CN103981197A - 一种含有新型前导肽的米黑根毛霉脂肪酶基因及其在毕赤酵母中的表达 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含有新型前导肽的米黑根毛霉脂肪酶基因及其在毕赤酵母中的表达。含有新型前导肽的米黑根毛霉脂肪酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过前导肽的改变实现了米黑根毛霉脂肪酶酶活和酶产量的提高，其酶活是野生型米黑根毛霉脂肪酶前导肽存在下的3倍，摇瓶发酵水平达到100U/ml，这在米黑根毛霉脂肪酶的研究领域还属于首次。米黑根毛霉脂肪酶属于真菌脂肪酶，本发明采用毕赤酵母表达系统以及按照毕赤酵母喜好性优化密码子后的脂肪酶基因，更有利于真菌脂肪酶的翻译后折叠、修饰及高效分泌。采用pPIC9K质粒作为表达载体，其含有的高效甲醇诱导强启动子有利于脂肪酶基因高效快速表达，能提高酶活和酶产量。

Description

一种含有新型前导肽的米黑根毛霉脂肪酶基因及其在毕赤酵母中的表达

技术领域：

本发明属于生物化学与分子生物学领域，具体涉及一种含有新型前导肽的米黑根毛霉脂肪酶基因及其在毕赤酵母中的表达。

背景技术：

脂肪酶(Lipase E.C.3.1.1.3)是一类特殊的酯酶，全称Triacylglycerol acylhydrolase，水解三酰甘油酯为脂肪酸、二酸甘油酯、单酸甘油酯及甘油，其天然底物一般是不溶于水的长链脂肪酸酰基酯，特点是在油水界面起催化作用（Pandey A，Benjamin S，Soccol C R，et al.The realmof microbial lipases in biotechnology[J].Biotechnol Appl Biochem，1999，29:119-131.）。由于其催化功能的多样性和作为一种生物催化剂的优越性，广泛应用于食品、制革、饲料、洗涤、油酯化工等领域（张树政.酶制剂工业[M].北京：科学出版社.1984，655-668.），是最常见的工业用酶之一，工业化脂肪酶制剂的品质改良及新品种的开发是现代生物技术介入最多的一个领域。

米黑根毛霉脂肪酶（Rhizomucor miehei Lipase，RML）是一种具有代表性的微生物脂肪酶，自从被发现以来得到了广泛的研究与应用，被认为是最有用的真菌脂肪酶之一，具有巨大的工业应用潜力。RML不仅能催化油脂水解，也能在非水相中催化酯合成、转酯化、酸解等反应（Chowdary G.V.，Divakar S.，Prafulla S.G.Modeling on isoamyl isovalerate synthesis fromRhizomucor miehei lipase in organic media:optimization studies[J].WorldJ.Microbiol.Biotechnol.2002,18:179–185）。目前，米黑根毛霉脂肪酶的酶学性质研究较深入，如Zacharis等以米黑根毛霉脂肪酶的转酯化和酯化反应为模型，针对特定的反应底物、反应介质、酶催化剂，选择合适的水合盐对调控水活度，提高了非水相催化效率。但就如何提高米黑根毛霉脂肪酶产量和获得高酶活，国内外报道较少，利用传统发酵条件优化显著提高RML酶活力已经是无能为力。

在生物体内，许多蛋白质，如很多胞外蛋白酶、某些多肽激素等都以含前导肽的前体形式合成。前导肽在蛋白质折叠中具有分子伴侣的功能。为了与一般意义上的分子伴侣相区别，人们将对蛋白质折叠有帮助的前导肽（Pro）称为分子内分子伴侣(intramolecular chaperone，IMC)。分子内分子伴侣帮助蛋白质在折叠过程中克服高的能量障碍，某些蛋白质的分子内分子伴侣甚至促进其在氧化性折叠中二硫键的正确配对。包括枯草杆菌素(subtilisin)、α水解蛋白酶(αlytic protease，αLP)、羧肽酶Y以及米根霉菌(Rhizopus oryzae)的脂肪酶在内蛋白质的正确折叠与成熟必须有Pro肽的存在才能完成，缺乏Pro肽的情况下，不能自发形成具有活性的酶。Xiao-Wei Yu等采用SOE PCR的方法，成功将米根霉（Rhizopus oryzae）脂肪酶前导肽序列替换为华根霉（Rhizopus.chinensis）脂肪酶的前导肽序列，并成功构建了表达载体，诱导发酵后发现，酶活较原始菌提高了11倍，达到4059.6U/mL，同时提高了酶对温度的稳定性（Xiao-Wei Yu,Chong Sha,Yong-Liang Guo,Rong Xiao,Yan Xu.High-level expression andcharacterization of a chimeric lipase from Rhizopus oryzae for biodiesel production[J].Biotechnology for Biofuels,2013,6:29）。由此可见，前导肽对于脂肪酶的酶活和产量有较大的影响。

巴斯德毕赤酵母（Pichia Pastoris）是近年来兴起的一个真核高效表达系统，具有许多独特的有点，已迅速发展成为分子生物学领域中被广泛用于重组蛋白生产的主要表达系统之一。Pichia Pastoris是一种噬甲基酵母，可以在以甲醇为唯一碳源和能源的培养基中快速生长。甲醇营养型毕赤酵母具有以下优势：（1）具有精确调控的启动子，可以精确表达目的外援蛋白；（2）表达效率高，其表达的外源蛋白可占总表达蛋白的90%以上，有利于目的蛋白的分离纯化；（3）在简单合成培养基中可实现高密度培养；（4）由于该酵母可以以甲醇为唯一的碳源和能源，而绝大多数微生物并不能以甲醇为碳源，这样就可以极大程度地降低杂菌在发酵液中的繁殖量，减小其对正常发酵的不利影响。因此，甲醇营养型毕赤酵母是近年来作为表达外源目的蛋白最有前途的表达系统。

发明内容：

本发明的目的是提供一种含有新型前导肽的米黑根毛霉脂肪酶基因，该基因表达出来的米黑根毛霉脂肪酶相比于野生型的米黑根毛霉脂肪酶，在表达效率和酶活上都有较大幅度的提高。

本发明的含有新型前导肽的米黑根毛霉脂肪酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

本发明还提供了一种含有上述含有新型前导肽的米黑根毛霉脂肪酶基因的表达载体。

所述的表达载体优选为pPIC9K质粒。

本发明另外还提供了一种含有上述表达载体的毕赤酵母。

本发明通过以下技术方案实现：

（1）Genbank中搜索获得米黑根毛霉脂肪酶成熟肽基因，按照毕赤酵母的对密码子的喜好性对米黑根毛霉脂肪酶（RML）成熟肽基因（rml）进行密码子优化，优化的结果如SEQ IDNo.3所示，由上海生工对优化过的基因进行合成。合成的基因序列送交华大基因测序，测序结果与预先设计的基因序列完全一致。

（2）Genbank中搜索获得华根霉脂肪酶前导肽基因，其序列如SEQ ID No.2所示，由上海生工对华根霉脂肪酶前导肽基因pro（RCL）进行合成，合成的基因序列送交华大基因的测序，测序结果与预先设计的基因序列完全一致。

（3）按照延伸重叠PCR的要求，分别设计两对引物。分别为：A1：GGGTACGTAATGGTTCCTGTTG，A2：ATCGATTGACATGCTGGGAGCAGT，B1：ACTGCTCCCAGCATGTCAATCGAT，B2：GGAATTCTTACGTGCACAACC。分别在A1上设置酶切位点SnBⅠ，B2上设置酶切位点EcoRⅠ，交由上海生工完成引物合成。

（4）以A1和A2为引物，进行PCR反应克隆出华根霉脂肪酶前导肽基因，以B1和B2为引物，进行PCR反应克隆出优化过的米黑根毛霉脂肪酶成熟肽基因。再以上述华根霉脂肪酶前导肽基因和米黑根毛霉脂肪酶成熟肽基因为模板，A1和B2为引物进行延伸重叠PCR反应，克隆出含有华根霉脂肪酶前导肽和米黑根毛霉脂肪酶成熟肽的新型基因，表示为pro(RCL)-rml，对扩增的pro(RCL)-rml基因进行测序，测序结果显示通过延伸重叠PCR扩增的pro(RCL)-rml基因序列与预先设计含有华根霉脂肪酶前导肽基因的米黑根毛霉脂肪酶基因序列完全一致，即与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列一致。

（5）将pro(RCL)-rml基因与pPIC9K质粒进行SnBⅠ和EcoRⅠ双酶切，胶回酶切收后的pro(RCL)-rml基因与pPIC9K质粒，T4连接酶连两者接后转化大肠杆菌DH5α，获得含有含有pPIC9K-pro(RCL)-rml质粒的菌株，挑克隆提取质粒后测序，测序结果显示，该克隆菌株中含有pro(RCL)-rml基因。

（6）提取上述菌株中pPIC9K-pro(RCL)-rml质粒，线性化后电转化毕赤酵母感受态细胞，转化后的细胞图MD平板，挑克隆，对克隆进行诱导发酵，检测酶活，获得新型高效米黑根毛霉脂肪酶基因工程菌。

相对于现有技术，本发明具有如下优点和有益效果：

考虑到前导肽对酶活及酶产量的影响，本发明通过前导肽的改变实现了米黑根毛霉脂肪酶酶活和酶产量的提高，其酶活是野生型米黑根毛霉脂肪酶前导肽存在下的3倍，摇瓶发酵水平达到100U/ml，这在米黑根毛霉脂肪酶的研究领域还属于首次。米黑根毛霉脂肪酶属于真菌脂肪酶，本发明采用毕赤酵母表达系统以及按照毕赤酵母喜好性优化密码子后的脂肪酶基因，更有利于真菌脂肪酶的翻译后折叠、修饰及高效分泌。采用pPIC9K质粒作为表达载体，其含有的高效甲醇诱导强启动子有利于脂肪酶基因高效快速表达，能提高酶活和酶产量。

附图说明：

图1是华根霉前导肽基因的PCR结果核酸电泳检测图。

图2是米黑根毛霉脂肪酶成熟肽基因的PCR结果核酸电泳检测图。

图3是双基因连接后的PCR反应结果核酸电泳检测图。

图4是pPIC9K-pro(RCL)-rml构建后，4号克隆测序结果及其与华根霉前导肽基因序列、米黑根毛霉脂肪酶成熟肽基因序列的比对。

图5是蛋白表达SDS-PAGE谱图。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：米黑根毛霉脂肪酶基因的优化及合成

现有的米黑根毛霉脂肪酶基因来源于米黑根毛霉，与酵母不同属，这可能是该基因在毕赤酵母中的表达量不高的主要原因。

本发明是在米黑根毛霉脂肪酶（RML）氨基酸序列（SEQ ID No.4）的基础上，采用毕赤酵母偏好的密码子替换rml（米黑根毛霉脂肪酶基因）在酵母中使用频率较低的密码子，设计出在毕赤酵母中使用频率高的基因序列，形成以下具体的基因序列，具体核苷酸序列如SEQID No.3所示，从而提高米黑根毛霉脂肪酶在酵母中的表达量。由上海生工对优化过的基因进行合成。合成的基因序列送交华大基因测序，测序结果与预先设计的基因序列完全一致。

实施例2：华根霉脂肪酶前导肽基因pro(RCL)（其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示）的PCR扩增

按照延伸重叠PCR的要求，分别设计两对引物。分别为：A1：GGGTACGTAATGGTTCCTGTTG，A2：ATCGATTGACATGCTGGGAGCAGT；B1：ACTGCTCCCAGCATGTCAATCGAT，B2：GGAATTCTTACGTGCACAACC。分别在A1上设置酶切位点SnBⅠ，B2上设置酶切位点EcoRⅠ，交由上海生工完成引物合成。其中A1和A2引物用于克隆pro(RCL)基因（其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示），B1和B2引物用于克隆实施例1的rml基因（其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示），同时A1和B2作为延伸重叠反应时的引物。

以合成的华根霉脂肪酶前导肽基因pro(RCL)的T载体pUC57-pro(RCL)（其是将华根霉脂肪酶前导肽基因pro(RCL)[其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示]插入T载体pUC57中而得）为模板，A1和A2为引物扩增pro(RCL)基因。体系为模板1μl；10×puf聚合酶buffer4μl；2.5mmol/L dNTP4μl；20μM mol/L的上下游引物各2μl；puf DNA聚合酶2μl（10U），加无菌水至总体积为50μl。反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，共30个循环；第30个循环后72℃延伸10min，PCR产物进行0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测并胶回收纯化285bp的目的条带（即扩增得到华根霉脂肪酶前导肽基因pro(RCL)），如图1所示。

实施例3：米黑根毛霉脂肪酶基因rml（核苷酸序列如SEQ ID No.3所示）的PCR扩增

以合成的米黑根毛霉脂肪酶基因rml的T载体pUC57-rml（其是将米黑根毛霉脂肪酶基因[其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示]插入T载体pUC57中而得）为模板，B1和B2为引物扩增rml基因。体系为模板1μl；10×puf聚合酶buffer4μl；2.5mmol/L dNTP4μl；20μM mol/L的上下游引物各2μl；puf DNA聚合酶1μl（2.5U），加无菌水至总体积为50μl。反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，共30个循环；第30个循环后72℃延伸10min，PCR产物进行0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测并胶回收纯化813bp的目的条带（即扩增得到米黑根毛霉脂肪酶基因rml），如图2所示。

实施例4：pro(RCL)-rml基因延伸重叠PCR扩增

取实施例2扩增的华根霉脂肪酶前导肽基因pro(RCL)基因1μl，实施例3的米黑根毛霉脂肪酶基因rml基因2μl混合作为模板，10×puf聚合酶buffer4μl，2.5mmol/L dNTP4μl，pufDNA聚合酶1μl（2.5U），加无菌水至总体积为50μl。反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸4min，1个循环后分别加入引物A1和B2各1μl，继续PCR，反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，共30个循环；第30个循环后72℃延伸10min。PCR产物进行0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测并胶回收纯化1100bp左右的目的条带（即为含有新型前导肽的米黑根毛霉脂肪酶基因pro(RCL)-rml基因，测序后其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，序列的两头添加有酶切位点EcoRⅠ和SnBⅠ），如图3所示。

实施例5：pPIC9K-pro(RCL)-rml质粒的构建

采用限制性内切酶EcoRⅠ和SnBⅠ双酶切pPIC9K质粒和pro(RCL)-rml基因，双酶切体系为目的基因（pro(RCL)-rml基因）70ul，酶切缓冲液20ul，EcoRⅠ和SnBⅠ各5ul。胶回收酶切后产物，并将二者（酶切后的pPIC9K质粒和pro(RCL)-rml基因）连接后转化大肠杆菌DH5α，筛选，得到重组质粒pPIC9K-pro(RCL)-rml的阳性克隆，提取阳性克隆的重组质粒pPIC9K-pro(RCL)-rml进行EcoRⅠ和SnBⅠ双酶切鉴定，鉴定正确后，委托深圳华大基因公司进行测序，测序结果显示4号阳性克隆基因序列与预期目标基因序列完全一致，基因序列比对如图4所示。测序结果证实，已经将pro(RCL)-rml基因（其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示）插入pPIC9K质粒中得到重组质粒pPIC9K-pro(RCL)-rml。

实施例6：高效表达pPIC9K-pro(RCL)-rml基因序列的脂肪酶毕赤酵母工程菌的构建以电击法将Sac I线性化的重组质粒pPIC9K-pro(RCL)-rml转化毕赤巴斯德酵母宿主菌GS115，转化物涂布于MD平板，培养2-3天。将MD平板上的转化子分别接种于含不同浓度的G418抗性的YPD平板上，培养3-5天。将高浓度G418-YPD平板上出现的转化子挑取其对应的单克隆，按照Invitrogen操作指南提取酵母基因组DNA作为模板，进行酵母基因组PCR鉴定（检测引物为A1：GGGTACGTAATGGTTCCTGTTG B2：

GGAATTCTTACGTGCACAACC），获得重组转化子GS115/pPIC9K-pro(RCL)-rml（其是将重组质粒pPIC9K-pro(RCL)-rml转化毕赤巴斯德酵母宿主菌GS115中）。

实施例7：表达高活力脂肪酶毕赤酵母工程菌的培养和酶活测定

鉴定正确的重组转化子GS115/pPIC9K-pro(RCL)-rml接种于20ml BMGY培养基中，30℃，200r/min振荡培养160h至OD₆₀₀到3离心收集菌体，再将其悬浮于BMMY培养基中，稀释至OD₆₀₀为1，继续振荡培养，每隔24h向BMMY培养基中补加甲醇至终浓度为1.0%进行诱导表达，发酵6天，每天取上清液，做SDS-PAGE检测，检测结果如图5所示，随着发酵时间的增加，蛋白表达量在逐渐增加。发酵液在5000rpm、4℃离心15分钟，弃沉淀，即获得含米黑根毛霉脂肪酶的上清液。利用橄榄油做底物进行NaOH法滴定测定米黑根毛霉脂肪酶水解活力结果显示该米黑根毛霉脂肪酶在摇瓶发酵水平酶活高达100U/ml，是同等条件下米黑根毛霉脂肪酶在自身前导肽存在下酵母表达酶活的3倍。

实施例8：脂肪酸甲酯的合成

采用大豆油和甲醇为原料，使用有机溶剂，在含有新型前导肽的米黑根毛霉脂肪酶粗酶粉作用下发生转酯化反应，得到脂肪酸甲酯产品。

将醇油摩尔比为3:1的甲醇和大豆油，加入到反应器中，将反应器置于40℃，150r/min的恒温摇床中摇匀5min后，添加实施例7的重组转化子GS115/pPIC9K-pro(RCL)-rml发酵得到的米黑根毛霉脂肪酶酶液，酶添加量按照每克油80U添加，水添加量根据酶液计算为油重的10%，反应30h取样，将样品以10000g/min离心10分钟，取100ul上层酯相，溶于900ul正己烷中，利用GC-MS分析可知，脂肪酸甲酯的得率约为96%。

将醇油摩尔比为5:1的甲醇和菜籽油，加入反应器中，将反应器置于42℃，150r/min的恒温摇床中摇匀5min后，添加实施例7的重组转化子GS115/pPIC9K-pro(RCL)-rml发酵得到的米黑根毛霉脂肪酶酶液，酶添加量按照每克油100U添加，水添加量根据酶液计算为油中的15%，反应24h后取样，将样品以10000g/min离心10分钟，取100ul上层酯相，溶于900ul正己烷中，利用GC-MS分析产物中的脂肪酸甲酯含量，脂肪酸甲酯的得率约为98%。

实施例9：脂肪酸乙酯的合成

将醇油摩尔比为3:1的乙醇和大豆油，加入到反应器中，将反应器置于40℃，150r/min的恒温摇床中摇匀5min后，添加实施例7的重组转化子GS115/pPIC9K-pro(RCL)-rml发酵得到的米黑根毛霉脂肪酶酶液，酶添加量按照每克油90U添加，水添加量根据酶液计算为油重的10%，反应40h取样，将样品以10000g/min离心10分钟，取100ul上层酯相，溶于900ul正己烷中，利用GC-MS分析可知，脂肪酸乙酯的得率约为90%。

Claims (4)

1.一种含有新型前导肽的米黑根毛霉脂肪酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.一种含有权利要求1所述的含有新型前导肽的米黑根毛霉脂肪酶基因的表达载体。

3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述的表达载体为pPIC9K质粒。

4.一种含有权利要求2或3所述的表达载体的毕赤酵母。