CN103233044B - 一种异戊二烯的生产方法及其生产菌株 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种异戊二烯的生产方法，并提供了一种用于生产异戊二烯的毕赤酵母工程菌株，保藏编号为CCTCC NO:M2013167。本发明通过将来自葛藤（Pueraria montana var.lobata）的异戊二烯合成酶基因转化入毕赤酵母中，构建得到能重组表达异戊二烯合成酶，进而高效发酵生产异戊二烯的毕赤酵母工程菌株，可广泛应用于异戊二烯的生产。

Description

一种异戊二烯的生产方法及其生产菌株

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种异戊二烯的生产方法及其生产菌株。

背景技术

异戊二烯（2-甲基-1,3-丁二烯）是一种高挥发性的共轭二烯烃，是合成橡胶的主要单体，其用量占异戊二烯总产量的95%，主要用于合成异戊橡胶，其产量仅次于丁苯橡胶和顺丁橡胶而居合成橡胶第三位，还可用于合成树脂、液体聚异戊二烯橡胶等。近年来，人们用异戊二烯合成里那醇、角鲨烯等，从而进一步合成香料、药品、农药等。异戊二烯还是天然产物萜类化合物的前体物质。

目前工业上有多种生产异戊二烯的方法，除C₅馏分分离得异戊二烯外，工业上还可采用合成法生产。由于各国原料价格和供应情况不同，不同国家采取的合成方法也有所不同，但更多的异戊二烯还是直接来自碳五馏分分离。由于现在采用的异戊二烯的生产方法主要是依赖于不可再生的化石燃料---石油，尽管合成和分离技术不断成熟，但是原材料终将会成为制约异戊二烯产业发展的关键因素，此外生产中还存在着高能耗、高污染的问题。

在自然界中，异戊二烯是可以由大多数植物叶片排放至大气中的一种易挥发的C₅萜类化合物。目前研究认为植物中的异戊二烯是在5-磷酸脱氧木糖（DXP）途径及甲羟戊酸（MVA）途径中，由异戊二烯合成酶特异性催化二甲基丙烯焦磷酸（DMAPP）合成，反应过程中焦磷酸被释放。异戊二烯在大气中年均排放量与大气中排放量最丰富的碳氢化合物甲烷相当，然而却鲜有报道收集大气中的异戊二烯作为一种可持续的新能源或化工产业中的原料，主要原因是植物占地面积较大，挥发性气体难以收集，能量转化效率低等。因此，有必要提供一种更经济环保的异戊二烯的生产方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种异戊二烯的生产方法，并提供一种用于生产异戊二烯的重组工程菌株；本发明通过将的异戊二烯合成酶基因转化入毕赤酵母中，构建得到能重组表达异源异戊二烯合成酶，进而高效发酵生产异戊二烯的毕赤酵母工程菌株。

申请人在长期的研究中发现，通过在毕赤酵母中导入异源异戊二烯合成酶，就能使本不能合成异戊二烯的毕赤酵母催化合成异戊二烯，从而促成了本发明。

本发明的异戊二烯的生产方法，是在毕赤酵母中表达异源的异戊二烯合成酶来代谢生成异戊二烯。

所述的在毕赤酵母中表达异源异戊二烯合成酶，是将携带有异戊二烯合成酶基因的重组表达载体转入毕赤酵母中。

所述的异戊二烯合成酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1；

所述的异戊二烯合成酶基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2；

所述的载体为真核表达载体；

本发明另一方面提供了一种巴斯德毕赤酵母GSISPS(Pichia pastoris GSISPS)，其携带有能表达葛藤的异戊二烯合成酶基因的表达载体，并于2013年5月3日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2013167。

本发明提供的异戊二烯生产方法简单、可靠、环保，构建得到的巴斯德毕赤酵母工程菌能高产异戊二烯，可广泛应用于异戊二烯的发酵生产，提高异戊二烯的产量。

附图说明

图1：本发明所用到的载体pPIC3.5-Isps的遗传图谱；

图2：本发明代谢合成的异戊二烯检测的气相色谱图，其中A为异戊二烯标准品；B为野生型毕赤酵母的顶空气体；C为毕赤酵母工程菌CCTCC NO：M2013167的顶空气体。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细描述，本领域技术人员应该理解的是，在不违背本发明的技术思路的前提下，所用到的具体试剂或材料可根据其起到的作用从已有的产品中进行选择，而不仅限于本发明所用的具体产品。

本发明所用到的具体的实验材料和试剂如下：

1、菌株与载体

大肠杆菌菌株DH5a，毕赤酵母，载体pPIC3.5，均购自Invitrogen公司。

2、酶与试剂盒

PCR酶，质粒提取，胶纯化，限制性内切酶、试剂盒等购自上海生工公司。

3、培养基

大肠杆菌培养基为LB(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，pH7.0)。LB-Amp为LB培养基加100ug/mL氨苄青霉素；

酵母培养基为YPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)；

酵母培养基BMGY(1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、0.00004％Biotin、1％甘油(V/V))；

诱导培养基BMMY(1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、0.00004％Biotin、0.5％甲醇(V/V))。

实施例1异戊二烯合成酶（Isps）的克隆和pPIC3.5-Isps表达载体的构建

将来自葛藤（Pueraria montana var.lobata）的异戊二烯合成酶的氨基酸序列和NCBI比对发现异戊二烯合成酶基因存在七个内含子，去掉内含子后的异戊二烯合成酶氨基酸序列为SEQ ID NO：1。依据毕赤酵母密码子偏好性，对异戊二烯合成酶（Isps）核苷酸序列进行优化，优化后的核苷酸序列为SEQ ID NO：2，人工合成该序列。

设计引物，通过PCR在Isps两端加入限制性酶切位点EcoRI和NotI（下划线）。

Isps引物设计如下：

Isps-F：5’-CCGGAATTCATGTGTGCTACTTCCTCC-3’

Isps-R：5’-ATTTGCGGCCGCTTAAACGTACATCAACTG-3’

PCR反应体系反应条件：94℃4min，94℃30s，56℃30s，72℃延伸2min，30个循环，72℃延伸7min。用胶回收试剂盒回收PCR产物，用限制酶EcoR1和Not1消化Isps及载体pPIC3.5，在T4连接酶的作用下，22℃连接。转化大肠杆菌DH5a，用LB-Amp平板筛选得到阳性克隆，测序确定其基因序列的正确性，得到pPIC3.5-Isps表达载体，质粒图谱如图1所示。

实施例2pPIC3.5-Isps转化毕赤酵母和发酵培养

利用限制性内切酶SacI或SalI消化pPIC3.5-Isps，使其线性化，更有利于目的基因同源重组进入毕赤酵母的染色体中。酵母细胞经1M的山梨醇处理后，与纯化后的含有Isps基因的线性质粒混匀，用电转化仪转化。复苏后的酵母细胞涂布在MD平板上，30℃培养3-4d。分别挑取MD平板上长出的单菌落，接种至25mL BMGY中(250ml摇瓶)，30℃，250-300rpm摇至OD600=2-6(对数生长，大约16-18h)。室温，1500-3000g离心5min，收集细胞，去除上清，用BMMY重悬细胞至OD600=1.0(大约100-200ml)，加入0.5%的甲醇，进行诱导表达。在1L摇瓶中加入上述培养物，加盖两层灭菌纱布或干酪包布，放入摇床继续生长。每24小时，加甲醇至终浓度为0.5%以继续诱导。检查培养基的量，确保正确加入甲醇，因为蒸发作用会减少培养基的体积。

实施例3异戊二烯产物的检测

重组毕赤酵母细胞在摇瓶中诱导表达72-96h后，用密封塞封口，继续培养30min后，将摇瓶在60℃下处理30min，抽取1mL顶空气体进行气相色谱检测，以异戊二烯标准品作为标准。系统采用GC2000型气相色谱仪，色谱柱为CP-Wax58（FFAP）CB（25m×0.25mm×0.39mm），检测器为火焰离子化检测器，气化室温度50℃，柱室温度50℃，检测器温度100℃。检测结果如图2所示，发酵液顶空气体中检测到了异戊二烯产物，而作为对照组的野生型毕赤酵母的顶空气体中未检测到异戊二烯产物，说明表达异戊二烯合成酶（Isps）的重组毕赤酵母菌株能合成异戊二烯。多个重组菌的表达产物分析结果也证明了本发明方法的可靠性。

从重组菌中筛选异戊二烯产量最高的重组毕赤酵母命名为巴斯德毕赤酵母GSISPS(Pichia pastoris GSISPS)，并于2013年5月3日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2013167。

Claims (3)

1.一种异戊二烯的生产方法，其特征在于，所述的生产方法是在毕赤酵母中表达异源的异戊二烯合成酶来代谢生成异戊二烯，所述的在毕赤酵母中表达异源异戊二烯合成酶，是将携带有异戊二烯合成酶基因的重组表达载体转入毕赤酵母中；其中异戊二烯合成酶的氨基酸序列为SEQ ID NO: 1，重组表达载体为真核表达载体。

2.如权利要求1 所述的生产方法，其特征在于所述的异戊二烯合成酶，其基因的核苷酸序列为SEQ ID NO: 2。

3.一种生产异戊二烯的毕赤酵母工程菌株，其保藏编号为CCTCC NO：M2013167。