CN104017786B - 一种磷脂酶a2突变体及其制备方法 - Google Patents
一种磷脂酶a2突变体及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种磷脂酶A2突变体及其制备的方法，其技术方案是利用重组DNA技术定点突变来源于天蓝色链霉菌的野生型磷脂酶A2的Glu37、Asp78的氨基酸残基，得到活力较高的磷脂酶A2基因，然后将高活力磷脂酶A2基因在枯草芽孢杆菌表达系统、毕赤酵母表达系统(包括毕赤酵母游离表达系统和毕赤酵母细胞表面展示系统)中表达，得到产高活力磷脂酶A2的重组菌株，表达后，检测高活力磷脂酶A2的比酶活较野生型磷脂酶A2提高13.7％，其中枯草芽孢杆菌高活力磷脂酶A2重组菌发酵后磷脂酶A2的酶活可达到53.5U/ml，毕赤酵母游离表达高活力磷脂酶A2重组菌的酶活可达106.4U/ml，毕赤酵母细胞表面展示高活力磷脂酶A2全细胞催化剂的酶活可达260U/(g·干细胞)。
Description
技术领域
本发明涉及一种磷脂酶及其制备方法。本发明涉及通过重叠PCR技术体外定向进化构建的比酶活提高的磷脂酶A2突变体，具体的说涉及到利用分子生物学技术获得比酶活提高的磷脂酶A2突变体，属于酶的基因工程技术领域。
背景技术
磷脂酶A2(PhospholipaseA2，PLA2)，是磷脂-2-酰基水解酶(EC3.1.1.4)，它催化甘油磷脂sn-2位酯键的水解反应，生成溶血磷脂和脂肪酸，在磷脂分解代谢中有重要作用，此外某些来源的磷脂酶A2具有催化磷脂sn-2位磷酸二脂酯键碱基交换的功能。
磷脂酶A2广泛存在于自然界，几乎所有的生物细胞及亚细胞中都有这种酶。存在于细胞内的磷脂酶A2，浓度、酶活较低，但参与许多重要的生理代谢过程；存在于细胞外的磷脂酶A2，含量高、活力强、易于富集纯化，是工业商品磷脂酶A2的主要来源。
磷脂酶A2在多个领域具有应用价值，1、用于溶血磷脂的制备：溶血磷脂在食品加工中可作为乳化分散剂、乳化剂使用，溶血磷脂添加在护肤化妆品中，能起到舒展皮肤皱纹，改善粗糙结构的作用。2、用于油脂精炼：磷脂酶A2可以将油脂中的磷脂转化成易于溶解在水中的溶血磷脂，然后经过离心即可除去油脂中的磷脂，以达到脱胶的目的。3、用于功能性磷脂的制备：由于某些磷脂酶A2具有催化磷脂sn-2位磷酸二脂酯键碱基交换的功能，可以将不饱和脂肪酸(如二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸)整合在磷脂骨架中，从而提高磷脂的生理功能。
虽然磷脂酶A2具有很多应用价值，但距工业生产的需要，特别是与其他酶生产和应用相比，存在很大的差距，主要原因是：1、酶源狭窄，目前磷脂酶A2主要从动物胰脏、蛇毒、蜂毒中提取，也有从动物内脏或微生物中提取磷脂酶A2，但是工艺复杂，不利于磷脂酶A2的大量生产和利用；2、该酶的作用机理尚未完全搞清，目前对其催化磷脂sn-2位磷酸二脂酯键水解的研究较多，而对催化磷脂sn-2位磷酸二脂酯键碱基交换的研究甚少。
酶分子体外定向进化属于蛋白质的非理性设计，是蛋白质工程的新策略。利用分子生物学手段在分子水平创造出分子的多样性，结合灵敏的筛选技术，迅速得到理想的突变体。它不需事先了解蛋白质的空间结构、活性位点、催化机制等因素，而是人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外改造酶基因，获得具有某些预期特征的改构酶。定点突变就是在已知的DNA序列中插入、缺失或取代一定长度的核苷酸序列。该方法已经被广泛的应用于基因表达的调控、基因结构与功能及蛋白质性质等方面的研究。本发明所使用的定点突变的方法是重叠PCR技术，该技术可以简单、快速的将两个或多个基因片段通过末端互补、重叠延伸进行体外基因的拼接。重叠PCR技术可以获得依靠限制性内切酶消化难以得到的产物，并且方便快速，在进行大片段基因的定点突变、基因片段删除以及多个编码序列嵌合连接上具有独有的优势。
枯草芽孢杆属于革兰氏阳性菌。枯草芽孢杆菌表达系统有以下优点：1、能够高效地分泌各种蛋白质；2、许多枯草芽孢杆菌在发酵工业上的使用已有相当长的历史，无致病性，不产生任何内毒素；3、芽孢杆菌属微生物遗传学背景研究的十分清楚，并具有生长迅速，对营养无特殊要求的优点；4密码子偏爱性不明显；5发酵简单，枯草芽孢杆菌是好氧菌，无需厌氧发酵设备，对培养基无特殊要求，发酵结束后，简单地分离发酵液和细菌菌体，即可进入目的蛋白的纯化回收阶段；6具有抗逆性，可生产多种耐热性酶制剂。
毕赤酵母是一种单细胞低等真核生物，培养条件普通，生长繁殖速度迅速。毕赤酵母表达系统用于表达基因工程产品时，可以大规模生产，有效降低了生产成本。毕赤酵母表达系统具有一定的翻译后加工能力，收获的外源蛋白质具有一定程度上的折叠加工和糖基化修饰，性质较原核表达系统表达的蛋白质更加稳定，毕赤酵母表达系统具有两种表达形式，包括毕赤酵母游离表达系统和毕赤酵母细胞表面展示系统。毕赤酵母游离表达系统表达的外源基因具有一定的翻译后加工能力，收获的外源蛋白质具有一定程度上的折叠加工和糖基化修饰，性质较原核表达系统表达的蛋白质更加稳定，某些酵母表达系统具有外分泌信号序列，能够将所表达的外源蛋白质分泌到细胞外，易于纯化，而毕赤酵母细胞表面展示系统除具有外源基因的翻译后加工能力和蛋白的折叠加工及适度糖基化的优点外，经该系统得到的全细胞催化剂还可以重复利用从而降低生产成本。毕赤酵母表达系统已成为现代分子生物学研究最重要的工具和模型，是表达外源基因比较理想的工具。
在本发明中，高活力磷脂酶A2基因在枯草芽孢杆菌表达系统和毕赤酵母表达系统中进行了表达，分别得到枯草芽孢杆菌高活力磷脂酶A2重组菌株和毕赤酵母磷高活力脂酶A2重组菌株(包括毕赤酵母高活力磷脂酶A2游离表达重组菌株和毕赤酵母细胞表面展示高活力磷脂酶A2重组菌株)。重组菌株发酵后，经过相应的处理可得高活力磷脂酶A2催化剂。
发明内容
本发明目的在于提供一种通过定向进化构建的酶活力提高的磷脂酶A2突变体及其制备的方法。
本发明实现目的技术路线如下：以天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)ATCC23899基因组为模板克隆出野生型磷脂酶A2基因plA2(如SEQIDNO：9所示)，将其与T载体连接后通过重叠PCR进行定点突变，获得高活力磷脂酶A2基因(如SEQIDNO：10所示)，构建重组载体并在枯草芽孢杆菌WB600及毕赤酵母GS115中成功表达，得到产高活力磷脂酶A2的重组菌株，进一步通过发酵提取工艺获得高活力的磷脂酶A2。
在本发明中采用如下定义：
1、氨基酸和DNA核酸序列的命名法
使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。
2、磷脂酶A2突变体的标识
采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示磷脂酶A2突变体中突变的氨基酸。如Glu37Ala，表示位置37的氨基酸由亲本磷脂酶A2的Glu替换成Ala，位置的编号对应于SEQIDNO：7中磷脂酶A2的氨基酸序列编号。
在本发明中，plA2表示磷脂酶A2的原始氨基酸序列(如SEQIDNO：7所示)，plA2m表示磷脂酶A2的突变氨基酸序列(如SEQIDNO：8所示)。
用于表达所述的磷脂酶A2突变体的宿主细胞为枯草芽孢杆菌WB600，表达载体为pBSA43；
用于表达所述的磷脂酶A2突变体的宿主细胞为毕赤酵母GS115，表达载体为pPIC9K；
用于表达所述的磷脂酶A2突变体的宿主细胞为毕赤酵母GS115，展示载体为pPIC9K-Flo；
本发明的实验步骤概述如下：
一种枯草芽孢杆菌高活力磷脂酶A2重组菌株的构建及高活力磷脂酶A2的制备过程包括以下步骤：
1、将野生型磷脂酶A2基因与载体pUC-T连接，构建重组质粒pUC-T-plA2，通过重叠PCR定点突变野生型磷脂酶A2基因，得到高活力磷脂酶A2突变体编码基因；
2、将高活力磷脂酶A2突变体编码基因与大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pBSA43连接，构建获得携带有高活力磷脂酶A2突变体编码基因的重组载体；
3、将重组载体转化入枯草芽孢杆菌WB600中，构建获得重组菌株；
4、将重组细胞进行发酵制备高活力磷脂酶A2；
5、制备高活力磷脂酶A2。
一种毕赤酵母高活力磷脂酶A2游离表达重组菌株的构建及高活力磷脂酶A2的制备过程包括以下步骤：
1、将野生型磷脂酶A2基因与载体pUC-T连接，构建重组质粒pUC-T-plA2，通过重叠PCR定点突变野生型磷脂酶A2基因，得到高活力磷脂酶A2突变体编码基因；
2、将高活力磷脂酶A2突变体编码基因与表达载体pPIC9K相连，得到携带高活力磷脂酶A2突变体编码基因的重组表达载体；
3、将重组载体转化入毕赤酵母GS115中，得到重组细胞；
4、将得到的重组细胞经遗传霉素筛选，结合磷脂酶A2的酶活测定，得到高活力磷脂酶A2的高产菌株；
5、将高产菌株进行发酵制备高活力磷脂酶A2；
6、制备高活力磷脂酶A2。
一种毕赤酵母细胞表面展示高活力磷脂酶A2重组菌株的构建及高活力磷脂酶A2全细胞催化剂的制备过程包括以下步骤：
1、将野生型磷脂酶A2编码基因与载体pUC-T连接，构建重组质粒pUC-T-plA2，通过重叠PCR定点突变野生型磷脂酶A2基因，得到高活力磷脂酶A2突变体编码基因；
2、将高活力磷脂酶A2突变体编码基因序列与毕赤酵母展示载体pPIC9K-Flo相连，得到携带高活力磷脂酶A2突变体编码基因的重组载体pPIC9K-Flo-plA2m；
3、将重组载体转化入宿主菌株毕赤酵母GS115中，得到毕赤酵母细胞表面展示磷脂酶A2重组菌株。
4、将重组菌株发酵后制备酵母细胞表面展示高活力磷脂酶A2全细胞催化剂。
本发明的有益效果为：
1、本发明使用重叠PCR技术，对野生型磷脂酶A2进行定点突变(Glu37Ala、Asp78His)，得到高活力磷脂酶A2。在37℃条件下，高活力磷脂酶A2的比酶活比野生型磷脂酶A2的比酶活提高了13.7％，
2、本发明中枯草芽孢杆菌高活力磷脂酶A2重组菌发酵后磷脂酶A2的酶活可达到53.5U/ml，毕赤酵母游离表达高活力磷脂酶A2重组菌的酶活可达106.4U/ml，毕赤酵母细胞表面展示高活力磷脂酶A2全细胞催化剂的酶活可达260U/(g·干细胞)。
3、本发明采用酵母展示系统，将磷脂酶A2展示于酵母表面，酵母细胞既作为酶的生产者，又可以充当固定化酶中的载体，免去了酶的纯化和固定等操作，简化了生产环节，降低了生产成本。
附图说明
图1为本发明磷脂酶A2成熟肽基因的PCR扩增电泳图
其中：M为DNAMarker，1、2为磷脂酶A2成熟肽基因；
图2为本发明定点突变流程；
图3为本发明重组质粒pBSA43-plA2m酶切验证图，其中：M为DNAMarker，1-3为pBSA43-plA2m经BamHI和HindIII双酶切；
图4为本发明重组质粒pPIC9K-plA2m酶切验证图，其中：M为DNAMarker，1为pPIC9K-plA2m经EcoRI和NotI双酶切；
图5为本发明重组质粒pPIC9K-Flo-plA2m酶切验证图，其中：M为DNAMarker，1为pPIC9K-Flo-plA2m经SnaBI和EcoRI双酶切；
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步说明，但本发明不只限于这些实施例，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
实施例1：野生型磷脂酶A2成熟肽基因的获得
1、野生型磷脂酶A2成熟肽基因来自天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)ATCC23899，提取其基因组DNA。
其中天蓝色链霉菌基因组DNA的提取步骤如下：
(1)从培养菌体的平板上挑取一环菌接种于40mL适当培养基中，26℃，150r/min培养2-3d。
(2)取1mL培养液于1.5mLEP管中，12000r/min离心10min，倒尽上清，用200μL溶液I重悬。
(3)加50μL的50mg/mL溶菌酶在4℃下消化1h。
(4)加入1/2体积的2％SDS溶液反应10min，至菌悬液呈现粘稠状。
(5)加入等体积的饱和苯酚：氯仿＝1：1，混合均匀，离心10min，将上清转移到另一干净EP管中，弃去下层有机相及蛋白沉淀。
(6)反复抽提两次，再用等体积氯仿抽提一次，去除痕量苯酚。
(7)加入2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，12000r/min离心10min，弃去上清，用70％乙醇(500或600μL)洗涤2次。
(8)将EP管倒置于滤纸上，晾干后用TE缓冲液溶解，-20℃保存备用。
2、根据磷脂酶A2成熟肽基因，分析其保守序列，设计本发明的磷脂酶A2成熟肽基因的扩增引物如下：
上游P1(SEQIDNO.1)：5’-GCCCCCGCGGACAAGCCCCAGGT-3’
下游P2(SEQIDNO.2)：5’-TCAGCCGAAGATCTTGACGGC-3’
扩增模板为天蓝色链霉菌基因组DNA，其扩增的反应条件为：
| 2×buffer | 25μL |
| dNTPs(2.5mmol/L each) | 2μL |
| 上游引物P1(20μmol/L) | 5μL |
| 下游引物P2(20μmol/L) | 5μL |
| DNA模版 | 2μL |
| LA TaqDNA聚合酶 | 0.5μL |
| ddH2O | 10.5μL |
| 总体积 | 50μL |
扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火40s，72℃延伸30s反应30个循环；72℃延伸10min。PCR扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳，得到369bp的条带(图1)，用小量DNA回收试剂盒回收PCR产物，得到本发明的野生型磷脂酶A2成熟肽基因plA2，见序列9。
实施例2：高活力磷脂酶A2基因获得。
1、野生型磷脂酶A2基因连接入T载体。
将纯化后的目的基因与pUC-T载体连接，将重组质粒化转入大肠杆菌DH5α中，经EcoRI、MluI双酶切验证，野生型磷脂酶A2基因已成功克隆到T载体上。
2、定点突变
基于重叠PCR技术(见图2)进行定点突变，构建高活力磷脂酶A2，设计引物如下：
上游P1(SEQIDNO.1)：5’-GCCCCCGCGGACAAGCCCCAGGT-3’
下游P2(SEQIDNO.2)：5’-TCAGCCGAAGATCTTGACGGC-3’
重叠引物P3(SEQIDNO.3)：5’-GGCCGCCTACGCGTTCGACTGGT-3’
重叠引物P4(SEQIDNO.4)：5’-ACCAGTCGAACGCGTAGGCGGCC-3’
重叠引物P5(SEQIDNO.5)：5’-GGGCAGCTTCCACGCCAACAAGA-3’
重叠引物P6(SEQIDNO.6)：5’-TCTTGTTGGCGTGGAAGCTGCCC-3’
重叠引物P3与P4包含了对37位氨基酸残基的突变。而重叠引物P5与P6则包含了对78位氨基酸残基的突变。
将野生型磷脂酶A2基因与pUC-T载体连接后形成的重组质粒pUC-T-plA2为模板进行PCR扩增，按照如下顺序，将各组分在PCR管内混合；
PCR1，反应体系如下：
| 2×buffer | 25μL |
| dNTPs(2.5mmol/L each) | 2μL |
| 上游引物P1(20μmol/L) | 5μL |
| 重叠引物P4(20μmol/L) | 5μL |
| DNA模板 | 2μL |
| LA TaqDNA聚合酶 | 0.5μL |
| ddH2O | 10.5μL |
| 总体积 | 50μL |
PCR2，反应体系如下：
| 2×buffer | 25μL |
| dNTPs(2.5mmol/L each) | 2μL |
| 重叠引物P3(20μmol/L) | 5μL |
| 下游引物P2(20μmol/L) | 5μL |
| DNA模板 | 2μL |
| LA TaqDNA聚合酶 | 0.5μL |
| ddH2O | 10.5μL |
| 总体积 | 50μL |
PCR扩增程序：95℃5min；95℃30s，60℃40s，72℃30s，30个循环；72℃10min。然后进行第二步的PCR，按照如下顺序，将各组分在PCR管内混合；
PCR3，反应体系如下：
| 2×buffer | 25μL |
| dNTPs(2.5mmol/L each) | 2μL |
| PCR1产物 | 1μL |
| PCR2产物 | 1μL |
| LA TaqDNA聚合酶 | 0.5μL |
| ddH2O | 20.5μL |
| 总体积 | 50μL |
PCR扩增程序：95℃5min；95℃30s，60℃40s，72℃30s，10个循环；72℃10min。
PCR4，反应体系如下：
| 2×buffer | 25μL |
| dNTPs(2.5mmol/L each) | 2μL |
| 上游引物P1(20μmol/L) | 5μL |
| 下游引物P2(20μmol/L) | 5μL |
| PCR3产物 | 2μL |
| LA TaqDNA聚合酶 | 0.5μL6 --> |
| ddH2O | 10.5μL |
| 总体积 | 50μL |
PCR扩增程序：95℃5min；95℃30s，60℃40s，72℃30s，30个循环；72℃10min。
测序(北京华大生物工程公司)结果表明，此时扩增得到Glu37Ala的磷脂酶A2基因片段，以此基因为DNA模版进行下一轮PCR。
PCR5，反应体系如下：
| 2×buffer | 25μL |
| dNTPs(2.5mmol/L each) | 2μL |
| 上游引物P1(20μmol/L) | 5μL |
| 重叠引物P6(20μmol/L) | 5μL |
| DNA模板 | 2μL |
| LA TaqDNA聚合酶 | 0.5μL |
| ddH2O | 10.5μL |
| 总体积 | 50μL |
PCR6，反应体系如下：
| 2×buffer | 25μL |
| dNTPs(2.5mmol/L each) | 2μL |
| 重叠引物P5(20μmol/L) | 5μL |
| 下游引物P2(20μmol/L) | 5μL |
| DNA模板 | 2μL |
| LA TaqDNA聚合酶 | 0.5μL |
| ddH2O | 10.5μL |
| 总体积 | 50μL |
PCR扩增程序：95℃5min；95℃30s，60℃40s，72℃30s，30个循环；72℃10min。然后进行第二步的PCR，按照如下顺序，将各组分在PCR管内混合；
PCR7，反应体系如下：
| 2×buffer | 25μL |
| dNTPs(2.5mmol/L each) | 2μL |
| PCR5产物 | 1μL |
| PCR6产物 | 1μL |
| LA TaqDNA聚合酶 | 0.5μL |
| ddH2O | 20.5μL |
| 总体积 | 50μL |
PCR扩增程序：95℃5min；95℃30s，60℃40s，72℃30s，10个循环；72℃10min。
PCR8，反应体系如下：
| 2×buffer | 25μL |
| dNTPs(2.5mmol/L each) | 2μL |
| 上游引物P1(20μmol/L) | 5μL |
| 下游引物P2(20μmol/L) | 5μL |
| PCR7产物 | 2μL |
| LA TaqDNA聚合酶 | 0.5μL |
| ddH2O | 10.5μL |
| 总体积 | 50μL |
PCR扩增程序：95℃5min；95℃30s，60℃40s，72℃30s，30个循环；72℃10min。
测序(北京华大生物工程公司)结果表明，此时扩增得到Glu37Ala、Asp78His的高活力磷脂酶A2基因plA2m，见序列10。
实施例3：枯草芽孢杆菌高活力磷脂酶A2重组菌的构建
1、表达载体pBSA43的构建
pBSA43为以大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭克隆载体pBE2为骨架，克隆入一个强的芽孢杆菌组成型启动子P43，以及能够使重组蛋白直接分泌到培养基中的果聚糖蔗糖酶信号序列sacB而获得。它带有Ampr基因，可以在大肠杆菌中利用氨苄青霉素抗性作为筛选标记。同时又带有Kmr，可以在枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌中利用卡那霉素抗性作为筛选标记。
2、高活力磷脂酶A2表达载体pBSA43-plA2m的构建
将经重叠PCR构建获得的高活力磷脂酶A2基因经BamHI和HindIII双酶切后与同样双酶切的枯草芽孢杆菌表达载体pBSA43连接，构建重组质粒pBSA43-plA2m。将pBSA43-plA2m转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性转化子，提取质粒进行酶切验证并测序，确定构建获得重组菌株pBSA43-plA2m。
3、表达载体pBSA43-plA2m转化枯草芽孢杆菌WB600
在60μL感受态细胞中加入1μL(50ng/μL)pBSA43-plA2m混匀并转移到冰冷的电转化杯(1mm)中，冰浴1-1.5min后，电击一次(25μF，200Ω，4.5-5.0ms)。电击完毕之后，立即加入1mL复苏培养基(LB+0.5mol/L山梨醇+0.38mol/L甘露醇)。37℃摇床震荡培养3h之后，将复苏物涂布在LB平板上，37℃培养24-36h，挑取阳性转化子，获得枯草芽孢杆菌重组菌株WB600/pBSA43-plA2m。
实施例4：毕赤酵母高活力磷脂酶A2游离表达重组菌的构建
1、高活力磷脂酶A2表达载体pPIC9K-plA2m的构建
将重叠PCR纯化产物EcoRI和NotI双酶切后与同样双酶切的毕赤酵母表达载体pPIC9K用连接酶进行连接，转化大肠杆菌DH5α，经Amp抗性筛选，菌落37℃摇培过夜后抽提质粒，重组质粒进行酶切验证。将验证正确的重组表达质粒分别命名为pPIC9K-plA2m。将经过酶切后得到的阳性克隆送至北京华大基因科技股份有限公司测序，以保证目的片段序列的正确性。
2、高活力磷脂酶A2重组菌株的构建及高活力磷脂酶A2高表达菌株的筛选
(1)线性化质粒DNA的制备
在转化毕赤酵母之前，要先将构建好的重组表达质粒pPIC9K-plA2m线性化，以提高质粒在毕赤酵母染色体上的整合效率。每次转化需要线性化质粒DNA5-20μg，用于转化的质粒DNA的纯度应至少满足限制性酶切的需要，质粒越纯，转化效率越高。分别用SacI和SalI限制性内切酶进行线性化酶切。
(2)线性化质粒pPIC9K-plA2m电转化毕赤酵母、阳性转化子的鉴定及磷脂酶A2高产菌株的筛选
①将80μL感受态细胞和5-20μg经线性化的DNA加入到1.5mL预冷的离心管中，混匀，将反应液转移到预先冰浴的转化杯中；
②冰浴装有转化液的转化杯5min，根据电转装置推荐的参数，进行毕赤酵母电转化：
③脉冲后，立即向转化杯中加入1mL预冷的1mol/L的山梨醇溶液，把转化液转移到一个新的1.5mL离心管中；
④30℃静置培养l～2h，吸取毕赤酵母GS115电转液200μL涂布在MD培养基上；
⑤30℃培养直至转化子出现；
⑥挑取转化子单菌落溶解在10μL去离子水中，取2μL菌液，加入Lyticase破壁酶，30℃反应l0min，反应液立即放入-80℃冰箱中冷冻l0min，使酵母细胞壁裂解，释放的基因组作为模板进行PCR。以转入空质粒pPIC9K的毕赤酵母GS115/pPIC9K作为对照，确定阳性转化子。
⑦在确定阳性转化子的基础上，先用含不同浓度遗传霉素的抗性平板筛选高遗传霉素抗性的转化子，然后分别测定这些高遗传霉素抗性的转化子的磷脂酶A2的酶活，以得到磷脂酶A2的高产菌株GS115/pPIC9K-plA2m。
实施例5：毕赤酵母细胞表面展示高活力磷脂酶A2重组菌的构建
1、重组质粒pPIC9K-Flo-plA2m的构建
将重叠PCR纯化产物与载体pPIC9K-Flo经SnaBI和EcoRI双酶切后，将高活力磷脂酶A2基因连接至载体pPIC9K-Flo中，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态中，在含有Amp的LB固体培养基中筛选培养，挑取阳性转化子，培养后提质粒，双酶切鉴定并测序，命名为pPIC9K-Flo-plA2m。
2、毕赤酵母重组菌的构建
将测序正确的重组质粒经SalI线性化后，用电转化法转化毕赤酵母GS115，MD平板筛选重组子，获得毕赤酵母细胞表面展示高活力磷脂酶A2重组菌GS115/pPIC9K-Flo-plA2m。
实施例6：高活力磷脂酶A2在枯草芽孢杆菌重组菌中的表达及制备
将枯草芽孢杆菌重组菌株WB600/pBSA43-plA2m接种于LB液体培养基(含卡纳霉素，30μg/mL)中，37℃，200r/min培养过夜，按1％接种量转接于50mL新鲜培养基中，200r/min培养48h，可制备获得高活力磷脂酶A2粗酶液，然后采用分级盐析法沉淀高活力磷脂酶A2，收集蛋白质沉淀，溶解后，透析除盐，再经离子交换层析、凝胶层析后，冷冻干燥制得高活力磷脂酶A2纯酶酶粉。
实施例7：高活力磷脂酶A2在毕赤酵母游离表达重组菌中的表达及制备
将培养于YPD固体平板上的毕赤酵母游离表达高活力磷脂酶A2重组菌接种至YPD液体培养基中，30℃、250r/min培养24h。以1％的接种量转接到新鲜BMGY培养基中，30℃培养24h，然后6000r/min离心5min得到菌体，转入BMMY培养基中。30℃、250r/min，每隔24h补甲醇，使其终浓度保持在0.5％V/V，培养120h后可得到磷脂酶A2的粗酶液，然后采用分级盐析法沉淀高活力磷脂酶A2，收集蛋白质沉淀，溶解后，透析除盐，再经离子交换层析、凝胶层析后，冷冻干燥制得高活力磷脂酶A2纯酶酶粉。
实施例8：毕赤酵母细胞表面展示高活力磷脂酶A2全细胞催化剂的制备
将培养于YPD固体平板上的毕赤酵母细胞表面展示高活力磷脂酶A2重组菌接种至YPD液体培养基中，30℃、250r/min培养24h，以1％的接种量转接到新鲜BMGY培养基中，30℃培养24h，然后6000r/min离心5min得到菌体，转入BMMY培养基中，30℃、250r/min培养120h，每隔24h补甲醇，使其终浓度保持在0.5％V/V，然后离心收集取菌体，用双蒸水洗1-2次，加入保护剂，通过真空冷冻干燥制得毕赤酵母细胞表面展示高活力磷脂酶A2全细胞催化剂。
实施例9：磷脂酶A2活力测定
1、磷脂酶A2酶活测定原理
微孔比色法是国外最新发展的一种磷脂酶A2测定法。其原理是基于1976年Aarsman等建立的巯基显色法,即合成一种磷脂类似物2-硫代十六酰乙基磷酸胆碱(2-hexadecanoylthio-l-ethyl-phosphorylcholine，HEPC)作底物，该底物中sn-2位以硫酯键替代，仍可受磷脂酶A2水解，并释放出游离巯基，与5.5’-二硫代硝基苯甲酸(DTNB)或其它显色剂显色,在410nm波长附近有最大吸收，测定吸收值，换算出巯基的量就可以求出酶活力。反应在96孔板中进行，用酶标仪测定吸收值。酶活力定义为：37℃下每分钟产生1nmol游离巯基的酶量为1个酶活力单位。
2、磷脂酶A2酶活测定方法
(1)基础液：0.2mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液90ml，加入0.2mol/LCaCl2，5mmol/LDTNB，5mmol/L去氧胆酸钠各20ml，充分混匀。
(2)工作液：5mmol/LHEPC1ml加基础液15ml，混匀。
(3)对照液：蒸馏水1ml，加基础液15ml，混匀。
磷脂酶A2的测定步骤
混匀，37℃温育1h，测410nm波长A值，空白调零
(4)酶活力计算
磷脂酶A2活力(U/ml)＝12.25×(A测定孔-A对照孔)
3、磷脂酶A2酶活测定
测定原始磷脂酶A2和突变后磷脂酶A2的比酶活，突变后磷脂酶A2的比酶活比突变前提高了13.7％。
比酶活定义：单位重量的蛋白质中所具有酶的活力单位数，一般用U/mg蛋白质来表示。
将得到的三株重组菌以及天蓝色链霉菌发酵后测定酶活，其中枯草芽孢杆菌高活力磷脂酶A2重组菌发酵后发酵液中磷脂酶A2的酶活可达到53.5U/ml，毕赤酵母游离表达高活力磷脂酶A2重组菌发酵后发酵液中的酶活可达106.4U/ml，毕赤酵母细胞表面展示高活力磷脂酶A2全细胞催化剂的酶活可达260U/(g·干细胞)，而天蓝色链霉菌磷脂酶A2的酶活仅为7.4U/ml。
Claims (7)
1.一种磷脂酶A2突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO：8所示。
2.权利要求1所述的磷脂酶A2突变体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)通过重叠PCR定点突变野生型磷脂酶A2基因，得到磷脂酶A2突变体编码基因；
(2)将所述的磷脂酶A2突变体编码基因酶切、连接到表达或展示载体，得到携带磷脂酶A2突变体编码基因重组载体；
(3)将重组载体转化至宿主细胞，得到重组菌株；
(4)表达所述的重组菌株，纯化获得如SEQIDNO：8所示的磷脂酶A2突变体；
所述野生型磷脂酶A2基因来自天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)ATCC23899，其核苷酸序列如SEQIDNO：9所示。
3.权利要求1或2所述的磷脂酶A2突变体的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO：10所示。
4.一种包含权利要求3所述的基因的克隆载体、表达载体或宿主细胞。
5.根据权利要求4所述的克隆载体、表达载体或宿主细胞，其特征在于，所述的克隆载体为T载体、所述的表达载体为pBSA43、所述的宿主细胞为枯草芽孢杆菌WB600。
6.权利要求4所述的克隆载体、表达载体或宿主细胞，其特征在于，所述的克隆载体为T载体、所述的表达载体为pPIC9K、所述的宿主细胞为毕赤酵母GS115。
7.权利要求3所述的基因的克隆载体、展示载体或宿主细胞，其特征在于，所述的克隆载体为T载体、所述的展示载体为pPIC9K-Flo、所述的宿主细胞为毕赤酵母GS115。
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