전체 MVA 경로를 함유한다. MVA 경로 핵산은 이종 핵산, 또는 내인성 핵산의 이중 카피일 수 있다. 일부 구현예에서는, 하나 이상의 MVA 경로 폴리펩티드는 MVA 경로 핵산에 대한 내인성 프로모터 또는 조절 부위를 MVA 경로 핵산의 더 큰 전사를 야기하는 다른 프로모터 및/또는 조절 부위로 대체함으로써 증가된다. 일부 구현예에서는, 세포는 이소프렌 신타아제 폴리펩티드를 인코딩하는 이종 핵산 (예를 들어 식물 이소프렌 신타아제 핵산), 및 이소프렌 신타아제 폴리펩티드를 인코딩하는 내인성 핵산의 이중 카피를 모두 함유한다.
예를 들어, 쿠주 이소프렌 신타아제 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 및 사카로마이세스 세레비지에 MVK, PMK, MVD 및 IDI 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 함유하는 대장균 세포는 6.67 x 104 nmol/L브로쓰/OD600/시간의 속도로 이소프렌을 생성한다 (실시예 8 참조). 추가적으로, 엔테로코쿠스 파에칼리스 (Enterococcus faecalis) AA-CoA 티올라아제, HMG-CoA 신타아제 및 HMG-CoA 환원효소 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 갖는 대장균 세포의 14ℓ 발효로 22 g의 메발론산 (MVA 경로의 중간체)이 생성된다. 이들 세포의 진탕 플라스크에서 ℓ 당 2~4 g의 메발론산이 생성된다. 이들 결과는 이종 MVA 경로 핵산이 대장균에서 활성이라는 것을 나타낸다. 상위 MVA 경로 및 하위 MVA 경로 뿐 아니라 쿠주 이소프렌 신타아제를 모두 함유하는 대장균 세포 (균주 MCM 127)는 오직 하위 MVA 경로 및 쿠주 이소프렌 신타아제에 대한 핵산만을 갖는 대장균 (균주 MCM 131)에 비해 유의하게 더 많은 이소프렌 (874 ㎍/L브로쓰/시간/OD)을 생성한다 (표 3 및 실시예 8, VIII 부분 참조).
또 다른 예로서, P. 알바 이소프렌 신타아제 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 및 M. 마제이 MVK 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 함유하는 대장균 세포는 효모 추출물의 공급 없이 67시간 발효 동안 320.6 g (9.54 x 104 nmol/L브로쓰/OD600/시간의 피크 특이적 속도에서 (즉 9.5 x 10-5 mol/L브로쓰/OD600/시간))의 이소프렌을 생성하거나, 효모 추출물을 공급하여 68시간 발효 동안 395.5 g (8.66 x 104 nmol/L브로쓰/OD600/시간의 피크 특이적 속도에서)의 이소프렌을 생성한다 (실시예 10 참조).
일부 구현예에서는, 세포의 적어도 일부는 연속 배양 (예를 들어 희석하지 않는 연속 배양)에서 이종 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 및/또는 MVA 경로 핵산을 약 5, 10, 20, 50, 75, 100, 200, 300회 이상의 세포 분열 동안 유지한다. 본 발명의 임의 측면의 일부 구현예에서는, 이종 또는 내인성 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 및/또는 MVA 경로 핵산의 이중 카피를 포함하는 핵산은 또한 카나마이신, 암피실린, 카르베니실린, 겐타마이신, 하이그로마이신, 플레오마이신, 블레오마이신, 네오마이신, 또는 클로람페니콜 항생제 내성 핵산과 같은 선택 마커를 포함한다.
실시예 7, VI 부분에서 나타내는 바와 같이, 생성된 이소프렌의 양은 이소프렌이 생성되도록 쿠주 이소프렌 신타아제, S. 세레비지에 IDI 및 대장균 DXS 핵산을 갖는 대장균 세포를 사용하는 세포 배양 배지에 효모 추출물을 첨가함으로써 추가로 증가될 수 있다. 특히, 생성된 이소프렌의 양은 시험된 농도에 대한 세포 배지 내의 효모 추출물의 양에 대해 선형으로 비례한다 (도 48C). 추가적으로, 브로쓰의 ℓ 당 약 0.11 g의 이소프렌이 효모 추출물 및 글루코오스를 갖는 세포 배지에서 생성되었다 (실시예 7, VIII 부분). 글루코오스의 존재 하에 효모 추출물의 양을 증가시키는 것은, 효모 추출물의 존재 하에 글루코오스의 양을 증가시키는 것보다 더 많은 이소프렌이 생성되게 한다. 또한 효모 추출물의 양을 증가시켜, 세포가 더 긴 시간 동안 높은 수준의 이소프렌을 생성하게 하고 세포의 건강이 개선되게 한다.
탄소원으로서 세 가지 유형의 가수분해된 바이오매스 (바가스, 옥수수대 및 침엽수 펄프)를 사용하여 이소프렌 생성을 또한 입증한다 (도 46A~C 및 도 69A 및 69B). 쿠주 이소프렌 신타아제, S. 세레비지에 IDI 및 대장균 DXS 핵산을 갖는 대장균 세포는 동량의 글루코오스 (예를 들어 1% 글루코오스, w/v)로부터의 이소프렌 양만큼, 가수분해된 바이오매스 탄소원으로부터 이소프렌을 생성한다. P. 알바 이소프렌 신타아제 및 MVA 경로를 발현하는 대장균 세포는 동량의 글루코오스로부터보다 암모니아 섬유 팽창 (AFEX) 사전처리된 옥수수대로부터 더 높은 초기 성장 속도로 이소프렌을 생성한다 (도 69 A 및 69B). 필요하다면, 임의 다른 바이오매스 탄소원이 본 발명의 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 많은 통상적 세포 배지보다 더 싸고, 그에 따라 이소프렌의 경제적 제조가 촉진되기 때문에, 상기 바이오매스 탄소원이 바람직하다.
추가적으로, 반전당 (invert sugar)은 이소프렌의 생성을 위한 탄소원으로서 역할하는 것으로 나타난다 (도 47D).
추가적으로, 자일로오스, 아세테이트 및 글리세롤이 또한 이소프렌의 생성을 위한 탄소원으로서 역할하는 것으로 나타난다 (도 69A~69D). 예를 들어 유일한 탄소원으로서 아세테이트 상에서 성장한, P. 알바 이소프렌 신타아제 및 MVA 경로를 갖는 대장균 세포는 글루코오스 상에서 성장하는 동안의 약 2배 더 높은 이소프렌의 특이적 생산성을 가진다 (실시예 10, IV 부분; 도 69A 및 69B).
일부 구현예에서는, 오일이 세포 배지에 포함된다. 예를 들어, 쿠주 이소프렌 신타아제 핵산을 함유하는 B. 서브틸리스 세포는 오일 및 글루코오스의 공급원을 함유하는 세포 배지에서 배양되는 경우 이소프렌을 생성한다 (실시예 4, III 부분). 또 다른 예로서, 상위 및 하위 MVA 경로 + 쿠주 이소프렌 신타아제를 함유하는 대장균 fadR atoC 돌연변이체 세포는 야자유 및 글루코오스 공급원을 함유하는 세포 배지에서 배양되는 경우 이소프렌을 생성한다 (실시예 12, II 부분). 일부 구현예에서는, 하나 초과의 오일 (예를 들어 2, 3, 4, 5개 이상의 오일)이 세포 배지에 포함된다. 어떠한 특정 이론에도 얽매이지 않는 것으로 의도되지만, (i) 오일이 이소프렌으로의 변환에 활용가능한 세포 내의 탄소량을 증가시킬 수 있고, (ii) 오일이 세포 내의 아세틸-CoA의 양을 증가시킴으로써 MVA 통로를 통한 탄소 흐름을 증가시킬 수 있고/있거나 (iii) 오일이 세포에 여분의 영양분을 제공할 수 있다고 믿어지는데, 이는 세포 내의 많은 탄소가 다른 생성물보다는 이소프렌으로 변환되기 때문에 바람직하다. 일부 구현예에서는, 오일을 함유하는 세포 배지에서 배양되는 세포는 이소프렌이 생성되도록 자연적으로 MVA 경로를 사용하거나, 전체 MVA 통로에 대한 핵산을 함유하도록 유전적으로 변형된다. 일부 구현예에서는, 오일이 세포 배양 배지에 첨가되기 전에 부분적으로 또는 완전히 가수분해되어 숙주 세포에 의한 오일의 사용이 촉진된다.
예시적 폴리펩티드 및 핵산
다양한 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 및/또는 MVA 경로 폴리펩티드 및 핵산이 본 발명의 조성물 및 방법에 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "폴리펩티드"는 폴리펩티드, 단백질, 펩티드, 폴리펩티드의 절편, 및 제 1 폴리펩티드의 일부 또는 전부 (예를 들어 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 또는 MVA 경로 폴리펩티드) 및 제 2 폴리펩티드의 일부 또는 전부 (예를 들어 His-표지와 같은, 융합 폴리펩티드의 정제 또는 검출을 촉진하는 펩티드)를 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서는, 융합 폴리펩티드는 둘 이상의 MVA 경로 폴리펩티드 (AA-CoA 티올라아제 및 HMG-CoA 환원효소 폴리펩티드와 같은)의 활성을 갖는다. 일부 구현예에서는, 폴리펩티드는 둘 이상의 MVA 경로 폴리펩티드의 활성을 갖는 자연 발생적 폴리펩티드 (예를 들어 엔테로코쿠스 파에칼리스 mvaE 핵산에 의해 인코딩되는 폴리펩티드)이다.
다양한 구현예에서, 폴리펩티드는 적어도 또는 약 50, 100, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400개 이상의 아미노산을 갖는다. 일부 구현예에서는, 폴리펩티드 절편은 전체 길이 폴리펩티드로부터 적어도 또는 약 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300개 이상의 연속 아미노산을 함유하며, 상응하는 전체 길이 폴리펩티드의 활성의 적어도 또는 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100%를 갖는다. 특정 구현예에서, 폴리펩티드는 임의 자연 발생적 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 또는 MVA 경로 폴리펩티드의 전체 아미노산 서열 또는 단편을 포함한다. 일부 구현예에서는, 폴리펩티드는 야생형 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 또는 MVA 경로 폴리펩티드의 서열 (즉, 자연적으로 발생하는 서열)과 비교하여 하나 이상의 돌연변이를 갖는다.
일부 구현예에서는, 폴리펩티드는 단리된 폴리펩티드이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "단리된 폴리펩티드"는 2, 5, 10, 20, 50개 이상의 상이한 폴리펩티드의 라이브러리와 같은 폴리펩티드의 라이브러리의 일부가 아니며, 자연적으로 발생하는 하나 이상의 성분으로부터 분리된다. 단리된 폴리펩티드는, 예를 들어 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 핵산의 발현에 의해 수득될 수 있다.
일부 구현예에서는, 폴리펩티드는 이종 폴리펩티드이다. "이종 폴리펩티드"는 동일한 숙주 세포에서 자연적으로 발현되는 또 다른 폴리펩티드의 서열과 아미노산 서열이 동일하지 않은 폴리펩티드를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "핵산"은 단일 또는 이중 가닥 형태인 둘 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 및/또는 리보뉴클레오티드를 나타낸다. 일부 구현예에서는, 핵산은 재조합 핵산이다. "재조합 핵산"은 관심 핵산이 유래하는 유기체의 자연 발생적 게놈에서, 관심 핵산의 측면에 위치하는 하나 이상의 핵산 (예를 들어 유전자)이 없는 관심 핵산을 의미한다. 그러므로 상기 용어는 예를 들어 벡터, 자체 복제 플라스미드 또는 바이러스, 또는 원핵생물 또는 진핵생물의 게놈 DNA 내에 통합되거나, 다른 서열에 독립적인 별개의 분자 (예를 들어 cDNA, 게놈 DNA 절편, 또는 PCR 또는 제한 엔도뉴클레아제 소화에 의해 생성되는 cDNA 절편)로서 존재하는 재조합 DNA를 포함한다. 일부 구현예에서 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 또는 MVA 경로 핵산은, 또 다른 폴리펩티드의 전부 또는 일부를 인코딩하는 또 다른 핵산에 작동가능하게 연결되어, 재조합 핵산이 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 또는 MVA 경로 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드, 및 또 다른 폴리펩티드 (예를 들어 His-표지와 같은, 융합 폴리펩티드의 정제 또는 검출을 촉진하는 펩티드)의 전부 또는 일부를 인코딩한다. 일부 구현예에서는, 재조합 핵산의 일부 또는 전부가 화학적으로 합성된다.
일부 구현예에서는, 핵산은 이종 핵산이다. "이종 핵산"은 동일한 숙주 세포에서 자연적으로 발견되는 또 다른 핵산의 서열과 동일하지 않은 핵산 서열의 핵산을 의미한다.
특정 구현예에서는, 핵산은 임의의 자연 발생적 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 또는 MVA 경로 핵산의 전체 핵산 서열 또는 단편을 포함한다. 일부 구현예에서는, 핵산은 자연 발생적 이소프렌 신타아제 핵산 DXS, IDI 또는 MVA 경로 핵산으로부터 적어도 또는 약 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서는, 핵산은 야생형 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 또는 MVA 경로 핵산의 서열 (즉, 자연적으로 발생하는 서열)과 비교하여 하나 이상의 돌연변이를 갖는다. 일부 구현예에서는, 핵산은 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 또는 MVA 경로 핵산의 전사 또는 번역을 증가시키는 하나 이상의 돌연변이 (예를 들어 침묵 돌연변이)를 갖는다. 일부 구현예에서는, 핵산은 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 또는 MVA 경로 폴리펩티드를 인코딩하는 임의 핵산의 변이체를 퇴화시킨다.
"코돈 퇴화성"은 인코딩된 폴리펩티드의 아미노산 서열에 영향을 주지 않고 뉴클레오티드 서열의 변이를 허용하는 유전적 코드에서의 차이 (divergence)를 나타낸다. 숙련된 기술자는 주어진 아미노산을 구체화하기 위한 뉴클레오티드 코돈의 이용에서 특정 숙주 세포에 의해 나타나는 "코돈-바이어스 (codon-bias)"를 잘 인지한다. 그러므로, 숙주 세포 내의 개선된 발현을 위해 핵산을 합성하는 경우 핵산을 설계하기 위한 일부 구현예에서 코돈 이용의 빈도가 숙주 세포의 바람직한 코돈 이용의 빈도에 도달하는 것이 바람직하다.
예시적 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 및/또는 MVA 경로 폴리펩티드 및 핵산의 기탁 번호를 부록 1에 열거하였다 (부록 1의 기탁 번호 및 이의 상응하는 서열은, 특히 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 및/또는 MVA 경로 폴리펩티드 및 핵산의 아미노산 및 핵산 서열에 대해 그 전체가 본원에 참고문헌으로 포함됨). Kegg 데이터베이스는 또한 수많은 예시적 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 및/또는 MVA 경로 폴리펩티드 및 핵산의 아미노산 및 핵산 서열을 포함한다 (예를 들어 "www.genome.jp/kegg/pathway/map/map00100.html" 및 그의 서열 참조; 특히 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 및/또는 MVA 경로 폴리펩티드 및 핵산의 아미노산 및 핵산 서열에 대해 그 전체가 본원에 참고문헌으로 포함됨). 일부 구현예에서는, 하나 이상의 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 및/또는 MVA 경로 폴리펩티드 및/또는 핵산은 부록 1에서의 임의 기탁 번호 또는 Kegg 데이터베이스에 존재하는 임의 서열에 상응하는 임의의 서열과 같은 2007년 12월 12일 또는 2008년 12월 11일에 공식적으로 활용가능한 서열과 동일한 서열을 갖는다. 추가적인 예시적 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 및/또는 MVA 경로 폴리펩티드 및 핵산은 하기에서 추가적으로 기재된다.
예시적 이소프렌 신타아제 폴리펩티드 및 핵산
상기 언급된 바와 같이, 이소프렌 신타아제 폴리펩티드는 디메틸알릴 디포스페이트 (DMAPP)를 이소프렌으로 변환시킨다. 예시적 이소프렌 신타아제 폴리펩티드는 폴리펩티드, 폴리펩티드의 절편, 펩티드, 및 이소프렌 신타아제 폴리펩티드의 하나 이상의 활성을 갖는 융합 폴리펩티드를 포함한다. 세포 추출물 내에서 시험관내, 또는 생체내에서 DMAPP를 이소프렌으로 변환시키는 폴리펩티드의 능력을 측정함으로써, 표준 방법을 사용하여 폴리펩티드가 이소프렌 신타아제 폴리펩티드 활성을 갖는지 여부를 측정할 수 있다. 예시적 검정에서, 실시예 1에서 기재된 바와 같은 진탕 플라스크 방법으로 균주 (예를 들어 본원에 기재된 대장균/pTrcKudzu 균주)를 성장시켜 세포 추출물을 제조한다. 유도가 완료된 후, 약 10 ㎖의 세포를 7000 x g에서 10분 동안 원심분리하여 펠릿화시키고 글리세롤이 없는 5 ㎖의 PEB에 재현탁한다. 표준 절차를 사용하여 세포 파쇄기 (French Pressure cell)로 세포를 용해한다. 대안적으로는, -80℃에서 동결/해동 후 리소자임 (Ready-Lyse 리소자임 용액; Epicentre)으로 세포를 처리한다.
세포 추출물 내의 이소프렌 신타아제 폴리펩티드 활성은 예를 들어 [Silver 등, J. Biol. Chem. 270:13010-13016, 1995 및 그의 참고문헌 (특히 이소프렌 신타아제 폴리펩티드 활성에 대한 검정에 대해, 각각 그 전문이 참고문헌으로 포함됨)에 기재된 바와 같이 측정될 수 있다. DMAPP (Sigma)를 질소 흐름 하에 건조되도록 증발시키고, 100 mM 인산 칼륨 완충액 (pH 8.2) 중 100 mM의 농도로 재수화하고 -20℃에서 보관한다. 검정을 수행하기 위해, 5 ㎕의 1M MgCl2, 1 mM (250 ㎍/㎖) DMAPP, 65 ㎕의 식물 추출 완충액 (PEB) (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 20 mM MgCl2, 5% 글리세롤 및 2 mM DTT)의 용액을 금속 나사 덮개 및 테플론 코팅된 규소 격막 (Agilent Technologies)을 갖는 20 ㎖ 상부공간 바이알 내의 25 ㎕의 세포 추출물에 첨가하고 37℃에서 15분 동안 진탕하면서 배양한다. 200 ㎕의 250 mM EDTA를 첨가하여 반응을 켄칭하고, 실시예 1, II 부분에서 기재된 바와 같이 GC/MS로 정량한다.
예시적 이소프렌 신타아제 핵산은 폴리펩티드, 폴리펩티드의 절편, 펩티드, 또는 이소프렌 신타아제 폴리펩티드의 하나 이상의 활성을 갖는 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 예시적 이소프렌 신타아제 폴리펩티드 및 핵산은 본원에 기재된 임의의 공급원 유기체로부터의 자연 발생적 폴리펩티드 및 핵산 뿐 아니라 본원에 기재된 임의의 공급원 유기체에서 유래한 돌연변이체 폴리펩티드 및 핵산을 포함한다.
일부 구현예에서는, 이소프렌 신타아제 폴리펩티드 또는 핵산은 콩아과 (Faboideae subfamily)와 같은 콩과 (family Fabaceae)로부터의 것이다. 일부 구현예에서는, 이소프렌 신타아제 폴리펩티드 또는 핵산은 푸에라리아 몬타나 (Pueraria montana (쿠주)) (Sharkey 등, Plant Physiology 137:700-712, 2005), 푸에라리아 로바타 (Pueraria lobata), 포플러 (예를 들어 포풀루스 알바 (Populus alba), 포풀루스 니가라 (Populus nigra), 포풀루스 트리코카르파 (Populus trichocarpa), 포풀루스 알바 x 트레물라 (tremula) (CAC35696), 또는 포풀루스 알바) (Sasaki 등, FEBS Letters 579(11): 2514-2518, 2005; Miller 등, Planta 213: 483-487, 2001), 아스펜 (aspen) (예를 들어 포풀루스 트레물로이데스 (Populus tremuloides)) (Silver 등, JBC 270(22): 13010-1316, 1995), 또는 잉글리시 오크 (English Oak) (쿠에르쿠스 로부르 (Quercus robur)) (Zimmer 등, WO 98/02550) (특히 이소프렌 신타아제 핵산, 및 이소프렌 신타아제 폴리펩티드의 발현에 대해 그 전문이 참고문헌으로 각각 포함됨)로부터의 폴리펩티드 또는 핵산이다. 적합한 이소프렌 신타아제는 비제한적으로, 특히 이소프렌 신타아제 핵산 및 폴리펩티드의 서열에 대해 그 전문이 참고문헌으로 각각 포함되는 Genbank 기탁 번호 AY341431, AY316691, AY279379, AJ457070 및 AY182241에 의해 확인되는 것들을 포함한다. 일부 구현예에서는, 이소프렌 신타아제 폴리펩티드 또는 핵산은 쿠에르쿠스 로부르 (Quercus robur)로부터의 자연 발생적 폴리펩티드 또는 핵산이 아니다 (즉, 이소프렌 신타아제 폴리펩티드 또는 핵산은 쿠에르쿠스 로부르로부터의 자연 발생적 폴리펩티드 또는 핵산 외의 이소프렌 신타아제 폴리펩티드 또는 핵산임). 일부 구현예에서는, 이소프렌 신타아제 핵산 또는 폴리펩티드는 포플러로부터의 자연 발생적 폴리펩티드 또는 핵산이다. 일부 구현예에서는, 이소프렌 신타아제 핵산 또는 폴리펩티드는 포플러로부터의 자연 발생적 폴리펩티드 또는 핵산이 아니다.
예시적 DXS 폴리펩티드 및 핵산
상기 나타내는 바와 같이, 1-데옥시-D-자일루로오스-5-포스페이트 신타아제 (DXS) 폴리펩티드는 피루베이트 및 D-글리세르알데히드-3-포스페이트를 1-데옥시-D-자일루로오스-5-포스페이트로 변환시킨다. 예시적 DXS 폴리펩티드는 폴리펩티드, 폴리펩티드의 절편, 펩티드, 및 DXS 폴리펩티드의 하나 이상의 활성을 갖는 융합 폴리펩티드를 포함한다. 세포 추출물 내에서 시험관내, 또는 생체내에서 피루베이트 및 D-글리세르알데히드-3-포스페이트를 1-데옥시-D-자일루로오스-5-포스페이트로 변환시키는 폴리펩티드의 능력을 측정함으로써, 표준 방법 (본원에 기재된 것들과 같은)을 사용하여 폴리펩티드가 DXS 폴리펩티드 활성을 갖는지 여부를 측정할 수 있다. 예시적 DXS 핵산은 폴리펩티드, 폴리펩티드의 절편, 펩티드, 또는 DXS 폴리펩티드의 하나 이상의 활성을 갖는 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 예시적 DXS 폴리펩티드 및 핵산은 본원에 기재된 임의의 공급원 유기체로부터의 자연 발생적 폴리펩티드 및 핵산 뿐 아니라 본원에 기재된 임의의 공급원 유기체에서 유래한 돌연변이체 폴리펩티드 및 핵산을 포함한다.
예시적 IDI 폴리펩티드 및 핵산
이소펜테닐 디포스페이트 이성화효소 폴리펩티드 (이소펜테닐-디포스페이트 델타- 이성화효소 또는 IDI)는 이소펜테닐 디포스페이트 (IPP) 및 디메틸알릴 디포스페이트 (DMAPP)의 상호변환 (예를 들어, IPP를 DMAPP로 변환시키고/시키거나 DMAPP를 IPP로 변환시킴)을 촉진한다. 예시적 IDI 폴리펩티드는 폴리펩티드, 폴리펩티드의 절편, 펩티드, 및 IDI 폴리펩티드의 하나 이상의 활성을 갖는 융합 폴리펩티드를 포함한다. 세포 추출물 내에서 시험관내, 또는 생체내에서 IPP 및 DMAPP를 상호변환시키는 폴리펩티드의 능력을 측정함으로써, 표준 방법 (본원에 기재된 것들과 같은)을 사용하여 폴리펩티드가 IDI 폴리펩티드 활성을 갖는지 여부를 측정할 수 있다. 예시적 IDI 핵산은 폴리펩티드, 폴리펩티드의 절편, 펩티드, 또는 IDI 폴리펩티드의 하나 이상의 활성을 갖는 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 예시적 IDI 폴리펩티드 및 핵산은 본원에 기재된 임의의 공급원 유기체로부터의 자연 발생적 폴리펩티드 및 핵산 뿐 아니라 본원에 기재된 임의의 공급원 유기체에서 유래한 돌연변이체 폴리펩티드 및 핵산을 포함한다.
예시적 MVA 경로 폴리펩티드 및 핵산
예시적 MVA 경로 폴리펩티드는 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라아제 (AA-CoA 티올라아제) 폴리펩티드, 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA 신타아제 (HMG-CoA 신타아제) 폴리펩티드, 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA 환원효소 (HMG-CoA 환원효소) 폴리펩티드, 메발로네이트 키나아제 (MVK) 폴리펩티드, 포스포메발로네이트 키나아제 (PMK) 폴리펩티드, 디포스포메발로네이트 데카르복실라아제 (MVD) 폴리펩티드, 포스포메발로네이트 데카르복실라아제 (PMDC) 폴리펩티드, 이소펜테닐 포스페이트 키나아제 (IPK) 폴리펩티드, IDI 폴리펩티드, 및 둘 이상의 MVA 경로 폴리펩티드의 활성을 갖는 폴리펩티드 (예를 들어 융합 폴리펩티드)를 포함한다. 특히, MVA 경로 폴리펩티드는 폴리펩티드, 폴리펩티드의 절편, 펩티드, 및 MVA 경로 폴리펩티드의 하나 이상의 활성을 갖는 융합 폴리펩티드를 포함한다. 예시적 MVA 경로 핵산은 폴리펩티드, 폴리펩티드의 절편, 펩티드, 또는 MVA 경로 폴리펩티드의 하나 이상의 활성을 갖는 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 예시적 MVA 경로 폴리펩티드 및 핵산은 본원에 기재된 임의의 공급원 유기체로부터의 자연 발생적 폴리펩티드 및 핵산 뿐 아니라 본원에 기재된 임의의 공급원 유기체에서 유래한 돌연변이체 폴리펩티드 및 핵산을 포함한다.
특히, 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라아제 폴리펩티드 (AA-CoA 티올라아제 또는 AACT)는 두 분자의 아세틸-CoA를 아세토아세틸-CoA로 변환시킨다. 세포 추출물 내에서 시험관내, 또는 생체내에서 두 분자의 아세틸-CoA를 아세토아세틸-CoA로 변환시키는 폴리펩티드의 능력을 측정함으로써, 표준 방법 (본원에 기재된 것들과 같은)을 사용하여 폴리펩티드가 AA-CoA 티올라아제 폴리펩티드 활성을 갖는지 여부를 측정할 수 있다.
3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA 신타아제 (HMG-CoA 신타아제 또는 HMGS) 폴리펩티드는 아세토아세틸-CoA를 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA로 변환시킨다. 세포 추출물 내에서 시험관내, 또는 생체내에서 아세토아세틸-CoA를 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA로 변환시키는 폴리펩티드의 능력을 측정함으로써, 표준 방법 (본원에 기재된 것들과 같은)을 사용하여 폴리펩티드가 HMG-CoA 신타아제 폴리펩티드 활성을 갖는지 여부를 측정할 수 있다.
3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA 환원효소 (HMG-CoA 환원효소 또는 HMGR) 폴리펩티드는 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA를 메발로네이트로 변환시킨다. 세포 추출물 내에서 시험관내, 또는 생체내에서 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA를 메발로네이트로 변환시키는 폴리펩티드의 능력을 측정함으로써, 표준 방법 (본원에 기재된 것들과 같은)을 사용하여 폴리펩티드가 HMG-CoA 환원효소 폴리펩티드 활성을 갖는지 여부를 측정할 수 있다.
메발로네이트 키나아제 (MVK) 폴리펩티드는 메발로네이트를 인산화하여 메발로네이트-5-포스페이트를 형성시킨다. 세포 추출물 내에서 시험관내, 또는 생체내에서 메발로네이트를 메발로네이트-5-포스페이트로 변환시키는 폴리펩티드의 능력을 측정함으로써, 표준 방법 (본원에 기재된 것들과 같은)을 사용하여 폴리펩티드가 MVK 폴리펩티드 활성을 갖는지 여부를 측정할 수 있다.
포스포메발로네이트 키나아제 (PMK) 폴리펩티드는 메발로네이트-5-포스페이트를 인산화하여 메발로네이트-5-디포스페이트를 형성시킨다. 세포 추출물 내에서 시험관내, 또는 생체내에서 메발로네이트-5-포스페이트를 메발로네이트-5-디포스페이트로 변환시키는 폴리펩티드의 능력을 측정함으로써, 표준 방법 (본원에 기재된 것들과 같은)을 사용하여 폴리펩티드가 PMK 폴리펩티드 활성을 갖는지 여부를 측정할 수 있다.
디포스포메발로네이트 데카르복실라아제 (MVD 또는 DPMDC) 폴리펩티드는 메발로네이트-5-디포스페이트를 이소펜테닐 디포스페이트 (IPP)로 변환시킨다. 세포 추출물 내에서 시험관내, 또는 생체내에서 메발로네이트-5-디포스페이트를 IPP로 변환시키는 폴리펩티드의 능력을 측정함으로써, 표준 방법 (본원에 기재된 것들과 같은)을 사용하여 폴리펩티드가 MVD 폴리펩티드 활성을 갖는지 여부를 측정할 수 있다.
포스포메발로네이트 데카르복실라아제 (PMDC) 폴리펩티드는 메발로네이트-5-포스페이트를 이소펜테닐 포스페이트 (IP)로 변화시킨다. 세포 추출물 내에서 시험관내, 또는 생체내에서 메발로네이트-5-포스페이트를 IP로 변환시키는 폴리펩티드의 능력을 측정함으로써, 표준 방법 (본원에 기재된 것들과 같은)을 사용하여 폴리펩티드가 PMDC 폴리펩티드 활성을 갖는지 여부를 측정할 수 있다.
이소펜테닐 포스페이트 키나아제 (IPK) 폴리펩티드는 이소펜틸 포스페이트 (IP)를 인산화하여 이소펜테닐 디포스페이트 (IPP)를 형성시킨다. 세포 추출물 내에서 시험관내, 또는 생체내에서 IP를 IPP로 변환시키는 폴리펩티드의 능력을 측정함으로써, 표준 방법 (본원에 기재된 것들과 같은)을 사용하여 폴리펩티드가 IPK 폴리펩티드 활성을 갖는지 여부를 측정할 수 있다.
예시적 IDI 폴리펩티드 및 핵산이 상기에 기재된다.
핵산을 단리하기 위한 예시적 방법
이소프렌 신타아제, DXS, IDI 및/또는 MVA 경로 핵산은 표준 방법을 사용하여 단리될 수 있다. 관심 공급원 유기체 (예를 들어 세균 게놈)으로부터 원하는 핵산을 수득하는 방법은 통상적인 것이며 분자 생물학계에 잘 알려져 있다 (예를 들어, 특히 관심 핵산의 단리에 대해 각각 그 전문이 참고문헌으로 포함된 WO 2004/033646 및 그에 인용된 참고문헌들 참조). 예를 들어, 핵산의 서열이 알려져 있다면 (예를 들어 본원에 기재된 임의의 알려진 핵산), 제한 엔도뉴클레아제 소화에 의해 적합한 게놈 라이브러리가 생성될 수 있으며, 원하는 핵산 서열에 상보적인 프로브로 스크리닝될 수 있다. 서열이 단리되고 나면, 적절한 벡터를 사용하는 형질전환에 적합한 양의 DNA가 수득되도록 중합효소 연쇄 반응 (PCR)과 같은 표준 프라이머 지정 증폭 방법을 사용하여 DNA를 증폭할 수 있다 (미국 특허 제 4,683,202 호; 특히 PCR 방법에 대해 그 전문이 참고문헌으로 포함됨).
대안적으로는, 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 및/또는 MVA 경로 핵산 (예를 들어 알려진 핵산 서열을 갖는 임의 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 및/또는 MVA 경로 핵산)은 표준 방법을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다.
본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용하기에 적합할 수 있는 추가적인 이소프렌 신타아제, DXS, IDI, 또는 MVA 경로 폴리펩티드 및 핵산은 표준 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 이소프렌을 자연적으로 생성하는 것으로 알려진 유기체의 염색체 DNA의 코스미드 라이브러리는 대장균과 같은 유기체에서 구성된 후 이소프렌 생성에 대해 스크리닝될 수 있다. 특히, 큰 단편의 게놈 DNA (35~45 kb)가 벡터 내에 패키징되는 코스미드 라이브러리가 생성되며 적절한 숙주를 형질전환시키는데 사용될 수 있다. 코스미드 벡터는 다량의 DNA를 수용할 수 있다는 점에 있어서 고유하다. 일반적으로 코스미드 벡터는 이종 DNA의 패키징 및 후속적 원형화에 필요한 cos DNA 서열의 하나 이상의 카피를 갖는다. cos 서열에 추가적으로, 이들 벡터는 또한 ColEI과 같은 복제 기원, 및 암피실린 또는 네오마이신에 내성인 핵산과 같은 약물 내성 마커를 포함한다. 적합한 세균 숙주의 형질전환을 위해 코스미드 벡터를 사용하는 방법은 특히 형질전환 방법에 대해 그 전문이 참고문헌으로 포함되는 [Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, 1989]에 잘 기재된다.
클론 코스미드에 대해 전형적으로, 이종 DNA는 적절한 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 단리되며, 적절한 리가아제를 사용하여 코스미드 벡터의 cos 부위에 인접하게 라이게이션된다. 선형화된 이종 DNA를 함유하는 코스미드 벡터는 이후 박테리오파지와 같은 DNA 패키징 비히클과 반응한다. 패키징 과정 동안 cos 위치가 절단되고 이종 DNA가 세균 바이러스성 입자의 헤드 부위 내에 패키징된다. 이후 이들 입자는 대장균과 같은 적합한 숙주 세포를 트랜스펙션시키는데 사용된다. 세포에 주입되고 나면, 이종 DNA는 cos 점착성 말단의 영향 하에 원형화된다. 이러한 방식으로, 이종 DNA의 큰 단편이 숙주 세포에 도입되고 발현될 수 있다.
이소프렌 신타아제, DXS, IDI 및/또는 MVA 경로 핵산을 수득하기 위한 추가적인 방법은 검정 (예를 들어 본원에 기재된 상부공간 검정), 또는 보존된 길이의 아미노산 (예를 들어 3 이상의 보존된 아미노산)을 인코딩하는 뉴클레오티드에 대해 지정된 프라이머를 사용하는 PCR에 의한 메타게놈 라이브러리 스크리닝을 포함한다. 보존된 아미노산은 알려진 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 및/또는 MVA 경로 폴리펩티드의 아미노산 서열을 정렬함으로써 확인될 수 있다. 이소프렌 신타아제 폴리펩티드에 대한 보존된 아미노산은 알려진 이소프렌 신타아제 폴리펩티드의 정렬된 서열을 기초로 하여 확인될 수 있다. 이소프렌을 자연적으로 생성하는 것으로 발견된 유기체는 표준 단백질 정제 방법 (당업계에 잘 알려진)에 적용될 수 있으며, 생성된 정제 폴리펩티드는 표준 방법을 사용하여 서열분석될 수 있다. 다른 방법이 문헌에서 발견된다 (예를 들어, Julsing 등, Applied. Microbiol. Biotechnol. 75: 1377-84, 2007; Withers 등, Appl Environ Microbiol. 73(19):6277-83, 2007 참조; 특히 이소프렌의 합성에 포함된 핵산의 확인에 대해 그 전문이 참고문헌으로 각각 포함됨).
추가적으로, 표준 서열 정렬 및/또는 구조 예측 프로그램을 사용하여, 제 1차 및/또는 예측된 폴리펩티드 제 2차 구조와 알려진 DXS, IDI, 또는 MVA 경로 폴리펩티드 및 핵산의 구조와의 유사성을 기초로 하여 추가적인 DXS, IDI, 또는 MVA 경로 폴리펩티드 및 핵산을 확인할 수 있다. swissprot-trembl 데이터베이스 ("www.expasy.org", Swiss Institute of Bioinformatics Swiss-Prot group CMU - 1 rue Michel Servet CH- 1211 Geneva 4, Switzerland)와 같은 표준 데이터베이스를 또한 사용하여 이소프렌 신타아제, DXS, IDI, 또는 MVA 경로 폴리펩티드 및 핵산을 확인할 수 있다. PredictProtein (630 West, 168 Street, BB217, New York, N.Y. 10032, USA)과 같은 표준 구조 예측 프로그램의 디폴트 설정을 사용하여 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 또는 MVA 경로 폴리펩티드의 제 2차 및/또는 제 3차 구조를 예측할 수 있다. 대안적으로, 표준 방법을 사용하여 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 또는 MVA 경로 폴리펩티드의 실제적인 제 2차 및/또는 제 3차 구조가 측정될 수 있다. 알려진 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 또는 MVA 경로 핵산으로부터 생성된 프로브에 대한 하이브리드화에 의해 추가적인 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 또는 MVA 경로 핵산이 또한 확인될 수 있다.
예시적 프로모터 및 벡터
본원에 기재된 임의의 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 또는 MVA 경로 핵산은 하나 이상의 벡터에 포함될 수 있다. 따라서, 발명자는 또한 본원에서 기재된 임의의 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 또는 MVA 경로 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 갖는 벡터를 나타낸다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "벡터"는 숙주 세포에서 하나 이상의 관심 핵산을 전달하고 바람직하게는 발현시킬 수 있는 구성물을 의미한다. 벡터의 예에는 비제한적으로, 플라스미드, 바이러스 벡터, DNA 또는 RNA 발현 벡터, 코스미드 및 파지 벡터가 포함된다. 일부 구현예에서는, 벡터는 발현 조절 서열의 조절 하에 핵산을 함유한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "발현 조절 서열"은 관심 핵산의 전사를 지시하는 핵산 서열을 의미한다. 발현 조절 서열은 항시성 또는 유도성 프로모터와 같은 프로모터, 또는 인핸서일 수 있다. "유도성 프로모터"는 환경 또는 발달 조절 하에 활성인 프로모터이다. 발현 조절 서열은 전사될 핵산 단편에 작동가능하게 연결된다.
일부 구현예에서는, 벡터는 선택 마커를 포함한다. 용어 "선택 마커"는 도입된 핵산 또는 벡터를 포함하는 이들 숙주 세포의 선택을 용이하게 하는 숙주 세포에서 발현될 수 있는 핵산을 나타낸다. 선택가능한 마커의 예에는 비제한적으로, 항생제 내성 핵산 (예를 들어 카나마이신, 암피실린, 카르베니실린, 겐타마이신, 하이그로마이신, 플레오마이신, 블레오마이신, 네오마이신 또는 클로람페니콜) 및/또는 숙주 세포에 영양 이득과 같은 대사작용 이득을 부여하는 핵산이 포함된다. 예시적 영양 선택 마커는 amdS, argB 및 pyr4로서 당업계에 공지된 마커를 포함한다. 트리코데르마의 형질전환을 위한 벡터 시스템에서 유용한 마커가 당업계에 알려져 있다 (예를 들어, Finkelstein, Chapter 6 in Biotechnology of Filamentous Fungi, Finkelstein 등, Eds. Butterworth-Heinemann, Boston, MA, Chap. 6., 1992; 및 Kinghorn 등, Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi, Blackie Academic and Professional, Chapman and Hall, London, 1992 참조; 특히 선택 마커에 대해 그 전문이 참고문헌으로 각각 포함됨). 일부 구현예에서는, 선택 마커는 형질전환된 세포가 질소원으로서 아세트아미드 상에서 성장하도록 하는 효소 아세트아미다아제를 인코딩하는 amdS 핵산이다. A. 니둘란스 (A. nidulans) amdS 핵산을 선택 마커로서 사용하는 것은 [Kelley 등, EMBO J. 4:475-479, 1985] 및 [Penttila 등, Gene 61 :155-164, 1987] (특히 선택 마커에 대해 그 전문이 참고문헌으로 각각 포함됨)에서 기재된다. 일부 구현예에서는, 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 또는 MVA 경로 핵산은 선택 마커 없이 세포의 염색체에 융합된다.
적합한 벡터는 사용되는 숙주 세포와 호환 가능한 것들이다. 적합한 벡터는, 예를 들어 세균, 바이러스 (예를 들어 박테리오파지 T7 또는 M-13 유래 파지), 코스미드, 효모 또는 식물에서 유래할 수 있다. 이러한 벡터를 수득하고 사용하기 위한 프로토콜은 당업자에게 알려져 있다 (예를 들어 Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, 1989 참조; 특히 벡터의 사용에 대해 그 전문이 참고문헌으로 포함됨).
프로모터는 당업계에 잘 알려져 있다. 숙주 세포에서 기능하는 임의의 프로모터는 숙주 세포 내의 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 또는 MVA 경로 핵산의 발현에 사용될 수 있다. 다양한 숙주 세포에서 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 또는 MVA 경로 핵산의 발현을 유발하는데 유용한 개시 조절 부위 또는 프로모터가 많이 존재하며 이는 당업자에게 익숙한 것이다 (예를 들어, WO 2004/033646 및 그의 참고문헌들 참조; 특히 관심 핵산의 발현을 위한 벡터에 대해 그 전문이 참고문헌으로 각각 포함됨). 이들 핵산을 유발할 수 있는 사실상 임의의 프로모터가 본 발명에 적합하며 비제한적으로 CYC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK, PHO5, GAPDH, ADCI, TRP1, URA3, LEU2, ENO 및 TPI (사카로마이세스에서의 발현에 유용함); AOX1 (피키아 (Pichia)에서의 발현에 유용함); 및 lac, trp, λPL, λPR, T7, tac 및 trc (대장균에서의 발현에 유용함)를 포함한다.
일부 구현예에서는, 글루코오스 이성화효소 프로모터가 사용된다 (예를 들어 미국 특허 제 7,132,527 호 및 그에 인용된 참고문헌들 참조; 특히 관심 폴리펩티드를 발현시키기 위한 플라스미드 시스템 및 프로모터에 대해 그 전문이 참고문헌으로 각각 포함됨). 보고된 글루코오스 이성화효소 프로모터 돌연변이체는 글루코오스 이성화효소 프로모터에 작동가능하게 연결된 핵산에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 발현 수준을 다양하게 하는데 사용될 수 있다 (미국 특허 제 7,132,527 호). 다양한 구현예에서는 글루코오스 이성화효소 프로모터가 낮은, 중간 또는 높은 카피 플라스미드 내에 포함된다 (미국 특허 제 7,132,527 호).
다양한 구현예에서는 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 및/또는 MVA 경로 핵산이 낮은 카피 플라스미드 (예를 들어, 세포 당 약 1 내지 약 4 카피로 유지되는 플라스미드), 중간 카피 플라스미드 (예를 들어, 세포 당 약 10 내지 약 15 카피로 유지되는 플라스미드) 또는 높은 카피 플라스미드 (예를 들어, 세포 당 약 50 이상의 카피로 유지되는 플라스미드) 내에 포함된다. 일부 구현예에서는, 이종 또는 특별 내인성 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 또는 MVA 경로 핵산은 T7 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서는, T7 프로모터에 작동가능하게 연결되는 이종 또는 특별 내인성 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 또는 MVA 경로 핵산은 중간 또는 높은 카피 플라스미드 내에 포함된다. 일부 구현예에서는, 이종 또는 특별 내인성 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 또는 MVA 경로 핵산은 Trc 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서는, Trc 프로모터에 작동가능하게 연결되는 이종 또는 특별 내인성 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 또는 MVA 경로 핵산은 중간 또는 높은 카피 플라스미드 내에 포함된다. 일부 구현예에서는, 이종 또는 특별 내인성 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 또는 MVA 경로 핵산은 Lac 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서는, Lac 프로모터에 작동가능하게 연결되는 이종 또는 특별 내인성 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 또는 MVA 경로 핵산은 낮은 카피 플라스미드 내에 포함된다. 일부 구현예에서는, 이종 또는 특별 내인성 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 또는 MVA 경로 핵산은 내인성 에스케리키아, 판토에아, 바실러스, 야로위야, 스트렙토마이세스 또는 트리코데르마 프로모터, 또는 내인성 알칼리 세린 프로테아제, 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 또는 MVA 경로 프로모터와 같은 내인성 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서는, 내인성 프로모터에 작동가능하게 연결되는 이종 또는 특별 내인성 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 또는 MVA 경로 핵산은 높은 카피 플라스미드 내에 포함된다. 일부 구현예에서는, 벡터는 세포 내의 염색체에 융합되지 않는 복제 플라스미드이다. 일부 구현예에서는, 벡터의 일부 또는 전부가 세포 내의 염색체에 융합된다.
일부 구현예에서는, 벡터는 진균 숙주 세포에 도입되는 경우 숙주 세포 게놈에 융합되고 복제되는 임의의 벡터이다. 벡터 목록에 대해서는 [Fungal Genetics Stock Center Catalogue of Strains] (FGSC, "www.fgsc.net" 및 그에 인용된 참고문헌들; 특히 벡터에 대해 그 전문이 참고문헌으로 각각 포함됨)를 참고로 한다. 적합한 발현 및/또는 융합 벡터의 추가적인 예가 [Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, 1989, Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel 등 (eds) 1987, Supplement 30, section 7.7.18); van den Hondel et al. in Bennett and Lasure (Eds.) More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press pp. 396-428, 1991; 및 미국 특허 제 5,874,276 호] (특히 벡터에 대해 그 전문이 참고문헌으로 각각 포함됨)에서 제공된다. 특히 유용한 벡터는 pFB6, pBR322, PUC18, pUC100 및 pENTR/D를 포함한다.
일부 구현예에서는, 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 또는 MVA 경로 핵산은 진균 숙주 세포에서 전사 활성을 나타내는 적합한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 프로모터는 숙주 세포에 대해 내인성 또는 이종인 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 핵산에서 유래할 수 있다. 일부 구현예에서는, 프로모터는 트리코데르마 숙주에서 유용하다. 프로모터의 적합한 비제한적 예는 cbh1, cbh2, egl1, egl2, pepA, hfb1, hfb2, xyn1 및 amy를 포함한다. 일부 구현예에서는, 프로모터는 숙주 세포에 대해 선천적인 것이다. 예를 들어 일부 구현예에서 T. 레에세이가 숙주인 경우, 프로모터는 선천적 T. 레에세이 프로모터이다. 일부 구현예에서는, 프로모터는 T. 레에세이 cbh1이며 이는 유도성 프로모터이고 기탁 번호 D86235로 GenBank에 수탁된다 (특히 프로모터에 대해 그 전문이 참고문헌으로 포함됨). 일부 구현예에서는, 프로모터는 진균 숙주 세포에 이종인 것이다. 유용한 프로모터의 또 다른 예는 A. 아와모리 (A. awamori) 및 A. 니게르 (A. niger) 글루코아밀라아제 (glaA) (Nunberg 등, Mol. Cell Biol. 4:2306-2315, 1984 및 Boel 등, EMBO J. 3: 1581-1585, 1984; 특히 프로모터에 대해 그 전문이 참고문헌으로 각각 포함됨); 아스페르길루스 니게르 알파 아밀라아제, 아스페르길루스 오리자에 (Aspergillus oryzae) TAKA 아밀라아제, T. 레에세이 xln1, 및 T. 레에세이 셀로바이오하이드롤라아제 1 (EP 137280, 특히 프로모터에 대해 그 전문이 참고문헌으로 포함됨)의 유전자로부터의 프로모터를 포함한다.
일부 구현예에서는, 발현 벡터는 또한 종결 서열을 포함한다. 종결 조절 부위는 또한 숙주 세포에 대해 선천적인 다양한 유전자에서 유래할 수 있다. 일부 구현예에서는, 종결 서열 및 프로모터 서열은 동일한 근원에서 유래한다. 또 다른 구현예에서는, 종결 서열은 숙주 세포에 대해 내인성이다. 특히 적합한 터미네이터 서열은 트리코데르마 균주 (예를 들어 T. 레에세이)에서 유래하는 cbh1이다. 다른 유용한 진균 터미네이터는 A. 니게르 또는 A. 아와모리 글루코아밀라아제 핵산으로부터의 터미네이터를 포함한다 (Nunberg 등, Mol. Cell Biol. 4:2306-2315, 1984 및 Boel 등, EMBO J. 3:1581-1585, 1984; 특히 진균 터미네이터에 대해 그 전문이 참고문헌으로 각각 포함됨). 임의로는, 종결 위치가 포함될 수 있다. 폴리펩티드의 효과적 발현을 위하여, 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA는 개시 코돈을 통해 발현이 적절한 메신저 RNA의 형성을 야기하도록 선택된 발현 조절 부위에 작동가능하게 연결된다.
일부 구현예에서는, 프로모터, 코딩 부위, 및 터미네이터는 모두 발현될 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 또는 MVA 경로 핵산으로부터 기원한다. 일부 구현예에서는, 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 또는 MVA 경로 핵산에 대한 코딩 부위는 발현 구성 프로모터 및 터미네이터 서열의 전사적 조절 하에 있도록 범용 발현 벡터에 삽입된다. 일부 구현예에서는, 유전자 또는 이의 부분은 강력한 cbh1 프로모터의 삽입된 하류이다.
이소프렌 신타아제, DXS, IDI 또는 MVA 경로 핵산은 표준 기술을 사용하여 발현 벡터와 같은 벡터에 통합될 수 있다 (Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982; 특히 적절한 DNA 서열의 스크리닝 및 벡터의 구성에 대해 그 전문이 참고문헌으로 포함됨). 관심 핵산 (예를 들어 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 또는 MVA 경로 핵산), 프로모터, 터미네이터 및 기타 서열을 포함하는 DNA 구성물을 라이게이션하고 이들을 적합한 벡터에 삽입하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 제한 효소는 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 또는 MVA 경로 핵산 및 벡터를 절단하는데 사용될 수 있다. 이후, 절단된 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 또는 MVA 경로 핵산, 및 절단된 벡터의 양립성 말단이 라이게이션될 수 있다. 일반적으로, 편리한 제한 위치에서의 라이게이션에 의해 연결이 일어난다. 이러한 위치가 존재하지 않는다면, 통상적인 실행에 따라 합성 올리고뉴클레오티드 링커를 사용한다 (Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, 1989, 및 Bennett and Lasure, More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, San Diego, pp 70-76, 1991; 특히 올리고뉴클레오티드 링커에 대해 그 전문이 참고문헌으로 각각 포함됨). 추가적으로, 벡터는 알려진 재조합 기술을 사용하여 구성될 수 있다 (예를 들어, Invitrogen Life Technologies, Gateway Technology).
일부 구현예에서는, 자연 발생적 세포에서 현재 발견되는 것보다 더 높은 수준으로 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 또는 MVA 경로 핵산을 과발현시키는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 결과는 이들 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 멀티카피 플라스미드 내로 선택적으로 클로닝하거나 이들 핵산을 강력한 유도성 또는 항시성 프로모터 하에 둠으로써 성취될 수 있다. 바람직한 폴리펩티드를 과발현시키는 방법은 통상적이고 분자 생물학계에 잘 알려져 있으며, 그 예를 [Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, 1989] (특히 클로닝 기술에 대해 그 전문이 참고문헌으로 포함됨)에서 발견할 수 있다.
하기의 원천은 본 발명에 따른 유용한 추가적인 일반적 방법론의 설명을 포함한다: Kreigler, Gene Transfer and Expression; A Laboratory Manual, 1990 및 Ausubel 등, Eds. Current Protocols in Molecular Biology, 1994 (특히 분자 생물학 및 클로닝 기술에 대해 그 전문이 참고문헌으로 각각 포함됨).
예시적 공급원 유기체
이소프렌 신타아제, DXS, IDI 또는 MVA 경로 핵산 (및 이의 인코딩된 폴리펩티드)는 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 및/또는 MVA 경로 핵산을 자연적으로 함유하는 임의 유기체로부터 수득될 수 있다. 상기 나타낸 바와 같이, 이소프렌은 세균, 효모, 식물 및 동물과 같은 다양한 유기체에 의해 자연적으로 형성된다. 유기체는 이소프렌을 생성하기 위해 MVA 경로, DXP 경로, 또는 MVA 및 DXP 경로 모두를 포함한다 (도 19). 따라서 DXS 핵산은 예를 들어, DXP 경로를 포함하거나 MVA 및 DXP 경로를 모두 포함하는 임의 유기체로부터 수득될 수 있다. IDI 및 이소프렌 신타아제 핵산은 예를 들어, MVA 경로, DXP 경로, 또는 MVA 및 DXP 경로 모두를 포함하는 임의 유기체로부터 수득될 수 있다. MVA 경로 핵산은 예를 들어, MVA 경로를 포함하거나 MVA 및 DXP 경로를 모두 포함하는 임의의 유기체로부터 수득될 수 있다.
일부 구현예에서는, 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 또는 MVA 경로 핵산의 핵산 서열은 자연에서의 하기 임의의 유기체에 의해 생성되는 핵산의 서열과 동일하다. 일부 구현예에서는, 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 또는 MVA 경로 폴리펩티드의 아미노산 서열은 자연에서의 하기 임의의 유기체에 의해 생성되는 폴리펩티드의 서열과 동일하다. 일부 구현예에서는, 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 또는 MVA 경로 핵산 또는 폴리펩티드는 본원에서 기재된 임의 유기체에서 유래하는 돌연변이체 핵산 또는 폴리펩티드이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "~에서 유래하는"은 하나 이상의 돌연변이가 도입되는 핵산 또는 폴리펩티드의 공급원을 나타낸다. 예를 들어, "식물 폴리펩티드에서 유래하는" 폴리펩티드는 하나 이상의 돌연변이가 야생형 식물 폴리펩티드의 서열 (즉 자연적으로 발생하는 서열)에 도입되어 야기되는 관심 폴리펩티드를 나타낸다.
일부 구현예에서는, 공급원 유기체는 진균이며 이의 예는 A. 오리자에 및 A. 니게르와 같은 아스페르길루스 종, S. 세레비지에 (S. cerevisiae)와 같은 사카로마이세스 종, S. 폼베 (S. pombe)와 같은 시조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces) 종, 및 T. 레에세이와 같은 트리코데르마 종이다. 일부 구현예에서는, 공급원 유기체는 필라멘트성 진균 세포이다. 용어 "필라멘트성 진균"은 유미코티나 아문 (subdivision Eumycotina)의 모든 필라멘트성 형태를 나타낸다 (Alexopoulos, C. J. (1962), Introductory Mycology, Wiley, New York 참조). 이들 진균은 키틴, 셀룰로오스 및 기타 복합 다당류로 이루어지는 세포벽을 갖는 영양 (vegetative) 균사체를 특징으로 한다. 필라멘트성 진균은 형태학적, 생리학적 및 유전적으로 효모와 구별된다. 필라멘트성 진균의 영양 성장은 균사 연장에 의한 것이며 탄소 이화작용은 절대 호기성이다. 필라멘트성 진균 모세포는 비제한적으로 트리코데르마 (예를 들어 트리코데르마 레에세이, 이전에 T. 롱기브라키아툼 (T. longibrachiatum)으로 분류되었던 무성형 하이포크레아 제코리나 (Hypocrea jecorina), 트리코데르마 비리데 (Trichoderma viride), 트리코데르마 코닌지 (Trichoderma koningii), 트리코데르마 하르지아눔 (Trichoderma harzianum)) (Sheir-Neirs 등., Appl. Microbiol. Biotechnol 20: 46-53, 1984; ATCC No. 56765 및 ATCC No. 26921); 페니실리움 종 (Penicillium sp.), 후미콜라 종 (Humicola sp.) (예를 들어 H. 인솔렌스 (H. insolens), H. 라누기노세 (H. lanuginose) 또는 H. 그리세아 (H. grisea)); 크리소스포리움 종 (Chrysosporium sp.) (예를 들어 C. 루크노웬세 (C. lucknowense)), 글리오클라디움 종 (Gliocladium sp.), 아스페르길루스 종 (예를 들어 A. 오리자에, A. 니게르, A. 소자에 (A. sojae), A. 자포니쿠스 (A. japonicus), A. 니둘란스 또는 A. 아와모리) (Ward 등, Appl. Microbiol. Biotechnol. 39: 7380743, 1993, 및 Goedegebuur 등, Genet 41: 89-98, 2002), 푸사리움 종 (Fusarium sp.) (예를 들어 F. 로세움 (F. roseum), F. 그라미눔 (F. graminum), F. 세레알리스 (F. cerealis), F. 옥시스포리움 (F. oxysporuim) 또는 F. 베네나툼 (F. venenatum)), 뉴로스포라 종 (Neurospora sp.) (예를 들어 N. 크라사 (N. crassa)), 하이포크레아 종 (Hypocrea sp.), 무코르 종 (Mucor sp.) (예를 들어 M. 미에헤이 (M. miehei)), 리조푸스 종 (Rhizopus sp.) 및 에메리셀라 종 (Emericella sp.) (또한 Innis 등, Sci. 228: 21-26, 1985 참조)의 종의 세포일 수 있다. 용어 "트리코데르마" 또는 "트리코데르마 종 (sp. 또는 spp.)"은 트리코데르마로 이전에 또는 현재 분류된 임의의 진균 속을 나타낸다.
일부 구현예에서는, 진균은 A. 니둘란스, A. 아와모리, A. 오리자에, A. 아쿠레아투스 (A. aculeatus), A. 니게르, A. 자포니쿠스, T. 레에세이, T. 비리데, F. 옥시스포룸 (F. oxysporum) 또는 F. 솔라니 (F. solani)이다. 아스페르길루스 종은 특히 진균에 대해 그 전문이 참고문헌으로 각각 포함되는 [Ward 등, Appl. Microbiol. Biotechnol. 39:738-743, 1993] 및 [Goedegebuur 등, Curr Gene 41: 89-98, 2002]에 개시된다. 특정 구현예에서는, 진균은 T. 레에세이의 종과 같은 트리코데르마 종이다. T. 레에세이의 종은 알려져 있으며 비제한적 예로 ATCC 번호 13631, ATCC 번호 26921, ATCC 번호 56764, ATCC 번호 56765, ATCC 번호 56767 및 NRRL 15709 (특히 T. 레에세이에 대해 그 전문이 참고문헌으로 각각 포함됨)를 포함한다. 일부 구현예에서는, 숙주 종은 RL-P37의 유도체이다. RL-P37은 특히 T. 레에세이 종에 대해 그 전문이 참고문헌으로 포함되는 [Sheir-Neiss 등, Appl. Microbiol. Biotechnology 20:46-53, 1984]에 개시된다.
일부 구현예에서는, 공급원 유기체는 사카로마이세스 종, 시조사카로마이세스 종, 피키아 종 또는 칸디다 종 (Candida sp.)과 같은 효모이다.
일부 구현예에서는, 공급원 유기체는 B. 리체니포르미스 (B. licheniformis) 또는 B. 서브틸리스와 같은 바실러스 종, P. 시트레아 (P. citrea)와 같은 판토에아 종, P. 알칼리게네스 (P. alcaligenes)와 같은 슈도모나스 (Pseudomonas) 종, S. 알부스, S. 리비단스 또는 S. 루비기노수스 (S. rubiginosus)와 같은 스트렙토마이세스 종, 또는 대장균과 같은 에스케리키아 종이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "바실러스 속"은 당업자에게 알려진 바와 같은 "바실러스" 속 내의 모든 종을 포함하며 비제한적으로 B. 서브틸리스, B. 리체니포르미스, B. 렌투스 (B. lentus), B. 브레비스 (B. brevis), B. 스테아로써모필루스 (B. stearothermophilus), B. 알칼로필루스 (B. alkalophilus), B. 아밀로리쿠에파시엔스 (B. amyloliquefaciens), B. 클라우시 (B. clausii), B. 할로두란스 (B. halodurans), B. 메가테리움 (B. megaterium), B. 코아굴란스 (B. coagulans), B. 써쿨란스 (B. circulans), B. 라우투스 (B. lautus) 및 B. 투링기엔시스 (B. thuringiensis)를 포함한다. 바실러스 속이 분류학적 개편을 계속하여 거치고 있다는 것이 인지된다. 따라서, 속에는 현재 "지오바실러스 스테아로써모필루스 (Geobacillus stearothermophilus)"로 명명되는 B. 스테아로써모필루스와 같은 유기체를 비제한적으로 포함하는 재분류된 종이 포함되는 것으로 의도된다. 산소의 존재 하에 내성 내생포자가 생성되는 것은 바실러스 속의 특징을 정의하는 것으로 고려되지만, 이러한 특징은 또한 최근 명명된 알리시클로바실러스 (Alicyclobacillus), 암피바실러스 (Amphibacillus), 아뉴리니바실러스 (Aneurinibacillus), 아녹시바실러스 (Anoxybacillus), 브레비바실러스 (Brevibacillus), 필로바실러스 (Filobacillus), 그라실리바실러스 (Gracilibacillus), 할로바실러스 (Halobacillus), 파에니바실러스 (Paenibacillus), 살리바실러스 (Salibacillus), 써모바실러스 (Thermobacillus), 우레이바실러스 (Ureibacillus) 및 비르기바실러스 (Virgibacillus)에 적용된다.
일부 구현예에서는, 공급원 유기체는 그람 양성 세균이다. 비제한적인 예에는 스트렙토마이세스 종 (예를 들어 S. 알부스, S. 리비단스, S. 코에리콜로르 (S. coelicolor) 또는 S. 그리세우스 (S. griseus)) 및 바실러스 종이 포함된다. 일부 구현예에서는, 공급원 유기체는 대장균 또는 슈도모나스 종과 같은 그람 음성 세균이다.
일부 구현예에서는, 공급원 유기체는 콩아과와 같은 콩과 식물과 같은 식물이다. 일부 구현예에서는, 공급원 유기체는 쿠주, 포플러 (포풀루스 알바 x 트레물라 CAC35696 또는 포풀루스 알바) (Sasaki 등, FEBS Letters 579(11): 2514-2518, 2005), 아스펜 (예를 들어 포풀루스 트레물로이데스) 또는 쿠에르쿠스 로부르이다.
일부 구현예에서는, 공급원 유기체는 녹조류, 홍조류, 글라우코피트 (glaucophyte), 클로라라크니오피트 (chlorarachniophyte), 유글레니드 (euglenid), 크로미스타 (chromista) 또는 디노플라젤레이트 (dinoflagellate)와 같은 조류이다.
일부 구현예에서는, 공급원 유기체는 형태학을 기준으로 임의의 하기 군으로 분류되는 남세균 (cyanobacteria)과 같은 남세균이다: 크로오코칼레스 (Chroococcales), 플레우로캅살레스 (Pleurocapsales), 오스실라토리알레스 (Oscillatoriales), 노스토칼레스 (Nostocales) 또는 스티고네마탈레스 (Stigonematales).
예시적 숙주 세포
다양한 숙주 세포가 사용되어 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 및/또는 MVA 경로 폴리펩티드를 발현시키고 발명에 청구된 방법으로 이소프렌을 생성시킬 수 있다. 예시적 숙주 세포는 제목 "예시적 공급원 유기체" 하의 이전 부분에 열거된 임의의 유기체로부터의 세포를 포함한다. 숙주 세포는 자연적으로 이소프렌을 생성하는 세포 또는 자연적으로 이소프렌을 생성하지 않는 세포일 수 있다. 일부 구현예에서는, 숙주 세포는 DXP 경로를 사용하여 자연적으로 이소프렌을 생성하고, 이러한 경로를 사용하는 이소프렌의 생성이 강화되도록 이소프렌 신타아제, DXS 및/또는 IDI 핵산이 첨가된다. 일부 구현예에서는, 숙주 세포는 MVA 경로를 사용하여 자연적으로 이소프렌을 생성하고, 이러한 경로를 사용하는 이소프렌의 생성이 강화되도록 이소프렌 신타아제 및/또는 하나 이상의 MVA 경로 핵산이 첨가된다. 일부 구현예에서는, 숙주 세포는 DXP 경로를 사용하여 자연적으로 이소프렌을 생성하고, MVA 경로 뿐 아니라 DXP 경로의 일부 또는 전부를 사용하여 이소프렌이 생성되도록 하나 이상의 MVA 경로 핵산이 첨가된다. 일부 구현예에서는, 숙주 세포는 DXP 및 MVA 경로 모두를 사용하여 자연적으로 이소프렌을 생성하고, 이들 경로 중 하나 또는 둘 모두에 의한 이소프렌의 생성이 강화되도록 하나 이상의 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 또는 MVA 경로 핵산이 첨가된다.
예시적 형질전환 방법
이소프렌 신타아제, DXS, IDI 및/또는 MVA 경로 핵산 또는 이를 함유하는 벡터는 인코딩된 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 및/또는 MVA 경로 폴리펩티드의 발현을 위한 표준 기술을 사용하여 숙주 세포 (예를 들어 본원에 기재된 식물 세포, 진균 세포, 효모 세포 또는 세균 세포)에 삽입될 수 있다. DNA 구성물 또는 벡터를 숙주 세포에 도입하는 것은 형질전환, 전기천공, 핵 미량주사, 형질도입, 트랜스펙션 (예를 들어, 리포펙틴 매개 또는 DEAE-덱스트린 매개 트랜스펙션 또는 재조합 파지 바이러스를 사용하는 트랜스펙션), 인산칼슘 DNA 침전물로의 인큐베이션, DNA-코팅된 미세사출물로의 고속 충격 및 원형질체 융합과 같은 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 일반적인 형질전환 기술은 당업계에 알려져 있다 (예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel 등. (eds) Chapter 9, 1987; Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, 1989; 및 Campbell 등, Curr. Genet. 16:53-56, 1989 참조; 특히 형질전환 방법에 대해 그 전문이 참고문헌으로 각각 포함됨). 트리코데르마에서의 이종 폴리펩티드의 발현은 미국 특허 제 6,022,725 호; 미국 특허 제 6,268,328 호; 미국 특허 제 7,262,041 호; WO 2005/001036; Harkki 등; Enzyme Microb. Technol. 13:227-233, 1991; Harkki 등, Bio Technol. 7:596-603, 1989; EP 244,234; EP 215,594; 및 Nevalainen 등, "The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous and Heterologous Genes" in Molecular Industrial Mycology, Eds. Leong and Berka, Marcel Dekker Inc., NY pp. 129-148, 1992 에 기재되며, 이는 특히 형질전환 및 발현 방법에 대해 그 전문이 참고문헌으로 각각 포함된다. 또한, 아스페르길루스 종의 형질전환에 대해 [Cao 등, (Sci. 9:991-1001, 2000; EP 238023; 및 Yelton 등, Proceedings. Natl. Acad. Sci. USA 81:1470-1474, 1984] (특히 형질전환 방법에 대해 그 전문이 참고문헌으로 각각 포함됨)이 참고된다. 도입된 핵산은 염색체 DNA에 융합되거나 염색체외 복제 서열로서 유지된다.
당업계에 알려진 임의 방법이 형질전환체를 선택하는데 사용될 수 있다. 비제한적인 한 예에서 amdS 마커를 포함하는 안정적 형질전환체는, 아세트아미드를 함유하는 고체 배양 배지에서 불완전한 외형보다는 매끄러운 외형을 갖는 원형 콜로니의 형성 및 빠른 성장 속도에 의해 불안정적 형질전환체와 구별된다. 추가적으로 일부 경우에서는, 고체 비선택 배지 (예를 들어 아세트아미드가 결여된 배지)에서의 형질전환체의 성장, 이러한 배양 배지로부터의 포자 수확, 및 이후 아세트아미드를 함유하는 선택 배지에서 발아 및 성장하는 이들 포자의 %의 측정에 의해 안정성의 추가적인 시험이 수행된다.
일부 구현예에서는, 진균 세포는 원형질체 형성 및 원형질체의 형질전환, 이후 알려진 방식으로의 세포벽 재생을 포함하는 방법에 의해 형질전환된다. 한 특정 구현예에서, 형질전환을 위한 트리코데르마 종의 제조는 진균 균사체로부터의 원형질체의 제조를 포함한다 (Campbell 등, Curr. Genet. 16:53-56, 1989; 특히 형질전환 방법에 대해 그 전문이 참고문헌으로 포함됨). 일부 구현예에서는, 균사체는 발아된 영양 포자로부터 수득된다. 균사체는 세포벽을 소화하여 원형질체를 야기하는 효소로 처리된다. 이후 원형질체는 현탁 배지에서 삼투압 안정화제의 존재에 의해 보호된다. 이들 안정화제는 소르비톨, 만니톨, 염화칼륨, 황화마그네슘 등을 포함한다. 통상적으로 이들 안정화제의 농도는 0.8 M 내지 1.2 M로 가변적이다. 현탁 배지에서 약 1.2 M 용액의 소르비톨을 사용하는 것이 바람직하다.
DNA를 숙주 트리코데르마 종에 흡수시키는 것은 칼슘 이온 농도에 의존적이다. 일반적으로 약 10 mM CaCl2 내지 50 mM CaCl2가 흡수 용액에 사용된다. 흡수 용액에서의 칼슘 이온에 추가로, 일반적으로 포함되는 다른 화합물은 TE 완충액 (10 mM Tris, pH 7.4; 1 mM EDTA) 또는 10 mM MOPS, pH 6.0 완충액 (몰포린프로판설폰산) 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 완충 시스템이다. 어떠한 특정 이론에도 얽매이지 않는 것으로 의도되지만, 폴리에틸렌 글리콜이 세포막이 융합하도록 작용함으로써 배지의 내용물이 트리코데르마 종의 세포질에 전달되고 플라스미드 DNA가 핵에 전달된다고 믿어진다. 이러한 융합은 종종 숙주 염색체에 융합된 다수 카피의 플라스미드 DNA를 남긴다.
통상적으로 105 내지 107/㎖ (예를 들어 2 x 106/㎖)의 밀도로 투과성 처리된 트리코데르마 종 원형질체 또는 세포를 함유하는 현탁액이 형질전환에 사용된다. 적절한 용액 (예를 들어 1.2 M 소르비톨 및 50 mM CaCl2) 내의 이들 원형질체 또는 세포의 100 ㎕ 부피를 원하는 DNA와 혼합한다. 일반적으로, 높은 농도의 PEG가 흡수 용액에 첨가된다. 0.1 내지 1 부피의 25% PEG 4000이 원형질체 현탁액에 첨가될 수 있다. 일부 구현예에서는, 약 0.25 부피가 원형질체 현탁액에 첨가된다. 디메틸 설폭시드, 헤파린, 스페르미딘, 염화칼륨 등과 같은 첨가제가 또한 흡수 용액에 첨가되고 형질전환을 보조할 수 있다. 유사한 절차가 다른 진균 숙주 세포에 대해서 활용가능하다 (예를 들어 미국 특허 제 6,022,725 및 6,268,328; 특히 형질전환 방법에 대해 그 전문이 참고문헌으로 각각 포함됨).
일반적으로, 혼합물은 이후 10분 내지 30분의 기간 동안 약 0℃에서 배양된다. 이후 추가적인 PEG를 혼합물에 첨가하여 원하는 핵산 서열의 흡수를 추가적으로 강화시킨다. 25% PEG 4000은 일반적으로 형질전환 혼합물 부피의 5 내지 15배의 부피로 첨가되지만; 더 크고 적은 부피가 적합할 수 있다. 25% PEG 4000은 바람직하게는 형질전환 혼합물 부피의 약 10배이다. PEG가 첨가된 후, 형질전환 혼합물은 소르비톨 및 CaCl2 용액을 첨가하기 전에 실온 또는 얼음 상에서 배양된다. 이후 원형질체 현탁액을 성장 배지의 용융 분취액에 추가로 첨가한다. 성장 배지가 성장 선택물 (예를 들어 아세트아미드 또는 항생제)을 포함하는 경우, 이는 형질전환체만이 성장하게 한다.
세균 세포의 형질전환은 예를 들어 특히 형질전환 방법에 대해 그 전문이 참고문헌으로 포함되는 [Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982]에 기재된 바와 같은 통상적인 방법에 따라 수행될 수 있다.
예시적 세포 배양 배지
본 발명은 또한 이소프렌을 생성하는 배양물 내의 세포 집단 또는 세포를 포함한다. "배양물 내의 세포"는 세포가 하나 이상의 세포 분열을 거치도록 하는 용액 (예를 들어 세포 배지) 내의 둘 이상의 세포를 의미한다. "배양물 내의 세포"에는 식물 조직으로 분화된 세포를 함유하는 살아있는 다세포성 식물의 일부인 식물 세포가 포함되지 않는다. 다양한 구현예에서, 세포 배양물에는 적어도 또는 약 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1,000, 5,000, 10,000개 이상의 세포가 포함된다.
임의의 탄소원이 숙주 세포를 배양하는데 사용될 수 있다. 용어 "탄소원"은 숙주 세포 또는 유기체에 의해 신진 대사될 수 있는 하나 이상의 탄소-함유 화합물을 나타낸다. 예를 들어, 숙주 세포를 배양하는데 사용되는 세포 배지는 숙주 세포의 생존성 또는 성장을 유지시키기에 적합한 임의의 탄소원을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서는, 탄소원은 탄수화물 (예를 들어 단당류, 이당류, 올리고당류 또는 다당류), 반전당 (예를 들어 효소적으로 처리된 수크로오스 시럽), 글리세롤, 글리세린 (예를 들어 바이오디젤 또는 비누-제조 공정의 글리세린 부산물), 디하이드록시아세톤, 1-탄소원, 오일 (예를 들어 옥수수유, 야자유 또는 콩기름과 같은 식물 또는 야채 오일), 아세테이트, 동물성 지방, 동물성 오일, 지방산 (예를 들어 포화 지방산, 불포화 지방산 또는 다중불포화 지방산), 지질, 인지질, 글리세롤지질, 모노글리세리드, 디글리세리드, 트리글리세리드, 폴리펩티드 (예를 들어 미생물 또는 식물 단백질 또는 펩티드), 재생가능 탄소원 (예를 들어 가수분해된 바이오매스 탄소원과 같은 바이오매스 탄소원), 효모 추출물, 효모 추출물로부터의 성분, 중합체, 산, 알코올, 알데히드, 케톤, 아미노산, 숙시네이트, 락테이트, 아세테이트, 에탄올 또는 전술한 것 중 둘 이상의 임의 조합이다. 일부 구현예에서는, 탄소원은 비제한적으로 글루코오스를 포함하는 광합성의 산물이다. 일부 구현예에서, 탄수화물은 자일로오스 또는 글루코오스이다.
예시적 단당류는 글루코오스 및 프룩토오스를 포함한다; 예시적 올리고당류는 락토오스 및 수크로오스를 포함하고, 예시적 다당류는 녹말 및 셀룰로오스를 포함한다. 예시적 탄수화물은 C6 당 (예를 들어 프룩토오스, 만노오스, 갈락토오스 또는 글루코오스) 및 C5 당 (예를 들어 자일로오스 또는 아라비노오스)을 포함한다. 일부 구현예에서는, 세포 배지는 탄수화물 뿐 아니라 탄수화물 외의 탄소원 (예를 들어 글리세롤, 글리세린, 디하이드록시아세톤, 1-탄소원, 오일, 동물성 지방, 동물성 오일, 지방산, 지질, 인지질, 글리세롤지질, 모노글리세리드, 디글리세리드, 트리글리세리드, 재생가능 탄소원, 또는 효모 추출물로부터의 성분)을 포함한다. 일부 구현예에서는, 세포 배지는 탄수화물 뿐 아니라 폴리펩티드 (예를 들어 미생물 또는 식물 단백질 또는 펩티드)를 포함한다. 일부 구현예에서는, 미생물 폴리펩티드는 효모 또는 세균으로부터의 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서는, 식물 폴리펩티드는 콩, 옥수수, 카놀라, 자트로파, 야자, 땅콩, 해바라기, 코코넛, 겨자, 평지씨, 목화씨, 야자 핵, 올리브, 잇꽃, 참깨 또는 아마인으로부터의 폴리펩티드이다.
일부 구현예에서는, 탄수화물의 농도는 적어도 또는 약 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 300, 400 g/L 이상과 같은 브로쓰 ℓ 당 적어도 또는 약 5 g 이상이다 (g/L, 브로쓰의 부피에는 세포 배지의 부피 및 세포의 부피가 모두 포함됨). 일부 구현예에서는, 탄수화물의 농도는 약 50 내지 약 400 g/L, 예를 들어 약 100 내지 약 360 g/L, 약 120 내지 약 360 g/L, 또는 약 200 내지 약 300 g/L이다. 일부 구현예에서는, 탄수화물의 농도는 숙주 세포의 배양 전 및/또는 배양 동안에 첨가되는 탄수화물 총량을 포함한다.
예시적 지질은 포화, 불포화 또는 분지된 C4 및 초과의 지방산인 하나 이상의 지방산을 함유하는 임의의 물질이다.
예시적 오일은 실온에서 액체인 지질이다. 일부 구현예에서는, 지질은 하나 이상의 C4 또는 초과의 지방산을 함유한다 (예를 들어, 4개 이상의 탄소를 갖는 하나 이상의 포화, 불포화 또는 분지된 지방산을 함유). 일부 구현예에서는, 오일은 콩, 옥수수, 카놀라, 자트로파, 야자, 땅콩, 해바라기, 코코넛, 겨자, 평지씨, 목화씨, 야자 핵, 올리브, 잇꽃, 참깨, 아마인, 유질 미생물 세포, 중국 수지 (Chinese tallow), 또는 전술한 것 중 둘 이상의 임의 조합으로부터 수득된다.
예시적 지방산은 "R"이 탄화수소인 화학식 RCOOH의 화합물을 포함한다. 예시적 불포화 지방산은 "R"이 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 포함하는 화합물을 포함한다. 예시적 불포화 지방산은 비제한적으로, 올레산, 박센산, 리놀렌산, 팔미텔라이딘산 및 아라키돈산을 포함한다. 예시적 다중불포화 지방산은 "R"이 다수의 탄소-탄소 이중 결합을 포함하는 화합물을 포함한다. 예시적 포화 지방산은 "R"이 포화 지방족기인 화합물을 포함한다. 일부 구현예에서는, 탄소원은 하나 이상의 C12-C22 지방산, 예를 들어 C12 포화 지방산, C14 포화 지방산, C16 포화 지방산, C18 포화 지방산, C20 포화 지방산 또는 C22 포화 지방산을 포함한다. 예시적 구현예에서는 지방산이 팔미트산이다. 일부 구현예에서는, 탄소원은 지방산 (예를 들어 불포화 지방산)의 염, 지방산 (예를 들어 불포화 지방산)의 유도체 또는 지방산 (예를 들어 불포화 지방산)의 유도체의 염이다. 적합한 염은 비제한적으로 리튬 염, 칼륨 염, 나트륨 염 등을 포함한다. 디- 및 트리글리세롤은 글리세롤의 지방산 에스테르이다.
일부 구현예에서는, 지질, 오일, 지방, 지방산, 모노글리세리드, 디글리세리드 또는 트리글리세리드의 농도는 적어도 또는 약 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 300, 400 g/L 이상과 같은 브로쓰 ℓ 당 적어도 또는 약 1 g (g/L, 브로쓰의 부피에는 세포 배지의 부피 및 세포의 부피가 모두 포함됨)이다. 일부 구현예에서는, 지질, 오일, 지방, 지방산, 모노글리세리드, 디글리세리드 또는 트리글리세리드의 농도는 약 10 내지 약 400 g/L, 예를 들어 약 25 내지 약 300 g/L, 약 60 내지 약 180 g/L, 또는 약 75 내지 약 150 g/L이다. 일부 구현예에서는, 농도는 숙주 세포 배양 전 및/또는 배양 동안 첨가되는 지질, 오일, 지방, 지방산, 모노글리세리드, 디글리세리드 또는 트리글리세리드 총량을 포함한다. 일부 구현예에서는, 탄소원은 (i) 지질, 오일, 지방, 지방산, 모노글리세리드, 디글리세리드 또는 트리글리세리드 및 (ii) 글루코오스와 같은 탄수화물을 모두 포함한다. 일부 구현예에서는, 지질, 오일, 지방, 지방산, 모노글리세리드, 디글리세리드 또는 트리글리세리드 대 탄수화물의 비율은 탄소 기준으로 약 1:1이다 (즉, 탄수화물 탄소 당 지질, 오일, 지방, 지방산, 모노글리세리드, 디글리세리드 또는 트리글리세리드 내의 하나의 탄소). 특정 구현예에서, 지질, 오일, 지방, 지방산, 모노글리세리드, 디글리세리드 또는 트리글리세리드의 양은 약 60 내지 180 g/L이고, 탄수화물의 양은 약 120 내지 360 g/L이다.
예시적 미생물 폴리펩티드 탄소원은 효모 또는 세균으로부터의 하나 이상의 폴리펩티드를 포함한다. 예시적 식물 폴리펩티드 탄소원은 콩, 옥수수, 카놀라, 자트로파, 야자, 땅콩, 해바라기, 코코넛, 겨자, 평지씨, 목화씨, 야자 핵, 올리브, 잇꽃, 참깨 또는 아마인으로부터의 하나 이상의 폴리펩티드를 포함한다.
예시적 재생가능 탄소원은 치즈 유장 투과물, 옥수수 침지수, 사탕무 당밀, 보리 맥아, 및 전술한 임의의 것으로부터의 성분을 포함한다. 예시적 재생가능 탄소원은 또한 옥수수, 지팽이풀 (switchgrass), 사탕수수, 발효 공정의 세포 폐기물, 및 콩, 옥수수 또는 밀의 제분으로부터의 단백질 부산물과 같은 바이오매스 내에 존재하는 아세테이트, 글루코오스, 헥소오스, 펜토오스 및 자일로오스를 포함한다. 일부 구현예에서는, 바이오매스 탄소원은 비제한적으로 풀, 밀, 밀짚, 바가스, 사탕수수 바가스, 침엽수 펄프, 옥수수, 옥수수 속대 또는 껍질 (husk), 옥수수 핵 (corn kernel), 옥수수 핵으로부터의 섬유, 옥수수대, 지팽이풀, 벼 외피 산물, 또는 곡물 (예를 들어 옥수수, 수수, 호밀, 트리티케이트 (triticate), 보리, 밀, 및/또는 증류 곡물)의 습식 또는 건식 제분으로부터의 부산물과 같은 리그노셀룰로오스, 헤미셀룰로오스 또는 셀룰로오스 물질이다. 예시적 셀룰로오스 물질은 목재, 종이 및 펄프 폐기물, 초본 식물 및 과일 펄프를 포함한다. 일부 구현예에서는, 탄소원은 줄기, 낟알, 뿌리 또는 덩이줄기와 같은 임의 식물 부분을 포함한다. 일부 구현예에서는, 임의의 하기 식물의 전부 또는 일부가 탄소원으로서 사용된다: 옥수수, 밀, 호밀, 수수, 트리티테케이트, 쌀, 기장, 보리, 카사바, 콩, 완두와 같은 콩류, 감자, 고구마, 바나나, 사탕수수 및/또는 타피오카. 일부 구현예에서는, 탄소원은 자일로오스 및 글루코오스를 모두 포함하거나 수크로오스 및 글루코오스를 모두 포함하는 바이오매스 가수분해물과 같은 바이오매스 가수분해물이다.
일부 구현예에서는, 재생가능 탄소원 (예를 들어 바이오매스)은 세포 배양 배지에 첨가되기 전 사전처리된다. 일부 구현예에서는, 사전처리는 효소적 사전처리, 화학적 사전처리 또는 효소적 및 화학적 사전처리 모두의 조합을 포함한다 (예를 들어 Farzaneh 등, Bioresource Technology 96 (18): 2014-2018, 2005; 미국 특허 제 6,176,176 호; 미국 특허 제 6,106,888 호; 특히 재생가능 탄소원의 사전처리에 대해 그 전문이 참고문헌으로 각각 포함됨). 일부 구현예에서는, 재생가능 탄소원은 세포 배양 배지에 첨가되기 전 부분적으로 또는 완전히 가수분해된다.
일부 구현예에서는, 재생가능 탄소원 (예를 들어 옥수수대)은 세포 배양 배지에 첨가되기 전 암모니아 섬유 팽창 (AFEX) 사전처리를 거친다 (예를 들어 Farzaneh 등, Bioresource Technology 96 (18): 2014-2018, 2005). AFEX 사전처리 동안, 재생가능 탄소원은 온건한 온도 (예를 들어 약 60 내지 약 100℃) 및 고압 (예를 들어 약 250 내지 약 300 psi)에서 약 5분 동안 액체 무수 암모니아로 처리된다. 이후, 압력을 빠르게 해제시킨다. 이러한 방법에서, 리그닌 용해화, 헤미셀룰로오스 가수분해, 셀룰로오스 탈결정화 및 증가된 표면적의 조합된 화학적 및 물리적 효과는 셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스가 발효가능 당으로 거의 완전하게 효소적으로 변환되게 한다. AFEX 사전처리는 거의 모든 암모니아가 회수되고 재사용될 수 있는 한편, 하류 방법에서 미생물에 대한 질소원으로서 역할하는 것으로 남아있다는 이점을 갖는다. 또한, 세척 흐름은 AFEX 사전처리에 필요하지 않다. 따라서, AFEX 처리 이후 건조 물질 회수는 본질적으로 100%이다. AFEX는 기본적으로 건조 대 건조 방법이다. 처리된 재생가능 탄소원은 장기간에 적합하며, 효소적 가수분해 또는 발효 방법에서 매우 높은 고체 적재로 공급될 수 있다. 셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스는 분해가 없거나 거의 없이 AFEX 방법에서 잘 보존된다. AFEX 사전처리를 거친 재생가능 탄소원의 효소적 가수분해 전에 중화할 필요는 없다. AFEX-처리된 탄소원의 효소적 가수분해는 후속 발효 사용을 위한 깨끗한 당 흐름을 만들어낸다.
일부 구현예에서는, 탄소원 (예를 들어 재생가능 탄소원)의 농도는 적어도 또는 약 0.1, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40 또는 50% 글루코오스 (w/v)와 동등하다. 탄소원으로부터 생성된 글루코오스의 양을 측정하기 위해 참조로서 글루코오스를 사용하는 표준 HPLC 방법을 사용하여 동량의 글루코오스를 측정할 수 있다. 일부 구현예에서는, 탄소원 (예를 들어 재생가능 탄소원)의 농도는 약 0.1 내지 약 20% 글루코오스, 예를 들어 약 0.1 내지 약 10% 글루코오스, 약 0.5 내지 약 10% 글루코오스, 약 1 내지 약 10% 글루코오스, 약 1 내지 약 5% 글루코오스, 또는 약 1 내지 약 2% 글루코오스와 동등하다.
일부 구현예에서는, 탄소원은 효모 추출물 또는 효모 추출물의 하나 이상의 성분을 포함한다. 일부 구현예에서는, 효모 추출물의 농도는 적어도 또는 약 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 300 g/L 이상과 같은 브로쓰의 ℓ 당 효모 추출물 1 g 이상 (g/L, 브로쓰의 부피에는 세포 배지의 부피 및 세포의 부피가 모두 포함됨)이다. 일부 구현예에서는, 효모 추출물의 농도는 약 1 내지 약 300 g/L, 예를 들어 약 1 내지 약 200 g/L, 약 5 내지 약 200 g/L, 약 5 내지 약 100 g/L, 또는 약 5 내지 약 60 g/L이다. 일부 구현예에서는, 농도는 숙주 세포의 배양 전 및/또는 배양 동안에 첨가되는 효모 추출물 총량을 포함한다. 일부 구현예에서는, 탄소원은 효모 추출물 (또는 이의 하나 이상의 성분) 및 글루코오스와 같은 또 다른 탄소원을 모두 포함한다. 일부 구현예에서는, 효모 추출물 대 다른 탄소원의 비율은 약 1:5, 약 1:10 또는 약 1:20 (w/w)이다.
추가적으로 탄소원은 또한 이산화탄소 또는 메탄올과 같은 1-탄소원 기질일 수 있다. 단일 탄소원 (예를 들어 메탄올, 포름알데히드 또는 포르메이트)로부터 글리세롤을 생성하는 것은 메탄올자화 (methylotrophic) 효모 (Yamada 등, Agric. Biol. Chem., 53(2) 541-543, 1989; 특히 탄소원에 대해 그 전문이 참고문헌으로 포함됨) 및 세균 (Hunter 등, Biochemistry, 24, 4148-4155, 1985; 특히 탄소원에 대해 그 전문이 참고문헌으로 포함됨)에서 보고된 바 있다. 이들 유기체는 메탄에서 포르메이트로의 산화 상태 범위에 있는 단일 탄소 화합물을 동화시키고 글리세롤을 생성시킬 수 있다. 탄소 동화의 경로는 리불로오스 모노포스페이트, 세린, 또는 자일루로오스-모노포스페이트를 통한 것일 수 있다 (Gottschalk, Bacterial Metabolism, Second Edition, Springer-Verlag: New York, 1986; 특히 탄소원에 대해 그 전문이 참고문헌으로 포함됨). 리불로오스 모노포스페이트 경로는 포르메이트와 리불로오스-5-포스페이트와의 축합으로 6개 탄소 당이 형성되어 이것이 프룩토오스가 되고 마침내 3탄소 산물 글리세르알데히드-3-포스페이트가 되는 것을 포함한다. 마찬가지로, 세린 경로는 메틸렌테트라하이드로폴레이트를 통해 1-탄소 화합물을 당분해 경로에 동화시킨다.
1 또는 2개의 탄소 기질에 추가로, 메탄올자화 유기체는 메틸아민, 글루코사민 및 대사작용 활성을 위한 다양한 아미노산과 같은 화합물을 함유하는 많은 다른 탄소를 이용하는 것으로 또한 알려져 있다. 예를 들어, 메탄올자화 효모는 메틸아민으로부터의 탄소를 이용하여 트레할로오스 또는 글리세롤을 형성시키는 것으로 알려져 있다 (Bellion 등, Microb. Growth Cl Compd, [Int. Symp.], 7th ed., 415-32. Editors: Murrell 등, Publisher: Intercept, Andover, UK, 1993; 특히 탄소원에 대해 그 전문이 참고문헌으로 포함됨). 유사하게, 다양한 칸디다 종은 알라닌 또는 올레산을 신진 대사시킨다 (Suiter 등, Arch. Microbiol. 153(5), 485-9, 1990; 특히 탄소원에 대해 그 전문이 참고문헌으로 포함됨).
일부 구현예에서는, 세포는 생리적 염 및 영양을 함유하는 표준 배지에서 배양된다 (예를 들어 [Pourquie, J. 등, Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation, eds. Aubert 등, Academic Press, pp. 71-86, 1988] 및 [Ilmen 등, Appl. Environ. Microbiol. 63: 1298-1306, 1997]; 특히 세포 배지에 대해 그 전문이 참고문헌으로 각각 포함됨). 예시적 성장 배지는 루리아 베르타니 (Luria Bertani, LB) 브로쓰, 사브로 덱스트로오스 (Sabouraud Dextrose, SD) 브로쓰, 또는 효모 배지 (Yeast medium, YM) 브로쓰와 같은 상업적으로 제조된 통상적 배지이다. 다른 한정 또는 합성 성장 배지가 또한 사용될 수 있고, 특정 숙주 세포의 성장을 위한 적절한 배지는 미생물 또는 발효 과학계의 당업자에게 알려져 있다.
적절한 탄소원에 추가로, 세포 배지는 바람직하게는 적합한 미네랄, 염, 공동 인자, 완충액, 및 배양물의 성장 또는 이소프렌 생성의 증진에 적합한 당업자에게 알려져 있는 기타 성분을 함유한다 (예를 들어 WO 2004/033646 및 그에 인용된 참고문헌, 및 WO 96/35796 및 그에 인용된 참고문헌; 특히 세포 배지 및 세포 배양 조건에 대해 그 전문이 참고문헌으로 각각 포함됨). 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 및/또는 MVA 경로 핵산이 유도성 프로모터의 조절 하에 있는 일부 구현예에서는 유도제 (예를 들어 당, 금속 염 또는 살균제)를 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 및/또는 MVA 경로 폴리펩티드의 발현을 유도하기에 효과적인 농도로 배지에 첨가하는 것이 바람직하다. 일부 구현예에서는, 세포 배지는 하나 이상의 DXS, IDI 또는 MVA 경로 핵산을 갖는 벡터 상의 항생제 내성 핵산 (예를 들어 카나마이신 내성 핵산)에 상응하는 항생제 (예를 들어 카나마이신)를 갖는다.
예시적 세포 배양 조건
세균 배양물의 유지 및 성장에 적합한 재료 및 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예시적 기술이 [Manual of Methods for General Bacteriology Gerhardt 등, eds), American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1994) 또는 Brock in Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology,초 Edition (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA] (특히 세포 배양 기술에 대해 그 전문이 참고문헌으로 각각 포함됨)에서 발견될 수 있다. 일부 구현예에서는, 세포는 숙주 세포에 삽입된 핵산에 의해 인코딩되는 하나 이상의 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 또는 MVA 경로 폴리펩티드가 발현되게 하는 조건 하에 배양 배지에서 배양된다.
표준 세포 배양 조건이 세포를 배양하는데 사용될 수 있다 (예를 들어 WO 2004/033646 및 그에 인용된 참고문헌; 특히 세포 배양 및 발효 조건에 대해 그 전문이 참고문헌으로 포함됨). 세포는 적절한 온도, 기체 혼합물 및 pH에서 (예를 들어 약 20 내지 약 37℃, 약 6% 내지 약 84% CO2, 및 pH 약 5 내지 약 9에서) 성장하고 유지된다. 일부 구현예에서는, 세포는 적절한 세포 배지에서 35℃에서 성장한다. 일부 구현예에서는, 예를 들어 배양물은 진탕 배양물 또는 발효기 내의 적절한 배지에서 원하는 양의 이소프렌 생성이 달성될 때까지 약 28℃에서 배양된다. 일부 구현예에서는, 발효를 위한 pH 범위는 약 pH 5.0 내지 약 pH 9.0 (예를 들어 약 pH 6.0 내지 약 pH 8.0, 또는 약 6.5 내지 약 7.0)이다. 반응은 숙주 세포의 필요 사항을 기초로 하여 호기성, 무산소 또는 혐기성 조건 하에 수행될 수 있다. 주어진 필라멘트성 진균의 예시적 배양 조건은 당업계에 공지되어 있으며 과학 문헌 및/또는 미국 미생물 보존 센터 (American Type Culture Collection) 및 진균 저장 센터 (Fungal Genetics Stock Center)와 같은 진균 공급원으로부터 발견될 수 있다.
다양한 구현예에서 세포는 회분식 (batch), 유가식 (fed-batch), 또는 연속 공정과 같은 임의 공지된 발효 방식을 사용하여 성장한다. 일부 구현예에서는, 발효의 회분식 방법이 사용된다. 고전적 회분식 발효는 배지의 조성물이 발효의 시작점에서 정해지고 발효 동안 인공적 변경이 가해지지 않는 폐쇄 시스템이다. 따라서, 발효의 시작점에서 세포 배지를 원하는 숙주 세포로 접종하고 발효는 시스템에 아무것도 첨가되지 않도록 한다. 그러나 전형적으로 "회분식" 발효는 탄소원의 첨가에 대한 회분이며 pH 및 산소 농도와 같은 조절 인자에서 이루어지도록 종종 시도된다. 회분식 시스템에서, 시스템의 대사산물 및 바이오매스 조성물은 발효가 중단되는 시간까지 끊임없이 변화한다. 회분식 배양물 내에서, 세포는 정적 지연상에서 고성장 로그상, 및 최종적으로는 성장 속도가 감소되거나 정지하는 정지상을 통해 적절하게 된다. 일부 구현예에서는, 로그상의 세포는 대량의 이소프렌 생성에 책임이 있다. 일부 구현예에서는, 정지상의 세포는 이소프렌을 생성한다.
일부 구현예에서는, 표준 회분식 시스템에 대해 유가식 시스템과 같은 변형이 사용된다. 유가식 발효 방법은 탄소원이 발효 진행으로서의 증가량으로 첨가된다는 것을 제외하고는 전형적인 회분식 시스템을 포함한다. 유가식 발효는 이화 작용 산물 억제가 세포의 신진 대사를 억제하는 경향이 있고 세포 배지 내에 제한된 양의 탄소원을 갖는 것이 바람직한 경우 유용하다. 유가식 발효는 제한된 양 또는 과량의 탄소원 (예를 들어 글루코오스)으로 수행될 수 있다. 유가식 시스템에서의 실제적 탄소원 농도를 측정하는 것은 어려우며, 그러므로 pH, 용존 산소 및 CO2와 같은 폐기 기체의 부분 압력과 같은 측정가능한 요소의 변화를 기준으로 추정된다. 회분식 및 유가식 발효는 통상적이며 당업계에 잘 알려져 있고, 그 예들이 [Brock, Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition (1989) Sinauer Associates, Inc.] (특히 세포 배양 및 발효 조건에 대해 그 전문이 참고문헌으로 포함됨)에서 발견될 수 있다.
일부 구현예에서는, 연속 발효 방법이 사용된다. 연속 발효는 한정된 발효 배지가 생물반응기에 연속적으로 첨가되고 동량의 조건화된 배지가 절차 동안 동시에 제거되는 개방형 시스템이다. 연속 발효는 일반적으로, 세로가 주로 로그상 성장에 있는 일정한 고밀도에서 배양물을 유지시킨다.
연속 발효에서는 세포 성장 또는 이소프렌 생성에 영향을 미치는 한 인자 또는 임의 수의 인자들의 조정이 가능하다. 예를 들어, 한 방법은 고정된 속도에서의 질소 수준 또는 탄소원과 같은 제한 영양을 유지하며 모든 다른 매개변수가 조정되게 한다. 다른 시스템에서, 성장에 영향을 주는 많은 수의 인자가 연속적으로 변경되는 한편 세포 농도 (예를 들어 배지 탁도에 의해 측정되는 농도)는 일정하게 유지된다. 연속 시스템은 항정 상태 성장 조건을 유지하고자 한다. 따라서, 배지의 배수로 인한 세포 유실은 발효에서의 세포 성장 속도에 대해 평형화된다. 연속 발효 방법에 대한 성장 인자 및 영양분을 조정하는 방법 뿐 아니라 생성물 형성 속도를 최대화하는 기술은 산업 미생물학계에 잘 알려져 있으며 다양한 방법들이 [Brock, Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology,초 Edition (1989) Sinauer Associates, Inc.] (특히 세포 배양 및 발효 조건에 대해 그 전문이 참고문헌으로 포함됨)에 상세히 기재된다.
일부 구현예에서 세포는 전체 세포 촉매로서 기질 상에 고정되며, 이소프렌 생성에 대한 발효 조건에 가해진다.
일부 구현예에서는, 산소를 액체에 도입하고 배양물의 균일성을 유지하기 위해 액체 배양물 병을 진탕기에 넣는다. 일부 구현예에서는, 인큐베이터가 온도, 습도, 진탕 속도 및/또는 배양물이 성장하는 기타 조건을 조절하는데 사용된다. 가장 단순한 인큐베이터는 전형적으로 약 65℃까지 상승하는 조정가능한 가열기를 갖는 절연 상자이다. 보다 정교한 인큐베이터는 또한 (냉장을 통해) 온도를 낮추는 능력, 또는 습도 또는 CO2 수준을 조절하는 능력을 포함한다. 대부분의 인큐베이터는 타이머를 포함하며; 일부는 또한 상이한 온도, 습도 수준 등을 통해 순환하도록 프로그래밍될 수 있다. 인큐베이터는 탁상용에서 소규모 방 크기의 유닛까지 그 크기가 다양할 수 있다.
필요하다면, 세포 배지의 일부 또는 전부를 바꾸어 영양분을 다시 채우고/채우거나 잠재적으로 유해한 대사작용 부산물 및 사멸 세포의 축적을 피할 수 있다. 현탁 배양물의 경우, 세포는 현탁 배양물의 원심분리 또는 여과, 및 이후 새로운 배지에 세포를 재현탁함으로써 배지로부터 분리될 수 있다. 점착성 배양물의 경우, 배지를 흡인에 의해 직접적으로 제거하고 대체할 수 있다. 일부 구현예에서는, 세포 배지는 연속 배양물 (예를 들어 희석하지 않은 연속 배양물)에서 적어도 또는 약 5, 10, 20, 40, 50, 60, 65회 이상의 세포 분열 동안 세포의 적어도 일부가 분열되게 한다.
일부 구현예에서는, 항시 또는 누출 프로모터 (예를 들어 Trc 프로모터)가 사용되며 프로모터에 작동가능하게 연결되는 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 또는 MVA 경로 핵산(들)의 발현이 유도되도록 화합물 (예를 들어 IPTG)이 첨가되지 않는다. 일부 구현예에서는, 프로모터에 작동가능하게 연결되는 이소프렌 신타아제, DXS, IDI 또는 MVA 경로 핵산(들)의 발현이 유도되도록 화합물 (예를 들어 IPTG)이 첨가된다.
이소프렌의 예시적 생성
일부 구현예에서는, 세포는 세포에 의해 이소프렌이 생성되게 하는 조건 하에 배양 배지에서 배양된다. "피크 절대 생산성"은 특정 기간의 시간 동안 세포를 배양 (예를 들어 특정 발효 런 동안 세포를 배양)하는 동안의 배출 기체 내에 있는 이소프렌의 최대 절대량을 의미한다. "피크 절대 생산성 시간 지점"은 특정 기간의 시간 동안 세포를 배양 (예를 들어 특정 발효 런 동안 세포를 배양)하는 동안 배출 기체 내의 이소프렌의 절대량이 최대일 때 발효 런 동안의 시간 지점을 의미한다. 일부 구현예에서는, 이소프렌 양은 피크 절대 생산성 시간 지점에서 측정된다. 일부 구현예에서는, 세포에 대한 피크 절대 생산성은 본원에 개시된 임의의 대략적 이소프렌 양이다.
"피크 특이적 생산성"은 특정 기간의 시간 동안 세포를 배양 (예를 들어 특정 발효 런 동안 세포를 배양)하는 동안의 세포 당 생성된 이소프렌의 최대량을 의미한다. "피크 특이적 생산성 시간 지점"은 세포 당 생성된 이소프렌의 양이 최대일 때 특정 기간의 시간 동안 세포를 배양 (예를 들어 특정 발효 런 동안 세포를 배양)하는 동안의 시간 지점을 의미한다. 피크 특이적 생산성은, 600 nm에서의 광학 밀도 (OD600)에 의해 측정되는 바와 같이 총 생산성을 세포량으로 나누어 측정된다. 일부 구현예에서는, 이소프렌 양은 피크 특이적 생산성 시간 지점에서 측정된다. 일부 구현예에서는, 세포에 대한 피크 특이적 생산성은 본원에 개시된 임의의 대략적인 세포 당 이소프렌 양이다.
"피크 체적 생산성"은 특정 기간의 시간 동안 세포를 배양 (예를 들어 특정 발효 런 동안 세포를 배양)하는 동안의 브로쓰의 부피 (세포 및 세포 배지의 부피를 포함) 당 생성된 이소프렌의 최대량을 의미한다. "피크 특이적 체적 생산성 시간 지점"은 브로쓰의 부피 당 생성된 이소프렌의 양이 최대일 때 특정 기간의 시간 동안 세포를 배양 (예를 들어 특정 발효 런 동안 세포를 배양)하는 동안의 시간 지점을 의미한다. 피크 특이적 체적 생산성은 총 생산성을 브로쓰의 부피 및 시간량으로 나누어 측정된다. 일부 구현예에서는, 이소프렌 양은 피크 특이적 체적 생산성 시간 지점에서 측정된다. 일부 구현예에서는, 세포에 대한 피크 특이적 체적 생산성은 본원에 개시된 임의의 대략적인 시간 당 부피 당 이소프렌 양이다.
"피크 농도"는 특정 기간의 시간 동안 세포를 배양 (예를 들어 특정 발효 런 동안 세포를 배양)하는 동안 생성된 이소프렌의 최대량을 의미한다. "피크 농도 시간 지점"은 세포 당 생성된 이소프렌의 양이 최대일 때 특정 기간의 시간 동안 세포를 배양 (예를 들어 특정 발효 런 동안 세포를 배양)하는 동안의 시간 지점을 의미한다. 일부 구현예에서는, 이소프렌 양은 피크 농도 시간 지점에서 측정된다. 일부 구현예에서는, 세포에 대한 피크 농도는 본원에 개시된 임의의 대략적 이소프렌 양이다.
"평균 체적 생산성"은 특정 기간의 시간 동안 세포를 배양 (예를 들어 특정 발효 런 동안 세포를 배양)하는 동안 브로쓰의 부피 (세포 및 세포 배지의 부피를 포함) 당 생성된 이소프렌의 평균량을 의미한다. 평균 체적 생산성은 총 생산성을 브로쓰의 부피 및 시간량으로 나누어 측정된다. 일부 구현예에서는, 세포에 대한 평균 특이적 체적 생산성은 본원에 개시된 임의의 대략적인 시간 당 부피 당 이소프렌 양이다.
"누적 총 생산성"은 특정 기간의 시간 동안 세포를 배양 (예를 들어 특정 발효 런 동안 세포를 배양)하는 동안 생성된 이소프렌의 누적 총량을 의미한다. 일부 구현예에서는 이소프렌의 누적 총량이 측정된다. 일부 구현예에서는, 세포에 대 한 누적 총 생산성은 본원에 개시된 임의의 대략적인 이소프렌 양이다.
일부 구현예에서는, 배양물 내의 세포는 초과로 또는 약 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 5,000, 10,000, 12,500, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 75,000, 100,000, 125,000, 150,000, 188,000 이상의 이소프렌 nmol/세포의 습식 중량에 대한 세포 g/시간 (nmol/gwcm/시간)으로 이소프렌을 생성한다. 일부 구현예에서는, 이소프렌의 양은 약 2 내지 약 200,000 nmol/gwcm/시간, 예를 들어 약 2 내지 약 100 nmol/gwcm/시간, 약 100 내지 약 500 nmol/gwcm/시간, 약 150 내지 약 500 nmol/gwcm/시간, 약 500 내지 약 1,000 nmol/gwcm/시간, 약 1,000 내지 약 2,000 nmol/gwcm/시간, 약 2,000 내지 약 5,000 nmol/gwcm/시간, 약 5,000 내지 약 10,000 nmol/gwcm/시간, 약 10,000 내지 약 50,000 nmol/gwcm/시간, 약 50,000 내지 약 100,000 nmol/gwcm/시간, 약 100,000 내지 약 150,000 nmol/gwcm/시간, 또는 약 150,000 내지 약 200,000 nmol/gwcm/시간이다. 일부 구현예에서는, 이소프렌의 양은 약 20 내지 약 200,000 nmol/gwcm/시간, 약 100 내지 약 5,000 nmol/gwcm/시간, 약 200 내지 약 2,000 nmol/gwcm/시간, 약 200 내지 약 1,000 nmol/gwcm/시간, 약 300 내지 약 1,000 nmol/gwcm/시간, 약 400 내지 약 1,000 nmol/gwcm/시간, 약 1,000 내지 약 5,000 nmol/gwcm/시간, 약 2,000 내지 약 20,000 nmol/gwcm/시간, 약 5,000 내지 약 50,000 nmol/gwcm/시간, 약 10,000 내지 약 100,000 nmol/gwcm/시간, 약 20,000 내지 약 150,000 nmol/gwcm/시간, 또는 약 20,000 내지 약 200,000 nmol/gwcm/시간이다.
nmol/gwcm/시간 단위의 이소프렌 양은 특히 이소프렌 생성의 측정에 대해 그 전문이 참고문헌으로 포함되는 미국 특허 제 5,849,970 호에서 개시된 바와 같이 측정될 수 있다. 예를 들어 2 ㎖의 상부공간 (예를 들어, 밀봉된 바이알에서 32℃에서 200 rpm에서 진탕하면서 약 3시간 동안 배양된 2 ㎖의 배양물과 같은 배양물로부터의 상부공간)은, n-옥탄/포라실 C 컬럼 (Alltech Associates, Inc., Deerfield, I11.)을 가지며 RGD2 산화수은 환원 기체 검출기 (Trace Analytical, Menlo Park, CA)와 결합된 등온선상 (85℃) 작동 시스템과 같은 표준 기체 크로마토그래피 시스템을 사용하여 이소프렌에 대해 분석된다 (예를 들어 Greenberg 등, Atmos. Environ. 27A: 2689-2692, 1993; Silver 등, Plant Physiol. 97:1588-1591, 1991 참조; 특히 이소프렌 생성의 측정에 대해 그 전문이 참고문헌으로 각각 포함됨). 기체 크로마토그래피 영역 단위는 표준 이소프렌 농도 교정 곡선을 통해 nmol 이소프렌으로 변환된다. 일부 구현예에서는, 세포의 습식 중량에 대한 세포의 g 에 대한 값은 세포 배양물의 세포에 대한 A600 값을 수득한 후, 알려진 A600 값을 갖는 세포 배양물에 대한 습식 중량의 교정 곡선을 기준으로 하여 상기 A600 값을 세포의 g으로 변환함으로써 계산된다. 일부 구현예에서는, 세포의 g은 1의 A600 값을 갖는 1 ℓ의 브로쓰 (세포 배지 및 세포를 포함)가 1 g의 습식 세포 중량을 갖는다고 가정함으로써 추정된다. 상기 값은 또한 인큐베이션된 배양물의 시간 수 (예를 들어 3시간)로 나누어진다.
일부 구현예에서는, 배양물 내 세포는 초과로 또는 약 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 5,000, 10,000, 100,000 이상의 이소프렌 ng/세포의 습식 중량에 대한 세포의 g/시간 (ng/gwcm/시간)으로 이소프렌을 생성한다. 일부 구현예에서는, 이소프렌의 양은 약 2 내지 약 5,000 ng/gwcm/시간, 예를 들어 약 2 내지 약 100 ng/gwcm/시간, 약 100 내지 약 500 ng/gwcm/시간, 약 500 내지 약 1,000 ng/gwcm/시간, 약 1,000 내지 약 2,000 ng/gwcm/시간, 또는 약 2,000 내지 약 5,000 ng/gwcm/시간이다. 일부 구현예에서는, 이소프렌의 양은 약 20 내지 약 5,000 ng/gwcm/시간, 약 100 내지 약 5,000 ng/gwcm/시간, 약 200 내지 약 2,000 ng/gwcm/시간, 약 200 내지 약 1,000 ng/gwcm/시간, 약 300 내지 약 1,000 ng/gwcm/시간, 또는 약 400 내지 약 1,000 ng/gwcm/시간이다. ng/gwcm/시간으로의 이소프렌 양은 상기 토의된 nmol/gwcm/시간 단위에서의 이소프렌 생성에 대한 값을 68.1로 곱하여 계산될 수 있다 (하기 방정식 5에서 기재된 바와 같음).
일부 구현예에서는, 배양물 내의 세포는 초과로 또는 약 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 5,000, 10,000, 50,000, 100,000 이상의 이소프렌 mg/브로쓰 L (mg/L브로쓰, 브로쓰의 부피에는 세포 및 세포 배지의 부피가 포함됨)로 이소프렌의 누적 역가 (총량)을 생성한다. 일부 구현예에서는, 이소프렌의 양은 약 2 내지 약 5,000 mg/L브로쓰, 예를 들어 약 2 내지 약 100 mg/L브로쓰, 약 100 내지 약 500 mg/L브로쓰, 약 500 내지 약 1,000 mg/L브로쓰, 약 1,000 내지 약 2,000 mg/L브로쓰, 또는 약 2,000 내지 약 5,000 mg/L브로쓰이다. 일부 구현예에서는, 이소프렌의 양은 약 20 내지 약 5,000 mg/L브로쓰, 약 100 내지 약 5,000 mg/L브로 쓰, 약 200 내지 약 2,000 mg/L브로쓰, 약 200 내지 약 1,000 mg/L브로쓰, 약 300 내지 약 1,000 mg/L브로쓰, 또는 약 400 내지 약 1,000 mg/L브로쓰이다.
진탕 플라스크 또는 유사한 배양물로부터의 이소프렌 mg/상부공간 L로의 이소프렌의 특이적 생산성은 약 1.0의 OD600 값의 세포 배양물로부터 1 ㎖ 샘플을 취하고 30분 동안 인큐베이션한 후 상부공간 내의 이소프렌의 양을 측정함으로써 측정될 수 있다 (예를 들어 실시예 1, II 부분에서 기재된 바와 같음). OD600 값이 1.0이 아니라면, OD600 값으로 나누어 1.0의 OD600 값에 대해 측정을 정상화시킬 수 있다. 이소프렌 mg/상부공간 L의 값은 38의 인자로 곱하여 배양물 브로쓰의 mg/L브로쓰/시간/OD600으로 변환될 수 있다. mg/L브로쓰/시간/OD600 단위의 값을 시간 수 및 OD600 값으로 곱하여 이소프렌 mg/브로쓰 L 단위의 누적 역가를 수득할 수 있다.
일부 구현예에서는, 배양물 내의 세포는 초과의 또는 약 0.1, 1.0, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1100, 1200, 1300, 1,400, 1,500, 1,600, 1,700, 1,800, 1,900, 2,000, 2,100, 2,200, 2,300, 2,400, 2,500, 2,600, 2,700, 2,800, 2,900, 3,000, 3,100, 3,200, 3,300, 3,400, 3,500 이상의 이소프렌 mg/브로쓰 L/시간 (mg/L브로쓰/시간, 브로쓰의 부피에는 세포 및 세포 배지의 부피가 포함됨)으로 이소프렌의 평균 체적 생산성을 갖는다. 일부 구현예에서는, 이소프렌의 평균 체적 생산성은 약 0.1 내지 약 3,500 mg/L브로쓰/시간, 예를 들어 약 0.1 내지 약 100 mg/L브로쓰/시간, 약 100 내지 약 500 mg/L브로쓰/시간, 약 500 내지 약 1,000 mg/L브로쓰/시간, 약 1,000 내지 약 1,500 mg/L브로쓰/시간, 약 1,500 내지 약 2,000 mg/L브로쓰/시간, 약 2,000 내지 약 2,500 mg/L브로쓰/시간, 약 2,500 내지 약 3,000 mg/L브로쓰/시간, 또는 약 3,000 내지 약 3,500 mg/L브로쓰/시간이다. 일부 구현예에서는, 이소프렌의 평균 체적 생산성은 약 10 내지 약 3,500 mg/L브로쓰/시간, 약 100 내지 약 3,500 mg/L브로쓰/시간, 약 200 내지 약 1,000 mg/L브로쓰/시간, 약 200 내지 약 1,500 mg/L브로쓰/시간, 약 1,000 내지 약 3,000 mg/L브로쓰/시간, 또는 약 1,500 내지 약 3,000 mg/L브로쓰/시간이다.
일부 구현예에서는, 배양물 내 세포는 초과로 또는 약 0.5, 1.0, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1100, 1200, 1300, 1,400, 1,500, 1,600, 1,700, 1,800, 1,900, 2,000, 2,100, 2,200, 2,300, 2,400, 2,500, 2,600, 2,700, 2,800, 2,900, 3,000, 3,100, 3,200, 3,300, 3,400, 3,500, 3,750, 4,000, 4,250, 4,500, 4,750, 5,000, 5,250, 5,500, 5,750, 6,000, 6,250, 6,500, 6,750, 7,000, 7,250, 7,500, 7,750, 8,000, 8,250, 8,500, 8,750, 9,000, 9,250, 9,500, 9,750, 10,000, 12,500, 15,000 이상의 이소프렌 mg/브로쓰 L/시간 (mg/L브로쓰/시간, 브로쓰의 부피에는 세포 및 세포 배지의 부피가 포함됨)으로 이소프렌의 피크 체적 생산성을 갖는다. 일부 구현예에서는, 이소프렌의 피크 체적 생산성은 약 0.5 내지 약 15,000 mg/L브로쓰/시간, 예를 들어 약 0.5 내지 약 10 mg/L브로쓰/시간, 약 1.0 내지 약 100 mg/L브로쓰/시간, 약 100 내지 약 500 mg/L브로 쓰/시간, 약 500 내지 약 1,000 mg/L브로쓰/시간, 약 1,000 내지 약 1,500 mg/L브로쓰/시간, 약 1,500 내지 약 2,000 mg/L브로쓰/시간, 약 2,000 내지 약 2,500 mg/L브로쓰/시간, 약 2,500 내지 약 3,000 mg/L브로쓰/시간, 약 3,000 내지 약 3,500 mg/L브로쓰/시간, 약 3,500 내지 약 5,000 mg/L브로쓰/시간, 약 5,000 내지 약 7,500 mg/L브로쓰/시간, 약 7,500 내지 약 10,000 mg/L브로쓰/시간, 약 10,000 내지 약 12,500 mg/L브로쓰/시간, 또는 약 12,500 내지 약 15,000 mg/L브로쓰/시간이다. 일부 구현예에서는, 이소프렌의 피크 체적 생산성은 약 10 내지 약 15,000 mg/L브로쓰/시간, 약 100 내지 약 2,500 mg/L브로쓰/시간, 약 1,000 내지 약 5,000 mg/L브로쓰/시간, 약 2,500 내지 약 7,500 mg/L브로쓰/시간, 약 5,000 내지 약 10,000 mg/L브로쓰/시간, 약 7,500 내지 약 12,500 mg/L브로쓰/시간, 또는 약 10,000 내지 약 15,000 mg/L브로쓰/시간이다.
발효기 내의 mg/L브로쓰/시간으로의 순간 이소프렌 생성 속도는 발효기 배출 기체의 샘플을 취하고, 예를 들어 실시예 1, II 부분에서 기재된 바와 같이 이소프렌의 양에 대해 이를 분석하고 (예를 들어 L기체 당 이소프렌 mg의 단위로) 상기 값을 배출 기체가 브로쓰 각각의 ℓ를 통해 지나가는 속도 (예를 들어, 1 vvm (공기 부피/브로쓰 부피/분)에서 이는 시간 당 60 L기체임)로 곱하여 측정될 수 있다. 따라서, 1 mg/L기체의 배출 기체 수준은 1 vvm의 공기 흐름에서 60 mg/L브로쓰/시간의 순간 생성 속도에 상응한다. 필요하다면, mg/L브로쓰/시간 단위의 값을 OD600 값으로 나누어 mg/L브로쓰/시간/OD 단위의 특이적 속도를 수득할 수 있다. 이소프렌 mg/L기체의 평균 값은 상기 평균 배출 기체 이소프렌 농도에 발효 동안의 발효 브로쓰의 ℓ 당 살포된 배출 기체의 총량을 곱하여 총 생성물 생산성 (발효 브로쓰 ℓ 당 이소프렌 g, mg/L브로쓰)으로 변환될 수 있다. 따라서, 1 vvm에서 10시간에 걸친 0.5 mg/L브로쓰/시간의 평균 배출 기체 이소프렌 농도는 300 mg 이소프렌/L브로쓰의 총 생성물 농도에 상응한다.
일부 구현예에서는, 배양물 내 세포는 초과로 또는 약 0.0015, 0.002, 0.005, 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.12, 0.14, 0.16, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6, 2.0, 2.2, 2.4, 2.6, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 11.0, 12.0, 13.0, 14.0, 15.0, 16.0, 17.0, 18.0, 19.0, 20.0, 21.0, 22.0, 23.0, 23.2, 23.4, 23.6, 23.8, 24.0, 25.0, 30.0, 31.0, 32.0, 33.0, 35.0, 37.5, 40.0, 45.0, 47.5, 50.0, 55.0, 60.0, 65.0, 70.0, 75.0, 80.0, 85.0, 또는 90.0 몰%의 세포 배양 배지 내 탄소를 이소프렌으로 변환시킨다. 일부 구현예에서는, 탄소의 이소프렌으로의 변환 %는 약 0.002 내지 약 90.0 몰%, 예를 들어 약 0.002 내지 약 0.005 몰%, 약 0.005 내지 약 0.01 몰%, 약 0.01 내지 약 0.05 몰%, 약 0.05 내지 약 0.15 몰%, 0.15 내지 약 0.2 몰%, 약 0.2 내지 약 0.3 몰%, 약 0.3 내지 약 0.5 몰%, 약 0.5 내지 약 0.8 몰%, 약 0.8 내지 약 1.0 몰%, 약 1.0 내지 약 1.6 몰%, 약 1.6 내지 약 3.0 몰%, 약 3.0 내지 약 5.0 몰%, 약 5.0 내지 약 8.0 몰%, 약 8.0 내지 약 10.0 몰%, 약 10.0 내지 약 15.0 몰%, 약 15.0 내지 약 20.0 몰%, 약 20.0 내지 약 25.0 몰%, 약 25.0 내지 30.0 몰%, 약 30.0 내지 35.0 몰%, 약 35.0 내지 40.0 몰%, 약 45.0 내지 50.0 몰%, 약 50.0 내지 55.0 몰%, 약 55.0 내지 60.0 몰%, 약 60.0 내지 65.0 몰%, 약 65.0 내지 70.0 몰%, 약 75.0 내지 80.0 몰%, 약 80.0 내지 85.0 몰%, 또는 약 85.0 내지 90.0 몰%이다. 일부 구현예에서는, 탄소의 이소프렌으로의 변환 %는 약 0.002 내지 약 0.4 몰%, 0.002 내지 약 0.16 몰%, 0.04 내지 약 0.16 몰%, 약 0.005 내지 약 0.3 몰%, 약 0.01 내지 약 0.3 몰%, 약 0.05 내지 약 0.3 몰%, 약 0.1 내지 0.3 몰%, 약 0.3 내지 약 1.0 몰%, 약 1.0 내지 약 5.0 몰%, 약 2 내지 약 5.0 몰%, 약 5.0 내지 약 10.0 몰%, 약 7 내지 약 10.0 몰%, 약 10.0 내지 약 20.0 몰%, 약 12 내지 약 20.0 몰%, 약 16 내지 약 20.0 몰%, 약 18 내지 약 20.0 몰%, 약 18 내지 23.2 몰%, 약 18 내지 23.6 몰%, 약 18 내지 약 23.8 몰%, 약 18 내지 약 24.0 몰%, 약 18 내지 약 25.0 몰%, 약 20 내지 약 30.0 몰%, 약 30 내지 약 40.0 몰%, 약 30 내지 약 50.0 몰%, 약 30 내지 약 60.0 몰%, 약 30 내지 약 70.0 몰%, 약 30 내지 약 80.0 몰%, 또는 약 30 내지 약 90.0 몰%이다.
탄소의 이소프렌으로의 변환 % (또한 "탄소 수율 %"로서 나타냄)는 생성된 이소프렌 내의 탄소 mol을 탄소원 내 탄소 mol (예를 들어 회분식 및 공급된 글루코오스 및 효모 추출물에서의 탄소 mol)로 나누어 측정될 수 있다. 이러한 수를 100%로 곱하여 % 값을 수득한다 (방정식 1에 나타낸 바와 같음).
방정식 1
탄소 수율% = (생성된 이소프렌 내의 탄소 mol)/(탄소원 내의 탄소 mol) * 100
상기 계산을 위해, 효모 추출물이 50% w/w 탄소를 함유하는 것으로 가정할 수 있다. 예로서, 실시예 7, VIII 부분에 기재된 500 ℓ에 대해, 탄소의 이소프렌으로의 변환%는 하기 방정식 2에 나타낸 바와 같이 계산될 수 있다.
방정식 2
탄소 수율% = (39.1 g 이소프렌 * 1/68.1 mol/g * 5 C/mol)/[(181221 g 글루코오스 * 1/180 mol/g * 6 C/mol) + (17780 g 효모 추출물 * 0.5 * 1/12 mol/g)] * 100 = 0.042%
본원에 기재된 두 가지 500 ℓ 발효에 대해 (실시예 7, VII 및 VIII 부분), 탄소의 이소프렌으로의 변환 %는 0.04~0.06%였다. 본원에 기재된 바와 같이 14ℓ 시스템을 사용하여 0.11~0.16 탄소 수율%를 수득하였다.
당업자는 이소프렌 생성 속도 및 생성된 이소프렌의 양을 어떠한 다른 단위로도 용이하게 변환할 수 있다. 단위 사이의 상호변환에 대한 예시적 방정식을 하기에 열거한다.
이소프렌 생성 속도에 대한 단위 ("총합 및 특이적")
방정식 3
1 g 이소프렌/L브로쓰/시간 = 14.7 mmol 이소프렌/L브로쓰/시간 (총 체적 속도)
방정식 4
1 nmol 이소프렌/gwcm/시간 = 1 nmol 이소프렌/L브로쓰/시간/OD600 (이러한 변환은 1의 OD600 값을 갖는 1ℓ의 브로쓰가 1 g의 습식 세포 중량을 갖는다고 가정함)
방정식 5
1 nmol 이소프렌/gwcm/시간 = 68.1 ng 이소프렌/gwcm/시간 (이소프렌 분자량이 주어짐)
방정식 6
1 nmol 이소프렌/L기체 02/시간 = 90 nmol 이소프렌/L브로쓰/시간 (브로쓰 L 당 90 L/시간의 02 유속에서)
방정식 7
1 ug 이소프렌/배출 기체 중 L기체 이소프렌 = L브로쓰 당 60 L기체의 유속에서 60 ug 이소프렌/L브로쓰/시간 (1 vvm)
역가에 대한 단위 (총합 및 특이적)
방정식 8
1 nmol 이소프렌/mg 세포 단백질 = 150 nmol 이소프렌/L브로쓰/OD600 (이러한 변환은 1의 OD600 값을 갖는 1ℓ의 브로쓰가 약 150 mg의 총 세포 단백질을 갖는다고 가정함) (특이적 생산성)
방정식 9
1 g 이소프렌/L브로쓰 = 14.7 mmol 이소프렌/L브로쓰 (총 역가)
필요하다면, 방정식 10을 사용하여 세포의 습식 중량을 포함하는 임의의 단위를 세포의 건식 중량을 포함하는 상응하는 단위로 변환할 수 있다.
방정식 10
세포의 건식 중량 = (세포의 습식 중량)/3.3
본 발명에 의해 포함되는 일부 구현예에서는 이소프렌 신타아제 폴리펩티드를 인코딩하는 이종 핵산을 포함하는 세포가, 이소프렌 신타아제 폴리펩티드를 인코딩하는 이종 핵산을 갖지 않는 본질적으로 동일한 조건 하에 성장한 상응하는 세포에서 생성된 이소프렌의 양보다 적어도 또는 약 2배, 3배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 150배, 200배, 400배 이상의 이소프렌 양을 생성한다.
본 발명에 의해 포함되는 일부 구현예에서는 이소프렌 신타아제 폴리펩티드를 인코딩하는 이종 핵산, 및 DXS, IDI 및/또는 MVA 경로 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 이종 핵산을 포함하는 세포가, 이종 핵산을 갖지 않는 본질적으로 동일한 조건 하에 성장한 상응하는 세포에서 생성된 이소프렌의 양보다 적어도 또는 약 2배, 3배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 150배, 200배, 400배 이상의 이소프렌의 양을 생성한다.
예시적 이소프렌 정제 방법
일부 구현예에서는, 본원에 기재된 임의의 방법은 이소프렌을 회수하는 것을 추가로 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 조성물 및 방법을 사용하여 생성된 이소프렌은 기체 스트리핑, 분획화, 흡수/탈착, 투과증발, 고체상으로부터의 이소프렌의 열 또는 진공 탈착, 또는 고정 또는 흡수된 이소프렌을 용매를 사용하여 고체상으로 추출하는 것과 같은 표준 기술을 사용하여 회수될 수 있다 (예를 들어 미국 특허 제 4,703,007 호 및 제 4,570,029 호 참조; 특히 이소프렌 회수 및 정제 방법에 대해 그 전문이 참고문헌으로 각각 포함됨). 일부 구현예에서는, 이소프렌의 회수는 액체 형태의 이소프렌 (예를 들어 용매 중 이소프렌의 용액 또는 이소프렌의 순 용액)의 단리를 포함한다. 기체 스트리핑은 연속 방식으로 발효 배출 기체 흐름으로부터 이소프렌 증기를 제거하는 것을 포함한다. 이러한 제거는 고체상으로의 흡수, 액체상으로의 분할, 또는 직접 축합을 비제한적으로 포함하는 여러 상이한 방법으로 달성될 수 있다. 일부 구현예에서는, 희석 이소프렌 증기 흐름의 막 풍부함은 액체 이소프렌의 축합을 야기하는 증기의 이슬점을 초과한다.
이소프렌의 회수는 한 단계 또는 다중 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서는, 발효 배출 기체로부터의 이소프렌 증기의 제거 및 이소프렌의 액체상으로의 변환은 동시에 수행된다. 예를 들어, 이소프렌은 배출 기체 흐름으로부터 직접적으로 축합되어 액체를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서는, 발효 배출 기체로부터의 이소프렌 증기의 제거 및 이소프렌의 액체상으로의 변환은 연속적으로 수행된다. 예를 들어, 이소프렌은 고체상으로 흡수된 후 용매로 고체상으로부터 추출될 수 있다.
일부 구현예에서는, 본원에 기재된 임의의 방법은 이소프렌을 정제하는 것을 추가로 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 조성물 및 방법을 사용하여 생성된 이소프렌은 표준 기술을 사용하여 정제될 수 있다. 정제는, 이소프렌이 생성되는 경우 존재하는 하나 이상의 성분으로부터 이소프렌이 분리되는 과정을 나타낸다. 일부 구현예에서는, 이소프렌은 실제적으로 순수한 액체로서 수득된다. 정제 방법의 예에는 (i) 액체 추출용 용제 중의 용액으로부터의 증류 및 (ii) 크로마토그래피가 포함된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "정제된 이소프렌"은 이소프렌이 생성되는 경우 존재하는 하나 이상의 성분으로부터 분리된 이소프렌을 의미한다. 일부 구현예에서 이소프렌은, 이소프렌이 생성되는 경우 존재하는 기타 성분 없이, 약 20 중량%이다. 다양한 구현예에서는, 이소프렌은 적어도 또는 약 25, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 90, 95 또는 99 중량% 순수하다. 순도는 적절한 방법, 예를 들어 컬럼 크로마토그래피, HPLC 분석 또는 GC- MS 분석에 의해 검정될 수 있다.
일부 구현예에서는, 본원에 기재된 임의의 방법은 이소프렌을 중합하는 것을 추가로 포함한다. 예를 들어, 정제된 이소프렌을 중합하는데 표준 방법을 사용하여 시스-폴리이소프렌을 형성시키거나, 표준 방법을 사용하여 다른 하위 스트림을 형성시킬 수 있다.
추가적인 방법 및 조성물이 미국 가출원 제 61/097,186 호 (2008년 9월 15일에 출원), 미국 가출원 제 61/097,189 호 (2008년 9월 15일에 출원), 및 미국 가출원 제 61/097,163 호 (2008년 9월 15일에 출원)에 기재되며, 이들 모두 특히 이소프렌을 생성하기 위한 조성물 및 방법에 대해 그 전문이 참고문헌으로 포함된다.
도 1은 대장균에서의 발현을 위해 코돈-최적화된 쿠주 (kudzu) 이소프렌 신타아제 유전자의 뉴클레오티드 서열이다 (SEQ ID NO:1). atg 시작 코돈은 이탤릭체이고, 정지 코돈은 굵은 글씨이며, 첨가된 PstI 위치는 밑줄 그은 부분이다.
도 2는 pTrcKudzu의 지도이다.
도 3은 pTrcKudzu의 뉴클레오티드 서열이다 (SEQ ID NO:2). RBS는 밑줄 그은 부분이며, 쿠주 이소프렌 신타아제 시작 코돈은 굵은 대문자체이고 정지 코돈은 굵은 대문자 이탤릭체이다. 벡터 골격은 pTrcHis2B이다.
도 4는 pETNHisKudzu의 지도이다.
도 5는 pETNHisKudzu의 뉴클레오티드 서열이다 (SEQ ID NO:5).
도 6은 pCL-lac-Kudzu의 지도이다.
도 7은 pCL-lac-Kudzu의 뉴클레오티드 서열이다 (SEQ ID NO:7).
도 8A는 벡터를 갖지 않는 대장균 BL21 세포에서의 이소프렌 생성을 나타내는 그래프이다.
도 8B는 pCL-lac-Kudzu를 갖는 대장균 BL21 세포에서의 이소프렌 생성을 나타내는 그래프이다.
도 8C는 pTrcKudzu를 갖는 대장균 BL21 세포에서의 이소프렌 생성을 나타내는 그래프이다.
도 8D는 pETN-HisKudzu를 갖는 대장균 BL21 세포에서의 이소프렌 생성을 나타내는 그래프이다.
도 9A는 14ℓ 유가식 (fed-batch) 발효에서 대장균 BL21/pTrcKudzu의 발효 시간에 걸친 OD를 나타내는 그래프이다.
도 9B는 14ℓ 유가식 발효에서 대장균 BL21/pTrcKudzu의 발효 시간에 걸친 이소프렌 생성을 나타내는 그래프이다.
도 1OA는 판토에아 시트레아 (Panteoa citrea)에서의 이소프렌의 생성을 나타내는 그래프이다. 대조군 세포는 재조합 쿠주 이소프렌 신타아제를 갖지 않는다. 회색 다이아몬드는 이소프렌 합성을 나타내고, 흑색 사각형은 OD600을 나타낸다.
도 1OB는 pCL-lac Kudzu를 발현하는 판토에아 시트레아에서의 이소프렌의 생성을 나타내는 그래프이다. 회색 다이아몬드는 이소프렌 합성을 나타내고, 흑색 사각형은 OD600을 나타낸다.
도 1OC는 pTrcKudzu를 발현하는 판토에아 시트레아에서의 이소프렌의 생성을 나타내는 그래프이다. 회색 다이아몬드는 이소프렌 합성을 나타내고, 흑색 사각형은 OD600을 나타낸다.
도 11은 재조합 이소프렌 신타아제를 발현하는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)에서의 이소프렌의 생성을 나타내는 그래프이다. BG3594comK는 플라스미드가 없는 B. 서브틸리스이다 (선천적 이소프렌 생성). CF443-BG3594comK는 pBSKudzu를 갖는 B. 서브틸리스이다 (재조합 이소프렌 생성). y축의 IS는 이소프렌을 나타낸다.
도 12는 pBS Kudzu #2의 뉴클레오티드 서열이다 (SEQ ID NO:57).
도 13은 야로위야 (Yarrowia)에서의 발현을 위해 코돈-최적화된 쿠주 이소프렌 신타아제의 뉴클레오티드 서열이다 (SEQ ID NO:8).
도 14는 야로위야에서의 발현을 위해 코돈-최적화된 쿠주 이소프렌 신타아제 유전자를 포함하는 pTrex3g의 지도이다.
도 15는 벡터 pSPZ 1 (MAP29Spb)의 뉴클레오티드 서열이다 (SEQ ID NO:11).
도 16은 야로위야에서의 발현을 위해 코돈-최적화된 합성 쿠주 (푸에라리아 몬타나 (Pueraria montana)) 이소프렌 유전자의 뉴클레오티드 서열이다 (SEQ ID NO:12).
도 17은 합성 하이브리드 포플러 (포풀루스 알바 (Populus alba) x 포풀루스 트레물라 (Populus tremula)) 이소프렌 신타아제 유전자의 뉴클레오티드 서열이다 (SEQ ID NO:13). ATG 시작 코돈은 굵은 글씨체이고, 정지 코돈은 밑줄 그은 부분이다.
도 18A는 벡터 pYLA 1, pYL1 및 pYL2의 도식적인 개략적 구성을 나타낸다.
도 18B는 벡터 pYLA(POP1)의 도식적인 개략적 구성을 나타낸다.
도 18C는 벡터 pYLA(KZ1)의 도식적인 개략적 구성을 나타낸다.
도 18D는 벡터 pYLI(KZ1)의 도식적인 개략적 구성을 나타낸다.
도 18E는 벡터 pYLI(MAP29)의 도식적인 개략적 구성을 나타낸다.
도 18F는 벡터 pYLA(MAP29)의 도식적인 개략적 구성을 나타낸다.
도 19A는 이소프렌에 대한 MVA 및 DXP 대사작용 경로를 나타낸다 (F. Bouvier 등, Progress in Lipid Res. 44:357-429, 2005를 근거로 함). 하기의 설명은 경로에서의 각각의 폴리펩티드의 대안적 명칭, 및 표시된 폴리펩티드의 활성을 측정하기 위한 검정을 개시하는 참고문헌을 포함한다 (이들 각각의 참고문헌은 그 전문이, 특히 MVA 및 DXP 경로에서의 폴리펩티드에 대한 폴리펩티드 활성에 대한 검정에 대해서 본원에 참고로 포함됨). 메발로네이트 경로: AACT; 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라아제, MvaE, EC 2.3.1.9. 검정: J. Bacteriol, 184: 2116-2122, 2002; HMGS; 하이드록시메틸글루타릴-CoA 신타아제, MvaS, EC 2.3.3.10. 검정: J. Bacteriol, 184: 4065-4070, 2002; HMGR; 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA 환원효소, MvaE, EC 1.1.1.34. 검정: J. Bacteriol, 184: 2116-2122, 2002; MVK; 메발로네이트 키나아제, ERG12, EC 2.7.1.36. 검정: Curr Genet 19:9-14, 1991. PMK; 포스포메발로네이트 키나아제, ERG8, EC 2.7.4.2, 검정: Mol Cell Biol., 11:620-631, 1991; DPMDC; 디포스포메발로네이트 데카르복실라아제, MVD1, EC 4.1.1.33. 검정: Biochemistry, 33:13355-13362, 1994; IDI; 이소펜테닐-디포스페이트 델타-이성화효소, IDI1, EC 5.3.3.2. 검정: J. Biol. Chem. 264:19169-19175, 1989. DXP 경로: DXS; 1-데옥시자일루로오스-5-포스페이트 신타아제, dxs, EC 2.2.1.7. 검정: PNAS, 94:12857-62, 1997; DXR; 1-데옥시-D-자일루로오스 5-포스페이트 환원이성화효소, dxr, EC 2.2.1.7. 검정: Eur. J. Biochem. 269:4446-4457, 2002; MCT; 4-디포스포시티딜-2C-메틸-D-에리트리톨 신타아제, IspD, EC 2.7.7.60. 검정: PNAS, 97:6451-6456, 2000; CMK; 4-디포스포시티딜-2-C-메틸-D-에리트리톨 키나아제, IspE, EC 2.7.1.148. 검정: PNAS, 97:1062- 1067, 2000; MCS; 2C-메틸-D-에리트리톨 2,4-시클로디포스페이트 신타아제, IspF, EC 4.6.1.12. 검정: PNAS, 96:11758-11763, 1999; HDS; 1-하이드록시-2-메틸-2-(E)-부테닐 4-디포스페이트 신타아제, ispG, EC 1.17.4.3. 검정: J. Org. Chem., 70:9168 -9174, 2005; HDR; 1-하이드록시-2-메틸-2-(E)-부테닐 4-디포스페이트 환원효소, IspH, EC 1.17.1.2. 검정: JACS, 126:12847- 12855, 2004.
도 19B는 고전적, 및 변형된 MVA 경로를 설명한다. 1, 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라아제 (AACT); 2, HMG-CoA 신타아제 (HMGS); 3, HMG-CoA 환원효소 (HMGR); 4, 메발로네이트 키나아제 (MVK); 5, 포스포메발로네이트 키나아제 (PMK); 6, 디포스포메발로네이트 데카르복실라아제 (MVD 또는 DPMDC); 7, 이소펜테닐 디포스페이트 이성화효소 (IDI); 8, 포스포메발로네이트 데카르복실라아제 (PMDC); 9, 이소펜테닐 포스페이트 키나아제 (IPK). 고전적 MVA 경로는 반응 1에서부터 반응 5 및 6을 통해 반응 7로 진행되는 반면, 변형된 MVA 경로는 반응 8 및 9를 통해 반응 7로 진행된다. 구조식에서 P 및 PP는 각각 포스페이트 및 피로포스페이트이다. 상기 도면은 특히 변형된 MVA 경로의 핵산 및 폴리펩티드에 대해 그 전문이 참고문헌으로 포함된 [Koga 및 Morii, Microbiology and Mol. Biology Reviews, 71:97-120, 2007]에서 취해졌다. 변형된 MVA 경로는, 예를 들어 메타노사르키나 마제이와 같은 일부 고세균성 유기체에 존재한다.
도 20은 쿠주 이소프렌 신타아제 유전자가 없거나 (좌측) 있는 (우측) 재조합 Y. 리포리티카 (Y. lipolytica) 균주에 의한 이소프렌의 GC-MS 분석의 결과를 나타내는 그래프를 보여준다. 화살표는 본래 이소프렌 표준의 용리 시간을 나타낸다.
도 21은 pTrcKudzu yIDI DXS Kan의 지도이다.
도 22는 pTrcKudzu yIDI DXS Kan의 뉴클레오티드 서열이다 (SEQ ID NO:20).
도 23A는 BL21/pTrcKudzukan에서 글루코오스로부터의 이소프렌의 생성을 나타내는 그래프이다. 시간 0은 IPTG (400 ㎛ol)로의 유도 시간이다. x축은 유도 후 시간이고; y축은 OD600이고 y2축은 이소프렌의 총 생산성 (㎍/상부공간 L) 또는 특이적 생산성 (㎍/상부공간 L/OD)이다. 다이아몬드형은 OD600을 나타내고, 원형은 총 이소프렌 생산성 (㎍/L)을 나타내며 사각형은 이소프렌의 특이적 생산성을 나타낸다 (㎍/L/OD).
도 23B는 BL21/pTrcKudzu yIDI kan에서 글루코오스로부터의 이소프렌 생성을 나타내는 그래프이다. 시간 0은 IPTG (400 ㎛ol)로의 유도 시간이다. x축은 유도 후 시간이고; y축은 OD600이고 y2축은 이소프렌의 총 생산성 (㎍/상부공간 L) 또는 특이적 생산성 (㎍/상부공간 L/OD)이다. 다이아몬드형은 OD600을 나타내고, 원형은 총 이소프렌 생산성 (㎍/L)을 나타내며 사각형은 이소프렌의 특이적 생산성을 나타낸다 (㎍/L/OD).
도 23C는 BL21/pTrcKudzu DXS kan에서 글루코오스로부터의 이소프렌 생성을 나타내는 그래프이다. 시간 0은 IPTG (400 ㎛ol)로의 유도 시간이다. x축은 유도 후 시간이고; y축은 OD600이고 y2축은 이소프렌의 총 생산성 (㎍/상부공간 L) 또는 특이적 생산성 (㎍/상부공간 L/OD)이다. 다이아몬드형은 OD600을 나타내고, 원형은 총 이소프렌 생산성 (㎍/L)을 나타내며 사각형은 이소프렌의 특이적 생산성을 나타낸다 (㎍/L/OD).
도 23D는 BL21/pTrcKudzu yIDI DXS kan에서 글루코오스로부터의 이소프렌 생성을 나타내는 그래프이다. 시간 0은 IPTG (400 ㎛ol)로의 유도 시간이다. x축은 유도 후 시간이고; y축은 OD600이고 y2축은 이소프렌의 총 생산성 (㎍/상부공간 L) 또는 특이적 생산성 (㎍/상부공간 L/OD)이다. 다이아몬드형은 OD600을 나타내고, 원형은 총 이소프렌 생산성 (㎍/L)을 나타내며 사각형은 이소프렌의 특이적 생산성을 나타낸다 (㎍/L/OD).
도 23E는 BL21/pCL PtrcKudzu에서 글루코오스로부터의 이소프렌의 생성을 나타내는 그래프이다. 시간 0은 IPTG (400 ㎛ol)로의 유도 시간이다. x축은 유도 후 시간이고; y축은 OD600이고 y2축은 이소프렌의 총 생산성 (㎍/상부공간 L) 또는 특이적 생산성 (㎍/상부공간 L/OD)이다. 다이아몬드형은 OD600을 나타내고, 원형은 총 이소프렌 생산성 (㎍/L)을 나타내며 사각형은 이소프렌의 특이적 생산성을 나타낸다 (㎍/L/OD).
도 23F는 BL21/pCL PtrcKudzu yIDI에서 글루코오스로부터의 이소프렌의 생성을 나타내는 그래프이다. 시간 0은 IPTG (400 ㎛ol)로의 유도 시간이다. x축은 유도 후 시간이고; y축은 OD600이고 y2축은 이소프렌의 총 생산성 (㎍/상부공간 L) 또는 특이적 생산성 (㎍/상부공간 L/OD)이다. 다이아몬드형은 OD600을 나타내고, 원형은 총 이소프렌 생산성 (㎍/L)을 나타내며 사각형은 이소프렌의 특이적 생산성을 나타낸다 (㎍/L/OD).
도 23G는 BL21/pCL PtrcKudzu DXS에서 글루코오스로부터의 이소프렌의 생성을 나타내는 그래프이다. 시간 0은 IPTG (400 ㎛ol)로의 유도 시간이다. x축은 유도 후 시간이고; y축은 OD600이고 y2축은 이소프렌의 총 생산성 (㎍/상부공간 L) 또는 특이적 생산성 (㎍/상부공간 L/OD)이다. 다이아몬드형은 OD600을 나타내고, 원형은 총 이소프렌 생산성 (㎍/L)을 나타내며 사각형은 이소프렌의 특이적 생산성을 나타낸다 (㎍/L/OD).
도 23H는 BL21/pTrcKudzuIDIDXSkan에서 글루코오스로부터의 이소프렌의 생성을 나타내는 그래프이다. 화살표는 IPTG (400 ㎛ol)로의 유도 시간을 나타낸다. x축은 유도 후 시간이고; y축은 OD600이고 y2축은 이소프렌의 총 생산성 (㎍/상부공간 L) 또는 특이적 생산성 (㎍/상부공간 L/OD)이다. 흑색 다이아몬드형은 OD600을 나타내고, 흑색 삼각형은 이소프렌 생산성 (㎍/L)을 나타내고, 백색 사각형은 이소프렌의 특이적 생산성을 나타낸다 (㎍/L/OD).
도 24는 pTrcKKDyIkIS kan의 지도이다.
도 25는 pTrcKKDyIkIS kan의 뉴클레오티드 서열이다 (SEQ ID NO:33).
도 26은 pCL PtrcUpperPathway의 지도이다.
도 27은 pCL PtrcUpperPathway의 뉴클레오티드 서열이다 (SEQ ID NO:46).
도 28은 nprE 유전자 자리에 B. 서브틸리스 염색체 내 융합을 위한 효모 idi 및 하위 MVA 경로를 함유하는 카세트의 지도를 나타낸다. nprE 상류/하류는 융합을 위한 nprE 유전자 자리로부터의 각각의 서열 1kb를 나타낸다. aprE 프로모터 (알칼리 세린 프로테아제 프로모터)는 aprE 유전자의 프로모터 (-35, -10, +1 전사 시작 위치, RBS)를 나타낸다. MVK1은 효모 메발로네이트 키나아제 유전자를 나타낸다. RBS-PMK는 시작 위치의 바실러스 RBS 상류를 갖는 효모 포스포메발로네이트 키나아제 유전자를 나타낸다. RBS-MPD는 시작 위치의 바실러스 RBS 상류를 갖는 효모 디포스포메발로네이트 데카르복실라아제 유전자를 나타낸다. RBS-IDI는 시작 위치의 바실러스 RBS 상류를 갖는 효모 idi 유전자를 나타낸다. 터미네이터는 B. 아밀로리쿠에파시엔스 (B. amyloliquefaciens)로부터의 알칼리 세린 프로테아제 전사 터미네이터를 나타낸다. SpecR은 스펙티노마이신 내성 마커를 나타낸다. "증폭을 위한 nprE 상류 반복 부분"은 증폭에 사용되는 상류 부위의 직렬 반복을 나타낸다.
도 29는 nprE 유전자 자리에 B. 서브틸리스 염색체 내 융합을 위한 효모 idi 및 하위 MVA 경로를 함유하는 카세트의 뉴클레오티드 서열이다 (SEQ ID NO:47).
도 30은 p9796-poplar의 지도이다.
도 31은 p9796-poplar의 뉴클레오티드 서열이다 (SEQ ID NO:48).
도 32는 pTrcPoplar의 지도이다.
도 33은 pTrcPoplar의 뉴클레오티드 서열이다 (SEQ ID NO:49).
도 34는 pTrcKudzu yIDI Kan의 지도이다.
도 35는 pTrcKudzu yIDI Kan의 뉴클레오티드 서열이다 (SEQ ID NO:50).
도 36은 pTrcKudzuDXS Kan의 지도이다.
도 37은 pTrcKudzuDXS Kan의 뉴클레오티드 서열이다 (SEQ ID NO:51).
도 38은 pCL PtrcKudzu의 지도이다.
도 39는 pCL PtrcKudzu의 뉴클레오티드 서열이다 (SEQ ID NO:52).
도 40은 pCL PtrcKudzu A3의 지도이다.
도 41은 pCL PtrcKudzu A3의 뉴클레오티드 서열이다 (SEQ ID NO:53).
도 42는 pCL PtrcKudzu yIDI의 지도이다.
도 43은 pCL PtrcKudzu yIDI의 뉴클레오티드 서열이다 (SEQ ID NO:54).
도 44는 pCL PtrcKudzu DXS의 지도이다.
도 45는 pCL PtrcKudzu DXS의 뉴클레오티드 서열이다 (SEQ ID NO:55).
도 46은 바이오매스 공급원료로부터의 이소프렌 생성을 나타내는 그래프를 보여준다. 패널 A는 옥수수대로부터의 이소프렌 생성을 나타내고, 패널 B는 바가스로부터의 이소프렌 생성을 나타내고, 패널 C는 침엽수 (softwood) 펄프로부터의 이소프렌 생성을 나타내고, 패널 D는 글루코오스로부터의 이소프렌 생성을 나타내며, 패널 E는 추가적인 공급원료를 갖지 않는 세포로부터의 이소프렌 생성을 나타낸다. 회색 사각형은 표시된 접종 후 시간에서의 배양물의 OD600 측정을 나타내고, 흑색 삼각형은 표시된 접종 후 시간에서의 이소프렌 생성을 나타낸다.
도 47A는 글루코오스가 첨가되지 않은 배양물에서 BL21 (λDE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan)에 의한 이소프렌 생성을 나타내는 그래프를 보여준다. 사각형은 OD600을 나타내고, 삼각형은 생성된 이소프렌을 나타낸다 (㎍/㎖).
도 47B는 BL21 (λDE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan)에 의한 1% 글루코오스 공급원료 반전당으로부터의 이소프렌 생성을 나타내는 그래프를 보여준다. 사각형은 OD600을 나타내고, 삼각형은 생성된 이소프렌을 나타낸다 (㎍/㎖).
도 47C는 BL21 (λDE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan)에 의한 1% 반전당 공급원료로부터의 이소프렌 생성을 나타내는 그래프를 보여준다. 사각형은 OD600을 나타내고, 삼각형은 생성된 이소프렌을 나타낸다 (㎍/㎖).
도 47D는 BL21 (λDE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan)에 의한 1% AFEX 옥수수대 공급원료로부터의 이소프렌 생성을 나타내는 그래프를 보여준다. 사각형은 OD600을 나타내고, 삼각형은 생성된 이소프렌을 나타낸다 (㎍/㎖).
도 48은 이소프렌 생성에 대한 효모 추출물의 효과를 입증하는 그래프를 보여준다. 패널 A는 가변적 양의 효모 추출물이 공급된 발효기 내의 광학 밀도의 시간 추이를 나타낸다. 패널 B는 가변적 양의 효모 추출물이 공급된 발효기 내의 이소프렌 역가의 시간 추이를 나타낸다. 역가는 발효 브로쓰의 ℓ당 생성된 이소프렌의 양으로서 정의된다. 패널 C는 유가식 배양물에서 성장시킨 대장균에서 이소프렌 생성에 대한 효모 추출물의 효과를 나타낸다.
도 49는 pTrcKudzu 및 yIDI 및 DXS 플라스미드를 함유하는 대장균 세포로 500ℓ 생물반응기에서 이소프렌을 생성하는 것을 입증하는 그래프를 나타낸다. 패널 A는 글루코오스 및 효모 추출물이 공급된 500ℓ 생물반응기 내의 광학 밀도의 시간 추이를 나타낸다. 패널 B는 글루코오스 및 효모 추출물이 공급된 500ℓ 생물반응기 내의 이소프렌 역가의 시간 추이를 나타낸다. 역가는 발효 브로쓰의 ℓ당 생성된 이소프렌의 양으로서 정의된다. 패널 C는 글루코오스 및 효모 추출물이 공급된 500ℓ 생물반응기로부터 생성된 총 이소프렌의 시간 추이를 나타낸다.
도 50은 pJMupperpathway2의 지도이다.
도 51은 pJMupperpathway2의 뉴클레오티드 서열이다 (SEQ ID NO:56).
도 52는 pBS Kudzu #2의 지도이다.
도 53A는 14ℓ 유가식 발효에서 재조합 쿠주 이소프렌 신타아제를 발현하는 바실러스의 발효 시간 동안의 성장을 나타내는 그래프이다. 흑색 다이아몬드형은 재조합 이소프렌 신타아제를 갖지 않는 대조군 균주 (BG3594comK) (선천적 이소프렌 생성)를 나타내고, 회색 삼각형은 pBSKudzu를 갖는 바실러스 (재조합 이소프렌 생성)를 나타낸다.
도 53B는 14ℓ 유가식 발효에서 재조합 쿠주 이소프렌 신타아제를 발현하는 바실러스의 발효 시간 동안의 이소프렌 생성을 나타내는 그래프이다. 흑색 다이아몬드형은 재조합 이소프렌 신타아제를 갖지 않는 대조군 균주 (BG3594comK) (선천적 이소프렌 생성)를 나타내고, 회색 삼각형은 pBSKudzu를 갖는 바실러스 (재조합 이소프렌 생성)를 나타낸다.
도 54는 플라스미드 pET24 P.alba HGS의 지도이다.
도 55A 및 55B는 플라스미드 pET24 P.alba HGS의 뉴클레오티드 서열이다 (SEQ ID NO:87).
도 56은 플라스미드 EWL230을 구성하기 위한 엔도뉴클레아제 소화에 사용된 제한 위치, 및 BspHI과 NcoI 위치 사이의 부착 말단을 나타내는 도식적 그림이다.
도 57은 플라스미드 EWL230의 지도이다.
도 58A 및 58B는 플라스미드 EWL230의 뉴클레오티드 서열이다 (SEQ ID NO:88).
도 59는 플라스미드 EWL244를 구성하기 위한 엔도뉴클레아제 소화에 사용된 제한 위치, 및 NsiI과 PstI 위치 사이의 부착 말단을 나타내는 도식적 그림이다.
도 60은 EWL244의 지도이다.
도 61A 및 61B는 플라스미드 EWL244의 뉴클레오티드 서열이다 (SEQ ID NO:89).
도 62는 플라스미드 MCM484-487의 지도이다.
도 63A~63C는 플라스미드 MCM484의 뉴클레오티드 서열이다 (SEQ ID NO:90).
도 64A~64C는 플라스미드 MCM485의 뉴클레오티드 서열이다 (SEQ ID NO:91).
도 65A~65C는 플라스미드 MCM486의 뉴클레오티드 서열이다 (SEQ ID NO:92).
도 66A~66C는 플라스미드 MCM487의 뉴클레오티드 서열이다 (SEQ ID NO:93).
도 67A~67D는 MVA 경로로부터의 유전자를 발현하고, 효모 추출물 공급 없이 15ℓ 규모의 유가식 배양에서 성장하는 대장균 균주 (EWL256)에 의한 이소프렌 생성의 그래프이다. 도 67A는 글루코오스가 공급된 15ℓ 생물반응기 내의 광학 밀도의 시간 추이를 나타낸다. 도 67B는 글루코오스가 공급된 15ℓ 생물반응기 내의 이소프렌 역가의 시간 추이를 나타낸다. 역가는 발효 브로쓰의 ℓ당 생성된 이소프렌의 양으로서 정의된다. 도 67C는 글루코오스가 공급된 15ℓ 생물반응기로부터 생성된 총 이소프렌의 시간 추이를 나타낸다. 도 67D는 글루코오스가 공급된 15ℓ 생물반응기 내의 총 이산화탄소 발생 속도 (TCER), 또는 대사작용 활성 프로필을 나타낸다.
도 68A~68E는 MVA 경로로부터의 유전자를 발현하며, 효모 추출물이 공급된 15ℓ 규모의 유가식 배양에서 성장한 대장균 균주 (EWL256)에 의한 이소프렌 생성의 그래프이다. 도 68A는 글루코오스가 공급된 15ℓ 생물반응기 내의 광학 밀도의 시간 추이를 나타낸다. 도 68B는 글루코오스가 공급된 15ℓ 생물반응기 내의 이소프렌 역가의 시간 추이를 나타낸다. 역가는 발효 브로쓰의 ℓ당 생성된 이소프렌의 양으로서 정의된다. 도 68C는 글루코오스가 공급된 15ℓ 생물반응기로부터 생성된 총 이소프렌의 시간 추이를 나타낸다. 도 68D는 글루코오스가 공급된 15ℓ 생물반응기 내의 체적 생산성을 나타낸다. 1.1 g/L/시간의 평균값은 효모 추출물 공급과 함께 40시간의 기간 (23~63시간) 동안 유지되었다. 도 68E는 글루코오스가 공급된 15ℓ 생물반응기 내의 이산화탄소 발생 속도 (CER), 또는 대사작용 활성 프로필을 나타낸다.
도 69A~69D는 MVA (경로)를 통한 상이한 탄소원으로부터의 이소프렌의 생성을 나타낸다. 도 69A는 유일한 탄소원으로서 글루코오스, 바이오매스 가수분해물, 글리세롤 또는 아세테이트에서, MVA 경로 및 이소프렌 신타아제를 모두 함유하는 대장균 EWL256의 성장을 나타낸다. 상이한 탄소원을 배지 중 1%의 농도로 첨가하였다. 탄소원이 첨가되지 않은 음성 대조군을 포함시켰다. 600 nM에서 광학 밀도로서 성장을 측정하였다. 도 69B는 유일한 탄소원으로서 글루코오스, 바이오매스 가수분해물, 글리세롤 또는 아세테이트에서 성장하는 경우, MVA 경로 및 이소프렌 신타아제를 모두 함유하는 대장균 EWL256으로부터의 이소프렌의 특이적 생산성을 나타낸다. 상이한 탄소원을 배지 중 1%의 농도로 첨가하였다. 탄소원이 첨가되지 않은 음성 대조군을 포함시켰다. 접종 190분 후, 255분 후 및 317분 후 샘플을 취하고, GC-MS를 사용하여 세균에 의해 생성된 이소프렌을 측정하였다. 도 69C는 유일한 탄소원으로서 글루코오스 또는 자일로오스에서 대장균 EWL256의 성장을 나타낸다. 상이한 탄소원을 배지 중 1%의 농도로 첨가하였다. 탄소원이 첨가되지 않은 음성 대조군을 포함시켰다. 60O nM에서 광학 밀도로서 성장을 측정하였다. 도 69D는 유일한 탄소원으로서 글루코오스 또는 자일로오스에서 성장하는 경우 대장균 EWL256으로부터의 이소프렌의 특이적 생산성을 나타낸다. 탄소원을 배지 중 1%의 농도로 첨가하였다. 탄소원이 첨가되지 않은 음성 대조군을 포함시켰다. 접종 260분 후, 322분 후 및 383분 후 샘플을 취하고, GC-MS를 사용하여 세균에 의해 생성된 이소프렌을 측정하였다.
도 7OA 및 7OB는 각각 글루코오스 및 지방산으로부터 대장균에 의한 이소프렌의 생성을 나타낸다. 도 7OA에 대하여, WW4를 pMCM118 (하위 메발론산 통로를 포함하는 플라스미드)로 형질전환한 것으로부터의 11개 콜로니를 골라 하위 통로의 존재를 확인하였다. 콜로니로부터의 세포를 0.1% 효모 추출물 및 2% 글루코오스를 함유하는 TM3 배지에서 배양하였다. 유도된 배양물의 분취액을, 유도 4시간 후 이소프렌 생성에 대해 검정하였다. 모든 콜로니가 이소프렌의 생성을 나타내었다. 50에서 900 uM 농도의 유도제에 대해 3에서 4.6배 감소된 세포 밀도에서 명백한 바와 같이, 유도제 IPTG는 강력한 성장 억제 효과를 가졌다 (데이터는 나타내지 않음). 그래프는 더 높은 유도로 이소프렌의 더 높은 특이적 역가가 수득된다는 것을 나타낸다. 도 7OB에 대하여, 생성 배양물은 세척된 하룻밤 배양물로부터 1 내지 10배 희석물로 접종되었다. 배양물은 수 시간 동안 성장하였고, 50 uM IPTG로 유도되었다. 좌측 막대는 유도 4시간 후, 뒤이어 1시간 이소프렌 축적 검정의 이소프렌 검정 결과를 나타낸다. 가운대 막대는 동일한 유도 기간을 가지지만 12시간 이소프렌 축적 검정에 의해 분석된, 동일한 배양물에 대한 1시간 정상화된 값을 나타낸다. 좌측 막대는 13시간 동안 유도된 배양물의 1시간 이소프렌 축적 검정에 대한 값을 나타낸다.
도 71은 Kudzu. Tsr, 티오스트렙톤 내성 유전자로부터 이소프렌 신타아제를 클로닝하는데 사용되는 대장균-스트렙토마이세스 셔틀 벡터 pUWL201PW (6400 bp)의 지도이다. 그림은 [Doumith 등, Mol. Gen. Genet. 264: 477-485, 2000]에서 가져온 것이다.
도 72는 스트렙토마이세스 알부스 (Streptomyces albus) 야생형 균주 ("wt"), 및 플라스미드 pUWL201PW (음성 대조군) 또는 pUWL201_iso (Kudzu로부터 이소프렌 신타아제를 인코딩함)를 갖는 균주에 의한 이소프렌 형성을 나타낸다.
도 73A는 M. 마제이 (M. mazei) 고세균성 하위 경로 오페론의 지도이다.
도 73B 및 73C는 M. 마제이 고세균성 하위 경로 오페론의 뉴클레오티드 서열이다 (SEQ ID NO:113).
도 74A는 M. 마제이 고세균성 Lowerin pET200D로부터의 MCM376 - MVK의 지도이다.
도 74B 및 74C는 M. 마제이 고세균성 Lowerin pET200D로부터의 MCM376 - MVK의 뉴클레오티드 서열이다 (SEQ ID NO:114).
도 75A~75D는 RM11608-2와 비교하여 EWL256에 대한 이소프렌 생성의 특이적 생산성 및 성장을 나타낸다. 성장 (OD550)은 백색 다이아몬드형으로 나타내고; 이소프렌의 특이적 생산성은 고체 막대로 나타낸다. x축은 200 (도 75A 및 75B) 또는 400 (도 75C 및 75D) uM IPTG로의 유도 후 시간 (hr)이다. Y-1축은 이소프렌의 생산성 (ug/L/OD/시간)이고 Y-2축은 550의 파장에서 광학 밀도의 임의 단위 (arbitrary unit)이다. OD550에 대한 이들 값에 6.66을 곱하여 배양물의 실제 OD를 수득하였다.
도 76은 플라스미드 pBBRCMPGI1.5-pgl의 지도이다.
도 77A 및 77B는 플라스미드 pBBRCMPGI1.5-pgl의 뉴클레오티드 서열이다 (SEQ ID NO:122).
도 78A~78F는 M. 마제이 메발로네이트 키나아제, P. 알바 이소프렌 신타아제 및 pgl (RHM111608-2)을 발현하며, 15ℓ 규모의 유가식 배양에서 성장하는 대장균 균주에 의한 이소프렌 생성의 그래프이다. 도 78A는 글루코오스가 공급된 15ℓ 생물반응기 내의 광학 밀도의 시간 추이를 나타낸다. 도 78B는 글루코오스가 공급된 15ℓ 생물반응기 내의 이소프렌 역가의 시간 추이를 나타낸다. 역가는 발효 브로쓰의 ℓ당 생성된 이소프렌의 양으로서 정의된다. 이소프렌을 계산하기 위한 방법: 59시간에서 생성된 축적 이소프렌, 59시간에서의 발효기 부피 당 g, L [=] g/브로쓰 L. 도 78C는 또한 글루코오스가 공급된 15ℓ 생물반응기 내의 이소프렌 역가의 시간 추이를 나타낸다. 이소프렌을 계산하기 위한 방법: ∫(순간 이소프렌 생성 속도, g/L/시간)dt, t = 0 내지 59시간 [=] g/브로쓰 L. 도 78D는 글루코오스가 공급된 15ℓ 생물반응기로부터 생성된 총 이소프렌의 시간 추이를 나타낸다. 도 78E는 글루코오스가 공급된 15ℓ 생물반응기 내의 체적 생산성을 나타낸다. 도 78F는 글루코오스가 공급된 15ℓ 생물반응기 내의 이산화탄소 발생 속도 (CER) 또는 대사작용 활성 프로필을 나타낸다.
도 79A는 플라스미드 pJ201:19813의 지도이다.
도 79B 및 79C는 pJ201:19813의 뉴클레오티드 서열이다 (SEQ ID NO:123).
본 발명의 단지 예시로서 의도되며, 따라서 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하는 것으로 고려되어서는 안 되는 실시예가 또한 기재되며, 상기 토의된 본 발명의 측면 및 구현예가 상술된다. 다르게 나타내지 않는 한, 온도는 섭씨 온도이며 압력은 대기압 또는 대기압에 가깝다. 전술한 예 및 상세한 설명은 실례로서 제공되며, 제한하는 것으로서 제공되지 않는다. 본 명세서에 인용된 모든 발행물, 특허 출원 및 특허는 각각의 개별적 발행물, 특허 출원 또는 특허가 참고문헌으로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 나타내어지는 것처럼 참고문헌으로 본원에 포함된다. 특히, 본원에 인용된 모든 발행물은 발명과 관련하여 사용될 수 있는 조성물 및 방법론을 기재하고 개시하기 위해 본원에 명백히 포함된다. 전술한 발명이 명쾌한 이해를 위한 실례 및 예시로서 일부 상세히 기재되지만, 본 발명의 교시의 관점에 있어서 첨부된 청구항의 취지 및 범주에서 벗어나지 않고 특정 변화 및 변경이 발명에 대해 만들어질 수 있다는 것이 당업자에게 용이하게 명백할 것이다.
실시예 1: 재조합 쿠주 이소프렌 신타아제를 발현하는 대장균에서의 이소프렌의 생성
I. 대장균에서 쿠주 이소프렌 신타아제를 발현하기 위한 벡터의 구성
쿠주 (푸에라리아 몬타나) 이소프렌 신타아제 유전자 (IspS)에 대한 단백질 서열을 GenBank (AAQ84170)에서 수득하였다. 대장균 코돈 사용을 위해 최적화된 쿠주 이소프렌 신타아제 유전자를 DNA2.0에서 구매하였다 (SEQ ID NO:1). BspLU11I/PstI으로 제한 엔도뉴클레아제 소화시켜 이소프렌 신타아제 유전자를 공급 플라스미드로부터 제거하고, 겔-정제하고, NcoI/PstI으로 소화된 pTrcHis2B (Invitrogen)에 라이게이션하였다. 이소프렌 신타아제 유전자 내의 정지 코돈이 PstI 위치에 대해 5'가 되도록 구성물을 설계하였다. 결과로서, 구성물이 발현되는 경우 His-표지가 이소프렌 신타아제 단백질에 결합하지 않는다. 생성된 플라스미드, pTrcKudzu를 서열분석으로 확인하였다 (도 2 및 3).
이소프렌 신타아제 유전자를 pET16b (Novagen)에 클로닝하였다. 이러한 경우, 재조합 이소프렌 신타아제 단백질이 N-말단 His 표지를 함유하도록 이소프렌 신타아제 유전자를 pET16b에 삽입하였다. 프라이머 세트 pET-His-Kudzu-2F: 5'-CGTGAGATCATATGTGTGCGACCTCTTCTCAATTTAC (SEQ ID NO:3) 및 pET-His-Kudzu-R: 5'-CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAGCTG (SEQ ID NO:4)를 사용하여 PCR로 pTrcKudzu로부터 이소프렌 신타아제 유전자를 증폭하였다. 이들 프라이머는 각각 유전자의 5'-말단에서 NdeI 위치, 및 3'-말단에서 BamHI 위치를 첨가한다. 상기 기재된 플라스미드 pTrcKudzu를 주형 DNA로서 사용하고, Herculase 중합효소 (Stratagene)를 제조사의 지시에 따라 사용하고, 프라이머를 10 pMol의 농도로 첨가하였다. PCR를 25 ㎕의 총 부피로 실행하였다. PCR 생성물을 NdeI/BamHI으로 소화시키고, 동일한 효소로 소화된 pET16b에 클로닝하였다. 라이게이션 믹스를 대장균 Top 10 (Invitrogen)에 형질전환하고 서열분석으로 올바른 클론을 선별하였다. 쿠주 이소프렌 신타아제 유전자가 T7 프로모터로부터 발현된 생성된 플라스미드를 pETNHisKudzu로 지정하였다 (도 4 및 5).
또한 쿠주 이소프렌 신타아제 유전자를 낮은 카피 수 플라스미드 pCL1920에 클로닝하였다. 프라이머를 사용하여 상기 기재된 pTrcKudzu로부터 쿠주 이소프렌 신타아제 유전자를 증폭하였다. 정방향 프라이머는 HindIII 위치 및 대장균 공통 (consensus) RBS를 5' 말단에 첨가하였다. PstI 클로닝 위치는 이미 pTrcKudzu 정지 코돈의 바로 3'에 존재하며, 따라서 역방향 프라이머를 최종 PCR 생성물이 PstI 위치를 포함하도록 구성하였다. 프라이머의 서열은 하기와 같다: HindIII-rbs-Kudzu F: 5'-CATATGAAAGCTTGTATCGATTAAATAAGGAGGAATAAACC (SEQ ID NO:6) 및 BamHI-Kudzu R: 5'-CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAGCTG (SEQ ID NO:4). 10 pmol 농도의 프라이머 및 1 ng의 주형 DNA (pTrcKudzu)와 함께 Herculase 중합효소를 사용하여 PCR 생성물을 증폭하였다. 증폭 프로토콜에는 [95℃에서 1분, 60℃에서 1분, 72℃에서 2분]의 30 사이클이 포함되었다. 생성물을 HindIII 및 PstI으로 소화시키고, HindIII 및 PstI으로 또한 소화된 pCL1920에 라이게이션시켰다. 라이게이션 믹스를 대장균 Top 10에 형질전환하였다. 여러 형질전환체를 서열분석으로 확인하였다. 생성된 플라스미드를 pCL-lac-Kudzu로 지정하였다 (도 6 및 7).
II. 이소프렌 생성의 측정
진탕 플라스크 배양물에 대해, 1 ㎖의 배양물을 진탕 플라스크로부터 20 ㎖ CTC 상부공간 바이알 (Agilent 바이알 카탈로그 번호 5188 2753; 마개 카탈로그 번호 5188 2759)로 옮겼다. 마개를 단단히 조이고, 바이알을 250 rpm에서 진탕하면서 동등한 온도에서 인큐베이션하였다. 30분 후 바이알을 인큐베이터에서 제거하고 하기 기재한 바와 같이 분석하였다 (이러한 검정으로부터의 일부 실험적 값에 대하여 표 1 참조).
발효기 내의 이소프렌 생성이 측정된 경우, 발효기의 배출 기체로부터 샘플을 취하고 하기 기재된 바와 같이 직접적으로 분석하였다 (이러한 검정으로부터의 일부 실험적 값에 대하여 표 2 참조).
상부공간 방식으로 작동하는 CTC Analytics (Switzerland) CombiPAL 오토샘플러가 연결된 Agilent 6890 GC/MS 시스템을 사용하여 분석을 수행하였다. Agilent HP-5MS GC/MS 컬럼 (30 m x 0.25 mm; 0.25 ㎛ 필름 두께)을 분석물을 분리하는데 사용하였다. 샘플러를 500 ㎕의 상부공간 기체가 주입되도록 설정하였다. GC/MS 방법은 1 ㎖/분의 흐름으로 담체로서 헬륨을 이용하였다. 주입 포트를 50:1의 살포 비율로 250℃에서 고정하였다. 분석하는 동안 오븐 온도를 37℃에서 2분 동안 고정하였다. Agilent 5793N 질량 선택 검출기를 m/z 67 상 단일 이온 모니터링 (SIM) 방식으로 실행시켰다. 검출기를 1.4 내지 1.7분에서 스위치를 꺼서 영구 기체가 용리되게 하였다. 이들 조건 하에 이소프렌 (2-메틸-1,3-부타디엔)이 관찰되어 1.78분에서 용리하였다. 교정 표를 사용하여 이소프렌의 절대량을 정량하였고, 1 ㎍/L 내지 200 ㎍/L로 선형인 것으로 발견되었다. 검출 한계는 이러한 방법을 사용하여 50 내지 100 ng/L인 것으로 추정되었다.
III. 재조합 이소프렌 신타아제를 발현하는 대장균 세포를 함유하는 진탕 플라스크에서의 이소프렌 생성
상기 기재된 벡터를 대장균 균주 BL21 (Novagen)에 도입하여 균주 BL21/ptrcKudzu, BL21/pCL-lac-Kudzu 및 BL21/pETHisKudzu를 생성시켰다. 단리를 위해 상기 균주를 LA (루리아 한천) 및 카르베니실린 (50 ㎍/㎖) 상에 스프레딩하고 37℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 단일 콜로니를 20 ㎖ 루리아 베르타니 브로쓰 (LB) 및 카르베니실린 (100 ㎍/㎖)을 함유하는 250 ㎖ 배플드 (baffled) 진탕 플라스크에 접종하였다. 배양물을 200 rpm에서 진탕하면서 20℃에서 하룻밤 동안 성장시켰다. 하룻밤 배양물의 OD600을 측정하고 배양물을 30 ㎖ MagicMedia (Invitrogen) 및 카르베니실린 (100 ㎍/㎖)을 함유하는 250 ㎖ 배플드 진탕 플라스크 내로 OD600 약 0.05가 되도록 희석하였다. 배양물을 200 rpm에서 진탕하면서 30℃에서 인큐베이션하였다. OD60O 약 0.5~0.8일 때 400 μM IPTG를 첨가하고 세포를 추가 6시간 동안 200 rpm에서 진탕하면서 30℃에서 인큐베이션하였다. IPTG로 유도한 0, 2, 4 및 6시간 후, 배양물의 1 ㎖ 분취액을 수집하고, OD600을 측정하고 생성된 이소프렌의 양을 상기 기재된 바와 같이 측정하였다. 결과를 도 8에 나타내었다.
IV. 14ℓ 발효에서 BL21/ptrcKudzu로부터 이소프렌의 생성
재조합 쿠주 이소프렌 신타아제 유전자를 함유하는 대장균으로부터의 이소프렌의 대규모 생성이 유가식 배양에서 측정되었다. 발효 배지의 ℓ 당 발효 배지 (TM2)의 제조 방법은 하기와 같다: K2HPO4 13.6 g, KH2PO4 13.6 g, MgSO4 * 7H2O 2 g, 시트르산 일수화물 2 g, 구연산 철 암모늄 0.3 g, (NH4)2SO4 3.2 g, 효모 추출물 5 g, 1000X 변형 미량 금속 용액 1 ㎖. 모든 성분을 diH2O에 함께 첨가하고 용해하였다. 수산화칼륨 (KOH)으로 pH를 6.8로 조정하고 부피에 대해 충분량이 되게 하였다. 최종 생성물을 0.22 μ 필터 (단독, 오토클레이브하지 않은)로 여과 멸균하였다. 1000X 변형 미량 금속 용액에 대한 제조 방법은 하기와 같다: 시트르산 * H2O 40 g, MnSO4 * H2O 30 g, NaCl 10 g, FeSO4 * 7H2O 1 g, CoCl2 * 6H2O 1 g, ZnSO * 7H2O 1 g, CuSO4 * 5H2O 100 mg, H3BO3 100 mg, NaMoO4 * 2H2O 100 mg. 각각의 성분을 diH2O에 한번에 하나씩 용해하고, HCl/NaOH로 pH를 3.0이 되게 하고, 부피에 대해 충분량이 되게 하고 0.22 μ 필터로 여과 멸균하였다.
이러한 실험을 14ℓ 생물반응기에서 실행하여 원하는 발효, pH 6.7 및 온도 34℃에서 글루코오스로부터 이소프렌이 형성되는 것을 모니터링하였다. 동결 바이알에서 취한 대장균 균주 BL21/ptrcKudzu의 접종물을 소이톤-효모 추출물-글루코오스 배지에서 제조하였다. 접종물이 OD550 = 0.6으로 성장한 후, 두 개의 600 ㎖ 플라스크를 원심분리하고, 세포 펠릿을 생물반응기에 옮기기 위해 내용물을 70 ㎖ 상청액에 재현탁하였다 (70 ㎖의 OD 3.1 물질). 접종 후 다양한 시간 지점에서, 샘플을 제거하고 생성된 이소프렌의 양을 상기 기재한 바와 같이 측정하였다. 결과를 도 9에 나타내었다.
실시예 2: 재조합 포플러 이소프렌 신타아제를 발현하는 대장균에서의 이소프렌의 생성
포플러 (포풀루스 알바 x 포풀루스 트레물라) 이소프렌 신타아제에 대한 단백질 서열 (Schnitzler, J-P, 등. (2005) Planta 222:777-786)을 GenBank (CAC35696)에서 수득하였다. 대장균에 대해 코돈 최적화된 유전자를 DNA2.0d에서 구매하였다 (p9796-poplar, 도 30 및 31). BspLU11I/PstI으로 제한 엔도뉴클레아제 소화시켜 이소프렌 신타아제 유전자를 공급 플라스미드로부터 제거하고, 겔-정제하고, NcoI/PstI으로 소화된 pTrcHis2B에 라이게이션하였다. 이소프렌 신타아제 유전자를 공급 플라스미드로부터 제거하였다. 삽입물 내의 정지 코돈이 PstI 위치 전에 있도록 구성물을 클로닝하여, His-표지가 이소프렌 신타아제 단백질에 결합하지 않게 하였다. 생성된 플라스미드 pTrcPoplar (도 32 및 33)를 서열분석으로 확인하였다.
실시예 3: 재조합 쿠주 이소프렌 신타아제를 발현하는 판토에아 시트레아에서의 이소프렌의 생성
실시예 1에서 기재된 pTrcKudzu 및 pCL-lac Kudzu 플라스미드를 P. 시트레아 내로 전기천공하였다 (미국 특허 제 7,241,587 호). 각각 카르베니실린 (200 ㎍/㎖) 또는 스펙티노마이신 (50 ㎍/㎖)을 함유하는 LA에서 형질전환체를 선별하였다. 진탕 플라스크로부터의 이소프렌의 생성 및 생성된 이소프렌 양의 측정을 재조합 쿠주 이소프렌 신타아제를 발현하는 대장균 균주에 대해 실시예 1에서 기재된 바와 같이 수행하였다. 결과를 도 10에 나타내었다.
실시예 4: 재조합 쿠주 이소프렌 신타아제를 발현하는 바실러스 서브틸리스에서의 이소프렌의 생성
I. 쿠주 이소프렌 신타아제의 발현을 위한 B. 서브틸리스 복제 플라스미드의 구성
aprE 프로모터의 조절 하에 복제 플라스미드 (클로람페니콜 내성 카세트를 갖는 pBS19)를 사용하여 쿠주 이소프렌 신타아제 유전자를 바실러스 서브틸리스 aprEnprE Pxyl-comK 균주 (BG3594comK)에서 발현시켰다. 이소프렌 신타아제 유전자, aprE 프로모터 및 전사 터미네이터를 PCR을 사용하여 개별적으로 증폭하고 융합하였다. 구성물을 이후 pBS19에 클로닝하고 B. 서브틸리스에 형질전환시켰다.
a) aprE 프로모터의 증폭
하기의 프라이머를 사용하여 바실러스 서브틸리스의 염색체 DNA에서 aprE 프로모터를 증폭하였다:
CF 797 (+) 시작 aprE 프로모터 MfeI
5'-GACATCAATTGCTCCATTTTCTTCTGCTATC (SEQ ID NO:58)
CF 07-43 (-) Kudzu ispS에 대한 aprE 프로모터 융합
5'-ATTGAGAAGAGGTCGCACACACTCTTTACCCTCTCCTTTTA (SEQ ID NO:59)
b) 이소프렌 신타아제 유전자의 증폭
쿠주 이소프렌 신타아제 유전자를 플라스미드 pTrcKudzu로부터 증폭하였다 (SEQ ID NO:2). 유전자를 대장균에 대해 코돈 최적화하고 DNA 2.0으로 합성하였다. 하기 프라이머를 사용하였다:
CF 07-42 (+) 쿠주 이소프렌 신타아제 유전자에 대한 aprE 프로모터 융합 (GTG 시작 코돈)
5'-TAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGTGTGCGACCTCTTCTCAAT (SEQ ID NO:60)
CF 07-45 (-) 터미네이터에 대한 쿠주 이소프렌 신타아제의 3' 말단 융합
5'-CCAAGGCCGGTTTTTTTTAGACATACATCAGCTGGTTAATC (SEQ ID NO:61)
c) 전사 터미네이터의 증폭
하기의 프라이머를 사용하여, 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스의 알칼리 세린 프로테아제로부터의 터미네이터를 이전에 서열분석된 플라스미드 pJHPms382로부터 증폭하였다:
CF 07-44 (+) 터미네이터에 대한 쿠주 이소프렌 신타아제의 3' 말단 융합
5'-GATTAACCAGCTGATGTATGTCTAAAAAAAACCGGCCTTGG (SEQ ID NO:62)
CF 07-46 (-) B. 아밀로리쿠에파시엔스 터미네이터의 말단 (BamHI)
5'-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (SEQ ID NO:63)
하기의 프라이머로 PCR을 사용하여 쿠주 절편을 터미네이터 절편에 융합하였다:
CF 07-42 (+) 쿠주 이소프렌 신타아제 유전자에 대한 aprE 프로모터 융합 (GTG 시작 코돈)
5'-TAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGTGTGCGACCTCTTCTCAAT (SEQ ID NO:61)
CF 07-46 (-) B. 아밀로리쿠에파시엔스 터미네이터의 말단 (BamHI)
5'-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (SEQ ID NO:63)
하기의 프라이머로 PCR을 사용하여 쿠주-터미네이터 절편을 프로모터 절편에 융합하였다:
CF 797 (+) 시작 aprE 프로모터 MfeI
5'-GACATCAATTGCTCCATTTTCTTCTGCTATC (SEQ ID NO:64)
CF 07-46 (-) B. 아밀로리쿠에파시엔스 터미네이터의 말단 (BamHI)
5'-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (SEQ ID NO:63)
Qiagen 키트를 사용하여 융합 PCR 절편을 정제하고 제한 효소 MfeI 및 BamHI으로 소화시켰다. 이러한 소화된 DNA 절편을 Qiagen 키트를 사용하여 겔 정제하고, EcoRI 및 BamHI으로 소화된 pBS19으로 알려진 벡터에 라이게이션하고 겔 정제하였다.
라이게이션 믹스를 대장균 Top 10 세포에 형질전환시키고, LA 및 50 카르베니실린 플레이트 상에서 콜로니를 선별하였다. 총 6개 콜로니를 선택하고 LB 및 50 카르베니실린에서 하룻밤 동안 성장시킨 후, Qiagen 키트를 사용하여 플라스미드를 단리하였다. 플라스미드를 EcoRI 및 BamHI으로 소화시켜 삽입물에 대해 확인하고, 하기의 프라이머로의 서열분석을 위해 3개의 올바른 플라스미드를 발송하였다:
CF 149 (+) aprE 프로모터의 EcoRI 출발
5'-GACATGAATTCCTCCATTTTCTTCTGC (SEQ ID NO:65)
CF 847 (+) pXX 049에서의 서열 (aprE 프로모터의 말단)
5'-AGGAGAGGGTAAAGAGTGAG (SEQ ID NO:66)
CF 07-45 (-) 터미네이터에 대한 쿠주 이소프렌 신타아제의 3' 말단 융합
5'-CCAAGGCCGGTTTTTTTTAGACATACATCAGCTGGTTAATC (SEQ ID NO:61)
CF 07-48 (+) 쿠주 이소프렌 신타아제에 대한 서열분석 프라이머
5'-CTTTTCCATCACCCACCTGAAG (SEQ ID NO:67)
CF 07-49 (+) 쿠주 이소프렌 신타아제에서의 서열분석
5'-GGCGAAATGGTCCAACAACAAAATTATC (SEQ ID NO:68)
pBS Kudzu #2로 지정된 플라스미드 (도 52 및 12)를 서열분석으로 바로잡고, BG 3594 comK, 바실러스 서브틸리스 숙주 균주에 형질전환시켰다. LA 및 5 클로람페니콜 플레이트 상에서 선별하였다. 형질전환체를 LA 및 5 클로람페니콜 상에서 선택하고 단일 콜로니를 분리한 후, 1.5의 OD600이 될 때까지 LB 및 5 클로람페니콜에서 성장시켰다. 글리세롤의 존재 하에 -80℃에서 바이알 내에 동결 보관하였다. 생성된 균주를 CF 443으로 지정하였다.
II. 재조합 이소프렌 신타아제를 발현하는 B. 서브틸리스 세포를 함유하는 진탕 플라스크에서의 이소프렌의 생성
하룻밤 배양물에 LA 및 클로람페니콜 (Cm, 25 ㎍/㎖)로부터의 CF 443의 단일 콜로니를 접종하였다. 배양물을 LB 및 Cm에서 200 rpm에서 진탕하면서 37℃에서 성장시켰다. 이들 하룻밤 배양물 (1 ㎖)을, 25 ㎖ Grants II 배지 및 클로람페니콜을 함유하는 250 ㎖ 배플드 진탕 플라스크에 25 ㎍/㎖의 최종 농도로 접종하는데 사용하였다. Grants II 배지의 제조 방법은 하기와 같고: 10 g 소이톤, 3 ㎖ 1M K2HPO4, 75 g 글루코오스, 3.6 g 우레아, 100 ㎖ 10X MOPS, 1ℓ가 되게 하는 충분량의 H2O, pH 7.2; 10X MOPS 제조 방법은 하기와 같으며: 83.72 g MOPS, 7.17 g 트리신 (tricine), 12 g KOH 펠릿, 10 ㎖ 0.276M K2SO4 용액, 10 ㎖ 0.528M MgCl2 용액, 29.22 g NaCl, 100 ㎖ 100X 미량영양소, 1ℓ가 되게 하는 충분량의 H2O; 100X 미량영양소의 제조 방법은 하기와 같다: 1.47 g CaCl2*2H2O, 0.4 g FeSO4*7H20, 0.1 g MnSO4*H20, 0.1 g ZnSO4*H2O, 0.05 g CuCl2*2H2O, 0.1 g CoCl2*6H2O, 0.1 g Na2MoO4*2H2O, 1ℓ가 되게 하는 충분량의 H2O. 진탕 플라스크를 37℃에서 인큐베이션하고, 샘플을 18, 24 및 44시간에 취하였다. 18시간에서, CF443 및 대조군 균주의 상부공간을 샘플링하였다. 이는 이소프렌의 18시간의 축적을 나타내었다. 이소프렌의 양을 실시예 1에서 기재한 바와 같이 기체 크로마토그래피로 측정하였다. 이소프렌의 생성은 재조합 이소프렌 신타아제를 발현시킴으로써 유의하게 증강되었다 (도 11).
III. 14ℓ 발효에서 CF443에 의한 이소프렌의 생성
복제 플라스미드 상에서 재조합 쿠주 이소프렌 신타아제 유전자를 함유하는 B. 서브틸리스로부터의 이소프렌의 대규모 생성이 유가식 배양에서 측정되었다. 쿠주 이소프렌 신타아제 유전자를 발현하는 바실러스 균주 CF 443, 또는 쿠주 이소프렌 신타아제 유전자를 발현하지 않는 대조군 균주를 대두박 (Cargill), 인산나트륨 및 인산 칼륨, 황화마그네슘 및 시트르산 용액, 염화 제2철 및 염화망간을 함유하는 영양 배지에서의 통상적인 유가식 발효에 의해 배양하였다. 발효 전, 배지를 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제 및 펙티나아제를 포함하는 효소의 혼합물을 사용하여 90분 동안 연화시켰다 (WO95/04134 참조). 14ℓ 회분식 발효에 60% wt/wt 글루코오스 (Cargill DE99 덱스트로오스, ADM Versadex greens 또는 Danisco 반전당) 및 99% wt/wt 오일 (Western Family 콩기름, 99% wt/wt는 세포 배양 배지에 첨가되기 전 오일의 농도임)을 공급하였다. 회분 내의 글루코오스가 측정불가할 때 공급을 시작하였다. 공급 속도는 몇 시간에 걸쳐 사면화하였고, 동일한 탄소 기준에서 오일이 첨가되어 조정되었다. 28% w/v 수산화암모늄을 사용하여 pH를 6.8~7.4로 조절하였다. 거품의 경우에는 항거품제를 배지에 첨가하였다. 발효 온도를 37℃에서 조절하고, 발효 배양물을 750 rpm에서 휘저었다. pH, DO%, 공기흐름 및 압력과 같은 다양한 기타 매개변수를 전체 절차 동안 내내 모니터링하였다. DO%를 20 초과로 유지하였다. 샘플을 36시간의 시간 추이에 걸쳐 취하고, 세포 성장 (OD550) 및 이소프렌 생성에 대해 분석하였다. 이들 실험의 결과를 도 53A 및 53B에 나타내었다.
IV. B. 서브틸리스에서 쿠주 이소프렌 신타아제 (ispS)의 융합
쿠주 이소프렌 신타아제 유전자를 aprE 프로모터의 조절 하에 융합 플라스미드 (pJH101-cmpR)에서 클로닝하였다. 시험한 조건 하에서는 이소프렌이 검출되지 않았다.
실시예 5: 트리코데르마에서의 이소프렌의 생성
I. 트리코데르마 레에세이에서의 쿠주 이소프렌 신타아제의 발현을 위한 벡터의 구성
야로위야 리포리티카 코돈-최적화된 쿠주 IS 유전자를 DNA 2.0에 의해 합성하였다 (SEQ ID NO:8) (도 13). 상기 플라스미드는 하기의 PCR 증폭 반응을 위한 주형으로서 역할하였다: 1 ㎕ 플라스미드 주형 (20 ng/ul), 1 ㎕ 프라이머 EL-945 (10 uM) 5'-GCTTATGGATCCTCTAGACTATTACACGTACATCAATTGG (SEQ ID NO:9), 1 ㎕ 프라이머 EL-965 (10 uM) 5'-CACCATGTGTGCAACCTCCTCCCAGTTTAC (SEQ ID NO:10), 1 ㎕ dNTP (10 mM), 5 ㎕ 10x PfuUltra II 융합 HS DNA 중합효소 완충액, 1 ㎕ PfuUltra II 융합 HS DNA 중합효소, 40 ㎕ 물 (총 반응 부피 50 ㎕). 정방향 프라이머에는 Y. 리포리티카 코돈-최적화된 쿠주 이소프렌 신타아제 유전자에 상응하지 않지만 pENTR/D-TOPO 벡터에 클로닝하기 위해 필요한 추가적인 4개 뉴클레오티드가 5'-말단에 포함되었다. 역방향 프라이머에는 Y. 리포리티카 코돈-최적화된 쿠주 이소프렌 신타아제 유전자에 상응하지 않지만 다른 벡터 골격에 클로닝하기 위해 삽입된 추가적인 21개 뉴클레오티드가 5'-말단에 포함되었다. MJ Research PTC-200 써모사이클러를 사용하여, 하기와 같이 PCR 반응을 수행하였다: 95℃에서 2분 (첫 사이클에서만), 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초 (27 사이클 동안 반복), 마지막 사이클 후 72℃에서 1분. PCR 생성물을 1.2% E-겔 상에서 분석하여 Y. 리포리티카 코돈-최적화된 쿠주 이소프렌 신타아제 유전자의 성공적인 증폭을 확인하였다.
이후, 제조사의 프로토콜에 따라 TOPO pENTR/D-TOPO 클로닝 키트를 사용하여 PCR 생성물을 클로닝하였다: 1 ㎕ PCR 반응, 1 ㎕ 염 용액, 1 ㎕ TOPO pENTR/D-TOPO 벡터 및 3 ㎕ 물 (총 반응 부피 6 ㎕). 반응물을 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 1 ㎕의 TOPO 반응물을 TOP 10 화학적 수용성 (competent) 대장균 세포에 형질전환시켰다. 형질전환체를 LA 및 50 ㎍/㎖ 카나마이신 플레이트 상에서 선별하였다. 여러 콜로니를 고르고, 각각을 LB 및 50 ㎍/㎖ 카나마이신을 함유하는 5 ㎖ 튜브에 접종하고, 배양물을 200 rpm에서 진탕하면서 37℃에서 하룻밤 동안 성장시켰다. 제조사의 프로토콜에 따라, QIAprep Spin Miniprep 키트를 사용하여 하룻밤 배양 튜브에서 플라스미드를 단리하였다. 여러 플라스미드를 서열분석하여 DNA 서열이 올바른지 확인하였다.
Y. 리포리티카 코돈-최적화된 쿠주 이소프렌 신타아제 유전자를 인코딩하는 단일 pENTR/D-TOPO 플라스미드를, 주문 제작된 pTrex3g 벡터에 게이트웨이 클로닝 (Gateway Cloning)하는데 사용하였다. pTrex3g의 구성은 WO 2005/001036 A2에 기재되어 있다. 게이트웨이 LR 클로나아제 (Clonase) II 효소 믹스 키트 (Invitrogen)에 대한 제조사의 프로토콜에 따라 반응을 수행하였다: 1 ㎕ Y. 리포리티카 코돈-최적화된 쿠주 이소프렌 신타아제 유전자 pENTR/D-TOPO 공여자 벡터, 1 ㎕ pTrex3g 목적지 벡터, 6 ㎕ TE 완충액, pH 8.0 (총 반응 부피 8 ㎕). 반응물을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 1 ㎕ 프로테이나아제 K 용액을 첨가하고 37℃에서 10분 동안 인큐베이션을 지속하였다. 이후 1 ㎕의 반응물을 TOP 10 화학적 수용성 대장균 세포에 형질전환시켰다. 형질전환체를 LA 및 50 ㎍/㎖ 카르베니실린 플레이트 상에서 선별하였다. 여러 콜로니를 고르고, 각각을 LB 및 50 ㎕g/㎖ 카르베니실린을 함유하는 5 ㎖ 튜브에 접종하고 배양물을 200 rpm에서 진탕하면서 37℃에서 하룻밤 동안 성장시켰다. 제조사의 프로토콜에 따라, QIAprep Spin Miniprep 키트 (Qiagen, Inc.)를 사용하여 하룻밤 배양 튜브에서 플라스미드를 단리하였다. 여러 플라스미드를 서열분석하여 DNA 서열이 올바른지 확인하였다.
Y. 리포리티카 코돈-최적화된 쿠주 이소프렌 신타아제 pTrex3g 플라스미드 (도 14)의 쿼드 삭제 트리코데르마 레에세이 균주로의 유전자총 (Biolistic) 형질전환을 유전자총 PDS-1000/HE 입자 전달 시스템을 사용하여 수행하였다 (WO 2005/001036 A2 참조). 특허 출원 WO 2005/001036 A2의 실시예 11에 열거된 프로토콜을 사용하여 안정적인 형질전환체의 단리 및 진탕 플라스크 평가를 수행하였다.
II. T. 레에세이의 재조합 균주에서의 이소프렌의 생성
상기 기재된 이소프렌 신타아제의 15 및 36시간 배양물 1 ㎖를 상부공간 바이알에 옮겼다. 바이알을 밀봉하고 30℃에서 5시간 동안 인큐베이션하였다. 상부공간 기체를 측정하고, 실시예 1에서 기재된 방법으로 이소프렌을 확인하였다. 형질전환체 중 2개가 미량의 이소프렌을 나타내었다. 이소프렌의 양은 14시간 인큐베이션에 의해 증가될 수 있었다. 2개의 양성 샘플은 14시간 인큐베이션에 대해 약 0.5 ㎍/L의 수준으로 이소프렌을 나타내었다. 미형질전환된 대조군은 검출가능한 수준의 이소프렌을 나타내지 않았다. 상기 실험은 외생 이소프렌 신타아제가 공급되는 경우 T. 레에세이가 내인성 전구체로부터 이소프렌을 생성할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 6: 야로위야에서의 이소프렌의 생성
I. 야로위야 리포리티카에서의 쿠주 이소프렌 신타아제의 발현을 위한 벡터의 구성
야로위야 리포리티카에서 쿠주 이소프렌 신타아제 유전자를 발현하기 위한 벡터의 구성을 위한 시작점은 벡터 pSPZ1 (MAP29Spb)이었다. 상기 벡터의 완전한 서열 (SEQ ID No:11)을 도 15에 나타내었다.
주형으로서 Y. 리포리티카 균주 GICC 120285의 염색체 DNA를 사용하여 PCR로 하기 절편을 증폭하였다: URA3 유전자의 프로모터 없는 형태, 18S 리보솜 RNA 유전자, Y. 리포리티카 XPR2 유전자의 전사 터미네이터, 및 XPR2 및 ICL1 유전자의 프로모터를 함유하는 두 DNA 절편. 하기의 PCR 프라이머를 사용하였다:
ICL13
5'-GGTGAATTCAGTCTACTGGGGATTCCCAAATCTATATATACTGCAGGTGAC (SEQ ID NO:69)
ICL15
5'-GCAGGTGGGAAACTATGCACTCC (SEQ ID NO:70)
XPR3
5'-CCTGAATTCTGTTGGATTGGAGGATTGGATAGTGGG (SEQ ID NO:71)
XPR5
5'-GGTGTCGACGTACGGTCGAGCTTATTGACC (SEQ ID NO:72)
XPRT3
5'-GGTGGGCCCGCATTTTGCCACCTACAAGCCAG (SEQ ID NO:73)
XPRT5
5'-GGTGAATTCTAGAGGATCCCAACGCTGTTGCCTACAACGG (SEQ ID NO:74)
Y18S3
5'-GGTGCGGCCGCTGTCTGGACCTGGTGAGTTTCCCCG (SEQ ID NO:75)
Y18S5
5'-GGTGGGCCCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAG (SEQ ID NO:76)
YURA3
5'-GGTGACCAGCAAGTCCATGGGTGGTTTGATCATGG (SEQ ID NO:77)
YURA50
5'-GGTGCGGCCGCCTTTGGAGTACGACTCCAACTATG (SEQ ID NO:78)
YURA51
5'-GCGGCCGCAGACTAAATTTATTTCAGTCTCC (SEQ ID NO:79)
PCR 증폭을 위해 PfuUltraII 중합효소 (Stratagene), 공급자-제공된 완충액 및 dNTP, 2.5 ㎛ 프라이머 및 표시된 주형 DNA를 제조사의 지시사항에 따라 사용하였다. 하기의 사이클을 사용하여 증폭을 수행하였다: 95℃에서 1분; 34x (95℃에서 30초; 55℃에서 30초; 72℃에서 3분) 및 72℃에서 10분 후 4℃ 인큐베이션.
야로위야에서의 발현을 위해 코돈-최적화된 쿠주 이소프렌 신타아제 유전자를 인코딩하는 합성 DNA 분자를 DNA 2.0에서 수득하였다 (도 16; SEQ ID NO:12). 각각 XPR2 및 ICL1 프로모터의 조절 하에 합성 쿠주 이소프렌 신타아제 유전자를 수반하는 플라스미드 pYLA(KZ1) 및 pYLI(KZ1)의 구성 도식의 전체 세부사항을 도 18에 나타내었다. 접합 인자 유전자 (MAP29)가 이소프렌 신타아제 유전자 대신에 삽입된 대조군 플라스미드를 또한 구성하였다 (도 18E 및 18F).
유사한 클로닝 절차를 사용하여 포플러 (포풀루스 알바 x 포풀루스 트레물라) 이소프렌 신타아제 유전자를 발현시켰다. 포플러 이소프렌의 서열은 [Miller B. 등. (2001) Planta 213, 483-487]에서 기재되며, 이를 도 17에 나타내었다 (SEQ ID NO:13). 각각 XPR2 및 ICL1 프로모터의 조절 하에 합성 포플러 이소프렌 신타아제 유전자를 수반하는 플라스미드 pYLA(POP1) 및 pYLI(POP1)을 생성하기 위한 구성 도식을 도 18A 및 B에 나타내었다.
II. Y. 리포리티카의 재조합 균주에 의한 이소프렌의 생성
벡터 pYLA(KZ1), pYLI(KZ1), pYLA(MAP29) 및 pYLI (MAP29)를 SacII로 소화시키고, 우리딘 원영양성 (prototrophy)에 대한 표준 리튬 아세테이트/폴리에틸렌 글리콜 절차에 의해 균주 Y. 리포리티카 CLIB 122를 형질전환하는데 사용하였다. 간략하게는, YEPD (1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 2% 글루코오스)에서 하룻밤 동안 성장시킨 효모 세포를 원심분리 (4000 rpm, 10분)로 수집하고, 멸균수로 1회 세척하고 0.1 M 리튬 아세테이트 (pH 6.0)에 현탁하였다. 세포 현탁액의 200 ㎕ 분취액을 선형화 플라스미드 DNA 용액 (10~20 ㎍)과 혼합하고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션하고, 동일한 완충액에서의 50% PEG 4000 1 ㎖과 혼합하였다. 현탁액을 실온에서 1시간 동안 추가로 인큐베이션한 후 42℃에서 2분 열 충격을 주었다. 이후 세포를 SC his leu 플레이트 (0.67% 효모 질소 베이스, 2% 글루코오스, 류신 및 히스티딘 각각 100 mg/L) 상에서 플레이팅하였다. 30℃에서 3~4일 인큐베이션한 후 형질전환체가 나타났다.
pYLA(KZ1) 형질전환에서의 3개 단리물, pYLI(KZ1) 형질전환에서의 3개 단리물, pYLA(MAP29) 형질전환에서의 2개 단리물 및 pYLI(MAP29) 형질전환에서의 2개 단리물을 진탕하면서 30℃에서 YEP7 배지 (1% 효모 추출물, 2% 펩톤, pH 7.0)에서 24시간 동안 성장시켰다. 10 ㎖의 배양물에서의 세포를 원심분리로 수집하고, 3 ㎖의 새로운 YEP7에 재현탁하고 15 ㎖ 나사 마개 바이알에 넣었다. 바이알을 부드럽게 (60 rpm) 진탕하면서 실온에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 이들 바이알의 상부공간 내의 이소프렌 함량을 실시예 1에서 기재된 바와 같이 질량-분석 검출기를 사용하여 기체 크로마토그래피로 분석하였다. pYLA(KZ1) 및 pYLI(KZ1)로 수득된 모든 형질전환체는 쉽게 검출가능한 양의 이소프렌을 생성하였다 (0.5 ㎍/L 내지 1 ㎍/L, 도 20). 이소프렌은 이소프렌 신타아제 유전자 대신 피타아제 유전자를 수반하는 대조군 균주의 상부공간에서 검출되지 않았다.
실시예 7: 쿠주 이소프렌 신타아제 및 idi , 또는 dxs , 또는 idi 및 dxs 를 발현하는 대장균에서의 이소프렌의 생성
I. 대장균에서 이소프렌의 생성을 위한 쿠주 이소프렌 신타아제 및 idi, 또는 dxs, 또는 idi 및 dxs를 인코딩하는 벡터의 구성
i) pTrcKudzuKan의 구성
pTrcKudzu (실시예 1에서 기재된)의 bla 유전자를 카나마이신 내성을 부여하는 유전자로 대체하였다. bla 유전자를 제거하기 위해 pTrcKudzu를 BspHI로 소화시키고, 쉬림프 알칼리 포스파타아제 (SAP)로 처리하고 65℃에서 열 사멸시킨 후, Klenow 절편 및 dNTP로 말단을 채웠다 (end-filled). 5 kbp 크기 절편을 아가로오스 겔에서 정제하고, 프라이머 MCM22 5'-GATCAAGCTTAACCGGAATTGCCAGCTG (SEQ ID NO:14) 및 MCM23 5'-GATCCGATCGTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC (SEQ ID NO:15)를 사용하여 pCR-Blunt-II-TOPO로부터 PCR 증폭된 kanr 유전자에 라이게이션하고, HindIII 및 PvuI으로 소화시키고, 말단을 채웠다. 카나마이신 내성을 부여하는 플라스미드를 수반하는 형질전환체 (pTrcKudzuKan)를 카나마이신 50 ㎍/㎖ 함유 LA 상에서 선별하였다.
ii) pTrcKudzu yIDI Kan의 구성
pTrcKudzuKan을 PstI으로 소화시키고, SAP으로 처리하고, 열 사멸시키고 겔 정제하였다. 이를 합성 RBS를 갖는 S. 세레비지에로부터의 idi를 인코딩하는 PCR 생성물에 라이게이션하였다. PCR용 프라이머는 NsiI-YIDI 1 F 5'-CATCAATGCATCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAAAATGAC (SEQ ID NO:16) 및 PstI-YIDI 1 R 5'-CCTTCTGCAGGACGCGTTGTTATAGC (SEQ ID NO:17)이고; 주형은 S. 세레비지에 게놈 DNA였다. PCR 생성물을 NsiI 및 PstI으로 소화시키고, 라이게이션하기 전에 겔 정제하였다. 라이게이션 혼합물을 화학적 수용성 TOP 10 세포에 형질전환하고, 50 ㎍/㎖ 카나마이신을 함유하는 LA 상에서 선별하였다. 여러 형질전환체를 선별하고 서열분석하고, 생성된 플라스미드를 pTrcKudzu-yIDI(kan)로 지칭하였다 (도 34 및 35).
iii) pTrcKudzu DXS Kan의 구성
플라스미드 pTrcKudzuKan을 PstI으로 소화시키고, SAP으로 처리하고, 열 사멸시키고 겔 정제하였다. 이를 합성 RBS를 갖는 대장균으로부터의 dxs를 인코딩하는 PCR 생성물에 라이게이션하였다. PCR용 프라이머는 MCM 13 5'-GATCATGCATTCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATGAGTTTTGATATTGCCAAATACCCG (SEQ ID NO:18) 및 MCM14 5'-CATGCTGCAGTTATGCCAGCCAGGCCTTGAT (SEQ ID NO:19)이고; 주형은 대장균 게놈 DNA였다. PCR 생성물을 NsiI 및 PstI으로 소화시키고, 라이게이션하기 전에 겔 정제하였다. 생성된 형질전환 반응물을 TOP 10 세포에 형질전환하고, 카나마이신 50 ㎍/㎖을 갖는 LA 상에서 선별하였다. 여러 형질전환체를 단리하고 서열분석하고, 생성된 플라스미드를 pTrcKudzu-DXS(kan)로 지칭하였다 (도 36 및 37).
iv) pTrcKudzu-yIDI-dxs (kan)의 구성
pTrcKudzu-yIDI(kan)을 PstI으로 소화시키고, SAP으로 처리하고, 열 사멸시키고 겔 정제하였다. 이를 합성 RBS를 갖는 대장균 dxs를 인코딩하는 PCR 생성물에 라이게이션 (프라이머 MCM13 5'-GATCATGCATTCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATGAGTTTTGATATTGCCAAATACCCG (SEQ ID NO:18) 및 MCM14 5'-CATGCTGCAGTTATGCCAGCCAGGCCTTGAT (SEQ ID NO:19); 주형 TOP 10 세포) (NsiI 및 PstI으로 소화됨)하고 겔 정제하였다. 최종 플라스미드를 pTrcKudzu-yIDI-dxs (kan)로 지칭하였다 (도 21 및 22).
v) pCL PtrcKudzu의 구성
상기 실시예 1로부터의 프로모터, 구조적 유전자 및 터미네이터를 함유하는 DNA 절편을 SspI을 사용하여 pTrcKudzu로부터 소화시키고 겔 정제하였다. 이를 PvuII로 소화시킨 pCL1920에 라이게이션하고, SAP으로 처리하고 열 사멸시켰다. 생성된 라이게이션 혼합물을 TOP 10 세포에 형질전환하고, 스펙티노마이신 50 ㎍/㎖을 함유하는 LA 상에서 선별하였다. 여러 콜로니를 단리하고 서열분석하고, 두 개를 선별하였다. pCL PtrcKudzu 및 pCL PtrcKudzu (A3)는 반대 위치에서 삽입물을 가졌다 (도 38~41).
vi) pCL PtrcKudzu yIDI의 구성
NsiI-PstI 소화된, 젤 정제된 상기 (ii)로부터의 IDI PCR 암플리콘 (amplicon)을 PstI으로 소화된 pCL PtrcKudzu에 라이게이션하고, SAP으로 처리하고 열 사멸시켰다. 라이게이션 혼합물을 TOP 10 세포에 형질전환하고, 스펙티노마이신 50 ㎍/㎖를 함유하는 LA에서 선별하였다. 여러 클론을 단리하고 서열분석하고, 생성된 플라스미드를 pCL PtrcKudzu yIDI로 지칭하였다 (도 42 및 43).
vii) pCL PtrcKudzu DXS의 구성
NsiI-PstI 소화된, 겔 정제된 상기 (iii)로부터의 DXS PCR 암플리콘을 PstI으로 소화된 pCL PtrcKudzu (A3)에 라이게이션하고, SAP으로 처리하고, 열 사멸시켰다. 라이게이션 혼합물을 TOP 10 세포에 형질전환하고 스펙티노마이신 50 ㎍/㎖을 함유하는 LA에서 선별하였다. 여러 클론을 단리하고 서열분석하고, 생성된 플라스미드를 pCL PtrcKudzu DXS로 지칭하였다 (도 44 및 45).
II. 상이한 카피 수로 쿠주 이소프렌 신타아제, idi 및/또는 dxs를 발현하는 배양물로부터의 상부공간에서의 이소프렌의 측정
플라스미드 pTrcKudzu(kan) (A), pTrcKudzu-yIDI kan (B), pTrcKudzu-DXS kan (C), pTrcKudzu-ylDI-DXS kan (D)로 이미 형질전환된 대장균 BL21 (λDE3)의 배양물을 LB 카나마이신 50 ㎍/㎖에서 성장시켰다. pCL PtrcKudzu (E), pCL PtrcKudzu, pCL PtrcKudzu-yIDI (F) 및 pCL PtrcKudzu-DXS (G)를 LB 스펙티노마이신 50 ㎍/㎖에서 성장시켰다. 400 μM IPTG로 시간 0 (OD600 약 0.5)에서 배양물을 유도하고 및 샘플을 이소프렌 상부공간 측정을 위해 취하였다 (실시예 1 참조). 결과를 도 23A~23G에서 나타내었다.
플라스미드 pTrcKudzu-yIDI-dxs (kan)을 형질전환으로 대장균 균주 BL21에 도입하였다. 생성된 균주 BL21/pTrc Kudzu IDI DXS를 카나마이신 (50 ㎍/㎖) 함유 LB에서 20℃에서 하룻밤 동안 성장시키고, 1% 글루코오스를 함유하는 TM3 (13.6 g K2PO4, 13.6 g KH2PO4, 2.0 g MgSO4*7H2O, 2.0 g 시트르산 일수화물, 0.3 g 구연산 철 암모늄, 3.2 g (NH4)2SO4, 0.2 g 효모 추출물, 1.0 ㎖ 1000x 변형 미량 금속 용액 (pH 6.8로 조정됨) 및 H2O 충분량, 및 여과 멸균됨)의 진탕 플라스크에 접종하는데 사용하였다. 0.8의 OD600에 도달할 때까지 플라스크를 30℃에서 인큐베이션한 후, 400 μM IPTG로 유도하였다. 유도 후 다양한 시간에서 샘플을 취하고, 상부공간 내의 이소프렌의 양을 실시예 1에서 기재된 바와 같이 측정하였다. 결과를 도 23H에 나타내었다.
III. 대장균/pTrcKudzu yIDI DXS에서의 바이오매스로부터의 이소프렌의 생성
균주 BL21 pTrcKudzuIDIDXS를 하기 세 유형의 바이오매스로부터 이소프렌을 생성하는 능력에 대해 시험하였다; 바가스, 옥수수대 및 침엽수 펄프 (대조군으로서 글루코오스). 바이오매스의 가수분해물을 효소적 가수분해에 의해 제조하고 (Brown, L 및 Torget, R., 1996, NREL standard assay method Lap-009 "Enzymatic Saccharification of Lignocellulosic Biomass") 글루코오스 동등물을 기초로 희석에 사용하였다. 상기 실시예에서, 글루코오스 동등물은 1% 글루코오스와 동등하였다. BL21 (DE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan)의 새로이 형질전환된 세포 플레이트로부터의 단일 콜로니를 사용하여 5 ㎖의 LB + 카나마이신 (50 ㎍/㎖)에 접종하였다. 배양물을 진탕하면서 25℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 다음날 하룻밤 배양물을 25 ㎖의 TM3 및 0.2% YE 및 1% 공급원료에서 0.05의 OD600으로 희석하였다. 공급원료는 옥수수대, 바가스 또는 침엽수 펄프였다. 글루코오스를 양성 대조군으로 사용하고, 글루코오스가 없는 것을 음성 대조군으로 사용하였다. 배양물을 180 rpm에서 진탕하면서 30℃에서 인큐베이션하였다. 배양물이 약 0.8의 OD600에 도달할 때 이를 OD600에 대해 모니터링하고, 배양물을 실시예 1에서 기재한 바와 같이 이소프렌 생성에 대해 1 및 3시간에서 분석하였다. 배양물은 유도되지 않았다. 첨가된 공급원료를 함유하는 모든 배양물은 글루코오스 양성 대조군과 동등하게 이소프렌을 생성하였다. 실험을 2 반복하여 수행하였고, 도 46에 나타내었다.
IV. 대장균/pTrcKudzuIDIDXS에서의 반전당으로부터의 이소프렌의 생성
BL21 (λDE3)/pTrcKudzu yIDI DXS (kan)의 새로이 형질전환된 세포 플레이트로부터의 단일 콜로니를 사용하여 5 ㎖의 LB 및 카나마이신 (50 ㎍/㎖)에 접종하였다. 배양물을 진탕하면서 25℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 다음날 하룻밤 배양물을 25 ㎖의 TM3 및 0.2% YE 및 1% 공급원료에서 0.05의 OD600으로 희석하였다. 공급원료는 글루코오스, 반전 글루코오스 또는 옥수수대였다. 반전당 공급원료 (Danisco Invert Sugar)를 효소적 처리 수크로오스 시럽에 의해 제조하였다. AFEX 옥수수대를 하기 기재한 바와 같이 제조하였다 (V 부분). 세포를 30℃에서 성장시키고, 배양물이 약 0.8~1.0의 OD600에 도달할 때 (0시간) 제 1 샘플을 측정하였다. 배양물을, OD600을 측정함으로써 성장에 대해, 및 실시예 1에서와 같이 0, 1 및 3시간에서 이소프렌 생성에 대해 분석하였다. 결과를 도 47에 나타내었다.
V. AFEX 사전처리된 옥수수대로부터의 가수분해물의 제조
AFEX 사전처리된 옥수수대를 Michigan Biotechnology Institute에서 수득하였다. 사전처리 조건은 60% 수분, 1:1 암모니아 로딩, 및 90℃에서 30분 후 자연 건조시켰다. AFEX 사전처리된 옥수수대 내의 수분 함량은 21.27%였다. AFEX 사전처리된 옥수수대 내의 글루칸 및 자일란의 함량은 각각 31.7% 및 19.1% (건조량 기준)였다. 당화 과정은 하기와 같다; 20 g의 AFEX 사전처리된 옥수수대를 5 ㎖의 1 M 나트륨 시트레이트 완충액 pH 4.8, 2.25 ㎖의 Accellerase 1000, 0.1 ㎖의 Grindamyl H121 (제빵 산업용 아스페르길루스 니게르로부터의 Danisco xylanase 제품), 및 72.65 ㎖의 DI 수를 갖는 500 ㎖ 플라스크에 첨가하였다. 플라스크를 궤도 진탕기에 넣고, 96시간 동안 50℃에서 인큐베이션하였다. 진탕기에서 1개의 샘플을 취하고 HPLC를 사용하여 분석하였다. 가수분해물은 38.5 g/L의 글루코오스, 21.8 g/L의 자일로오스, 및 10.3 g/L의 글루코오스 및/또는 자일로오스 올리고머를 함유하였다.
VI. 유가식 배양에서 성장한 대장균에서의 이소프렌 생성에 대한 효모 추출물의 효과
상기 기재된 pTrcKudzu yIDI DXS 플라스미드를 함유하는 대장균 세포로 이전에 기재된 바와 같이 14ℓ 규모에서 발효를 수행하였다. 효모 추출물 (Bio Springer, Montreal, Quebec, Canada)를 지수 증대 속도 (exponential rate)에서 공급하였다. 발효기에 전달된 효모 추출물의 총량은 40시간 발효 동안 70~830 g으로 가변적이었다. 발효 브로쓰의 광학 밀도를 550 nm의 파장에서 측정하였다. 발효기 내의 최종 광학 밀도는 첨가된 효모 추출물의 양에 대해 비례하였다 (도 48A). 발효기로부터의 배출 기체 내의 이소프렌 수준을 이전에 기재된 바와 같이 측정하였다. 이소프렌 역가는 발효의 과정에 걸쳐 증가하였다 (도 48B). 생성된 이소프렌의 양은 공급 효모 추출물의 양에 대해 선형으로 비례하였다 (도 48C).
VII. pTrcKudzu DXS yIDI의 500ℓ 발효에서의 이소프렌의 생성
쿠주 이소프렌 신타아제, S. 세레비지에 IDI 및 대장균 DXS 핵산 (대장균 BL21 (λDE3) pTrc Kudzu dxs yidi)를 갖는 대장균 세포의 500ℓ 발효를 사용하여 이소프렌을 생성하였다. 이소프렌의 수준은 15시간 동안의 시간에 걸쳐 50 내지 300 ㎍/L로 가변적이었다. 평균 이소프렌 농도, 장치를 통한 평균 흐름 및 이소프렌 급등의 함량을 기준으로, 수집된 이소프렌의 양을 약 17 g인 것으로 계산하였다.
VIII. 유가식 배양에서 성장한 대장균의 500ℓ 발효에서의 이소프렌의 생성
배지 제조 방법 (발효 배지 ℓ 당):
K2HPO4 7.5 g, MgSO4 * 7H2O 2 g, 시트르산 일수화물 2 g, 구연산 철 암모늄 0.3 g, 효모 추출물 0.5 g, 1000X 변형 미량 금속 용액 1 ㎖. 모든 성분을 diH2O에 함께 첨가하고 용해하였다. 상기 용액을 오토클레이브하였다. 암모늄 기체 (NH3)로 pH를 7.0으로 조정하고 부피에 대해 충분량이 되게 하였다. 글루코오스 10 g, 티아민 * HCl 0.1 g, 및 항생제를 멸균 및 pH 조정 후 첨가하였다.
1000X 변형 미량 금속 용액:
시트르산 * H2O 40 g, MnSO4 * H2O 30 g, NaCl 10 g, FeSO4 * 7H2O 1 g, CoCl2 * 6H2O 1 g, ZnSO4 * 7H2O 1 g, CuSO4 * 5H2O 100 mg, H3BO3 100 mg, NaMoO4 * 2H2O 100 mg. 각각의 성분을 한번에 하나씩 DI H2O에 용해하고, HCl/NaOH로 pH를 3.0으로 조정한 후 부피에 대해 충분량이 되게 하고, 0.22 마이크론 필터로 여과 멸균하였다.
pTrcKudzu yIDI DXS 플라스미드를 함유하는 대장균 세포를 갖는 500ℓ 생물반응기에서 발효를 수행하였다. 상기 실험을 실행하여 원하는 발효 pH 7.0 및 온도 30℃에서 글루코오스 및 효모 추출물로부터의 이소프렌 형성을 모니터링하였다. 동결 바이알에서 취한 대장균 균주의 접종물을 소이톤-효모 추출물-글루코오스 배지에서 제조하였다. 접종물을 OD 0.15으로 성장시키고 (550 nm에서 측정), 20 ㎖를 사용하여 2.5ℓ 소이톤-효모 추출물-글루코오스 배지를 함유하는 생물반응기에 접종하였다. 2.5ℓ 생물반응기를 30℃에서 OD 1.0로 성장시키고, 2.0ℓ를 500ℓ 생물반응기에 옮겼다.
효모 추출물 (Bio Springer, Montreal, Quebec, Canada) 및 글루코오스를 지수 증대 속도에서 공급하였다. 50시간 발효 동안 생물반응기에 전달된 글루코오스 및 효모 추출물의 총량은 각각 181.2 kg 및 17.6 kg이었다. 시간에 걸친 생물반응기 내의 광학 밀도를 도 49A에 나타내었다. 생물반응기로부터의 배출 기체 내의 이소프렌 수준은 이전에 기재된 바와 같이 측정되었다. 이소프렌 역가는 발효의 과정에 걸쳐 증가하였다 (도 49B). 50시간 발효 동안 생성된 이소프렌의 총량은 55.1 g이고, 생성의 시간 추이를 도 49C에 나타내었다.
실시예 8: 쿠주 이소프렌 신타아제 및 재조합 메발론산 경로 유전자를 발현하는 대장균에서의 이소프렌의 생성
I. 하위 MVA 경로 클로닝
하위 메발론산 경로를 클로닝하기 위한 전략은 하기와 같다. 메발론산 생합성 통로의 네 가지 유전자; 메발로네이트 키나아제 (MVK), 포스포메발로네이트 키나아제 (PMK), 디포스포메발로네이트 데카르복실라아제 (MVD) 및 이소펜테닐 디포스페이트 이성화효소 유전자를 S. 세레비지에 염색체 DNA로부터 PCR로 증폭하고 pCR BluntII TOPO 플라스미드 (Invitrogen) 내에 개별적으로 클로닝하였다. 일부 경우에서, idi 유전자를 대장균 염색체 DNA로부터 증폭하였다. 대장균 공통 RBS (AGGAGGT (SEQ ID NO:80) 또는 AAGGAGG (SEQ ID NO:81))가 5' 말단에 삽입되고, 시작 코돈의 8 bp 상류 및 PstI 위치가 3' 말단에 첨가되도록 프라이머를 설계하였다. 이후, 전체 경로가 어셈블링될 때까지 유전자를 하나씩 pTrcHis2B 벡터에 클로닝하였다.
S. 세레비지에 S288C로부터의 염색체 DNA를 ATCC (ATCC 204508D)에서 수득하였다. 제조사의 지시사항에 따라 PfuTurbo를 사용하여 프라이머 MVKF (5'-AGGAGGTAAAAAAACATGTCATTACCGTTCTTAACTTCTGC, SEQ ID NO:21) 및 MVK-PstI-R (5'-ATGGCTGCAGGCCTATCGCAAATTAGCTTATGAAGTCCATGGTAAATTCGTG, SEQ ID NO:22)을 사용하여 S. 세레비지에의 염색체로부터 MVK 유전자를 증폭하였다. 1.2% E-겔 (Invitrogen)을 통한 전기영동으로 올바른 크기의 PCR 생성물 (1370 bp)을 확인하고 pZeroBLUNT TOPO 내에 클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 pMVK1로 지정하였다. 플라스미드 pMVK1을 SacI 및 Taq 1 제한 엔도뉴클레아제로 소화시키고 절편을 겔 정제하고, SacI 및 BstBI으로 소화된 pTrcHis2B에 라이게이션하였다. 생성된 플라스미드를 pTrcMVK1로 지칭하였다.
메발론산 생합성 경로 내의 제 2 유전자, PMK를 하기 프라이머를 사용하여 증폭하였다: PstI-PMK1 R (5'-GAATTCGCCCTTCTGCAGCTACC, SEQ ID NO:23) 및 BsiHKA I-PMK1 F (5'-CGACTGGTGCACCCTTAAGGAGGAAAAAAACATGTCAG, SEQ ID NO:24). 제조사의 지시사항에 따라 Pfu Turbo 중합효소 (Stratagene)를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 올바른 크기의 생성물 (1387 bp)을 PstI 및 BsiHKI로 소화시키고, PstI로 소화된 pTrcMVK1에 라이게이션하였다. 생성된 플라스미드를 pTrcKK로 지칭하였다. MVD 및 idi 유전자를 동일한 방식으로 클로닝하였다. 프라이머 쌍 PstI-MVD 1 R (5'-GTGCTGGAATTCGCCCTTCTGCAGC, SEQ ID NO:25) 및 NsiI-MVD 1 F (5'-GTAGATGCATGCAGAATTCGCCCTTAAGGAGG, SEQ ID NO:26)를 사용하여 PCR을 실행하여 MVD 유전자 및 PstI- YIDI 1 R (5'-CCTTCTGCAGGACGCGTTGTTATAGC, SEQ ID NO:27) 및 NsiI-YIDI 1 F (5'-CATCAATGCATCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAAAATGAC, SEQ ID NO:28)를 증폭하여 yIDI 유전자를 증폭하였다. 일부 경우에서 IPP 이성화효소 유전자, 대장균으로부터의 idi를 사용하였다. 대장균으로부터의 idi를 증폭하기 위해, 하기의 프라이머 세트를 사용하였다: PstI-CIDI 1 R (5'-GTGTGATGGATATCTGCAGAATTCG, SEQ ID NO:29) 및 NsiI-CIDI 1 F (5'-CATCAATGCATCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATG, SEQ ID NO:30). 주형 DNA는 대장균 FM5로부터 표준 방법에 의해 단리된 염색체 DNA였다 (WO 96/35796 및 WO 2004/033646; 특히 핵산의 단리에 대해 그 전문이 참고문헌으로 각각 포함됨). 최종 플라스미드를, 호모 idi 유전자를 인코딩하는 구성물에 대해서는 pKKDIy로, 또는 대장균 idi 유전자를 인코딩하는 구성물에 대해서는 pKKDIc로 지칭하였다. 플라스미드를 후속적 분석을 위해 대장균 숙주 BL21에 형질전환하였다. 일부 경우에서 쿠주로부터의 이소프렌 신타아제를 pKKDIy에 클로닝하여 플라스미드 pKKDIyIS를 수득하였다.
하위 MVA 경로를 또한 카나마이신 항생제 내성 마커를 함유하는 pTrc에 클로닝하였다. 플라스미드 pTrcKKDIy를 제한 엔도뉴클레아제 ApaI 및 PstI으로 소화시키고, 5930 bp 절편을 1.2% 아가로오스 E-겔 상에서 분리시키고, 제조사의 지시사항에 따라 Qiagen Gel Purification 키트를 사용하여 정제하였다. 실시예 7에서 기재된 플라스미드 pTrcKudzuKan을 제한 엔도뉴클레아제 ApaI 및 PstI로 소화시키고, 벡터를 함유하는 3338 bp 절편을 Qiagen Gel Purification 키트를 사용하여 1.2% E-겔에서 정제하였다. 3338 bp 벡터 절편 및 5930 bp 하위 MVA 경로 절편를 Roche Quick Ligation 키트를 사용하여 라이게이션하였다. 라이게이션 혼합물을 대장균 TOP 10 세포에 형질전환하고, 형질전환체를 카나마이신 (50 ㎍/㎖) 함유 LA 상에서 선별하면서 37℃에서 하룻밤 동안 성장시켰다. 형질전환체를 제한 효소 소화로 확인하고, 하나를 저장물로서 동결시켰다. 플라스미드를 pTrcKanKKDIy로 지정하였다.
II. 쿠주 이소프렌 신타아제 유전자의 pTrcKanKKDIy 내로의 클로닝
프라이머 MCM50 5'-GATCATGCATTCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATGTGTGCGACCTCTTCTCAATTTACT (SEQ ID NO:31) 및 MCM53 5'-CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAGCTG (SEQ ID NO:32)를 사용하여 실시예 1에서 기재된 pTrcKudzu로부터 쿠주 이소프렌 신타아제 유전자를 PCR로 증폭하였다. 생성된 PCR 절편을 pCR2.1에 클로닝하고, 대장균 TOP 10에 형질전환시켰다. 상기 절편은 쿠주 이소프렌 신타아제에 대한 코딩 서열 및 대장균에서의 RBS를 함유하는 상류 부위를 포함한다. 형질전환체를 카르베니실린 (50 ㎍/㎖) 함유 LA 상에서 선별하면서 37℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 절편의 올바른 삽입물을 서열분석으로 확인하고, 상기 균주를 MCM93으로 지정하였다.
균주 MCM93으로부터의 플라스미드를 제한 엔도뉴클레아제 NsiI 및 PstI으로 소화시켜 RBS 및 쿠주 이소프렌 신타아제를 함유하는 1724 bp 삽입물을 유리시켰다. 1724 bp 절편을 1.2% 아가로오스 E-겔에서 분리하고, 제조사의 지시사항에 따라 Qiagen Gel Purification 키트를 사용하여 정제하였다. 플라스미드 pTrcKanKKDIy를 제한 엔도뉴클레아제 PstI으로 소화시키고, 37℃에서 30분 동안 SAP으로 처리하고, Qiagen PCR cleanup 키트를 사용하여 정제하였다. 플라스미드 및 쿠주 이소프렌 신타아제를 인코딩하는 DNA 절편을 Roche Quick Ligation 키트를 사용하여 라이게이션하였다. 라이게이션 믹스를 대장균 TOP 10 세포에 형질전환하고, 형질전환체를 카나마이신 (50 ㎍/㎖) 함유 LA 상에서 선별하면서 37℃에서 하룻밤 동안 성장시켰다. 올바른 형질전환체를 제한 소화로 확인하고, 플라스미드를 pTrcKKDyIkISKan (도 24 및 25)로 지정하였다. 상기 플라스미드를 BL21(λDE3) 세포 (Invitrogen)에 형질전환하였다.
III. 쿠주로부터의 이소프렌 신타아제 및 재조합 하위 메발로네이트 경로를 발현하는 대장균에서의 메발로네이트로부터의 이소프렌 생성
균주 BL21/pTrcKKDyIkISKan를 pH 7.1로 조정되고 0.5% 글루코오스 및 0.5% 메발론산으로 보충된 MOPS 배지에서 배양하였다 (Neidhardt 등, (1974) J. Bacteriology 119:736-747). 동일한 조건이지만 0.5% 메발론산이 첨가되지 않은 대조군 배양물을 또한 설정하였다. 배양물이 0.3 내지 0.5의 OD600에 도달할 때, 1% 접종물을 갖는 하룻밤 종자 배양물로부터 배양을 시작하고 500 μM IPTG로 유도하였다. 배양물을 250 rpm에서 진탕하면서 30℃에서 성장시켰다. 실시예 1에서 기재한 상부공간 검정을 사용하여 이소프렌의 생성을 유도 3시간 후 분석하였다. 이소프렌의 최대 생성은 6.67 x 104 nmol/L브로쓰/OD600/시간이었다 (L브로쓰는 브로쓰의 부피이며, 세포 배지의 부피 및 세포의 부피가 모두 포함됨). 메발론산이 보충되지 않은 대조군 배양물은 측정가능한 이소프렌을 생성하지 않았다.
IV. 상위 MVA 경로 클로닝
3가지 효소적 활성을 인코딩하는 두 유전자를 포함하는 상위 메발로네이트 생합성 경로를 엔테로코쿠스 파에칼리스로부터 클로닝하였다. mvaE 유전자는 경로에서의 제 1 및 제 3 단백질인 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라아제 및 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA (HMG-CoA) 환원효소 모두의 효소적 활성을 갖는 단백질을 인코딩하며, mvaS 유전자는 상기 경로에서의 제 2 효소, HMG-CoA 신타아제를 인코딩한다. 하기의 프라이머를 사용하여, 대장균 리보솜 결합 위치 및 전방에 스페이서를 갖는 E. 파이칼리스 게놈 DNA (ATCC 700802D-5)로부터 mvaE 유전자를 증폭하였다:
CF 07-60 (+) mvaE w/ RBS + ATG 시작 코돈 SacI의 시작
5'-GAGACATGAGCTCAGGAGGTAAAAAAACATGAAAACAGTAGTTATTATTG (SEQ ID NO:34)
CF 07-62 (-) 중간에서 RBS를 갖는 mvaS에 대한 mvaE 융합
5'-TTTATCAATCCCAATTGTCATGTTTTTTTACCTCCTTTATTGTTTTCTTAAATC (SEQ ID NO:35)
하기의 프라이머를 사용하여 전방에 대장균으로부터의 스페이서 및 RBS를 갖는 E. 파에칼리스 게놈 DNA (ATCC 700802D-5)로부터 mvaS 유전자를 증폭하였다:
CF 07-61 (+) 중간에서 RBS를 갖는 mvaS에 대한 mvaE 융합
5'-GATTTAAGAAAACAATAAAGGAGGTAAAAAAACATGACAATTGGGATTGATAAA (SEQ ID NO:36)
CF 07-102 (-) mvaS 유전자 BglII의 말단
5'-GACATGACATAGATCTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID NO:37)
하기의 프라이머를 사용하여 PCR 절편을 PCR과 함께 융합하였다:
CF 07-60 (+) mvaE w/ RBS + ATG 시작 코돈 SacI의 시작
5'-GAGACATGAGCTCAGGAGGTAAAAAAACATGAAAACAGTAGTTATTATTG (SEQ ID NO:34)
CF 07-102 (-) mvaS 유전자 BglII의 말단
5'-GACATGACATAGATCTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID NO:37)
Qiagen 키트를 사용하여 융합 PCR 절편을 정제하고, 제한 효소 SacI 및 BglII로 소화시켰다. 상기 소화된 DNA 절편을 Qiagen 키트를 사용하여 겔 정제하고, Sac I 및 BglII으로 소화된 시판되는 벡터 pTrcHis2A에 라이게이션하였다.
라이게이션 믹스를 대장균 Top 10 세포에 형질전환하고, 콜로니를 LA 및 50 ㎍/㎖ 카르베니실린 플레이트 상에서 선별하였다. 총 6개의 콜로니를 선택하고, LB 및 50 ㎍/㎖ 카르베니실린에서 하룻밤 동안 성장시키고, 플라스미드를 Qiagen 키트를 사용하여 단리하였다. 플라스미드를 SacI 및 BglII로 소화시켜 삽입물을 확인하고, 한 올바른 플라스미드를 하기의 프라이머로 서열분석하였다:
CF 07-58 (+) mvaE 유전자의 시작
5'-ATGAAAACAGTAGTTATTATTGATGC (SEQ ID NO:38)
CF 07-59 (-) mvaE 유전자의 말단
5'-ATGTTATTGTTTTCTTAAATCATTTAAAATAGC (SEQ ID NO:39)
CF 07-82 (+) mvaS 유전자의 시작
5'-ATGACAATTGGGATTGATAAAATTAG (SEQ ID NO:40)
CF 07-83 (-) mvaS 유전자의 말단
5'-TTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID NO:41)
CF 07-86 (+) mvaE에서의 서열
5'-GAAATAGCCCCATTAGAAGTATC (SEQ ID NO:42)
CF 07-87 (+) mvaE에서의 서열
5'-TTGCCAATCATATGATTGAAAATC (SEQ ID NO:43)
CF 07-88 (+) mvaE에서의 서열
5'-GCTATGCTTCATTAGATCCTTATCG (SEQ ID NO:44)
CF 07-89 (+) 서열 mvaS
5'-GAAACCTACATCCAATCTTTTGCCC (SEQ ID NO:45)
pTrcHis2AUpperPathway#1으로 지칭되는 플라스미드를 서열분석으로 바로잡고, 시판되는 대장균 균주 BL21에 형질전환하였다. LA 및 50 ㎍/㎖ 카르베니실린 상에서 선별하였다. 두 형질전환체를 선택하고, 1.5의 OD600에 도달할 때까지 LB 및 50 ㎍/㎖ 카르베니실린에서 성장시켰다. 두 균주 모두를 글리세롤의 존재 하에 -80℃에서 바이알 내에서 동결시켰다. 균주를 BL21에서의 pTrcHis2AUpperPathway#1, 단리물#1에 대해 CF 449로, BL21에서의 pTrcHis2AUpperPathway#1, 단리물#2에 대해 CF 450으로 지정하였다. 분석한 경우, 두 클론 모두 동일하게 행동하는 것으로 발견되었다.
V. UpperMVA 경로의 pCL1920 내로의 클로닝
플라스미드 pTrcHis2AUpperPathway를 제한 엔도뉴클레아제 SspI로 소화시켜 pTrc-mvaE-mvaS-(His 표지)-터미네이터를 함유하는 절편을 방출시켰다. 상기 절편에서, his-표지는 번역되지 않았다. Qiagen Gel Purification 키트를 사용하여, 상기 무딘 말단 4.5 kbp 절편을 1.2% E-겔에서 정제하였다. 제한 엔도뉴클레아제 PvuII로 벡터를 소화시키고, SAP로 처리하고, Qiagen Gel Purification 키트를 사용하여 1.2% E-겔로부터 겔 정제하여 pCL1920으로부터의 탈인산화된, 무딘 말단 4.2 kbp 절편을 제조하였다. Roche Quick Ligation 키트를 사용하여 두 절편을 라이게이션하고, TOP 10 화학적 수용성 세포에 형질전환시켰다. 형질전환체를 스펙티노마이신 (50 ㎍/㎖) 함유 LA 상에서 선별하였다. PCR에 의해, 삽입물의 존재에 대해 스크리닝하여 올바른 콜로니를 확인하였다. 플라스미드를 pCL PtrcUpperPathway로 지정하였다 (도 26 및 27).
VI. 조합된 상위 및 하위 메발론산 경로를 발현하는 균주
완전한 메발론산 경로와 함께 쿠주 이소프렌 신타아제를 수득하기 위해서, 플라스미드 pTrcKKDyIkISkan 및 pCLpTrcUpperPathway를 모두 BL21(λDE3) 수용성 세포 (Invitrogen)에 형질전환하고, 형질전환체를 카나마이신 (50 ㎍/㎖) 및 스펙티노마이신 (50 ㎍/㎖)을 함유하는 LA 상에서 선별하였다. 형질전환체를 플라스미드 프렙으로 확인하여, 플라스미드 모두가 숙주 내에서 유지되는지를 확실하게 하였다. 균주를 MCM127로 지정하였다.
VII. 대장균/pUppeerpathway에서의 글루코오스로부터 메발론산의 생성
BL21/pTrcHis2A-mvaE/mvaS 또는 FM5/p pTrcHis2A-mvaE/mvaS를 LB 및 카르베니실린 (100 ㎍/㎖)에 접종하고, 200 rpm에서 진탕하면서 37℃에서 하룻밤 동안 성장시켰다. 이들 배양물을 250 ㎖ 배플드 플라스크 내의 50 ㎖ 배지로 0.1의 OD600이 되도록 희석하였다. 배지는 TM3, 1 또는 2% 글루코오스, 카르베니실린 (100 ug/㎖) 또는 TM3, 1% 글루코오스, 가수분해된 콩기름, 및 카르베니실린 (100 ug/㎖) 또는 TM3 및 바이오매스 (제조된 바가스, 옥수수대 또는 지팽이풀)였다. 배앙물을 OD600이 0.4에 도달할 때까지 약 2~3시간 동안 200 rpm에서 진탕하면서 30℃에서 성장시켰다. 이 시점에서, IPTG (400 μM)을 첨가하여 mvaE mvaS 구성물로부터의 발현을 유도하였다. 2시간 주기 내지 유도 후 6시간, 이후 필요시 24, 36 및 48시간 후에 취한 샘플로 추가 20 또는 40시간 동안 배양물을 인큐베이션하였다. 1 ㎖의 배양물을 제거하고, OD60O을 측정하고, 마이크로퓨즈 (microfuge)에서 세포를 펠릿화고 상청액을 제거하고, 메발론산에 대해 이를 분석하여 샘플링을 수행하였다.
엔테로코쿠스 파에칼리스 AA-CoA 티올라아제, HMG-CoA 신타아제, 및 HMG-CoA 환원효소 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 갖는 대장균 세포의 14ℓ 발효로, 세포 배지로서 TM3 배지 및 2% 글루코오스를 사용하여 22 g의 메발론산이 생성되었다. 이들 세포의 진탕 플라스크에서는 세포 배양 배지로서 LB 배지 및 1% 글루코오스를 사용하여 ℓ 당 2~4 g의 메발론산이 생성되었다. 이들 균주에서의 메발론산의 생성은 MVA 경로가 대장균에서 기능한다는 것을 나타내었다.
VIII. 상위 및 하위 MVA 경로 + 쿠주 이소프렌 신타아제를 함유하는 대장균 BL21로부터의 이소프렌의 생성
상기 기재한 바와 같은 상위 및 하위 MVA 경로 및 쿠주 이소프렌 신타아제 유전자를 함유하는 플라스미드, 및 실시예 7에서 기재된 idi, dxs 및 dxr 및 이소프렌 신타아제 유전자를 함유하는 플라스미드의 다양한 조합에서의 형질전환으로써 하기의 균주를 제작하였다. 사용된 숙주 세포는 화학적 수용성 BL21(λDE3)이고, 표준 방법으로 형질전환을 수행하였다. 카나마이신 (50 ㎍/㎖) 또는 카나마이신 + 스펙티노마이신 (둘 모두 50 ㎍/㎖의 농도)을 함유하는 L 한천에서 형질전환체를 선별하였다. 플레이트를 37℃에서 성장시켰다. 생성된 균주를 하기와 같이 지정하였다:
카나마이신 + 스펙티노마이신 (각각 50 ㎍/㎖)에서 성장시킴
MCM127 - BL21(λDE3) 내의 pCL Upper MVA 및 pTrcKKDyIkIS (kan)
MCM131 - BL21(λDE3) 내의 pCL1920 및 pTrcKKDyIkIS (kan)
MCM125 - BL21(λDE3) 내의 pCL Upper MVA 및 pTrcHis2B (kan)
카나마이신 (50 ㎍/㎖)에서 성장시킴
MCM64 - BL21(λDE3) 내의 pTrcKudzu yIDI DXS (kan)
MCM50 - BL21(λDE3) 내의 pTrcKudzu (kan)
MCM123 - BL21(λDE3) 내의 pTrcKudzu yIDI DXS DXR (kan)
상기 균주를 냉동기 저장물로부터 LA 및 적절한 항생제에 스트리킹하고, 37℃에서 하룻밤 동안 성장시켰다. 각각의 플레이트로부터의 단일 콜로니를 진탕 플라스크 (25 ㎖ LB 및 적절한 항생제)에 접종하는데 사용하였다. 플라스크를 200 rpm에서 진탕하면서 22℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 다음날 아침에 플라스크를 37℃ 인큐베이터에 옮기고 200 rpm에서 진탕하면서 추가 4.5시간 동안 성장시켰다. 25 ㎖ 배양물을 원심분리하여 세포를 펠릿화시키고, 세포를 5 ㎖ LB 및 적절한 항생제에 재현탁하였다. 배양물을 이후 25 ㎖ LB, % 글루코오스, 및 적절한 항생제로 0.1의 OD600이 되도록 희석하였다. 각각의 균주에 대해 두 개 플라스크를 설정하고, 첫 번째 세트는 IPTG (800 μM)로 유도하고, 두 번째 세트는 유도하지 않았다. 배양물을 250 rpm에서 진탕하면서 37℃에서 인큐베이션하였다. 배양물의 한 세트를 1.50시간 후에 유도하였다 (샘플링 시간 지점 1의 직후). 각각의 샘플링 시간 지점에서, OD600을 측정하고 실시예 1에서 기재된 바와 같이 이소프렌의 양을 측정하였다. 결과를 표 3에 나타내었다. 생성된 이소프렌의 양을 특정 균주에 대한 피크 생성에서의 양으로서 나타내었다.
표 3. 대장균 균주에서의 이소프렌의 생성
Figure pct00003
ND: 미검출
미량: 피크가 존재하나 적분가능하지 않음
IX. 메발론산의 분석
메발로놀아세톤 (1.0 g, 7.7 mmol) (CAS# 503-48-0)을 메발론산의 칼륨염을 생성시키기 위해 물 (7.7 ㎖)에 용해하고 수산화칼륨 (7.7 mmol)으로 처리한 시럽으로서 Sigma-Aldrich (WI, USA)에서 공급받았다. 메발론산으로의 변환을 1H NMR 분석으로 확증하였다. 14,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 제거한 후 상청액의 300 ㎕ 분취액을 900 ㎕의 H2O에 첨가하여 HPLC 분석을 위한 샘플을 제조하였다. 이후 과염소산 (70% 용액의 36 ㎕)을 첨가한 후, 얼음 상에서 5분 동안 혼합 및 냉각하였다. 이후 샘플을 다시 원심분리하고 (14,000 rpm에서 5분), 상청액을 HPLC에 옮겼다. 메발론산 표준물 (20, 10, 5, 1 및 0.5 g/L)을 동일한 방식으로 제조하였다. 5 mM 황산으로 0.6 ㎖/분에서 용리된 BioRad Aminex 87-H+ 컬럼 (300 mm, 7.0 mm)을 사용하여 굴절률 (RI) 검출을 갖는 HPLC에 의해 메발론산의 분석 (20 uL 주입 부피)을 수행하였다. 이들 조건 하에 18.5분에서 락톤 형태로서 메발론산을 용리하였다.
실시예 9. 바실러스 서브틸리스로의 융합을 위한 상위 및 하위 MVA 경로의 구성
I. 바실러스 서브틸리스에서의 상위 MVA 경로의 구성
엔테로코쿠스 파에칼리스로부터의 상위 경로를 aprE 프로모터의 조절 하에 B. 서브틸리스에 융합하였다. 상위 경로는 하기 두 유전자로 이루어진다; AACT 및 HMGR를 인코딩하는 mvaE, 및 HMGS를 인코딩하는 mvaS. 두 유전자는 중간에서, mvaS 앞의 RBS 위치에서 정지 코돈과 함께 융합되고, aprE 프로모터의 조절 하에 있다. 터미네이터는 mvaE 유전자 뒤에 위치한다. 클로람페니콜 내성 마커는 mvaE 유전자 뒤에 클로닝되며, 구성물은 상동성의 측면 부위를 사용하여 이중 교차에 의해 aprE 유전자 자리에서 융합된다.
PCR 반응에 의해 함께 융합되게 할 돌출물 (overhang)을 함유하도록 네 개의 DNA 절편을 PCR로 증폭하였다. 제조사의 지시사항에 따라 Herculase 중합효소를 사용하여 PCR 증폭을 실행하였다.
1: PaprE
CF 07-134 (+) aprE 프로모터 PstI의 시작
5'-GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC (SEQ ID NO:82)
CF 07-94 (-) mvaE에 대한 PaprE 융합
5'-CAATAATAACTACTGTTTTCACTCTTTACCCTCTCCTTTTAA (SEQ ID NO:83)
주형: 바실러스 서브틸리스 염색체 DNA
2: mvaE
CF 07-93 (+) aprE 프로모터에 대한 mvaE 융합 (GTG 시작 코돈)
5'-TTAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGAAAACAGTAGTTATTATTG (SEQ ID NO:84)
CF 07-62 (-) 중간에서 RBS를 갖는 mvaS에 대한 mvaE 융합
5'-TTTATCAATCCCAATTGTCATGTTTTTTTACCTCCTTTATTGTTTTCTTAAATC (SEQ ID NO:35)
주형: 엔테로코쿠스 파에칼리스 염색체 DNA (ATCC)
3. mvaS
CF 07-61 (+) 중간에서 RBS를 갖는 mvaS에 대한 mvaE 융합
5'-GATTTAAGAAAACAATAAAGGAGGTAAAAAAACATGACAATTGGGATTGATAAA (SEQ ID NO:36)
CF 07-124 (-) 터미네이터에 대한 mvaS의 말단 융합
5'-CGGGGCCAAGGCCGGTTTTTTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID NO:85)
주형: 엔테로코쿠스 파에칼리스 염색체 DNA
4. B. 아밀로리쿠에파시엔스 알칼리 세린 프로테아제 터미네이터
CF 07-123 (+) 터미네이터에 대한 mvaS의 말단 융합
5'-ACCGTTCGTTCTTATCGAAACTAAAAAAAACCGGCCTTGGCCCCG (SEQ ID NO:86)
CF 07-46 (-) B. 아밀로리쿠에파시엔스 터미네이터 BamHI의 말단
5'-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (SEQ ID NO:63)
주형: 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스 염색체 DNA
PCR 융합 반응
5. mvaS에 대한 mvaE 융합
CF 07-93 (+) aprE 프로모터에 대한 mvaE 융합 (GTG 시작 코돈)
5'-TTAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGAAAACAGTAGTTATTATTG (SEQ ID NO:84)
CF 07-124 (-) 터미네이터에 대한 mvaS의 말단 융합
5'-CGGGGCCAAGGCCGGTTTTTTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID NO:85)
주형: 상기로부터의 #2 및 3
6. aprE 프로모터에 대한 mvaE-mvaS 융합
CF 07-134 (+) aprE 프로모터 PstI의 시작
5'-GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC (SEQ ID NO:82)
CF 07-124 (-) 터미네이터에 대한 mvaS의 말단 융합
5'-CGGGGCCAAGGCCGGTTTTTTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID NO:85)
주형: 상기로부터의 #1 및 #4
7. 터미네이터에 대한 PaprE-mvaE-mvaS 융합
CF 07-134 (+) aprE 프로모터 PstI의 시작
5'-GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC (SEQ ID NO:82)
CF 07-46 (-) B. 아밀로리쿠에파시엔스 터미네이터 BamHI의 말단
5'-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (SEQ ID NO:63)
주형: #4 및 #6
생성물을 제한 엔도뉴클레아제 PstI/BamHI으로 소화시키고, PstI/BamHI으로 소화시킨 pJM102에 라이게이션하였다 (Perego, M. 1993. Integrational vectors for genetic manipulation in Bacillus subtilis, p. 615-624. In A. L. Sonenshein, J. A. Hoch, and R. Losick (ed.), Bacillus subtilis and other gram-positive bacteria: biochemistry, physiology, and molecular genetics. American Society for Microbiology, Washington, D.C.). 라이게이션물을 대장균 TOP 10 화학적 수용성 세포에 형질전환하고, 형질전환체를 카르베니실린 (50 ㎍/㎖) 함유 LA 상에서 선별하였다. 올바른 플라스미드를 서열분석으로 확인하고, pJMUpperpathway2로 지정하였다 (도 50 및 51). 정제된 플라스미드 DNA를 바실러스 서브틸리스 aprEnprE Pxyl-comK에 형질전환하고, 형질전환체를 클로람페니콜 (5 ㎍/㎖) 함유 L 한천에서 선별하였다. 올바른 콜로니를 선별하고, 클로람페니콜 10, 15 및 25 ㎍/㎖를 함유하는 L 한천 상에서 순차적으로 플레이팅하여 상위 경로를 함유하는 카세트의 카피 수를 증폭시켰다.
1% 글루코오스를 함유하는 LB에서 성장시켜, 생성된 균주를 메발론산 생성에 대해 시험하였다. 메발론산의 생성에 대해 배양물을 GC로 분석하였다.
상기 균주를 하위 메발론산 경로의 융합에 대한 숙주로서 이후 사용하였다.
하기 프라이머를 사용하여 상기 다양한 구성물을 서열분석하였다.
서열분석 프라이머:
CF 07-134 (+) aprE 프로모터 PstI의 시작
5'-GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC (SEQ ID NO:82)
CF 07-58 (+) mvaE 유전자의 시작
5'-ATGAAAACAGTAGTTATTATTGATGC (SEQ ID NO:38)
CF 07-59 (-) mvaE 유전자의 말단
5'-ATGTTATTGTTTTCTTAAATCATTTAAAATAGC (SEQ ID NO:39)
CF 07-82 (+) mvaS 유전자의 시작
5'-ATGACAATTGGGATTGATAAAATTAG (SEQ ID NO:40)
CF 07-83 (-) mvaS 유전자의 말단
5'-TTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID NO:41)
CF 07-86 (+) mvaE에서의 서열
5'-GAAATAGCCCCATTAGAAGTATC (SEQ ID NO:42)
CF 07-87 (+) mvaE에서의 서열
5'-TTGCCAATCATATGATTGAAAATC (SEQ ID NO:43)
CF 07-88 (+) mvaE에서의 서열
5'-GCTATGCTTCATTAGATCCTTATCG (SEQ ID NO:44)
CF 07-89 (+) 서열 mvaS
5'-GAAACCTACATCCAATCTTTTGCCC (SEQ ID NO:45)
형질전환체를 5 ㎍/㎖의 농도로 클로람페니콜을 함유하는 LA 상에서 선별하였다. 한 콜로니가 서열분석에 의해 올바른 융합을 갖는 것을 확증하고, 수 일에 걸쳐 25 ㎍/㎖의 최종 수준까지 증가하는 농도로 클로람페니콜을 함유하는 LA 상에서 플레이팅하였다. 이는 관심 유전자를 포함하는 카세트의 증폭을 야기하였다. 생성된 균주를 CF 455: pJMupperpathway#1 X 바실러스 서브틸리스 aprEnprE Pxyl comK (클로람페니콜 25 ㎍/㎖을 함유하는 LA 상에서 성장하도록 증폭됨)로 지정하였다.
II. 바실러스 서브틸리스에서의 하위 MVA 경로의 구성
mvk1, pmk, mpd 및 idi로 이루어지는 하위 MVA 경로는 B. 서브틸리스 염색체의 nprE 부위로부터의 측면 DNA 부위 (융합 위치), aprE 프로모터, 및 스펙티노마이신 내성 마커로 이루어지는 카세트에서 조합된다 (도 28 및 29 참조). 상기 카세트를 DNA2.0에 의해 합성하고, aprE 유전자 자리에서 융합된 상위 MVA 경로를 함유하는 B. 서브틸리스의 염색체에 융합하였다. 쿠주 이소프렌 신타아제 유전자를 실시예 4에서 기재된 복제 플라스미드로부터 발현시키고, 상위 및 하위 경로가 모두 융합된 균주에 형질전환하였다.
실시예 10: M. 마제이 메발로네이트 키나아제 및 P. 알바 이소프렌 신타아제를 발현하는 대장균에서의 이소프렌의 생성
I. M. 마제이 메발로네이트 키나아제 (MVK) 및 P. 알바 이소프렌 신타아제를 인코딩하는 균주 및 벡터의 구성
(i) 균주 EWL201 (BL21, Cm-GI1.2-KKDyI)의 구성
대장균 BL21 (Novagen brand, EMD Biosciences, Inc.)은 수용 균주로서, MCM331 P1 용해물 ([Ausubel, 등, Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, Inc.]에서 기재된 방법에 따라 제조된 용해물)로 형질도입되었다. L 한천 및 20 ㎍/㎕ 클로람페니콜 상에 세포를 스프레딩하여 형질도입체를 선별하였다. 플레이트를 30℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 형질도입체의 분석으로, 대조군 플레이트 (역전에 대한 물 + 세포 대조군 플레이트, 및 용해물 오염에 대한 물 및 P1 용해물 대조군 플레이트) 상에서는 콜로니가 나타나지 않았다.
네 개의 형질도입체를 고르고, 5 ㎖ L 브로쓰 및 20 ㎍/㎕ 클로람페니콜을 접종하는데 사용하였다. 배양물을 200 rpm에서 진탕하면서 30℃에서 하룻밤 동안 성장시켰다. PCR 분석을 위한 각각의 형질도입체의 게놈 DNA 프렙을 만들기 위해, 1.5㎖의 하룻밤 세포 배양물을 원심분리하였다. 세포 펠릿을 400 ㎕ 재현탁 완충액 (2O mM Tris, 1 mM EDTA, 5O mM NaCl, pH 7.5)으로 재현탁하고, 4 ㎕ RNase (무-DNase) (Roche)를 첨가하였다. 튜브를 30분 동안 37℃에서 인큐베이션한 후, 4 ㎕ 10% SDS 및 4 ㎕의 10 mg/㎖ 프로테이나아제 K 저장액 (Sigma- Aldrich)을 첨가하였다. 튜브를 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 세포 용해물을 2 ㎖ Phase Lock Light Gel 튜브 (Eppendorf)에 옮기고, 각각 200 ㎕의 포화 페놀 (pH 7.9) (Ambion Inc.) 및 클로로포름을 첨가하였다. 튜브를 잘 혼합시키고, 5분 동안 미세원심분리 (microcentrifuge)하였다. 400 ㎕ 클로로포름으로 두 번째 추출을 수행하고, 수성층을 새로운 에펜도르프 튜브에 옮겼다. 1 ㎖의 100% 에탄올을 첨가하고 5분 동안 원심분리하여 게놈 DNA를 침전시켰다. 게놈 DNA 펠릿을 1 ㎖의 70% 에탄올로 세척하였다. 에탄올을 제거하고 게놈 DNA 펠릿을 짧게 자연 건조시켰다. 게놈 DNA 펠릿을 200 ㎕ TE로 재현탁하였다.
PfU Ultra II DNA 중합효소 (Stratagene) 및 주형으로 200 ng/㎕의 게놈 DNA를 사용하여, 제조사의 프로토콜에 따라 2개의 상이한 세트의 PCR 반응 튜브를 제조하였다. 세트 1에 대해, 프라이머 MCM 130 및 GB Cm-Rev (표 4)를 사용하여 형질도입체가 attTn7 유전자 자리에 성공적으로 융합된 것을 확인하였다. 세트 1에 대한 PCR 매개변수는 하기와 같다: 95℃에서 2분 (첫 사이클에서만), 95℃에서 25초, 55℃에서 25초, 72℃에서 25초 (28 사이클 동안 단계 2~4를 반복), 72℃에서 1분. 세트 2에 대해, 프라이머 MVD For 및 MVD Rev (표 4)를 사용하여 gi1.2-KKDyI 오페론이 적절하게 융합된 것을 확인하였다. 세트 2에 대한 PCR 매개변수는 하기와 같다: 95℃에서 2분 (첫 사이클에서만), 95℃에서 25초, 55℃에서 25초, 72℃에서 10초 (28 사이클 동안 단계 2~4를 반복), 72℃에서 1분. 1.2% E-겔 (Invitrogen Corp.)에서의 PCR 암플리콘의 분석으로, 모든 4개의 형질도입체 클론이 올바르다는 것이 나타났다 (하나를 고르고 균주 EWL201로 지정하였음).
ii) 균주 EWL204 (BL21, 루프아웃-GI1.2-KKDyI)의 구성
Datsenko 및 Wanner (2000) (Datsenko 등, Proc Natl. Acad. Sci USA 97:6640-6645, 2000)에 의해 기재된 바와 같이 플라스미드 pCP20을 사용하여 클로람페니콜 마커를 균주 EWL201의 외부로 루프화시켰다. 에스케리키아 콜리 K-12에서의 염색체 유전자의 1-단계 불활성은 PCR 생성물을 사용하였다 (Datsenko 등, PNAS, 97: 6640-6645, 2000). EWL201 세포를 L 브로쓰에서 중간 로그상까지 성장시킨 후 얼음 냉각된 멸균수로 3회 세척하였다. 50 ㎕의 세포 현탁액 분취액을 1 ㎕의 pCP20과 혼합하고, 세포 현탁액 혼합물을 Gene Pulser Electroporator (Bio-Rad Inc.)를 사용하여 2.5 볼트 및 25 uFd에서 2 mm 큐벳 (Invitrogen Corp.)내에서 전기천공하였다. 1 ㎖의 LB를 세포에 즉시 첨가한 후, 금속 마개를 갖는 14 ㎖ 폴리프로필렌 튜브 (Sarstedt)에 옮겼다. 30℃에서 1시간 동안 성장시켜 세포가 회수되게 하였다. 형질전환체를 L 한천 및 20 ㎍/㎕ 클로람페니콜 및 50 ㎍/㎕ 카르베니실린 상에서 선별하고 30℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 다음날, 단일 콜로니를 초기 로그상이 될 때까지 10 ㎖ L 브로쓰 및 50 ㎍/㎕ 카르베니실린에서 30℃에서 성장시켰다. 이후 성장 배양물의 온도를 2시간 동안 42℃로 변경하였다. 여러 희석물을 제조하고, 세포를 이후 LA 플레이트 (항생제 선택성이 없는) 상에 스프레딩하고, 30℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 다음날, 20개의 콜로니를 고르고 L 한천 (항생제 없음) 및 LA 및 20 ㎍/㎕ 클로람페니콜 플레이트 상에 적용시켰다. 이후 플레이트를 3O℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. LA 플레이트에서 성장할 수 있으나, LA 및 20 ㎍/㎕ 클로람페니콜 플레이트에서는 성장하지 못하는 세포는 외부에 루프화된 클로람페니콜 마커를 갖는 것으로 간주되었다 (하나를 고르고 균주 EWL204로 지정하였음).
iii) 플라스미드 pEWL230 (pTrc P. alba)의 구성
대장균 발현을 위한 코돈 최적화 방법을 기초로 하여, 포풀루스 알바 이소프렌 신타아제 (P. 알바 HGS)를 인코딩하는 합성 유전자의 생성물을 DNA2.0 Inc. (Menlo Park, CA)에서 외주 제작하였다. 합성 유전자는 플라스미드 pET24a (Novagen brand, EMD Biosciences, Inc.) 내로 주문식으로 클로닝되었고, 동결건조되어 전달되었다 (도 54, 55A 및 55B).
제조사의 프로토콜에 따라 주형으로서 pET24 P. alba HGS, 프라이머 MCM182 및 MCM192, 및 Herculase II 융합 DNA 중합효소 (Stratagene)를 사용하여 PCR 반응을 수행하여 P. 알바 이소프렌 신타아제 (P. 알바 HGS) 유전자를 증폭하였다. PCR 조건은 하기와 같다: 95℃에서 2분 (첫 사이클에서만), 95℃에서 25초, 55℃에서 20초, 72℃에서 1분, 25 사이클 동안 반복, 72℃에서 3분 동안 최종 연장.
QIAquick PCR Purification 키트 (Qiagen Inc.)을 사용하여 P. 알바 이소프렌 신타아제 PCR 생성물을 정제하였다.
P. 알바 이소프렌 신타아제 PCR 생성물을 이후 1 ㎕ BspHI 엔도뉴클레아제 (New England Biolabs)와 함께 2 ㎕ 1OX NEB 완충액 4를 함유하는 20 ㎕ 반응물에서 소화시켰다. 반응물을 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 소화된 PCR 절편을 이후 QIAquick PCR Purification 키트를 사용하여 정제하였다. 제 2 제한 소화를 1 ㎕ PstI 엔도뉴클레아제 (Roche)와 함께 2 ㎕ 1OX 완충액 H를 함유하는 20 ㎕ 반응물에서 수행하였다. 반응물을 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 소화된 PCR 절편을 이후 QIAquick PCR Purification 키트를 사용하여 정제하였다. 플라스미드 pTrcHis2B (Invitrogen Corp.)를 1 ㎕ NcoI 엔도뉴클레아제 (Roche), 1 ㎕ PstI 엔도뉴클레아제, 및 2 ㎕ 10X 완충액 H를 함유하는 20 ㎕ 반응물에서 소화시켰다. 반응물을 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 소화된 pTrcHis2B 벡터를 1.2% E-겔 (Invitrogen Corp.)을 사용하여 겔 정제하고, QIAquick Gel Extraction 키트 (Qiagen)를 사용하여 추출하였다 (도 56). BspHI 및 NcoI 위치의 양립성 부착 말단을 사용하여, 5 ㎕ P. 알바 이소프렌 신타아제 삽입물, 2 ㎕ pTrc 벡터, 1 ㎕ T4 DNA 리가아제 (New England Biolabs), 2 ㎕ 10X 리가아제 완충액 및 10 ㎕ ddH2O를 함유하는 20 ㎕ 라이게이션 반응물을 제조하였다. 라이게이션 혼합물을 실온에서 40분 동안 인큐베이션하였다. ddH2O의 페트리 접시에 0.025 ㎛ 니트로셀룰로오스 막 필터 (Millipore)를 띄우고 실온에서 30분 동안 라이게이션 혼합물을 니트로셀룰로오스 막 필터 상부에 조심스럽게 도포시켜 라이게이션 혼합물을 탈염시켰다. MCM446 세포 (II 부분 참조)를 LB에서 중간 로그상까지 성장시킨 후 얼음 냉각된 멸균수로 3회 세척하였다. 50 ㎕의 세포 현탁액 분취액을 5 ㎕의 탈염된 pTrc P. alba HGS 라이게이션 믹스와 혼합하였다. 세포 현탁액 혼합물을 Gene Pulser Electroporator를 사용하여 2.5 볼트 및 25 uFd에서 2 mm 큐벳 내에서 전기천공하였다. 1 ㎖의 LB를 세포에 즉시 첨가한 후, 금속 마개를 갖는 14 ㎖ 폴리프로필렌 튜브 (Sarstedt)에 옮겼다. 30℃에서 2시간 동안 성장시켜 세포가 회수되게 하였다. 형질전환체를 L 한천 및 50 ㎍/㎕ 카르베니실린 및 10 mM 메발론산 상에서 선별하고, 30℃에서 인큐베이션하였다. 다음날, 6개의 형질전환체를 고르고, 5 ㎖ L 브로쓰 및 50 ㎍/㎕ 카르베니실린 튜브에서 30℃에서 하룻밤 동안 성장시켰다. 플라스미드 프렙을 QIAquick Spin Miniprep 키트 (Qiagen)를 사용하여 하룻밤 배양물에서 수행하였다. 플라스미드를 증식시키기 위한 BL21 세포의 사용으로 인해, 고품질 플라스미드 DNA를 수득하기 위하여 PB 완충액 5X 및 PE 완충액 3X를 사용한 스핀 컬럼 세척의 변경을 표준 제조사의 프로토콜에 포함시켰다. 플라스미드를 20 ㎕ 반응물에서 PstI로 소화시켜 올바른 크기의 선형 절편을 보증하였다. 모든 6개의 플라스미드는 올바른 크기였고, 프라이머 MCM65, MCM66, EL1000로 서열분석하기 위해 Quintara Biosciences (Berkeley, CA)로 수송하였다 (표 4). DNA 서열분석 결과는 모든 6개의 플라스미드가 올바르다는 것을 나타냈다. 하나를 고르고 플라스미드를 EWL230으로 지정하였다 (도 57, 58A 및 58B).
iv) 플라스미드 pEWL244 (pTrc P. alba-mMVK)의 구성
PCR 반응을 수행하여, 제조사의 프로토콜에 따라 주형으로서 MCM376 (v 부분 참조), 프라이머 MCM165 및 MCM177 (표 4 참조), 및 Pfu Ultra II 융합 DNA 중합효소 (Stratagene)를 사용하여 메타노사르키나 마제이 (M. 마제이) MVK 유전자를 증폭하였다. PCR 조건은 하기와 같다: 95℃에서 2분 (첫 사이클에서만), 95℃에서 25초, 55℃에서 25초, 72℃에서 18초, 28 사이클 동안 반복, 72℃에서 1분 동안 최종 연장. M. 마제이 MVK PCR 생성물을 QIAquick PCR Purification 키트 (Qiagen Inc.,)를 사용하여 정제하였다.
이후, M. 마제이 MVK PCR 생성물을 8 ㎕ PCR 생성물, 2 ㎕ PmeI 엔도뉴클레아제 (New England Biolabs), 4 ㎕ 10X NEB 완충액 4, 4 ㎕ 10X NEB BSA 및 22 ㎕ 의 ddH2O를 함유하는 40 ㎕ 반응물에서 소화시켰다. 반응물을 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 소화된 PCR 절편을 이후 QIAquick PCR Purification 키트를 사용하여 정제하였다. 제 2 제한 소화를 2 ㎕ NsiI 엔도뉴클레아제 (Roche), 4.7 ㎕ 10X 완충액 H 및 40 ㎕의 PmeI 소화된 M. 마제이 MVK 절편을 함유하는 47 ㎕ 반응물에서 수행하였다. 반응물을 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 소화된 PCR 절편을 이후 1.2% E-겔을 사용하여 겔 정제하고, QIAquick Gel Extraction 키트를 사용하여 추출하였다. 플라스미드 EWL230을 10 ㎕ 플라스미드, 2 ㎕ PmeI 엔도뉴클레아제, 4 ㎕ 10X NEB 완충액 4, 4 ㎕ 10X NEB BSA 및 20 ㎕의 ddH2O를 함유하는 40 ㎕ 반응물에서 소화시켰다. 반응물을 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 소화된 PCR 절편을 이후 QIAquick PCR Purification 키트를 사용하여 정제하였다. 제 2 제한 소화를 2 ㎕ PstI 엔도뉴클레아제, 4.7 ㎕ 10X 완충액 H 및 40 ㎕의 PmeI 소화된 EWL230 선형 절편을 함유하는 47 ㎕ 반응물에서 수행하였다. 반응물을 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 소화된 PCR 절편을 이후 1.2% E-겔을 사용하여 겔 정제하고, QIAquick Gel Extraction 키트를 사용하여 추출하였다 (도 59). NsiI 및 PstI 위치의 양립성 부착 말단을 사용하여, 8 ㎕ M. 마제이 MVK 삽입물, 3 ㎕ EWL230 플라스미드, 1 ㎕ T4 DNA 리가아제, 2 ㎕ 10X 리가아제 완충액 및 6 ㎕ ddH2O를 함유하는 20 ㎕ 라이게이션 반응물을 제조하였다. 라이게이션 혼합물을 16℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 다음날, ddH2O의 페트리 접시에 0.025 ㎛ 니트로셀룰로오스 막 필터를 띄우고 실온에서 30분 동안 라이게이션 혼합물을 니트로셀룰로오스 막 필터의 상부에 조심스럽게 도포시켜 라이게이션 혼합물을 탈염시켰다. MCM446 세포를 LB에서 중간 로그상까지 성장시킨 후 얼음 냉각된 멸균수로 3회 세척하였다. 50 ㎕의 세포 현탁액 분취액을 5 ㎕의 탈염된 pTrc P.alba-mMVK 라이게이션 믹스와 혼합하였다. 세포 현탁액 혼합물을 Gene Pulser Electroporator를 사용하여 2.5 볼트 및 25 uFd에서 2 mm 큐벳 내에서 전기천공하였다. 1 ㎖의 LB를 세포에 즉시 첨가한 후, 금속 마개를 갖는 14 ㎖ 폴리프로필렌 튜브에 세포를 옮겼다. 30℃에서 2시간 동안 성장시켜 세포가 회수되게 하였다. 형질전환체를 LA 및 50 ㎍/㎕ 카르베니실린 및 5 mM 메발론산 플레이트 상에서 선별하고, 30℃에서 인큐베이션하였다. 다음날, 6개의 형질전환체를 고르고, 5 ㎖ LB 및 50 ㎍/㎕ 카르베니실린 튜브에서 3O℃에서 하룻밤 동안 성장시켰다. 플라스미드 프렙을 QIAquick Spin Miniprep 키트를 사용하여 하룻밤 배양물에서 수행하였다. 플라스미드를 증식시키기 위한 BL21 세포의 사용으로 인해, 고품질 플라스미드 DNA를 수득하기 위하여 PB 완충액 5X 및 PE 완충액 3X를 사용한 스핀 컬럼 세척의 변경을 표준 제조사의 프로토콜에 포함시켰다. 플라스미드를 20 ㎕ 반응물에서 PstI로 소화시켜 올바른 크기의 선형 절편을 보증하였다. 6개의 플라스미드 중 3개는 올바른 크기였고, 프라이머 MCM65, MCM66, EL1000, EL1003 및 EL1006으로 서열분석하기 위해 Quintara Biosciences로 수송하였다 (표 4). DNA 서열분석 결과는 모든 3개의 플라스미드가 올바르다는 것을 나타냈다. 하나를 고르고 플라스미드를 EWL244로 지정하였다 (도 60, 61A~B).
v) pET200D에서의 M. 마제이 고세균성 하위로부터의 플라스미드 MCM376 - MVK의 구성
Invitrogen Platinum HiFi PCR 믹스를 사용하고 프라이머 MCM161 및 MCM162 (표 4)를 사용하여 M. 마제이 고세균성 하위 경로 오페론으로부터의 MVK ORF (도 73A~C)를 PCR 증폭하였다. 45 uL의 PCR 믹스를 1 uL 주형, 10 uM의 각 프라이머 1 uL, 및 2 uL 물과 조합하였다. 하기의 사이클과 같은 반응을 수행하였다: 94℃에서 2:00분; 94℃에서 0:30분, 55℃에서 0:30분 및 68℃에서 1:15분의 30 사이클; 및 이후 72℃에서 7:00분, 및 냉각될 때까지 4℃. 3 uL의 상기 PCR 반응물을 제조사의 프로토콜에 따라 Invitrogen pET200D 플라스미드에 라이게이션시켰다. 3 uL의 상기 라이게이션물을 Invitrogen TOP 10 세포에 도입하고, 형질전환체를 LA/kan50 상에서 선별하였다. 형질전환체로부터의 플라스미드를 단리하고 삽입물을 서열분석하여, MCM376이 야기되었다 (도 74A~C).
vi) 균주 EWL251 (BL21(DE3), Cm-GI1.2-KKDyI, pTrc P.alba-mMVK)의 구성
MCM331 세포 (S. 세레비지에 메발로네이트 키나아제, 메발로네이트 포스페이트 키나아제, 메발로네이트 피로포스페이트 데카르복실라아제 및 IPP 이성화효소를 인코딩하는 염색체 구성물 gi1.2KKDyI를 함유함)를 LB에서 중간 로그상까지 성장시킨 후 얼음 냉각된 멸균수로 3회 세척하였다. 50 ㎕의 세포 현탁액을 1 ㎕의 플라스미드 EWL244와 혼합하였다. 세포 현탁액 혼합물을 Gene Pulser Electroporator를 사용하여 2.5 볼트 및 25 uFd에서 2 mm 큐벳 내에서 전기천공하였다. 1 ㎖의 LB를 세포에 즉시 첨가한 후, 금속 마개를 갖는 14 ㎖ 폴리프로필렌 튜브에 옮겼다. 30℃에서 2시간 동안 성장시켜 세포가 회수되게 하였다. 형질전환체를 LA 및 50 ㎍/㎕ 카르베니실린 및 5 mM 메발론산 플레이트 상에서 선별하고 37℃에서 인큐베이션하였다. 한 콜로니를 선별하고 균주 EWL251로 지정하였다.
vii) 균주 EWL256 (BL2(DE3), Cm-GI1.2-KKDvI, pTrc P.alba-mMVK, pCL Upper MVA)의 구성
EWL251 세포를 LB에서 중간 로그상까지 성장시킨 후, 얼음 냉각된 멸균수로 3회 세척하였다. 50 ㎕의 세포 현탁액을 1 ㎕의 플라스미드 MCM82 (E. 파에칼리스 mvaE 및 mvaS를 인코딩하는 pCL PtrcUpperPathway)와 혼합하였다. 세포 현탁액 혼합물을 Gene Pulser Electroporator를 사용하여 2.5 볼트 및 25 uFd에서 2 mm 큐벳 내에서 전기천공하였다. 1 ㎖의 LB를 세포에 즉시 첨가한 후, 금속 마개를 갖는 14 ㎖ 폴리프로필렌 튜브에 옮겼다. 30℃에서 2시간 동안 성장시켜 세포가 회수되게 하였다. 형질전환체를 LA 및 50 ㎍/㎕ 카르베니실린 및 50 ㎍/㎕ 스펙티노마이신 플레이트 상에서 선별하고 37℃에서 인큐베이션하였다. 한 콜로니를 고르고 균주 EWL256으로 지정하였다.
[표 4: 프라이머 서열]
Figure pct00004
II. MCM442-449의 구성: FRT-cmR-FRT-gi1.x-mKKDyI를 갖는 BL21 및 BL21(DE3)
i) 재조합을 위한 주형의 구성
FRT-기준 재조합 카세트, 및 Red/ET-매개 융합용 플라스미드 및 항생제 마커 루프아웃을 Gene Bridges GmbH (Germany)에서 수득하였다. 이들 재료를 사용하는 절차를 Gene Bridges 프로토콜에 따라 실행하였다. 프라이머 MCM193 및 MCM 195를 사용하여, 제조사의 프로토콜에 따라 Stratagene Herculase II Fusion 키트를 사용하여 FRT-gb2-Cm-FRT 주형으로부터 내성 카세트를 증폭하였다. 5O uL 반응물을 하기와 같은 사이클에 적용하였다: 95℃, 2분; (95℃, 20초, 55℃, 20초, 72℃, 1분) x 5, (95℃, 20초, 60℃, 20초, 72℃, 1분) x 25; 72℃, 3분; 냉각될 때까지 4℃. 제조사의 프로토콜에 따라 Qiagen PCR 컬럼으로 암플리콘을 정제하고, 3O uL EB (용리 완충액)에서 용리하였다. 1x Roche H 완충액 및 0.5 uL BSA를 갖는 2O uL 반응물 내에서 NdeI 및 PciI로 DNA를 소화시켰다. 각각 1 uL의 NdeI, NcoI, 및 Roche H 완충액을 함유하는 10 uL 반응물 내에서 플라스미드 MCM376을 소화시켰다. 반응을 37℃에서 하룻밤 동안 진행시킨 후, 절단된 DNA를 Qiagen PCR 컬럼 상에서 정제하고 3O uL EB에서 용리하였다. 1 uL 벡터, 3 uL PCR 생성물, 1 uL Roche Quick 리가아제 완충액 2, 5 uL 완충액 1, 및 1 uL 리가아제를 함유하는 반응물 내에서 PCR 생성물을 MCM376에 라이게이션하였다. 반응을 실온에서 3시간 동안 진행시킨 후, 제조사의 프로토콜에 따라 5 uL를 Invitrogen TOP 10 세포에 형질전환하였다. 형질전환체를 L 한천 (LA) 및 클로람페니콜 (10 ug/㎖) 상에서 37℃에서 하룻밤 동안 선별하였다.
보관을 위해 형질전환체 콜로니를 클로람페니콜 (30 ug/㎖) 및 카나마이신 (50 ug/㎖) 함유 LA에 적용하고, 서열분석을 위해 Quintara (Berkeley, CA)에 보냈다. 프라이머 MCM195 내의 "N"에서의 네 가지 상이한 뉴클레오티드를 각각 갖는 네 개의 콜로니가, 삽입된 프로모터에 대해 올바른 서열을 갖는 것으로 발견되었다. 클론을 클로람페니콜 (30 ug/㎖) 및 카나마이신 (50 ug/㎖) 함유 LB 5 ㎖에서 성장시키고, 플라스미드 DNA의 제조에 사용하였다. 상기 플라스미드를 TOP 10 세포에 재형질전환하고, 균주를 하기와 같이 동결하였다:
[표 5: MCM484-487]
Figure pct00005
ii) 재조합 표적 균주 MCM349 및 MCM441의 생성
제조사의 지시사항에 따라 플라스미드 pGB706 (GeneBridges)을 사용하여 클로람페니콜 내성 (cmR) 마커를 균주 MCM331의 외부로 루프화시켰다. MCM331 세포를 LB에서 중간 로그상까지 성장시킨 후, 얼음 냉각된 멸균수로 3회 세척하였다. pGB706 DNA의 1 uL 분취액을 5O uL의 세포 현탁액에 첨가하고, 상기 혼합물을 2.5 볼트, 25 uFd에서 2 mm 큐벳 내에서 전기천공한 직후 3O℃에서 1시간 동안 50O uL LB에서 회수하였다. 형질전환체를 3O℃에서, 테트라사이클린 (5 ug/㎖) 함유 LB 상에서 선별하였다. 다음날, 눈에 띄게 탁해질 때까지 (약 0.5~0.8의 OD600) 클론을 테트라사이클린 (5 ug/㎖) 함유 LB에서 3O℃에서 성장시켰다. 상기 배앙물을 LB에 스트리킹하고 37℃에서 하룻밤 동안 성장시켰다. 클로람페니콜 (10 ug/㎖) 함유 LB 또는 테트라사이클린 (5 ug/㎖) 함유 LB에서 성장할 수 없는 클론을 MCM348로서 동결하였다. 플라스미드 MCM356 (pRedET 카르벤실린; GeneBridges)을 상기 기재된 바와 같이 전기천공하고, 형질전환체를 카르베니실린 (50 ug/㎖) 함유 LB 상에서 30℃에서 선별하였다. 클론을 LB 카르베니실린 (50 ug/㎖)에서 30℃에서 성장시키고 MCM349로서 동결하였다.
상기와 같이 플라스미드 MCM356를 EWL204에 전기형질전환 (electrotransformation)하여 균주 MCM441을 제작하였다.
iii) FRT-cmR-FRT-gi1.x-mMVK의 MCM349 및 MCM441 내로의 재조합
제조사의 프로토콜에 따라, 프라이머 MCM120 및 MCM196 및 Herculase II Fusion 키트와 함께 PCR 증폭을 위한 주형으로서 플라스미드 MCM484-487을 사용하였다. 0, 1 또는 3 uL DMSO로, 주형 당 세 반응을 실행하였다. 5O uL 반응물을 하기와 같은 사이클에 적용하였다: 95℃, 2분; 5 사이클 동안 (95℃, 20초; 55℃, 20초; 72℃, 1.5분); 25 사이클 동안 (95℃, 20초; 6O℃, 20초; 72℃, 1.5분); 72℃에서 3분; 하룻밤 동안 4℃. 주어진 주형으로부터의 세 반응물을 모으고 Qiagen PCR 컬럼 상에서 정제하고, 60℃에서 30 uL EB로 용리하였다. 37℃에서 3시간 동안 1x Roche 완충액 A에서 5 uL DNA를 1 uL DpnI으로 소화시켰다. 상기 DNA를 이후 30분 동안 과량의 물에 대해 미세투석하였다.
새로이 스트리킹한 균주를 30℃에서 약 0.5의 OD600으로 카르베니실린 (50 ug/㎖) 함유 LB 5 ㎖에서 성장시켰다. 4O mM L-아라비노오스를 첨가하고, 배양물을 37℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 수확하고 상기 3 uL 투석된 암플리콘으로 전기천공한 후, 50O uL SOC에서 37℃에서 1.5~3시간 동안 회수하였다. 형질전환체를 클로람페니콜 (5 ug/㎖) 함유 LA 플레이트 상에서 37℃에서 선별하였다.
카나마이신 감수성 클론을 암플리콘의 삽입을 위한 PCR에 의해 스크리닝하였다. 양성 클론으로부터의 PCR 생성물을 서열분석하여 삽입된 DNA의 서열을 확인하였다. 암플리콘은 FRT-cmR-FRT-gi1.x-mKKDyI로 대체되는 MCM441 및 348 내 attTn7에서의 FRT-gi1.2-yKKDyI와 일치하였다 (yK 및 mK 지정은 각각 사카로마이세스 세레비지에 및 메타노사르키나 마제이로부터의 메발로네이트 키나아제를 나타냄).
[표 6A: 하기의 균주를 클로람페니콜 (5 ug/㎖) 함유 LB에서 성장시키고 동결하였음]
Figure pct00006
[표 6B: 프라이머]
Figure pct00007
III. 메발론산 경로로부터의 유전자를 발현하며 15ℓ 규모에서의 유가식 배양물에서 성장하는 대장균에서의 이소프렌 생성에 대한 효모 추출물의 효과
배지 제조 방법 (발효 배지 ℓ 당):
K2HPO4 7.5 g, MgSO4 * 7H2O 2 g, 시트르산 일수화물 2 g, 구연산 철 암모늄 0.3 g, 효모 추출물 0.5 g, 1000X 변형 미량 금속 용액 1 ㎖. 모든 성분을 diH2O에 함께 첨가하고 용해하였다. 상기 용액을 오토클레이브하였다. 수산화암모늄 (30%)으로 pH를 7.0으로 조정하고 부피에 대해 충분량이 되게 하였다. 글루코오스 1O g, 티아민 * HCl 0.1 g, 및 항생제를 멸균 및 pH 조정 후 첨가하였다.
1000X 변형 미량 금속 용액:
시트르산 * H2O 40 g, MnSO4 * H2O 30 g, NaCl 10 g, FeSO4 * 7H2O 1 g, CoCl2 * 6H2O 1 g, ZnSO4 * 7H2O 1 g, CuSO4 * 5H2O 100 mg, H3BO3 100 mg, NaMoO4 * 2H2O 100 mg. 각각의 성분을 Di H2O에 한번에 하나씩 용해하고, HCl/NaOH로 pH를 3.0이 되게 하고, 부피에 대해 충분량이 되게 하고 0.22 마이크론 필터로 여과 멸균하였다.
상위 메발론산 (MVA) 경로 (pCL Upper), 융합된 하위 MVA 경로 (gi1.2KKDyI), 및 M. 마제이로부터의 메발로네이트 키나아제 및 P. 알바로부터의 이소프렌 신타아제 (pTrcAlba-mMVK)의 고발현물을 포함하는 BL21 (DE3) 대장균 세포를 갖는 15ℓ 생물반응기에서 발효를 실행하였다. 이러한 실험을 실행하여 원하는 발효 pH 7.0 및 온도 30℃에서 글루코오스로부터 이소프렌이 형성되는 것을 모니터링하였다. 대장균 균주의 동결 바이알을 해동시키고, 트립톤-효모 추출물 배지에 접종하였다. 접종물이 OD 1.0 (550 nm에서 측정됨)으로 성장한 후, 초기 부피를 5ℓ로 하는 15ℓ생물반응기에 접종하는데 500 ㎖를 사용하였다.
i) 효모 추출물 공급 없이 유가식 배양에서 성장한 대장균 세포 (EL256)에서의 이소프렌의 생성
세포가 정지상에 도달할 때까지 지수 증대 속도로 글루코오스를 공급하였다. 이후, 글루코오스 공급을 감소시켜 대사작용 요구를 충족시켰다. 67시간 발효 동안 생물반응기로 전달된 글루코오스의 총량은 3.9 ㎏이었다. 이소프로필-베타-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG)를 첨가하여 유도하였다. 550 nm에서의 광학 밀도 (OD550)가 9의 값에 도달했을 때 IPTG 농도는 102 uM이었다. OD55O이 140에 도달했을 때 IPTG 농도는 192 uM으로 상승하였다. 시간에 걸친 생물반응기 내의 OD550 프로파일을 도 67A에 나타내었다. 생물반응기로부터의 배출 기체 중 이소프렌 수준을 Hiden 질량 분석기를 사용하여 측정하였다. 이소프렌 역가는 발효의 과정에 걸쳐 35.6 g/L의 최종 값으로 증가하였다 (도 67B). 67시간 발효 동안 생성된 이소프렌의 총량은 320.6 g이었고, 생성의 시간 추이를 도 67C에 나타내었다. TCER로 측정된 바와 같은 대사작용 활성 프로파일을 도 67D에 나타내었다. 발효 동안 이소프렌을 생성하는데 이용된 탄소의 몰 수율은 17.9%였다. 글루코오스로부터의 이소프렌의 중량% 수율은 8.1%였다.
효모 추출물을 공급하는 유가식 배양에서 성장한 대장균 세포 (EL256)에서의 이소프렌의 생성
세포가 정지상에 도달할 때까지 지수 증대 속도로 글루코오스를 공급하였다. 이후, 글루코오스 공급을 감소시켜 대사작용 요구를 충족시켰다. 68시간 발효 동안 생물반응기로 전달된 글루코오스의 총량은 7.1 ㎏이었다. 총 1.06 ㎏의 효모 추출물을 또한 발효 동안 공급하였다. IPTG를 첨가하여 유도하였다. 550 nm에서의 광학 밀도 (OD550)가 7의 값에 도달했을 때 IPTG 농도는 208 uM이었다. OD55O이 180에 도달했을 때 IPTG 농도는 193 uM으로 상승하였다. 시간에 걸친 생물반응기 내의 OD550 프로파일을 도 68A에 나타내었다. 생물반응기로부터의 배출 기체 중 이소프렌 수준을 Hiden 질량 분석기를 사용하여 측정하였다. 이소프렌 역가는 발효의 과정에 걸쳐 32.2 g/L의 최대값으로 증가하였다 (도 68B). 68시간 발효 동안 생성된 이소프렌의 총량은 395.5 g이었고, 생성의 시간 추이를 도 68C에 나타내었다. 체적 생산성의 시간 추이를 도 68D에 나타내었고, 이는 1.1 g/L/시간의 평균 속도를 23 내지 63시간 동안 유지하였다는 것을 나타낸다. CER로 측정된 바와 같은 대사작용 활성 프로파일을 도 68E에 나타내었다. 발효 동안 이소프렌을 생성하는데 이용된 탄소의 몰 수율은 10.3%였다. 글루코오스로부터의 이소프렌의 중량% 수율은 5.2%였다.
IV. 메발론산 (MVA) 경로 및 이소프렌 신타아제를 갖는 대장균 (EWL256)에서의 상이한 탄소원으로부터의 이소프렌의 생성
배지 제조 방법 (발효 배지 ℓ 당):
K2HPO4 13.6 g, KH2PO4 13.6 g, MgSO4 * 7H2O 2 g, 시트르산 일수화물 2 g, 구연산 철 암모늄 0.3 g, (NH4)2SO4 3.2 g, 효모 추출물 0.2 g, 1000X 변형 미량 금속 용액 1 ㎖. 모든 성분을 순차적으로 diH2O에 용해하였다. 수산화암모늄 (30%)으로 pH를 6.8로 조정하고, 부피에 대해 충분량이 되게 하였다. 배지를 0.22 마이크론 필터로 여과 멸균하였다. 탄소원을 1%의 최종 농도로 첨가하였다. 멸균 및 pH 조정 후에 필요한 항생제를 첨가하였다.
1000X 미량 금속 용액 (발효 배지 ℓ 당):
시트르산 * H2O 40 g, MnSO4 * H2O 30 g, NaCl 10 g, FeSO4 * 7H2O 1 g, CoCl2 * 6H2O 1 g, ZnSO4 * 7H2O 1 g, CuSO4 * 5H2O 100 mg, H3BO3 100 mg, NaMoO4 * 2H2O 100 mg. 각각의 성분을 diH2O에 한번에 하나씩 용해하고, HCl/NaOH로 pH를 3.0이 되게 하고, 부피에 대해 충분량이 되게 하고 0.22 마이크론 필터로 여과 멸균하였다.
i) AFEX 바이오매스 가수분해물의 제조
AFEX 사전처리된 옥수수대를 가수분해하여 자일로오스, 글루코오스 및 아세테이트를 모두 함유하는 바이오매스 가수분해물을 제조하였다.
[Michigan Biotechnology Institute]에서 제공된 AFEX 사전처리 옥수수대를 사용하였다. 사전처리 조건은 60% 수분, 1:1 암모니아 적하량, 및 90℃에서 30분 동안이었고, 그 후 자연 건조하였다. AFEX 사전처리 옥수수대 중의 수분 함량은 21.27%였다. AFEX 사전처리 옥수수대 중의 글루칸 및 자일란의 함량은 각각 31.7% 및 19.1% (건조량 기준)였다. 사용되는 효소는 Accellerase 1000, Grindamyl H121 (제빵용 아스페르길루스 니게르로부터의 Danisco 자일라나아제 제품)이었다.
당화의 경우, 20 g의 AFEX 사전처리 옥수수대를 500 ㎖ 플라스크 내에, 5 ㎖의 1 M pH 4.8 나트륨 시트레이트 완충액, 2.25 ㎖의 Accellerase 1000, 0.1 ㎖의 Grindamyl H121, 및 72.65 ㎖의 DI 물과 함께 첨가하였다. 플라스크를 궤도 진탕기에 넣고, 50℃에서 96시간 동안 인큐베이션하였다.
분석을 위해, 진탕기에서 하나의 샘플을 취하여, HPLC를 사용하여 분석하였다. 가수분해물에는 37.2 g/L의 글루코오스 및 24.3 g/L의 자일로오스, 및 7.6 g/L의 글루코오스 및/또는 자일로오스의 올리고머가 함유되어 있었다. 추가적으로는, 가수분해물에는 또한 1.17 g/L 아세테이트가 함유되어 있었다.
ii) 실험 절차
MVA 경로 및 이소프렌 신타아제를 함유하는 대장균 균주 EWL256의 접종물을 동결 바이알로부터 취하고 스펙티노마이신 (50 ug/㎖) 및 카르비니클린 (50 ug/㎖)을 함유하는 LB 브로쓰 한천 플레이트에 스트리킹하고 30℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 단일 콜로니를 유일한 탄소원으로서 글루코오스, 자일로오스, 글리세롤, 아세테이트 또는 바이오매스를 함유하는 TM3 배지에 접종하고, 30℃에서 하룻밤 동안 성장시켰다. 아세테이트 상에서 성장한 세포는 유의하게 낮은 광학 밀도에 도달하였다. 글루코오스, 글리세롤, 바이오매스 가수분해물 또는 아세테이트 상에서 성장한 세포를 각각의 탄소원을 함유하는 TM3 배지 20 ㎖에 희석하여 60O nM에서 측정된 0.1 사이의 광학 밀도에 도달하도록 하였다. 임의의 탄소원을 함유하지 않는 음성 대조군을 글루코오스 하룻밤 배양물로부터 제조하였다. 글루코오스 및 자일로오스로 별도의 실험을 수행하였고, 이때 배양물을 0.05의 광학 밀도로 희석하였다. 모든 배양 조건 (아세테이트 및 글리세롤의 경우를 제외함)을 2 반복으로 시험하고, 제시된 결과는 이들 배양물 사이의 평균으로 정하였다. 시험 시작시 200 μM IPTG로 이소프렌의 생성을 유도하였다. 플라스크를 궤도 진탕기 (200 rpm)에서 30℃에서 인큐베이션하고, 광학 밀도 측정에 의해 성장을 확인하였다. 글루코오스 공급 배양물이 약 0.4의 광학 밀도에 도달한 후, 샘플을 3시간 동안 매 시간 모든 시험된 탄소원으로부터의 이소프렌 생성에 대해 분석하였다. 100 ㎕의 샘플을 2 ㎖ 유리 바이알로 2 반복으로 옮기고, 밀봉하고 30분 동안 30℃에서 인큐베이션하였다. 이후 80℃에서 8분 동안의 인큐베이션에 의해 세균을 열 사멸시켰다. GC-MS를 사용하여 생성된 이소프렌의 양을 측정하고 특이적 생산성 (㎍/L*시간)을 계산하였다.
iii) 결과
모든 시험된 탄소원 상에서의 성장 동안 유의한 이소프렌 생성이 입증될 수 있었다. 이러한 탄소원은 통상의 알코올, 유기산, 5 또는 6 (C5 또는 C6) 탄당, 및 바이오매스 가수분해물의 예이다.
바이오매스 가수분해물 상에서의 초기 성장 속도는 글루코오스 상에서의 성장 속도에 필적하였다 (도 69A). 바이오매스 가수분해물 상에서의 성장 동안의 초기 특이적 생산성은 글루코오스 상에서의 성장 동안의 것보다 유의하게 높았다. 이것은 바이오매스 가수분해물이 이소프렌 생성을 위한 효율적인 탄소원으로서 사용될 수 있다는 것을 입증한다. 특이적 생산성은 바이오매스 가수분해물 상에서의 성장 255분 후 감소하였다 (도 69B). 세균는 글루코오스와 비교하였을 때 유일한 탄소원으로서 자일로오스를 사용하여 낮은 성장 속도를 보였으나 (도 69C), 유의한 특이적 이소프렌 생산성이 측정되었다 (도 69D). 이는 C5 및 C6 당 모두가 메발로네이트 산 경로를 통한 이소프렌의 생성에 이용될 수 있다는 것을 보여준다.
놀랍게도, 유일한 탄소원으로서의 아세테이트 상에서 성장한 세균은 글루코오스 상에서의 성장 동안 약 2배 높은 이소프렌의 특이적 생산성을 가졌다 (도 69A). 세균은 글루코오스와 비교하였을 때 아세테이트 상에서 더 느리게 성장하지만 (도 69B), 수행된 실험은 아세테이트가 또한 이소프렌의 생성을 위한 탄소원으로서 사용될 수 있다는 것을 입증한다. 아세테이트는 또한 HPLC에 의해 측정된 바와 같이 바이오매스 가수분해물 내에 존재하였다.
세균은 유일한 탄소원으로서의 글리세롤로 잘 성장하였고 (도 69A), 유의한 이소프렌 생성이 입증되었다 (도 69B). 이는 통상의 알코올도 또한 메발로네이트 산 경로를 통한 이소프렌의 생성을 위한 탄소원으로서 사용될 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 11: 스트렙토마이세스 종에서의 식물로부터의 이소프렌- 신타아제의 발현
이소프렌 신타아제 Kudzu에 대한 유전자는 플라스미드 pJ201:19813으로부터 수득되었다. 플라스미드 pJ201:19813은 푸에라이아 로바타 (Pueraia lobata) (Kudzu 식물)로부터의 이소프렌 신타아제를 인코딩하고, 슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida), 로도슈도모나스 팔루스트리스 (Rhodopseudomonas palustris) 및 코리네박테리움 (Corynebacterium)에 대해 코돈-최적화되어 있다 (도 79A~79C (SEQ ID NO:123)). 플라스미드 pJ201:19813를 제한 효소 NdeI 및 BamHI로 소화시키면 유전자 isol9813이 방출되고, 이를 스트렙토마이세스-대장균 셔틀 벡터 pUWL201PW (Doumith 등, Mol. Gen. Genet. 264: 477-485, 2000; 도 71) 내로 라이게이션시켜 pUWL201_iso를 생성시킨다. pUWL201_iso의 제한 분석에 의해 성공적인 클로닝을 확인하였다. 이소프렌 신타아제 isol9813의 발현은, 스트렙토마이세스 종에서의 항시적 발현은 허용하나, 대장균에서의 발현은 허용하지 않는 erm-프로모터의 조절 하에서 이루어졌다.
PUWL201PW (삽입물 없음) 및 pUWL201_iso를 [Hopwood 등., The John innes foundation, Norwich, 1985]에 의해 기재되는 바와 같이 원형질체의 형질전환에 의해 스트렙토마이세스 알부스 J1074 (Sanchez 등., Chem. Biol. 9:519-531, 2002) 내로 도입하였다.
원형질체 현탁액의 200 ㎕ 분취액을 1.9 ㎍ pUWL201PW 또는 2.9 ㎍ pUWL201_iso로 형질전환시켰다. 비-선별성 R5-한천 플레이트 상에서 28℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션한 후, 티오스트렙톤 (250 ㎍/㎖)을 함유하는 R3-오버레이 한천에서 4일 동안 추가 인큐베이션하여 양성 형질전환체를 선별하였다. 티오스트렙톤 내성 형질전환체를 Plasmid Mini 키트 (Qiagen)를 사용하는 플라스미드 제제에 의해 pUWL-플라스미드의 존재 하에서 시험하였다. 준비된 플라스미드 DNA를 대장균 DH5α 내로 재도입하여, 제한 분석으로 분석하기에 충분한 양의 플라스미드 DNA를 생성시켰다. 양성 형질전환체를 암피실린-함유 L-한천 플레이트 상에서 선별하고 NdeI 및 BamHI 엔도뉴클레아제로 플라스미드 DNA를 소화시켜 삽입물 분석을 수행하였다. 이소프렌 신타아제를 양성 pUWL201 iso 클론에서 1.7 kb 절편으로서 확인하였으나, 대조군 균주 (pUWL201PW)에서는 이러한 절편이 관찰되지 않았다.
대조군 플라스미드 pUWL201PW 또는 이소프렌 신타아제 인코딩 pUWL201_iso를 함유하는 S. 알부스의 형질전환체 및 야생형 균주를 이소프렌 형성에 대해 분석하였다. 티오스트렙톤 (200 ㎍/㎖)의 존재 또는 부재 하의 고체 배지 (트립신 콩 브로쓰 한천, TSB; 2.5 ㎖) 상에서 균주를 2 반복으로 배양하고, 밀봉된 상부공간 바이알 (총 부피 20 ㎖) 내에 28℃에서 4일 동안 인큐베이션하였다. SIM-방식으로 GC-MS에 의해 500 ㎕ 상부공간 샘플 (종결 지점 측정)을 분석하고, 이소프렌을 참조 지체 시간 및 분자량 (67 m/z)에 따라 확인하였다. 상부공간 샘플 내에 존재하는 이소프렌을 이전에 생성된 검정 곡선에 의해 정량화하였다. 야생형 S. 알부스 및 pUWL201PW를 갖는 대조군 균주가 이소프렌을 검출 한계 (0.04~0.07 ppm) 보다 약간 높은 농도로 생성하는 반면, pUWL201_iso를 갖는 S. 알부스는 대조군에 비해 10배 이상 초과량으로 이소프렌을 생성하였다 (0.75 ppm; 도 72). 상기 결과는 악티노마이세테스 (Actinomycetes) 군의 원핵세포 유기체 내 식물 유래 이소프렌 신타아제의 성공적인 발현을 입증한다.
실시예 12: 상위 또는 상위 및 하위 메발론산 경로, 및 쿠주 이소프렌 신타아제를 함유하는 대장균 fadR atoC LS5218 내에서의 지방산 또는 야자유로부터 이소프렌 또는 메발로네이트의 생성
에스케리키아 콜라이 (대장균) fadR atoC 균주 LS5218 (#6966)은 [Coli Genetic Stock Center]로부터 수득하였다. FadR은 지방산 분해 효소를 인코딩하는 유전자의 발현을 하향 조절하는 전사 억제자를 인코딩한다 (Campbell 등, J. Bacteriol. 183: 5982-5990, 2001). AtoC는 AtoS와 함께 2 성분 조절 시스템에서의 반응 조절자로서, 아세토락테이트 신진 대사를 조절한다. fadR atoC 균주는 지방산 분해 유전자의 구조적 발현을 허용하고 장쇄 지방산을 장쇄 길이 폴리하이드록시알카노에이트 내로 도입시킨다. 야자유가 메발로네이트 또는 이소프렌 생성을 위한 탄소원으로서 사용되는 경우, 야자유는 글리세롤과 지방산으로 변환되었다. 이에 대한 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 이는 리파아제 (예를 들어, 돼지 (Porcine) 췌장 리파아제, 칸디다 루고사 (Candida rugosa) 리파아제, 또는 기타 유사한 리파아제)로의 인큐베이션에 의해 효소적으로 또는 수산화나트륨과 같은 염기로의 비누화에 의해 화학적으로 수행될 수 있다.
i) 상위 메발론산 경로를 발현하는 대장균 fadR atoC 균주
표준 방법 (Sambrooke 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, 1989)을 사용하여 pCLPtrcUpperPathway를 LS5218 내로 전기천공하여 균주 WW4를 제작하였다. 탄소원으로서 C12 지방산 (FA) 또는 야자유가 보충된 TM3 배지에서 세포를 배양한 경우 메발론산 (MVA) 생성에 의해 플라스미드의 도입이 입증되었다. 지방산으로부터 WW4에 의한 MVA의 생성을 입증하기 위해, 하룻밤 배양액으로부터의 세포를 0.25% C12 FA (Sigma 카탈로그 번호 L9755)가 보충된 변형 TM3 배지 (효모 추출물이 없는 TM3) 5 ㎖ 내로 1 내지 100 배 희석시켰다. MVA 생성 (24 mg/L)의 첫 번째 징후는 IPTG 유도 배양액의 3O℃에서의 하룻밤 동안의 인큐베이션 후 명백하였다. 생성된 MVA의 194 mg/L의 최종 수준으로 3일에 걸쳐 생성이 증가하였다. 오일로부터 WW4에 의한 MVA의 생성을 입증하기 위해, 하룻밤 배양액으로부터의 세포를 TM3 배지 5 ㎖ 당 200 mg의 소화된 야자유가 보충된 변형 TM3 배지 내로 1 내지 100배 희석시켰다. MVA 생성 (50 mg/L)의 첫 번째 징후는 IPTG 유도 배양액의 3O℃에서의 하룻밤 동안의 인큐베이션 후 명백하였다. 생성된 MVA의 500 mg/L의 최종 수준으로 3일에 걸쳐 생성이 증가하였다.
ii) 상위 및 하위 MVA 경로 및 쿠주 이소프렌 신타아제를 발현하는 대장균 fadR atoC 균주
에스케리키아 콜라이 (대장균) 균주 WW4 (LS5218 fadR atoC pCLPtrcUpperPathway)를 pMCM118 [pTrcKKDyIkIS]로 형질전환시켜 WW10을 수득하였다. 균주를 TM3 및 글루코오스에서 배양하고 IPTG (100, 300 또는 900 uM)로 유도한 경우 이소프렌의 생성이라는 증거에 의해 플라스미드의 도입이 입증되었다. 균주는 IPTG에 비교적 민감성이었고, 100 uM IPTG에서도 유의한 성장 결핍을 보였다. 이러한 결과를 도 7OA에 나타내었다.
도데칸산으로부터의 이소프렌 생성을 시험하기 위해, WW10을 스펙티노마이신 (50 ug/㎖), 및 카나마이신 (50 ug/㎖) 함유 L 브로쓰에서 200 rpm에서 진탕하면서 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 변형 TM3 배지로의 본래 배양 부피에서의 원심분리 및 재현탁에 의해 세포를 변형 TM3 배지로 세척하였다. 상기 종균 배양물 (starter culture)로부터 세척되고 재현탁된 세포를 0.125% C12 지방산 (Sigma 카탈로그 번호 L9755) 함유 변형 TM3 배지 5 ㎖ 내로 1 내지 100배 및 1 내지 10배 희석하였다.
야자유로부터의 메발로네이트의 생성을 입증하기 위하여, 37℃ 및 250 rpm에서 수일 동안 리파아제로 오일을 사전소화시켜 지방산을 방출시켰다 (튜브가 진탕될 때 형성된 거품에 의해 가수분해가 증명되는 것으로 판단됨).
추가로, 야자유와 함께 시험 튜브에 함유된 변형 TM3 매질에서 세척된 세포를 1 내지 10배 희석시킴으로써 배양물을 제조하였다. 추가 희석 없이 세척된 세포의 잔여물 (2.5 ㎖)에 0.125% C12FA를 첨가함으로써 추가 튜브를 제조하였다 (생물변환 (bioconversion)). 250 rpm에서 진탕하면서 30℃에서 3.75시간 성장시킨 후, 50 uM IPTG를 첨가하여 배양물 모두를 유도하였다. 변형된 상부공간 검정법 (500 rpm에서 진탕하면서 30℃에서 1시간 축적)을 이용하여 이소프렌 축적에 대해 각각의 배양물 200 uL를 검정한 후 4시간 동안 인큐베이션을 지속하였다. 추가적인 이소프렌 검정법을 GCMS 분석 전에 검정법 유리 블록의 12시간 인큐베이션으로 수행하였다. 유도된 배양물의 인큐베이션을 하룻밤 동안 유지하고, 다음날 아침 200 uL 분취량을 이소프렌 생성에 대해 다시 검정하였다 (1시간, 30 deg, 500 rpm Shel-Lab 진탕기). 상기 배양물의 분석을 통해 유의한 수준의 이소프렌의 생성이 나타났다. 하룻밤 동안 인큐베이션되고 유도된 후 하룻밤 종균 배양물로부터의 1/10 희석물로 접종된 배양물에서 최고 수준의 이소프렌이 관찰되었다. 이러한 결과는 상기 배양물이 지속적으로 성장하고 세포 밀도를 증가시킨다는 것을 제안한다. 이러한 결과를 도 70B에 나타내었다. 지방산 현탁액의 외관이 탁하기 때문에 세포 밀도를 직접 측정할 수 없다. 그러므로 상기 배양물의 분취량을 플레이팅하여 상기 배양물의 세포 밀도를 측정하였고, 8xl07 콜로니 형성 단위가 나타났다. 이는 0.1의 OD600에 거의 상응한다. 그럼에도, 상기 배양물은 유의한 이소프렌 생성을 제공하였고; 본 실시예에 기재된 경로 없이는 유사한 균주에 대해서 이소프렌이 관찰되지 않는다.
실시예 13: 대장균에서 ybhE 의 항시적 발현에 의한 이소프렌 생성의 향상
본 실시예는 야생형 ybhE를 갖는 대조군 균주와 비교하여 ybhE (pgl)을 항시적으로 발현하는 균주에서의 이소프렌 생성을 나타낸다. 유전자 ybhE (pgl)는 이종으로 발현되는 단백질의 변역 후 글루코닐화를 억제하고, 생성물 용해도 및 수율을 향상시키면서 펜토오스 포스페이트 경로를 통해 바이오매스 수율 및 플럭스를 또한 개선시키는 6-포스포글루코노락토나아제를 인코딩한다 (Aon 등, Applied and Environmental Microbiology, 74(4): 950-958, 2008).
이소프렌을 생성하는 대장균의 BL21 균주 (EWL256)는 복제 플라스미드 pBBR1MCS5 (겐타마이신) (Dr. K. Peterson, Louisiana State University 로부터 수득함) 상의 ybhE 유전자의 항시적 발현으로 구성된다.
FRT-기준 재조합 카세트, 및 Red/ET-매개 융합용 플라스미드 및 항생제 마커 루프아웃을 Gene Bridges GmbH (독일)에서 수득하였다. 이들 재료를 사용하는 절차를 Gene Bridges 프로토콜에 따라 실행하였다. 프라이머 Pgl-F 및 PglGI1.5-R을 사용하여, 제조사의 프로토콜에 따라 Stratagene Herculase II Fusion 키트를 사용하여 FRT-gb2-Cm-FRT 주형으로부터 내성 카세트를 증폭하였다. PCR 반응물 (최종 부피 50 uL)은 5 uL 완충액, 1 uL 주형 DNA (Gene Bridges로부터의 FRT-gb2-Cm-F), 각 프라이머 10 pmol, 및 1.5 uL 25 mM dNTP 믹스를 함유하였고, dH2O를 사용하여 50 uL로 제조하였다. 반응물을 하기와 같은 사이클에 적용하였다: 1 x 2분, 95℃, 이후 (95℃에서 30초; 63℃에서 30초; 72℃에서 3분)의 30 사이클.
생성된 PCR 생성물을 QiaQick PCR 정제 키트 (Qiagen)를 사용하여 정제하고, 하기와 같이 pRed-ET 재조합효소-함유 플라스미드를 갖는 전기수용성 (electrocompetent) MG1655 세포 내로 전기천공하였다. 5 ㎖의 L 브로쓰를 약 0.6의 OD600으로 30℃에서 성장시켜 세포를 제조하였다. 4% 아라비노오스를 첨가함으로써 재조합 효소 발현을 위해 세포를 유도하였고, 30분 동안 30℃, 이어서 30분 동안 37℃에서 성장시켰다. 1.5 ㎖의 세포 분취량을 얼음 냉각된 dH2O로 3~4회 세척하였다. 최종 세포 펠릿을 40 uL의 얼음 냉각된 dH2O에 재현탁시키고, 2~5 uL의 PCR 생성물을 첨가하였다. Gene Pulser Electroporator (Bio-Rad Inc.)로 1.3 kV에서 1-mm 갭 큐벳 내에서 전기천공을 수행하였다. 세포를 30℃에서 1~2시간 동안 회수하고, 클로람페니콜 (5 ug/㎖)을 함유하는 L 한천 상에 플레이팅하였다. 융합 부위 측면에 위치한 (flanking) 프라이머 (2 프라이머 세트: pgl 및 49 rev 및 3' EcoRV-pglstop; Bottom Pgb2 및 Top GB's CMP (946))를 사용하여 PCR 및 서열분석으로 5개의 형질전환체를 분석하였다. 올바른 형질전환체를 선별하고, 이러한 균주를 MG1655 GI1.5-pgl::CMP로 지정하였다.
MG1655 GI1.5-pgl::CMP의 염색체 DNA를 주형으로 사용하여 FRT-CMP-FRT-GI 1.5-ybhE 구성물을 함유하는 PCR 절편을 생성하였다. 이러한 구성물은 하기와 같이 pBBR1MCS5 (겐타마이신)으로 클로닝되었다. 본원에서 CMP-GI1.5-pgl로 지칭되는 절편을, 5' 프라이머 Pglconfirm-F 및 3' 프라이머 3' EcoRV-pglstop을 사용하여 증폭시켰다. 제조사가 제시한 바와 같이, Invitrogen TOPO-Blunt 클로닝 키트를 사용하여 플라스미드 벡터 pCR-Blunt II-TOPO 내로 생성된 절편을 클로닝하였다. CMP-GI1.5-pgl 절편을 갖는 NsiI 절편을 pBBR1MCS5 (겐타마이신)의 PstI 위치로 클로닝하였다. 5 ㎕ CMP-GI1.5-pgl 삽입물, 2 ㎕ pBBR1MCS5 (겐타마이신) 벡터, 1 ㎕ T4 DNA 리가아제 (New England Biolabs), 2 ㎕ 1OX 리가아제 완충액, 및 lO ㎕ ddH2O를 함유하는 20 ㎕ 라이게이션 반응물을 제조하였다. 라이게이션 혼합물을 실온에서 40분 동안 인큐베이션한 후, 상기 개시된 매개변수를 사용하여 전기수용성 Top 10 세포 (Invitrogen) 내로 2~4 uL를 전기천공하였다. 10 ug/㎖ 클로람페니콜 및 5 ug/㎖ 겐타마이신을 함유하는 L 한천 상에서 형질전환체를 선별하였다. 선별된 클론의 서열을 상기 기재된 다수의 프라이머 뿐만 아니라 Sequetech, CA 에 의해 제공되는 역방향 프라이머 및 사내 (in-house) T3을 사용하여 측정하였다. 이러한 플라스미드를 pBBRCMPGI1.5-pgl로 지정하였다 (도 77A~B 및 SEQ ID NO:122).
실시예 10에서 상기 기재한 바와 같이 플라스미드 pBBRCMPGI1.5-pgl를 EWL256 내로 전기천공하고, 클로람페니콜 (10 ug/㎖), 겐타마이신 (5 ug/㎖), 스펙티노마이신 (50 ug/㎖) 및 카르베니실린 (50 ug/㎖)을 함유하는 L 한천 상에 형질전환체를 플레이팅하였다. 하나의 형질전환체를 선별하여 RM11608-2로 지정하였다.
프라이머:
Figure pct00008
Figure pct00009
i) 소규모 분석
배지 제조 방법 (발효 배지 ℓ 당):
K2HPO4 13.6 g, KH2PO4 13.6 g, MgSO4 * 7H2O 2 g, 시트르산 일수화물 2 g, 구연산 철 암모늄 0.3 g, (NH4)2SO4 3.2 g, 효모 추출물 1 g, 1000X 미량 금속 용액 1 ㎖. 모든 성분을 diH2O에 함께 첨가하고 용해하였다. 수산화암모늄 (30%)을 사용하여 pH를 6.8로 조정하고, 부피에 대해 충분량이 되게 하였다. 0.22 마이크론 필터를 사용하여 배지를 여과 멸균하였다. 글루코오스 5.O g 및 항생제를 멸균 및 pH 조정 후 첨가하였다.
100OX 미량 금속 용액 (발효 배지 ℓ 당):
시트르산 * H2O 40 g, MnSO4 * H2O 30 g, NaCl 10 g, FeSO4 * 7H2O 1 g, CoCl2 * 6H2O 1 g, ZnSO4 * 7H2O 1 g, CuSO4 * 5H2O 100 mg, H3BO3 100 mg, NaMoO4 * 2H2O 100 mg. 각 성분을 한번에 하나씩 diH2O에 용해하였다. HCl/NaOH로 pH를 3.0으로 조정한 후, 용액을 부피에 대해 충분량이 되게 하고 0.22 마이크론 필터를 사용하여 여과 멸균하였다.
a) 실험 절차
MicroReactor Technologies, Inc 사제 Cellerator™ 에서 균주를 성장시켜 이소프렌 생성을 분석하였다. 각 24 웰의 작용 부피는 4.5 ㎖였다. 온도를 3O℃로 유지시켰고, pH 설정점은 7.0이었고, 산소 흐름 설정점은 20 sccm이었으며, 교반 속도는 800 rpm이었다. 동결 바이알에서 취한 대장균 균주의 접종물을 LB 브로쓰 한천 플레이트 (항생제 포함) 상에 스트리킹하고, 30℃에서 인큐베이션하였다. 단일 콜로니를 항생제를 갖는 배지에 접종하고, 하룻밤 동안 성장시켰다. 세균을 항생제를 갖는 배지 4.5 ㎖로 희석하여 550 nm에서 측정된 광학 밀도 0.05에 도달시켰다.
기체 크로마토그래프-질량 분석기 (GC-MS) (Agilent) 상부공간 검정법을 사용하여 이소프렌의 배출 기체 분석을 수행하였다. 샘플을 하기와 같이 제조하였다: 100 ㎕의 전체 브로쓰를 밀봉된 GC 바이알에 넣고, 30분의 고정 시간 동안 30℃에서 인큐베이션하였다. 5분 동안 70℃에서의 인큐베이션으로 이루어진 열 사멸 단계에 이어서, 샘플을 GC에 적하시켰다.
실행 과정 동안 마이크로플레이트 판독기 (Spectramax)를 사용하여 파장 550 nm에서 광학 밀도 (OD)를 수득하였다. 이소프렌 농도 (㎍/L)를 OD 판독 및 시간 (hr)으로 나누어 특이적 생산성을 수득하였다.
두 개의 균주 EWL256 및 RM11608-2를 200 및 400 uM IPTG 유도 수준에서 평가하였다. 1, 2.5, 4.75 및 8시간 후-유도 (post-induction)에서 세포 성장 (OD550) 및 이소프렌 생성에 대해 샘플을 분석하였다. 샘플을 2 반복하여 수행하였다.
b) 결과
2개의 상이한 농도의 IPTG에서 ybhE (pgl)를 발현하는 균주가 대조군 균주에 비해 특이적 이소프렌 생산성에 있어서 극적인 2~3배 증가를 갖는다는 것을 실험을 통해 입증하였다.
ii) M. 마제이 메발로네이트 키나아제, P. 알바 이소프렌 신타아제, 및 pgl 과발현물 (RHM111608-2)을 발현하며 15ℓ 규모에서 유가식 배양물에서의 성장하는 대장균으로부터의 이소프렌 발효
배지 제조 방법 (발효 배지 ℓ 당)
K2HPO4 7.5 g, MgSO4 * 7B2O 2 g, 시트르산 일수화물 2 g, 구연산 철 암모늄 0.3 g, 효모 추출물 0.5 g, 1000X 변형 미량 금속 용액 1 ㎖. 모든 성분을 diH2O에 함께 첨가하고 용해하였다. 용액을 오토클레이브하였다. 수산화암모늄 (30%)으로 pH를 7.0으로 조정하고 및 부피에 대해 충분량이 되게 하였다. 글루코오스 10 g, 티아민 * HCl 0.1 g, 및 항생제를 멸균 및 pH 조정 후 첨가하였다.
1000X 변형 미량 금속 용액:
시트르산 * H2O 40 g, MnSO4 * H2O 30 g, NaCl 10 g, FeSO4 * 7H2O 1 g, CoCl2 * 6H2O 1 g, ZnSO4 * 7H2O 1 g, CuSO4 * 5H2O 100 mg, H3BO3 100 mg, NaMoO4 * 2H2O 100 mg. 각각의 성분을 한번에 하나씩 diH2O에 용해하고, HCl/NaOH으로 pH를 3.0으로 조정한 후, 용액을 부피에 대해 충분량이 되게 하고, 0.22 마이크론 필터로 여과 멸균하였다.
상위 메발론산 (MVA) 경로 (pCL Upper), 융합된 하위 MVA 경로 (gi1.2KKDyI), M. 마제이로부터의 메발로네이트 키나아제의 고발현물 및 P. 알바 (pTrcAlba-mMVK)로부터의 이소프렌 신타아제의 고발현물, 및 pgl (pBBR-pgl)의 고발현물을 함유하는 BL21 (DE3) 대장균 세포를 갖는 15ℓ 생물반응기에서 발효를 수행하였다. 상기 실험을 실행하여 원하는 발효 pH 7.0 및 온도 34℃에서 글루코오스로부터의 이소프렌 형성을 모니터링하였다. 대장균 균주의 동결 바이알을 해동시키고, 트립톤-효모 추출물 배지에 접종하였다. 접종물을 550 nm에서 측정된 OD 1.0으로 성장시킨 후, 500 ㎖를 사용하여 15ℓ 생물반응기에 접종하여 초기 부피를 5ℓ가 되게 하였다.
세포가 정지상에 도달할 때까지 지수 증대 속도로 글루코오스를 공급하였다. 이때 이후, 글루코오스 공급을 감소시켜 대사작용 요구를 충족시켰다. 40시간 (59시간) 발효 동안 생물반응기에 전달된 글루코오스 총량은 3.1 kg (59시간에 4.2 kg)이었다. IPTG를 첨가하여 유도하였다. 550 nm에서 광학 밀도 (OD550)가 4 값에 도달할 때 IPTG 농도는 110 uM이었다. OD550이 150에 도달할 때 IPTG 농도는 192 uM으로 상승하였다. 시간에 따른 생물반응기 내에서의 OD550 프로파일을 도 78A에 나타내었다. 생물반응기로부터의 배출 기체 내의 이소프렌 수준을 Hiden 질량 분석기를 사용하여 측정하였다. 이소프렌 역가는 발효 과정에 걸쳐 40시간에서 33.2 g/L (59시간에서 48.6 g/L)의 최대값으로 증가하였다 (도 78B). 이소프렌 역가는 발효 과정에 걸쳐 40시간에서 40.0 g/L (59시간에서 60.5 g/L)의 최대값으로 증가하였다 (도 78C). 40시간 (59시간) 발효 동안 생성된 이소프렌의 총량은 281.3 g (59시간에서 451.0 g)이었고, 생성의 시간 추이를 도 78D에 나타내었다. 체적 생산성의 시간 추이를 도 78E에 나타내었고, 평균 속도 1.0 g/L/시간을 0 내지 40시간 유지한 것을 나타내었다 (19 내지 59시간에서 1.4 g/L/시간). CER로 측정한 바와 같은 대사작용 활성 프로파일을 도 78F에 나타내었다. 발효 동안 이소프렌을 생성하는데 이용된 탄소의 몰 수율은 40시간에서 19.6% (59시간에서 23.6%)였다. 글루코오스로부터의 이소프렌의 중량%는 40시간에서 8.9% (59시간에서 10.7%)였다.
다르게 정의하지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속한 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것들이다. [Singleton, 등, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2nd ed., John Wiley and Sons, New York (1994), 및 Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, N.Y. (1991)]은 본 발명에서 사용되는 많은 용어의 일반적 일람을 갖는 지식 중 하나를 제공한다. 본 발명이 다양할 수 있는 특정 방법론, 프로토콜, 및 기재된 시약에 제한되지 않는다는 것이 이해될 것이다. 당업자는 또한 본원에 기재된 것과 유사 또는 동등한 임의 방법 및 재료가 본 발명을 실행 또는 시험하는데 또한 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본원에 제공된 표제는 전체로서 본 명세서에 참고문헌으로 포함될 수 있는 발명의 다양한 측면 또는 구현예의 제한이 아니다.
본원에서 사용하기 위해, 달리 명백하게 나타내지 않는 한, 단수형 표현은 복수형 표현을 나타낸다.
본원의 값 또는 매개변수에 대한 표현 "약"은 자체적 값 또는 매개변수를 지시하는 구현예를 포함 (및 설명)한다. 예를 들어, "약 X"를 나타내는 설명은 "X"의 설명을 포함한다. 수치적 범위는 범위를 한정하는 수치를 포함한다.
본원에 기재된 발명의 측면 및 구현예가 측면 및 구현예를 "포함하고", "구성하고" 및 "본질적으로 이로 이루어지는" 것이 이해된다.
부록 1
예시적 1- 데옥시 -D- 자일루로오스 -5- 포스페이트 신타아제 핵산 및 폴리펩티드
Figure pct00010
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Figure pct00019
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Figure pct00022
예시적 아세틸- CoA - 아세틸트랜스퍼라아제 핵산 및 폴리펩티드
Figure pct00023
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Figure pct00025
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Figure pct00027
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Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
예시적 HMG - CoA 신타아제 핵산 및 폴리펩티드
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
예시적 하이드록시메틸글루타릴 - CoA 환원효소 핵산 및 폴리펩티드
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
예시적 메발로네이트 키나아제 핵산 및 폴리펩티드
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
예시적 포스포메발로네이트 키나아제 핵산 및 폴리펩티드
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
예시적 디포스포메발로네이트 데카르복실라아제 핵산 및 폴리펩티드
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
예시적 이소펜테닐 포스페이트 키나아제 ( IPK ) 핵산 및 폴리펩티드
메타노박테리움 써모오토프로티쿰 (Methanobacterium thermoautotrophicum) gi|2621082
메타노코쿠스 잔나스치이 (Methanococcus jannaschii) DSM 2661 gi|1590842
메타노칼도코쿠스 잔나스치이 (Methanocaldococcus jannaschii) gi|1590842
메타노써보박터 써마우토트로피쿠스 (Methanothermobacter thermautotrophicus) gi|2621082
피크로필루스 토리두스 (Picrophilus torridus) DSM9790 (IG-57) gi|48477569
피로코쿠스 아비시 (Pyrococcus abyssi) gi|14520758
피로코쿠스 호리코시이 (Pyrococcus horikoshii) OT3 gi|3258052
아카에오글로부스 풀기두스 (Archaeoglobus fulgidus) DSM4304 gi|2648231
예시적 이소펜테닐 - 디포스페이트 델타-이성화효소 ( IDI ) 핵산 및 폴리펩티 드
Figure pct00056
Figure pct00057
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Figure pct00059
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Figure pct00062
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Figure pct00064
예시적 이소프렌 신타아제 핵산 및 폴리펩티드
Genbank 기탁 번호
AY341431
AY316691
AY279379
AJ457070
AY182241
<110> DANISCO US INC. THE GOOD YEAR TIRE & RUBBER COMPANY CERVIN, Marguerite WHITED, Gregory M. CHOTANI, Gopal K. VALLE, Fernando FIORESI, Carol SANFORD, Karl J. MCAULIFFE, Jospeh C. FEHER, Frank J. PUHALA, Aaron S. MIASNIKOV, Andrei ALDOR, Ilana S. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR PRODUCING ISOPRENE <130> 643842000249 <150> PCT/US2008/086869 <151> 2008-12-15 <150> US 61/013,574 <151> 2007-12-13 <160> 123 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 1701 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 atgtgtgcga cctcttctca atttactcag attaccgagc ataattcccg tcgttccgca 60 aactatcagc caaacctgtg gaatttcgaa ttcctgcaat ccctggagaa cgacctgaaa 120 gtggaaaagc tggaggagaa agcgaccaaa ctggaggaag aagttcgctg catgatcaac 180 cgtgtagaca cccagccgct gtccctgctg gagctgatcg acgatgtgca gcgcctgggt 240 ctgacctaca aatttgaaaa agacatcatt aaagccctgg aaaacatcgt actgctggac 300 gaaaacaaaa agaacaaatc tgacctgcac gcaaccgctc tgtctttccg tctgctgcgt 360 cagcacggtt tcgaggtttc tcaggatgtt tttgagcgtt tcaaggataa agaaggtggt 420 ttcagcggtg aactgaaagg tgacgtccaa ggcctgctga gcctgtatga agcgtcttac 480 ctgggtttcg agggtgagaa cctgctggag gaggcgcgta ccttttccat cacccacctg 540 aagaacaacc tgaaagaagg cattaatacc aaggttgcag aacaagtgag ccacgccctg 600 gaactgccat atcaccagcg tctgcaccgt ctggaggcac gttggttcct ggataaatac 660 gaaccgaaag aaccgcatca ccagctgctg ctggagctgg cgaagctgga ttttaacatg 720 gtacagaccc tgcaccagaa agagctgcaa gatctgtccc gctggtggac cgagatgggc 780 ctggctagca aactggattt tgtacgcgac cgcctgatgg aagtttattt ctgggcactg 840 ggtatggcgc cagacccgca gtttggtgaa tgtcgcaaag ctgttactaa aatgtttggt 900 ctggtgacga tcatcgatga cgtgtatgac gtttatggca ctctggacga actgcaactg 960 ttcaccgatg ctgtagagcg ctgggacgtt aacgctatta acaccctgcc ggactatatg 1020 aaactgtgtt tcctggcact gtacaacacc gttaacgaca cgtcctattc tattctgaaa 1080 gagaaaggtc ataacaacct gtcctatctg acgaaaagct ggcgtgaact gtgcaaagcc 1140 tttctgcaag aggcgaaatg gtccaacaac aaaattatcc cggctttctc caagtacctg 1200 gaaaacgcca gcgtttcctc ctccggtgta gcgctgctgg cgccgtctta cttttccgta 1260 tgccagcagc aggaagacat ctccgaccac gcgctgcgtt ccctgaccga cttccatggt 1320 ctggtgcgtt ctagctgcgt tatcttccgc ctgtgcaacg atctggccac ctctgcggcg 1380 gagctggaac gtggcgagac taccaattct atcattagct acatgcacga 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tggaatttcg aattcctgca atccctggag aacgacctga aagtggaaaa 540 gctggaggag aaagcgacca aactggagga agaagttcgc tgcatgatca accgtgtaga 600 cacccagccg ctgtccctgc tggagctgat cgacgatgtg cagcgcctgg gtctgaccta 660 caaatttgaa aaagacatca ttaaagccct ggaaaacatc gtactgctgg acgaaaacaa 720 aaagaacaaa tctgacctgc acgcaaccgc tctgtctttc cgtctgctgc gtcagcacgg 780 tttcgaggtt tctcaggatg tttttgagcg tttcaaggat aaagaaggtg gtttcagcgg 840 tgaactgaaa ggtgacgtcc aaggcctgct gagcctgtat gaagcgtctt acctgggttt 900 cgagggtgag aacctgctgg aggaggcgcg taccttttcc atcacccacc tgaagaacaa 960 cctgaaagaa ggcattaata ccaaggttgc agaacaagtg agccacgccc tggaactgcc 1020 atatcaccag cgtctgcacc gtctggaggc acgttggttc ctggataaat acgaaccgaa 1080 agaaccgcat caccagctgc tgctggagct ggcgaagctg gattttaaca tggtacagac 1140 cctgcaccag aaagagctgc aagatctgtc ccgctggtgg accgagatgg gcctggctag 1200 caaactggat tttgtacgcg accgcctgat ggaagtttat ttctgggcac tgggtatggc 1260 gccagacccg cagtttggtg aatgtcgcaa agctgttact aaaatgtttg gtctggtgac 1320 gatcatcgat gacgtgtatg acgtttatgg cactctggac gaactgcaac tgttcaccga 1380 tgctgtagag cgctgggacg ttaacgctat taacaccctg ccggactata tgaaactgtg 1440 tttcctggca ctgtacaaca ccgttaacga cacgtcctat tctattctga aagagaaagg 1500 tcataacaac ctgtcctatc tgacgaaaag ctggcgtgaa ctgtgcaaag cctttctgca 1560 agaggcgaaa tggtccaaca acaaaattat cccggctttc tccaagtacc tggaaaacgc 1620 cagcgtttcc tcctccggtg tagcgctgct ggcgccgtct tacttttccg tatgccagca 1680 gcaggaagac atctccgacc acgcgctgcg ttccctgacc gacttccatg gtctggtgcg 1740 ttctagctgc gttatcttcc gcctgtgcaa cgatctggcc acctctgcgg cggagctgga 1800 acgtggcgag actaccaatt ctatcattag ctacatgcac gaaaacgatg gtaccagcga 1860 ggaacaggcc cgcgaagaac tgcgtaaact gatcgacgcc gaatggaaaa agatgaatcg 1920 tgaacgcgtt agcgactcca ccctgctgcc taaagcgttc atggaaatcg cagttaacat 1980 ggcacgtgtt tcccactgca cctaccagta tggcgatggt ctgggtcgcc cagactacgc 2040 gactgaaaac cgcatcaaac tgctgctgat tgaccctttc ccgattaacc agctgatgta 2100 tgtctaactg cagctggtac catatgggaa ttcgaagctt tctagaacaa aaactcatct 2160 cagaagagga tctgaatagc gccgtcgacc atcatcatca tcatcattga gtttaaacgg 2220 tctccagctt ggctgttttg gcggatgaga gaagattttc agcctgatac agattaaatc 2280 agaacgcaga agcggtctga taaaacagaa tttgcctggc ggcagtagcg cggtggtccc 2340 acctgacccc atgccgaact cagaagtgaa acgccgtagc gccgatggta gtgtggggtc 2400 tccccatgcg agagtaggga actgccaggc atcaaataaa acgaaaggct cagtcgaaag 2460 actgggcctt tcgttttatc tgttgtttgt cggtgaacgc tctcctgagt aggacaaatc 2520 cgccgggagc ggatttgaac gttgcgaagc aacggcccgg agggtggcgg gcaggacgcc 2580 cgccataaac tgccaggcat caaattaagc agaaggccat cctgacggat ggcctttttg 2640 cgtttctaca aactcttttt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat 2700 gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta tgagtattca 2760 acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca 2820 cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta 2880 catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt 2940 tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc gtgttgacgc 3000 cgggcaagag caactcggtc 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Construct <400> 123 tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat tcatatcagg attatcaata 60 ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa actcaccgag gcagttccat 120 aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc gtccaacatc aatacaacct 180 attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga aatcaccatg agtgacgact 240 gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc agacttgttc aacaggccag 300 ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac cgttattcat tcgtgattgc 360 gcctgagcga ggcgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac aattacaaac aggaatcgag 420 tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat tttcacctga atcaggatat 480 tcttctaata cctggaacgc tgtttttccg gggatcgcag tggtgagtaa ccatgcatca 540 tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagtggca taaattccgt cagccagttt 600 agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac ctttgccatg tttcagaaac 660 aactctggcg catcgggctt cccatacaag cgatagattg tcgcacctga ttgcccgaca 720 ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca tgttggaatt taatcgcggc 780 ctcgacgttt cccgttgaat atggctcata ttcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt 840 tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa 900 ataggggtca gtgttacaac caattaacca attctgaaca ttatcgcgag cccatttata 960 cctgaatatg gctcataaca ccccttgttt gcctggcggc agtagcgcgg tggtcccacc 1020 tgaccccatg ccgaactcag aagtgaaacg ccgtagcgcc gatggtagtg tggggactcc 1080 ccatgcgaga gtagggaact gccaggcatc aaataaaacg aaaggctcag tcgaaagact 1140 gggcctttcg cccgggctaa ttagggggtg tcgcccttcg attgacggtt acgggatcct 1200 cacacgtaca tcagctggtt gatggggaac gggtcgatga gcagcagctt gatgcggttc 1260 tcggtggcgt aatccgggcg gcccagcccg tccccatatt ggtaggtgca gtggctcacg 1320 cgggccatgt tcacggcgat ctccatgaac gccttcggca gcagggtgct gtccgacacg 1380 cgctcgcggt tcattttctt ccactcggcg tcgatcagct tgcgcagctc ttcgcgggcc 1440 tgttcctcgc tcgtgccgtc gttctcgtgc atgtagctga tgatgctgtt ggtggtttcg 1500 ccgcgttcga gttccgccgc cgaggtcgcc agatcgttgc acagccgaaa gatcacgcag 1560 gacgagcgca ccaggccgtg gaagtcggtc agggagcgga gggcgtggtc cgagatatct 1620 tcctgctgct ggcagaccga gaagtagctc ggcgccagca gcgcgacccc gctggaggac 1680 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tcaaagccat gctgccgcag caggcggaag ctcagggcgg tcgcgtgcag atcgcttttg 2580 ttcttcttat tctcgtccag caggacgatg ttctccagcg ccttgatgat atctttctca 2640 aacttgtagg tcaggcccag gcgctgcacg tcgtcgatga gctccagcag gctcaggggc 2700 tgggtgtcca cccggttgat catgcaacgc acctcctcct ccagcttggt ggccttctct 2760 tcgagcttct ccaccttcag gtcgttttcc aggctctgca ggaactcgaa gttccacagg 2820 ttgggctggt agttcgcgga ccgacggcta ttatgctcgg tgatctgggt gaactggctg 2880 ctggtggcgc acatatgtat atctccttct taaagttaaa caagcttaag atgttcagcg 2940 acaagggcga cacaaaattt attctaaatg cataataaat actgataaca tcttatagtt 3000 tgtattatat tttgtattat cgttgacatg tataattttg atatcaaaaa ctgattttcc 3060 ctttattatt ttcgagattt attttcttaa ttctctttaa caaactagaa atattgtata 3120 tacaaaaaat cataaataat agatgaatag tttaattata ggtgttcatc aatcgaaaaa 3180 gcaacgtatc ttatttaaag tgcgttgctt ttttctcatt tataaggtta aataattctc 3240 atatatcaag caaagtgaca ggcgccctta aatattctga caaatgctct ttccctaaac 3300 tccccccata aaaaaacccg ccgaagcggg tttttacgtt atttgcggat taacgattac 3360 tcgttatcag aaccgcccag ggggcccgag cttaagactg gccgtcgttt tacaacacag 3420 aaagagtttg tagaaacgca aaaaggccat ccgtcagggg ccttctgctt agtttgatgc 3480 ctggcagttc cctactctcg ccttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg 3540 ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat 3600 caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta 3660 aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa 3720 atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc 3780 cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt 3840 ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca 3900 gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg 3960 accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat 4020 cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta 4080 cagagttctt gaagtggtgg gctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct 4140 gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac 4200 aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa 4260 aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgacg 4320 cgcgcgtaac tcacgttaag ggattttggt catgagcttg cgccgtcccg tcaagtcagc 4380 gtaatgctct gcttt 4395

Claims (105)

  1. 약 400 nmol/gwcm/시간 초과의 이소프렌을 생성하는 배양물 내 세포.
  2. 약 0.1 mg/L브로쓰/시간 초과의 이소프렌의 평균 체적 생산성을 갖는 배양물 내 세포.
  3. 세포 배양 배지로부터 세포가 소비하는 약 0.002 몰% 초과의 탄소를 이소프렌으로 변환시키는 배양물 내 세포.
  4. 세포가 (i) 약 400 nmol/gwcm/시간 초과의 이소프렌을 생성하고, (ii) 세포 배양 배지로부터 세포가 소비하는 약 0.002 몰% 초과의 탄소를 이소프렌으로 변환시키거나, 또는 (iii) 약 0.1 mg/L브로쓰/시간 초과의 이소프렌의 평균 체적 생산성을 갖는, 이소프렌 신타아제 폴리펩티드를 인코딩하는 이종 핵산을 포함하는 배양물 내 세포.
  5. 이종 핵산이 프로모터에 작동가능하게 연결되며, 세포에 의한 이소프렌의 생성이 약 400 nmol/gwcm/시간 초과인, 이소프렌 신타아제 폴리펩티드를 인코딩하는 이종 핵산을 포함하는 배양물 내 세포.
  6. 이종 핵산이 프로모터에 작동가능하게 연결되며, 세포가 약 0.1 mg/L브로쓰/시간 초과의 이소프렌의 평균 체적 생산성을 갖는, 이소프렌 신타아제 폴리펩티드를 인코딩하는 이종 핵산을 포함하는 배양물 내 세포.
  7. 이종 핵산이 프로모터에 작동가능하게 연결되며, 세포 배양 배지로부터 세포가 소비하는 탄소의 약 0.002 몰% 초과가 이소프렌으로 변환되는, 이소프렌 신타아제 폴리펩티드를 인코딩하는 이종 핵산을 포함하는 배양물 내 세포.
  8. 제 1 항, 제 4 항 또는 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 약 4.0 x 103 nmol/gwcm/시간 초과의 이소프렌을 생성하는 세포.
  9. 제 8 항에 있어서, 약 4.0 x 104 nmol/gwcm/시간 초과의 이소프렌을 생성하는 세포.
  10. 제 9 항에 있어서, 약 1.5 x 105 nmol/gwcm/시간 초과의 이소프렌을 생성하는 세포.
  11. 제 1 항, 제 4 항 또는 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 약 400 nmol/gwcm/시간 내지 약 2.0 x 105 nmol/gwcm/시간의 이소프렌을 생성하는 세포.
  12. 제 2 항, 제 4 항 또는 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 약 100 mg/L브로쓰/시간 초과의 이소프렌의 평균 체적 생산성을 갖는 세포.
  13. 제 12 항에 있어서, 약 1,000 mg/L브로쓰/시간 초과의 이소프렌의 평균 체적 생산성을 갖는 세포.
  14. 제 13 항에 있어서, 약 1,500 mg/L브로쓰/시간 초과의 이소프렌의 평균 체적 생산성을 갖는 세포.
  15. 제 2 항, 제 4 항 또는 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 약 0.1 내지 약 1,500 mg/L브로쓰/시간의 이소프렌의 평균 체적 생산성을 갖는 세포.
  16. 제 3 항, 제 4 항 또는 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 약 0.05 몰% 초과의 탄소를 이소프렌으로 변환시키는 세포.
  17. 제 16 항에 있어서, 약 1 몰% 초과의 탄소를 이소프렌으로 변환시키는 세포.
  18. 제 17 항에 있어서, 약 10 몰% 초과의 탄소를 이소프렌으로 변환시키는 세포.
  19. 제 18 항에 있어서, 약 20 몰% 초과의 탄소를 이소프렌으로 변환시키는 세포.
  20. 제 3 항, 제 4 항 또는 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 약 0.002 내지 약 25 몰%의 탄소를 이소프렌으로 변환시키는 세포.
  21. 제 4 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 이소프렌 신타아제 폴리펩티드가 식물 이소프렌 신타아제 폴리펩티드인 세포.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, IDI 폴리펩티드를 인코딩하는 이종 핵산을 추가로 포함하는 세포.
  23. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, IDI 폴리펩티드를 인코딩하는 내인성 핵산의 카피의 삽입물을 추가로 포함하는 세포.
  24. 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, DXS 폴리펩티드를 인코딩하는 이종 핵산을 추가로 포함하는 세포.
  25. 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, DXS 폴리펩티드를 인코딩하는 내인성 핵산의 카피의 삽입물을 추가로 포함하는 세포.
  26. 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, IDI 폴리펩티드 및 DXS 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 추가로 포함하는 세포.
  27. 제 26 항에 있어서, 한 핵산이 이소프렌 신타아제 폴리펩티드, IDI 폴리펩티드 및 DXS 폴리펩티드를 인코딩하는 세포.
  28. 제 27 항에 있어서, 한 플라스미드가 이소프렌 신타아제 폴리펩티드, IDI 폴리펩티드 및 DXS 폴리펩티드를 인코딩하는 세포.
  29. 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, MVA 경로 폴리펩티드를 인코딩하는 이종 핵산을 추가로 포함하는 세포.
  30. 제 29 항에 있어서, MVA 경로 폴리펩티드가 메발로네이트 키나아제 (MVK)인 세포.
  31. 제 30 항에 있어서, MVK가 메타노사르키나 (Methanosarcina)로부터의 폴리펩티드인 세포.
  32. 제 31 항에 있어서, MVK가 메타노사르키나 마제이 (Methanosarcina mazei)로부터의 폴리펩티드인 세포.
  33. 제 4 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서, 이소프렌 신타아제 폴리펩티드가 푸에라리아 (Pueraria)로부터의 자연 발생적 폴리펩티드인 세포.
  34. 제 33 항에 있어서, 이소프렌 신타아제 폴리펩티드가 푸에라리아 몬타나 (Pueraria montana)로부터의 자연 발생적 폴리펩티드인 세포.
  35. 제 4 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서, 이소프렌 신타아제 폴리펩티드가 포풀루스 (Populus)로부터의 자연 발생적 폴리펩티드인 세포.
  36. 제 35 항에 있어서, 이소프렌 신타아제 폴리펩티드가 포풀루스 알바 (Populus alba)로부터의 자연 발생적 폴리펩티드인 세포.
  37. 제 35 항 또는 제 36 항에 있어서, MVA 경로 폴리펩티드를 인코딩하는 이종 핵산을 추가로 포함하는 세포.
  38. 제 37 항에 있어서, MVK가 메타노사르키나로부터의 폴리펩티드인 세포.
  39. 제 38 항에 있어서, MVK가 메타노사르키나 마제이로부터의 폴리펩티드인 세포.
  40. 제 1 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서, 세균 세포인 세포.
  41. 제 40 항에 있어서, 그람-양성 세균 세포인 세포.
  42. 제 41 항에 있어서, 바실러스 (Bacillus) 세포인 세포.
  43. 제 42 항에 있어서, 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 세포인 세포
  44. 제 40 항에 있어서, 그람-음성 세균 세포인 세포.
  45. 제 44 항에 있어서, 에스케리키아 (Escherichia) 또는 판토에아 (Pantoea) 세포인 세포.
  46. 제 45 항에 있어서, 에스케리키아 콜리 (Escherichia coli) 또는 판토에아 시트레아 (Pantoea citrea) 세포인 세포.
  47. 제 1 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서, 진균 세포인 세포.
  48. 제 47 항에 있어서, 트리코데르마 (Trichoderma) 세포인 세포.
  49. 제 48 항에 있어서, 트리코데르마 레에세이 (Trichoderma reesei) 세포인 세포.
  50. 제 47 항에 있어서, 효모 세포인 세포.
  51. 제 50 항에 있어서, 야로위야 (Yarrowia) 세포인 세포.
  52. 제 51 항에 있어서, 야로위야 리포리티카 (Yarrowia lipolytica) 세포인 세포.
  53. 약 400 nmol/gwcm/시간 초과의 이소프렌을 생성하기에 충분한 조건 하에서 세포를 배양하는 것을 포함하는 이소프렌 생성 방법.
  54. 약 0.1 mg/L브로쓰/시간 초과의 이소프렌의 평균 체적 생산성을 야기하는 조건 하에 세포를 배양하는 것을 포함하는 이소프렌 생성 방법.
  55. 세포 배양 배지로부터 세포가 소비하는 약 0.002 몰% 초과의 탄소를 이소프렌으로 변환시키기에 충분한 조건 하에 세포를 배양하는 것을 포함하는 이소프렌 생성 방법.
  56. 이종 핵산이 프로모터에 작동가능하게 연결되며 세포에 의한 이소프렌의 생성이 약 400 nmol/gwcm/시간 초과인, 이소프렌 신타아제 폴리펩티드를 인코딩하는 이종 핵산을 포함하는 세포를 배양하는 것을 포함하는 이소프렌 생성 방법.
  57. 이종 핵산이 프로모터에 작동가능하게 연결되며 세포가 약 0.1 mg/L브로쓰/시간 초과의 이소프렌의 평균 체적 생산성을 갖는, 이소프렌 신타아제 폴리펩티드를 인코딩하는 이종 핵산을 포함하는 세포를 배양하는 것을 포함하는 이소프렌 생성 방법.
  58. 이종 핵산이 프로모터에 작동가능하게 연결되며 세포 배양 배지로부터 세포가 소비하는 약 0.002 몰% 초과의 탄소가 이소프렌으로 변환되는, 이소프렌 신타아제 폴리펩티드를 인코딩하는 이종 핵산을 포함하는 세포를 배양하는 것을 포함하는 이소프렌 생성 방법.
  59. 하기를 포함하는 이소프렌 생성 방법:
    (a) 이소프렌을 생성하기에 적합한 배양 조건 하에 이소프렌 신타아제 폴리펩티드를 인코딩하는 이종 핵산을 포함하는 세포 {(i) 약 400 nmol/gwcm/시간 초과의 이소프렌을 생성하며, (ii) 세포 배양 배지로부터 세포가 소비하는 약 0.002 몰% 초과의 탄소를 이소프렌으로 변환시키거나, 또는 (iii) 약 0.1 mg/L브로쓰/시간 초과의 이소프렌의 평균 체적 생산성을 갖는 세포}를 배양하고,
    (b) 이소프렌을 생성함.
  60. 제 53 항, 제 56 항 또는 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 약 4.0 x 103 nmol/gwcm/시간 초과의 이소프렌을 생성하는 방법.
  61. 제 60 항에 있어서, 세포가 약 4.O x 104 nmol/gwcm/시간 초과의 이소프렌을 생성하는 방법.
  62. 제 61 항에 있어서, 세포가 약 1.5 x 105 nmol/gwcm/시간 초과의 이소프렌을 생성하는 방법.
  63. 제 53 항, 제 56 항 또는 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 약 400 nmol/gwcm/시간 내지 약 2.0 x 105 nmol/gwcm/시간의 이소프렌을 생성하는 방법.
  64. 제 54 항, 제 57 항 또는 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 약 100 mg/L브로쓰/시간 초과의 이소프렌의 평균 체적 생산성을 갖는 방법.
  65. 제 64 항에 있어서, 세포가 약 1,000 mg/L브로쓰/시간 초과의 이소프렌의 평균 체적 생산성을 갖는 방법.
  66. 제 65 항에 있어서, 세포가 약 1,500 mg/L브로쓰/시간 초과의 이소프렌의 평균 체적 생산성을 갖는 방법.
  67. 제 54 항, 제 57 항 또는 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서, 약 0.1 내지 약 1,500 mg/L브로쓰/시간의 이소프렌의 평균 체적 생산성을 갖는 세포.
  68. 제 55 항, 제 58 항 또는 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 약 0.05 몰% 초과의 탄소를 이소프렌으로 변환시키는 방법.
  69. 제 68 항에 있어서, 세포가 약 1 몰% 초과의 탄소를 이소프렌으로 변환시키는 방법.
  70. 제 69 항에 있어서, 세포가 약 10 몰% 초과의 탄소를 이소프렌으로 변환시키는 방법.
  71. 제 70 항에 있어서, 세포가 약 20 몰% 초과의 탄소를 이소프렌으로 변환시키는 방법.
  72. 제 55 항, 제 58 항 또는 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 약 0.002 내지 약 25 몰%의 탄소를 이소프렌으로 변환시키는 방법.
  73. 제 53 항 내지 제 72 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포에 의해 생성된 이소프렌을 회수하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  74. 제 56 항 내지 제 73 항 중 어느 한 항에 있어서, 이소프렌 신타아제 폴리펩티드가 식물 이소프렌 신타아제 폴리펩티드인 방법.
  75. 제 53 항 내지 제 74 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 IDI 폴리펩티드를 인코딩하는 이종 핵산을 추가로 포함하는 방법.
  76. 제 53 항 내지 제 75 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 IDI 폴리펩티드를 인코딩하는 내인성 핵산의 카피의 삽입물을 추가로 포함하는 방법.
  77. 제 53 항 내지 제 76 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 DXS 폴리펩티드를 인코딩하는 이종 핵산을 추가로 포함하는 방법.
  78. 제 53 항 내지 제 77 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 DXS 폴리펩티드를 인코딩하는 내인성 핵산의 카피의 삽입물을 추가로 포함하는 방법.
  79. 제 53 항 내지 제 78 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 IDI 폴리펩티드 및 DXS 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 추가로 포함하는 방법.
  80. 제 79 항에 있어서, 한 핵산이 이소프렌 신타아제 폴리펩티드, IDI 폴리펩티드 및 DXS 폴리펩티드를 인코딩하는 방법.
  81. 제 80 항에 있어서, 한 플라스미드가 이소프렌 신타아제 폴리펩티드, IDI 폴리펩티드 및 DXS 폴리펩티드를 인코딩하는 방법.
  82. 제 53 항 내지 제 81 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 MVA 경로 폴리펩티드를 인코딩하는 이종 핵산을 추가로 포함하는 방법.
  83. 제 82 항에 있어서, MVA 경로 폴리펩티드가 메발로네이트 키나아제 (MVK)인 세포.
  84. 제 83 항에 있어서, MVK가 메타노사르키나로부터의 폴리펩티드인 세포.
  85. 제 84 항에 있어서, MVK가 메타노사르키나 마제이로부터의 폴리펩티드인 세포.
  86. 제 56 항 내지 제 85 항 중 어느 한 항에 있어서, 이소프렌 신타아제 폴리펩티드가 푸에라리아로부터의 자연 발생적 폴리펩티드인 방법.
  87. 제 86 항에 있어서, 이소프렌 신타아제 폴리펩티드가 푸에라리아 몬타나로부터의 자연 발생적 폴리펩티드인 방법.
  88. 제 56 항 내지 제 85 항 중 어느 한 항에 있어서, 이소프렌 신타아제 폴리펩티드가 포풀루스로부터의 자연 발생적 폴리펩티드인 방법.
  89. 제 88 항에 있어서, 이소프렌 신타아제 폴리펩티드가 포풀루스 알바로부터의 자연 발생적 폴리펩티드인 방법.
  90. 제 88 항 또는 제 89 항에 있어서, MVA 경로 폴리펩티드를 인코딩하는 이종 핵산을 추가로 포함하는 방법.
  91. 제 90 항에 있어서, MVK가 메타노사르키나로부터의 폴리펩티드인 세포.
  92. 제 91 항에 있어서, MVK가 메타노사르키나 마제이로부터의 폴리펩티드인 세포.
  93. 제 53 항 내지 제 92 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 세균 세포인 방법.
  94. 제 93 항에 있어서, 세포가 그람-양성 세균 세포인 방법.
  95. 제 94 항에 있어서, 세포가 바실러스 세포인 방법.
  96. 제 95 항에 있어서, 세포가 바실러스 서브틸리스 세포인 방법.
  97. 제 93 항에 있어서, 세포가 그람-음성 세균 세포인 방법.
  98. 제 97 항에 있어서, 세포가 에스케리키아 또는 판토에아 세포인 방법.
  99. 제 98 항에 있어서, 세포가 에스케리키아 콜리 또는 판토에아 시트레아 세포인 방법.
  100. 제 53 항 내지 제 92 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 진균 세포인 방법.
  101. 제 100 항에 있어서, 세포가 트리코데르마 세포인 방법.
  102. 제 100 항에 있어서, 세포가 트리코데르마 레에세이 세포인 방법.
  103. 제 100 항에 있어서, 세포가 효모 세포인 방법.
  104. 제 103 항에 있어서, 세포가 야로위야 세포인 방법.
  105. 제 104 항에 있어서, 세포가 야로위야 리포리티카 세포인 방법.
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