CN103898142A - 一种硫醇过氧化物酶提高毕赤酵母外源蛋白质表达量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明针对提高毕赤酵母外源重组蛋白质制备能力，公开了一种硫醇过氧化物酶作为辅助因子提高毕赤酵母外源重组蛋白质表达量的方法，属于生物化工领域。本发明将硫醇过氧化物酶基因与来自毕赤酵母或酿酒酵母的诱导型启动子或组成型启动子相连接，构建基因表达载体，转化入表达外源重组蛋白质的甲醇诱导型毕赤酵母菌株中进行共表达或过表达，硫醇过氧化物酶基因作为氧化还原应激应答的全局调控基因，在不同强度的启动子及基因拷贝数的转录水平调控作用下，提高外源重组蛋白质在甲醇诱导型毕赤酵母中表达量。该发明为提高细胞生产重组蛋白质的能力和生物反应效率提供新方法，对于生物技术过程强化具有重要价值。

Description

一种硫醇过氧化物酶提高毕赤酵母外源蛋白质表达量的方法

技术领域

本发明涉及一种硫醇过氧化物酶作为辅助因子提高毕赤酵母外源蛋白表达量的方法，属于生物化工领域。

背景技术

毕赤酵母真核表达系统(Pichia pastoris)因其遗传背景清楚，技术操作简单，生产成本较低而适合大规模发酵，是目前应用领域最广泛的表达系统之一。广泛使用在食品、医药、轻工、化工、环境和能源行业中的酶制剂和蛋白药物大部分是通过毕赤酵母表达系统得到的，但是仍存在对不同来源的目的蛋白的表达量不足，表达效率不高的缺陷。降低发酵过程成本，提高重组蛋白的高效表达效率一直是生物技术领域最受关注的研究热点。有研究发现，通过共表达分子伴侣、折叠酶基因等辅助因子，增强相关代谢途径的重要基因转录水平，可以有效地提高一些重组蛋白的表达效率。

硫醇过氧化物酶是反应氧化压力应激应答的相关基因，可以降低甲醇诱导型毕赤酵母细胞内部由于代谢甲醇产生的过多过氧化氢及活性氧自由基对细胞产生的氧化损伤，参与抗氧化系统，同时，可以激活转录因子，进行信号转导，全局调控基因转录。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种硫醇过氧化物酶作为辅助因子提高甲醇诱导型毕赤酵母外源蛋白表达量的方法；本发明的另外一个目的是提供硫醇过氧化物酶基因的一种新应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

将硫醇过氧化物酶基因与来自毕赤酵母的诱导型启动子或组成型启动子相连接，构建基因表达载体，转化入表达外源重组蛋白质的甲醇诱导型毕赤酵母菌株中进行共表达或过表达，硫醇过氧化物酶基因作为辅助基因，在不同强度的启动子及基因拷贝数的转录水平调控作用下，提高外源重组蛋白质在甲醇诱导型毕赤酵母中表达量。

本发明的优点是利用了硫醇过氧化物酶基因作为氧化还原应激应答的全局调控基因，激活转录因子，进行信号转导，同时具有很强的自由基消除剂优点，有效克服了甲醇诱导型毕赤酵母在高密度发酵时因甲醇代谢及环境胁迫导致的自由基积累以及进一步的对蛋白表达量的影响，同时有助于外源蛋白的正确构象形成，降低未正确折叠蛋白响应机制影响，促进外源蛋白分泌。本发明为提高细胞生产重组蛋白质的能力和生物反应效率提供新方法，对于生物技术过程强化具有重要价值。

附图说明

图1：硫醇过氧化物酶基因过表达的外源蛋白表达增强型菌株表达β-葡萄糖醛酸苷酶和木聚糖酶的比酶活图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：硫醇过氧化物酶基因在外源重组蛋白质的甲醇诱导型毕赤酵母中的过表达。

以毕赤酵母GAP组成型启动子表达载体过表达毕赤酵母硫醇过氧化物酶基因为例：设计引物，从毕赤酵母克隆出硫醇过氧化物酶基因Tpx片段，与NCBI公布的Komagataella pastorisGS115硫醇过氧化物酶基因序列（PAS_chr2-2_0382）作比对，同源性分析显示，克隆的基因片段与基因库Komagataella pastoris GS115硫醇过氧化物酶基因的同源性为100%。

引物序列为：

Tpx-F(EcoRI):5‘CAGGAATTCATGTCTTCATTTTATGATCTGGCCCCATTA3’

Tpx-R(XbaI):5‘GCTCTAGATTACAACTGGTTTGCAGGTGGAAAATGTT3’

将克隆出的Tpx基因片段和毕赤酵母常用表达载体pGAPZB通过EcoRI和XbaI酶切后用T4DNA链接酶于16℃过夜连接，连接产物用热击化学法转化入宿主菌TOP10，转化菌液涂布在含有博来霉素（25mg/mL）LB平板上，37℃过夜培养，以Tpx基因的PCR引物进行菌落PCR的方法鉴定阳性克隆子，最终获得含有Tpx基因的重组表达质粒pGAPZB-Tpx，用双酶切进行验证。

采用BlnI双酶切pGAPZB-Tpx质粒，使其线性化；将线性化的pGAPZB-Tpx质粒分别电击转化入表达β-葡萄糖醛酸苷酶和木聚糖酶的甲醇诱导型毕赤酵母中,使其同源插入在毕赤酵母的基因组上，在100mg/mL博来霉素抗性平板上培养2-3天后，用pGAPZB的通用引物采用菌落PCR的方法筛选阳性毕赤酵母转化子，然后进一步发酵培养验证。

实施例2：过表达Tpx基因的外源蛋白表达增强型菌株的发酵。

培养基：种子和斜面培养基为酵母基本发酵培养基为BMGY培养基（1L）：蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甘油10%，YNB13.4g，100mM磷酸缓冲液（pH6.0）；诱导培养基为BMMY培养基（1L）：蛋白胨20g，酵母抽提物10g，葡萄糖20g；固体培养基添加琼脂20g；YNB13.4g，100mM磷酸缓冲液（pH6.0）；甲醇1%，甲醇诱导补加时间间隔为24h。

培养方法：挑选过表达硫醇过氧化物酶基因的表达β-葡萄糖醛酸苷酶和木聚糖酶毕赤酵母阳性转化子，接种入YPD种子培养基。将30℃、200rpm下培养到OD600在1.6-1.7之间的种子以2%的接种量转入基本发酵培养基，于30℃、200rpm下；诱导条件：在BMGY中培养至OD值为1.2-1.5时，将酵母细胞转入BMMY培养基中连续培养96h，每间隔24h补加甲醇诱导蛋白的产生，每24h取发酵液1mL，离心后获得上清测定蛋白浓度及酶活性。分别以转入空质粒pGAPZB的表达β-葡萄糖醛酸苷酶和木聚糖酶毕赤酵母做空白对照。

过表达硫醇过氧化物酶基因的表达β-葡萄糖醛酸苷酶和木聚糖酶毕赤酵母分别较对照，摇瓶上发酵过程中比酶活有明显的增强。β-葡萄糖醛酸苷酶比酶活最高提高量为对照的2.33倍；木聚糖酶比酶活最高提高量为对照的1.35倍。数据如图1。

分别以过表达Tpx基因的β-葡萄糖醛酸苷酶和木聚糖酶表达增强菌为出发菌株，将培养好的YPD菌液以接种量为10%无菌操作接入3L全自动发酵罐中，初始条件为：装液量1000mL（YNB10%，甘油25%），初始搅拌转速为400r/min,通气量2.5vvm，以30%的100mM磷酸缓冲液和25%氨水控制pH为6.0，生长期及诱导期的培养温度为28℃，采用搅拌关联的溶氧控制，维持溶氧在25%，搅拌转速最高值设置为1000r/min。当甘油耗尽（溶氧迅速上升）时，溶氧＞50%时，开始流加甲醇诱导，使培养基甲醇浓度迅速达到1.8%（w/w），表达增强型菌株在3L罐上表达β-葡萄糖醛酸苷酶酶活为1.5×10⁴U/mL，木聚糖酶酶活为43U/mL。

实施例3：硫醇过氧化物酶基因在转录水平上调控外源重组蛋白质表达量。

通过NCBI数据库查阅来源于毕赤酵母或酿酒酵母及其他物种的几种功能相关的或相似的序列硫醇过氧化物酶基因序列，设计引物，以OE-PCR或酶切位点设计的方式与来自毕赤酵母或酿酒酵母的不同强度的组成型和诱导型启动子表达质粒相连接，转化入外源重组蛋白质的甲醇诱导型毕赤酵母进行共表达或过表达，通过启动子强度及诱导方式调节硫醇过氧化物酶基因转录水平高低，进而影响重组蛋白在甲醇诱导型毕赤酵母工程菌中的分泌表达量。硫醇过氧化物酶低拷贝菌株（2-4个拷贝）的表达外源蛋白的酶活均高于高拷贝菌株（＞4个拷贝）。硫醇过氧化物酶低转录水平较益于外源蛋白增强表达。

Claims (4)

1.一种硫醇过氧化物酶基因作为辅助因子提高毕赤酵母外源蛋白质表达量的方法，其特征在于，将硫醇过氧化物酶基因与来自毕赤酵母的诱导型启动子或组成型启动子相连接，构建基因表达载体，转化入表达外源重组蛋白质的甲醇诱导型毕赤酵母菌株中进行共表达或过表达，在不同强度的启动子及基因拷贝数的转录水平调控作用下，提高外源重组蛋白质在甲醇诱导型毕赤酵母中表达量。

2.如权利要求1所述的硫醇过氧化物酶基因作为辅助因子在提高毕赤酵母外源重组蛋白质表达量的应用。

3.如权利要求1所述的硫醇过氧化物酶基因来源于毕赤酵母或酿酒酵母及其他物种的功能相关的或相似的序列。

4.如权利要求1所述的启动子与硫醇过氧化物酶基因连接构建策略中，不同强度的启动子为来源于毕赤酵母或酿酒酵母的组成型或诱导型启动子。