CN103502266A

CN103502266A - 具有粘度改变表型的丝状真菌

Info

Publication number: CN103502266A
Application number: CN201280019710.8A
Authority: CN
Inventors: E·A·博迪; R·J·普莱特二世
Original assignee: Danisco USA Inc
Current assignee: Danisco USA Inc; Danisco US Inc
Priority date: 2011-04-22
Filing date: 2012-04-20
Publication date: 2014-01-08
Anticipated expiration: 2032-04-20
Also published as: CA2833756A1; CA2833539A1; AU2017235968B2; DK2699667T3; CN103502430A; EP2699668B1; US9593341B2; AU2017235968A1; EP2699667B1; BR112013026535A2; CN103517981A; CA2833756C; CA2833539C; EP2673290B1; WO2012145592A1; JP2014513530A; KR20140033047A; AU2012245325B2; BR112013025434A2; WO2012145598A1

Abstract

本发明描述的是与具有改变的生长特性的变异丝状真菌相关的组合物和方法。这种变体非常适于在深层培养中生长，例如用于大规模生产用于商业应用的酶和其他蛋白质。

Description

具有粘度改变表型的丝状真菌

优先权

本专利申请要求二者均于2011年4月22日提交的系列号为61/478,160和61/478,162的美国临时申请和各自于2011年4月29日提交的系列号为61/480,602、61/480,610和61/480,629的美国临时申请的优先权，特此这些申请案以引用的方式全文并入本文。

技术领域

本发明的菌株和方法涉及丝状真菌中的基因突变，该基因突变产生具有改变的生长特性的菌株变体。这种变体非常适于在深层培养中生长，例如用于大规模生产用于商业应用的酶和其他蛋白质或代谢物。

背景技术

丝状真菌能够高水平表达天然和异源蛋白质，从而使得它们非常适于大规模生产用于工业应用、医药应用、动物健康应用以及食品和饮料应用的酶和其他蛋白质。通常在生物反应器中在菌丝体深层培养中培养丝状真菌，所述生物反应器适于将氧气和营养物质引入和分布进培养基(即发酵液)中。菌丝体的形态特征影响发酵液的流变特性，从而影响生物反应器性能。

一般来讲，发酵液的粘度越高，氧气和营养物质的分布越不均匀，搅拌培养物所需的能量越高。在一些情况下，发酵液的粘度变得足够高而明显妨碍氧气和营养物质的溶解，从而不利地影响真菌的生长。另外，混合粘稠发酵液以及对粘稠发酵液进行充气所需的能量可大大增加生产成本，以及招致在马达和电源供应方面的资本支出较高。

发明内容

本发明描述了涉及丝状真菌的菌株和方法，所述丝状真菌具有产生粘度改变表型的遗传变更。

在一个方面，提供衍生自亲本株的丝状真菌变异株，该变异株包含能使变异株的细胞与亲本株的细胞相比产生改变量的功能性Gasl蛋白的遗传变更，其中变异株的细胞在深层培养有氧发酵过程中，(i)与亲本株的细胞相比，产生出需要改变的搅拌量来维持预选的溶氧量的细胞发酵液，和/或(ii)与亲本株的细胞相比，产生出在预选的搅拌量下维持改变的溶氧量的细胞发酵液。

在一些实施例中，功能性Gasl蛋白的改变量为减少量，并且变异株在深层培养有氧发酵过程中，(i)与亲本株的细胞相比，产生出需要减少的搅拌量来维持预选的溶氧量的细胞发酵液，和/或(ii)与亲本株的细胞相比，在预选的搅拌量下维持增加的溶氧量的细胞发酵液。

在一些实施例中，遗传变更包含亲本株中所存在的gasl基因的破坏。在一些实施例中，破坏gasl基因是缺失gasl基因的全部或部分所致。在一些实施例中，破坏gasl基因是缺失包含gasl基因的基因组DNA的一部分所致。在一些实施例中，破坏gasl基因是诱变gasl基因所致。

在一些实施例中，破坏gasl基因是用位点特异性重组进行。在一些实施例中，破坏gasl基因是与在gasl基因的遗传基因座处引入选择性标记相结合来进行。

在一些实施例中，变异株不产生功能性Gasl蛋白。在一些实施例中，变异株不产生Gasl蛋白。

在一些实施例中，变异株还包含编码所关注的蛋白质的基因。在一些实施例中，变异株还含sfb3基因的破坏。在一些实施例中，变异株还包含sebl基因的破坏。在一些实施例中，变异株还包含sfb3基因和sebl基因的破坏。在一些实施例中，变异株还包含至少一个选自如下的基因的破坏：sfb3基因、sebl基因、mpgl基因、crzl基因和tps2基因。在一些实施例中，变异株每单位量生物质产生与亲本株基本上相同量或更多的蛋白质。

在一些实施例中，丝状真菌为盘菌亚门(Pezizomycotina)物种。在一些实施例中，丝状真菌为木霉属(Trichoderma)物种、曲霉属(Aspergillus)物种、镰刀菌属(Fusarium)物种、足放线病菌属(Scedosporium)物种、青霉属(Penicillium)物种、金孢子菌属(Chrysosporium)物种、头孢霉属(Cephalosporium)物种、篮状菌属(Talaromyces)物种、Geosmithia属物种和链孢霉属(Neurospora)物种。在一些实施例中，丝状真菌可包括但不限于里氏木霉(Trichoderma reesei)(此前分类为长梗木霉(Trichodermalongibrachiatum)和红褐肉座菌(Hypocrea jecorina))、黑曲霉(Aspergillusniger)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、解乌头酸曲霉(Aspergillusitaconicus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、土曲霉(Aspergillus terreus)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、多育赛多孢(Scedosporium prolificans)、粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、埃默森篮状菌(Talaromyces(Geosmithia)emersonii)、腐皮镰刀菌(Fusarium venenatum)和Chrysosporiumlucknowense。在一些实施例中，丝状真菌为里氏木霉。

在另一方面，提供制备丝状真菌细胞的变异株的方法，该方法包括：将遗传变更引入丝状真菌细胞的亲本株中，与亲本株的细胞相比该遗传变更改变了功能性Gasl蛋白的产生，从而产生变异丝状真菌细胞，该变异丝状真菌细胞在深层培养有氧发酵过程中，(i)与亲本株的细胞相比，产生出需要改变的搅拌量来维持预选的溶氧量的细胞发酵液，和/或(ii)与亲本株的细胞相比，产生出在预选的搅拌量下维持改变的溶氧量的细胞发酵液。

在一些实施例中，遗传变更减少或防止功能性Gasl蛋白的产生，从而产生变异丝状真菌细胞，该变异丝状真菌细胞在深层培养有氧发酵过程中，(i)与亲本株的细胞相比，产生出需要减少的搅拌量来维持预选的溶氧量的细胞发酵液，和/或(ii)与亲本株的细胞相比，产生出在预选的搅拌量下维持增加的溶氧量的细胞发酵液。

在一些实施例中，遗传变更包括利用遗传操作破坏亲本丝状真菌细胞中的gasl基因。在一些实施例中，遗传变更包括利用遗传操作缺失亲本丝状真菌细胞中的gasl基因。在一些实施例中，遗传变更利用位点特异性遗传重组进行。

在一些实施例中，破坏gasl基因是与在gasl基因的遗传基因座处引入选择性标记相结合来进行。在一些实施例中，变异株每单位量生物质产生与亲本株基本上相同量或更多的蛋白。在一些实施例中，破坏gasl基因是与破坏sfb3基因相结合进行。在一些实施例中，破坏gasl基因是与破坏至少一个选自sfb3基因、sebl基因、mpgl基因、crzl基因和tps2基因的基因相结合进行。

在一些实施例中，变异株每单位量生物质产生与亲本株基本上相同量或更多的蛋白。

在一些实施例中，丝状真菌为盘菌亚门物种。在一些实施例中，丝状真菌为木霉属物种、曲霉属物种、镰刀菌属物种、足放线病菌属物种、青霉属物种、金孢子菌属物种、头孢霉属物种、篮状菌属物种、白乔史密斯霉属(Geosmithia)属物种和链孢霉属物种。在一些实施例中，丝状真菌可包括但不限于里氏木霉(此前分类为长梗木霉和红褐肉座菌)、黑曲霉、烟曲霉、解乌头酸曲霉、米曲霉、构巢曲霉、土曲霉、酱油曲霉、日本曲霉、多育赛多孢、粗糙脉孢霉、绳状青霉、产黄青霉、埃默森篮状菌、腐皮镰刀菌和勒克瑙金孢菌(Chrysosporium lucknowense)。在一些实施例中，丝状真菌为里氏木霉。

在一些实施例中，亲本株还包含编码所关注的蛋白质的基因。在一些实施例中，在引入减少或防止功能性Gasl蛋白的产生的遗传变更之前，编码所关注的蛋白质的基因存在于亲本株中。在一些实施例中，亲本株内的所关注的蛋白质由内源基因或异源基因编码。

在另一方面，提供由上述变异株中任一者产生的所关注的蛋白质。

在又一方面，提供由上述方法中任一者产生的且具有上述特性中任一者的丝状真菌。

在另一方面，提供衍生自亲本株的丝状真菌变异株，该变异株包含：(a)遗传变更，所述遗传变更使得(i)与亲本株的细胞相比，深层培养物中需要减少的搅拌量来维持预选的溶氧量，和/或(ii)与亲本株的细胞相比，在预选的搅拌量下维持深层培养物中增加的溶氧量；和(b)编码所关注的蛋白质的基因，其中所述编码所关注的蛋白质的基因在(a)中的遗传变更之前存在于变异株中。

在一些实施例中，导致变异株的遗传变更包含亲本株中所存在的gasl基因的破坏。在一些实施例中，破坏gasl基因是与在gasl基因的遗传基因座处引入选择性标记相结合进行。在一些实施例中，破坏gasl基因是与破坏sfb3基因相结合进行。在一些实施例中，破坏gasl基因是与破坏sebl基因相结合进行。在一些实施例中，破坏gasl基因是与破坏至少一个选自sfb3基因、sebl基因、mpgl基因、crzl基因和tps2基因的基因相结合进行。

根据本说明书(包括附图)，本发明的变异株和方法的这些及其他的方面和实施例将显而易见。

附图说明

图1为如实例1中所述的gasl破坏载体pRATT247-gaslD-pyr2的图谱。

具体实施方式

I.综述

本发明的菌株和方法涉及具有影响其形态和生长特性的遗传修饰的丝状真菌细胞变异株。当在深层培养中培养该变异细胞时，其产生与包含亲本株细胞的细胞发酵液相比具有不同流变特性的细胞发酵液。这些变异株中的一些非常适于大规模生产酶及其他在商业上重要的蛋白质。

II.定义

在详细描述本发明菌株和方法之前，为了清楚起见对如下术语进行定义。未定义的术语应该与它们在相关领域中所用的普通含义一致。

如本文所用，“里氏木霉”是指子囊菌门(Ascomycota)盘菌亚门的丝状真菌。该生物体此前被分类为长梗木霉或被分类为红褐肉座菌。

如本文所用，短语“丝状真菌细胞的变异株”或类似短语是指例如通过遗传操作，从属于盘菌亚门的亲本(或参照)株衍生(即从其获得或可从其获得)的丝状真菌细胞的株系。在本说明书中，亲本株和变异株可描述为具有某些特性，例如遗传修饰、表达表型、形态等等；然而，本领域技术人员将理解，在技术上其为具有这些特性的亲本株或变异株的细胞，并且为了方便而称为“菌株”。

如本文所用，术语“所关注的蛋白质”是指期望在丝状真菌中表达的多肽。这种蛋白质可以是酶、底物结合蛋白、表面活性蛋白、结构蛋白等等，并且可以高水平表达，且可用于商业化目的。所关注的蛋白质可由相对于变异株和/或亲本株的内源基因或异源基因编码。所关注的蛋白质可在细胞内表达或作为分泌性蛋白表达。

如本文所用，短语“基本上无活性”或类似短语，意指特定的活性在混合物中不能检测到或者其存在量不会干扰该混合物的预期目的。

如本文所用，术语“多肽”和“蛋白质”(和/或它们各自的复数形式)可互换使用来指包含肽键连接的氨基酸残基的任何长度的聚合物。本文中使用氨基酸残基的常规单字母或三字母代码。该聚合物可以是直连或支链的，其可包含经修饰的氨基酸，并且其可夹杂有非氨基酸。该术语还包含已经以天然方式或通过干预进行修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他的操作或修饰，例如与标记组分缀合。还包括在该定义中的是例如含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。

如本文所用，在功能上和/或在结构上类似的蛋白质视为“相关蛋白”。这类蛋白质可衍生自不同属和/或种的生物体，或甚至不同纲的生物体(例如细菌和真菌)。相关蛋白还涵盖通过一级序列分析确定、通过二级或三级结构分析确定或通过免疫交叉反应确定的同源物。

如本文所用，术语“衍生的多肽/蛋白质”是指通过在N末端或C末端任一端或这两个末端添加一个或多个氨基酸、在氨基酸序列中的一个或多个不同位点置换一个或多个氨基酸、在蛋白质的任一端或两个末端或在氨基酸序列中的一个或多个位点缺失一个或多个氨基酸和/或在氨基酸序列中的一个或多个位点插入一个或多个氨基酸而衍生自或可衍生自蛋白质的蛋白质。可通过修饰编码天然蛋白质的DNA序列、将该DNA序列转化进合适的宿主中并使该经修饰的DNA序列表达而形成衍生的蛋白质来实现蛋白质衍生物的制备。

相关的(和衍生的)蛋白质包括“变体蛋白”。变体蛋白与参照/亲本蛋白(例如野生型蛋白)的差别在于少数氨基酸残基的置换、缺失和/或插入。变体蛋白与亲本蛋白质间的差异氨基酸残基的数目可以为一个或多个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更多个氨基酸残基。变体蛋白可与参照蛋白具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或甚至至少约99或更多的氨基酸序列同一性。变体蛋白与参照蛋白的差别还可在于所选的基序、结构域、表位、保守区等等。

如本文所用，术语“类似序列”是指蛋白质内提供与所关注的蛋白质(即通常是所关注的起始蛋白质)类似的功能、三级结构和/或保守残基的序列。例如，在含有α-螺旋或β-片层结构的表位区域中，类似序列中的置换氨基酸优选维持相同的特异性结构。该术语还指核苷酸序列以及氨基酸序列。在一些实施例中，开发类似序列使得置换氨基酸导致显示类似或改善功能的变体酶。在一些实施例中，所关注蛋白质中的氨基酸的三级结构和/或保守残基位于或接近所关注的区段或片段。因而，若所关注的区段或片段含有例如α-螺旋或β-片层结构，则置换氨基酸优选维持该特异性结构。

如本文所用，术语“同源蛋白”是指具有与参照蛋白类似的活性和/或结构的蛋白质。同源物不一定是进化相关的。因而，意图是该术语涵盖从不同生物体获得的相同、类似或对应的酶(例如，就结构和功能而言)。在一些实施例中，希望鉴别具有与参照蛋白类似的四级、三级和/或一级结构的同源物。在一些实施例中，同源蛋白诱导与参照蛋白类似的免疫应答。在一些实施例中，同源蛋白经工程改造而产生具有所需活性的酶。

序列之间的同源程度可用本领域已知的任何合适方法测定(参见例如，Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.(《应用数学进展》)2：482；Needleman和Wunsch(1970)J. Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)，48：443；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)85：2444；诸如威斯康星遗传软件包(Wisconsin GeneticsSoftware Package)(威斯康星州麦迪逊的GCG公司(Genetics ComputerGroup，Madison，WI))中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA之类的程序；和Devereux等人(1984)Nucleic Acids Res.(《核酸研究》)12：387-95)。

例如，PILEUP是测定序列同源性水平的有用程序。PILEUP利用渐进性双序列比对从一组相关序列产生多序列比对。其还可以绘出关系树，该关系树示出了用于产生比对的聚类关系。PILEUP使用Feng和Doolittle(Feng和Doolittle(1987)J. Mol.Evol.(《分子进化杂志》)35：351-60)的渐进比对方法的简化形式。该方法类似于Higgins和Sharp((1989)CABIOS5：151-53)所描述的方法。可用的PILEUP参数包括：默认空位权重＝3.00，默认空位长度权重＝0.10，以及加权的末端空位。可用的算法的另一个例子为BLAST算法，该算法由Altschul等人((1990)J. Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)215：403-10)和Karlin等人((1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)90：5873-87)描述。一种特别有用的BLAST程序为WU-BLAST-2程序(参见例如，Altschul等人(1996)Meth.Enzymol.(《酶学方法》)266：460-80)。参数“W”、“T”和“X”决定比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用如下默认值：字长(W)＝11、BLOSUM62打分矩阵(参见例如，Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad. Sci.USA(《美国科学院院刊》)89：10915)、比对(B)＝50，期望值(E)＝10、M′5、N′-4以及对两条链均进行比较。

如本文所用，在至少两个核酸或多肽的情况下，短语“基本上相似”和“基本上相同”通常意指与参照(例如野生型)序列相比，多核苷酸或多肽包含具有至少约70％同一性、至少约75％同一性、至少约80％同一性、至少约85％同一性、至少约90％同一性、至少约91％同一性、至少约92％同一性、至少约93％同一性、至少约94％同一性、至少约95％同一性、至少约96％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性或甚至至少约99％同一性或更高同一性的序列。序列同一性可用已知的程序如BLAST、ALIGN和CLUSTAL，使用标准参数测定。(参见例如，Altschul等人，(1990)J. Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)215：403-410；Henikoff等人(1989)Proc.Natl.Acad. Sci.USA(《美国科学院院刊》)89：10915；Karin等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA(《美国科学院院刊》)90：5873；和Higgins等人(1988)Gene(《基因》)73：237-244)。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Centerfor Biotechnology Information)公开获得。另外，可用FASTA(Pearson等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《(美国科学院院刊》)85：2444-48)搜索数据库。两个多肽基本上相同的一个指示是第一多肽与第二多肽是免疫交叉反应性的。通常，差别在于保守氨基酸置换的多肽是免疫交叉反应性的。因而，例如，若两个肽差别仅在于保守置换，则多肽基本上与第二多肽相同。两条核酸序列基本上相同的另一个指示是，两个分子在严格条件(例如在中到高的一系列严格性内)彼此杂交。

如本文所用，术语“基因”与术语“等位基因”在关于编码和引导蛋白质或RNA表达的核酸时是同义的。丝状真菌的营养体形式通常是单倍体，因而单拷贝的指定基因(即单个等位基因)足以赋予指定表型。

如本文所用，术语“野生型的”和“天然的”可互换使用并且是指自然中存在的基因、蛋白质或株系。

如本文所用，“缺失基因”是指从宿主细胞的基因组移除基因。若基因包括未紧邻基因的编码序列的控制元件(例如，增强子元件)，则缺失基因是指缺失该编码序列，以及任选缺失相邻的增强子元件，包括但不限于例如启动子和/或终止子序列。

如本文所用，“破坏基因”广义地指基本上在宿主细胞中防止细胞产生功能基因产物，例如蛋白质的任何遗传或化学操作，即突变。破坏方法的例子包括完全或部分缺失基因的任何部分，包括多肽编码序列、启动子、增强子或另一调控元件，或者诱变上述者，其中诱变涵盖置换、插入、缺失、倒位以及它们的组合和变型形式，上述突变中的任一者基本上防止功能基因产物的产生。基因还可以利用RNAi、反义或废止基因表达的任何其他方法来破坏。

如本文所用，术语“遗传操作”和“遗传变更”可交换使用并且是指核酸序列的变更/改变。该变更可包括但不限于核酸序列中的至少一个核酸的置换、缺失、插入或化学修饰。

如本文所用，“有氧发酵”是指在存在氧气的情况下的生长。

如本文所用，术语“细胞发酵液”统指液体/深层培养物中的培养基和细胞。

如本文所用，术语“细胞群”是指液体/深层培养物中存在的细胞组分(包括完整的和溶解的细胞)。细胞群可以干重或湿重表示。

如本文所用，术语“流变学”是指研究物质形变和流动的物理学分支。

如本文所用，“粘度”是流体对机械应力(如剪切应力或拉伸应力)引起的形变的抗性的量度。在本发明语境中，粘度还可以指包含丝状真菌细胞的细胞发酵液对机械应力(例如通过转子/叶轮所提供的机械应力)的抗性。由于细胞发酵液的粘度可能难以直接测量，可使用粘度的间接量度，如在预选搅拌量下培养物发酵液的溶氧量、维持预选溶氧量所需的搅拌量、搅拌细胞发酵液以维持所选溶氧量所需的能量量或甚至是固体培养基上的集落形态。

如本文所用，丝状真菌细胞的“粘度改变”变异株是指产生这样的细胞发酵液的变异株，该细胞发酵液与亲本株产生的等价细胞发酵液相比具有减少的或增加的粘度(即，减少的或增加的对剪切或拉伸应力的抗性)。一般来讲，相当的细胞发酵液或等价的细胞发酵液具有相当的细胞群。优选地，关于粘度的任何直接或间接量度，粘度改变的变异株与亲本株之间的差别为至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、或甚至至少50％或更多。本发明描述了用于比较丝状真菌细胞发酵液的粘度的方法。

如本文所用，丝状真菌细胞的“粘度降低”变异株是指产生这样的细胞发酵液的变异株，该细胞发酵液与亲本株产生的等价细胞发酵液相比具有减少的粘度(即减少的对剪切或拉伸应力的抗性)。优选地，关于粘度的任何直接或间接量度，粘度改变的变异株与亲本株之间的差别为至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、或甚至至少50％或更多。

如本文所用，“溶氧”(DO)是指以体积/体积单位测量的液体培养基中存在的氧(O₂)量。在整个发酵过程中，溶氧水平可维持在高的水平，例如170-100％至20％之间、100-80％至20％之间、70％至20％之间、65％至20％之间、60％至20％之间、55％至20％之间、50％至20％之间、45％至20％之间、44％至20％之间、43％至20％之间、42％至20％之间、41％至20％之间、40％至20％之间、35％至20％之间、30％至20％之间以及25％至20％之间。具体地讲，溶氧可在发酵开始时高并且允许随着发酵进行而下降。溶氧水平可通过搅拌(例如搅动)发酵物的速率和/或通过添加空气或氧气的速率来控制。可以400-700rpm搅拌(如搅动)培养物并且通过改变空气或氧气流量和叶轮速度将溶氧水平维持在高于20％、高于25％、高于30％、高于35％、高于40％、高于45％、高于50％和高于55％或更高。

如本文所用，“主要遗传定子”是指基因或其遗传操作，该基因或其遗传操作是在缺少其他基因或其他基因的遗传操作的情况下赋予指定表型所必要且充分的。然而，特定基因是赋予指定表型所必要且充分的并不排除可通过进一步的遗传操作实现对表型的附加影响的可能性。

如本文所用，“功能性多肽/蛋白质”为具有活性，例如酶活性、结合活性、表面活性性质等，并且尚未被诱变、截短或以其他方式修饰来废止或降低该活性的蛋白质。如所指定的，功能性多肽可以是热稳定性的或不耐热的。

如本文所用，“功能性基因”为能够被细胞组分用于产生活性基因产物、通常是蛋白质的基因。功能性基因是被破坏的基因的对立物，被破坏的基因被修饰而使得它们不能被细胞组分用于产生活性基因产物，或者具有降低的被细胞组分用于产生活性基因产物的能力。

如本文所用，如果变异株与亲本株之间蛋白质的表达差异小于约20％、小于约15％、小于约10％、小于约7％、小于约5％、或甚至小于约3％，则相比于亲本株，变异细胞“维持或保持高的蛋白质表达和/或分泌水平”。

如本文所用，如果宿主细胞已通过遗传方式或化学方式改变而防止产生表现具有野生型蛋白质的特征性活性、尤其是促进菌丝伸长或以其他方式增加液体培养物中丝状真菌的粘度的活性的功能性蛋白质/多肽，则宿主细胞已经“经过修饰而防止产生规定的蛋白质”。这类修饰包括但不限于缺失或破坏编码该蛋白质的基因、修饰该基因而使得所编码的多肽缺少上述活性、修饰该基因以影响翻译后加工或稳定性、以及它们的组合。

如本文所用，“所关注的蛋白质”为期望在丝状真菌细胞的深层培养中产生的蛋白质。一般来讲，所关注的蛋白质在商业上对于工业用途、医药用途、动物健康用途以及食品和饮料用途而言是重要的，从而使得期望它们大量产生。所关注的蛋白质应区别于丝状真菌细胞表达的无数其他蛋白质，这些其他蛋白质通常不是所关注的产品并且主要视为本底蛋白质污染物。

如本文所用，如果相比于亲本株产生的蛋白质的量，变异株产生的蛋白质的量减少不超过20％、不超过15％、不超过10％、甚至不超过5％，则变异株每单位量生物质产生与亲本株“基本上相同的量”的蛋白质，其中蛋白量被归一化至从中测定蛋白质产量的细胞的生物质总量，其中生物质可以湿重(如细胞团块)或干重表示。

如本文所用，如果相比于亲本株，变异株产生的蛋白质的量增加至少5％、至少10％、至少15％或更多，则变异株每单位量生物质产生比亲本株“基本上更多的蛋白质”，其中蛋白量被归一化至从中测定蛋白质产量的细胞的生物质总量，其中生物质可以湿重(如细胞团块)或干重表示。

如本文所用，“荧光染料”为发荧光的染料。优选的荧光染料与真菌细胞壁中的纤维素和/或几丁质结合。

如本文所用，单数冠词“一个”、“一种”和“所述”涵盖多个指代物，除非上下文明确指明不是这样。特此以引用的方式将本文所引用的所有参考文献全文并入本文。如下缩写/首字母缩写具有如下含义，除非另外规定：

III.Gasl蛋白产量改变的丝状真菌菌株

在一个方面，提供衍生自亲本株的丝状真菌变异株，该变异株包含遗传变更，与亲本株相比该遗传变更引起变异株的细胞产生改变量的功能性Gasl蛋白。变异株的细胞随后在深层培养有氧发酵期间，与亲本株的细胞相比，产生出需要改变的搅拌量来维持预选的溶氧量的细胞发酵液，或产生出在预选的搅拌量下维持改变的溶氧量的细胞群。

在一些情形下，与亲本株的细胞相比该遗传变更引起变异株的细胞产生降低量的功能性Gasl蛋白，并且与亲本株的细胞相比所得的细胞发酵液需要减少的搅拌来维持预选的溶氧量或在预选的搅拌量下维持更高的溶氧量。在这些情形中，据信与亲本株的细胞群相比，变异株的细胞群表现具有降低的粘度，这是造成与溶氧量和搅拌相关的观察结果的原因，如实例中所述。

功能性Gasl蛋白的量的降低可由破坏亲本株中存在的gasl基因引起。因为破坏gasl基因是将粘度降低表型赋予变异株的主要遗传定子，所以这类变异株仅需要包含破坏的gasl基因，而所有其他基因可保持完整。在一些情形中，与衍生变异株的亲本株相比，该变异株可任选包括另外的遗传变更。这种另外的遗传变更不必赋予粘度降低，但可进一步降低粘度或为变异株赋予其他优点。

破坏gasl基因可用基本上防止功能性gasl基因产物即Gasl蛋白表达的任何合适方法进行。本领域技术人员已知的示例性破坏方法包括但不限于：完全或部分缺失gasl基因，包括完全或部分缺失例如Gasl编码序列、启动子、终止子、增强子或另一调控元件；和完全或部分缺失包括gasl基因的任何部分的染色体的一部分。破坏gasl基因的具体方法包括在gasl基因的任何部分(例如，Gasl编码序列、启动子、终止子、增强子或另一调控元件)中产生核苷酸置换或插入。优选地，通过利用序列特异性分子生物学技术通过遗传操作(与通过化学诱变相反，化学诱变通常不靶向特定的核酸序列)进行缺失、插入和/或置换(统称突变)。然而，可将化学诱变用于破坏gasl基因。

gasl基因中的突变可降低gasl启动子的效率、降低gasl增强子的效率、干扰gaslmRNA的剪接或编辑、干扰gaslmRNA的翻译、将终止密码子引入Gasl编码序列中以防止全长Gasl蛋白的翻译、改变Gasl蛋白的编码序列以产生活性较低或失活的蛋白质或降低Gasl与其他核蛋白组分的相互作用、改变Gasl蛋白的编码序列以产生较不稳定的蛋白质或靶向该蛋白质进行破坏、引起Gasl蛋白错误折叠或未经正确修饰(例如，通过糖基化进行的修饰)或干扰Gasl蛋白的细胞运输。

在一个实施例中，这些及其他遗传操作是为了降低或防止功能性Gasl蛋白的表达，或者降低或防止Gasl蛋白的正常生物活性，从而产生会导致粘度降低表型的形态改变。

在其它情形中，遗传变更增加或恢复功能性Gasl蛋白的表达，或者增加Gasl蛋白的正常生物活性，从而产生会导致粘度增加或恢复的表型的形态改变。增加或恢复Gasl功能的示例性遗传变更是将增加拷贝的gasl基因引入细胞、增加gasl启动子、增强子或其他控制元件的效率、增加编码Gasl蛋白的mRNA的翻译、增加编码Gasl蛋白的mRNA的稳定性、在gasl基因中引入增加Gasl蛋白的活性或稳定性的改变、在gasl基因中引入调节与其他蛋白质或核酸等的相互作用的改变的那些。其他增加或恢复Gasl功能的遗传变更是能使会降低或防止功能性Gasl蛋白表达的遗传变更的效果发生逆转的那些。

用于所述的操作和用途的丝状真菌细胞通常来自子囊菌门盘菌亚门，尤其是具有营养菌丝状态且包含gasl基因的同源物的真菌。这种生物体包括用于生产商业上重要的工业用和医药用蛋白质的丝状真菌细胞，包括但不限于木霉属物种、曲霉属物种、镰刀菌属物种、足放线病菌属物种、青霉属物种、金孢子菌属物种、头孢霉属物种、篮状菌属物种、Geosmithia属物种和链孢霉属物种。具体的生物体包括但不限于里氏木霉(此前分类为长梗木霉或红褐肉座菌)、曲霉菌曲霉、烟曲霉、解乌头酸曲霉、米曲霉、构巢曲霉、土曲霉、酱油曲霉、日本曲霉、多育赛多孢、粗糙脉孢霉、绳状青霉、产黄青霉、埃默森篮状菌、腐皮镰刀菌和Chrysosporiumlucknowense。

Gel/Gas/Phr家族的真菌β(1，3)-葡聚糖基转移酶通过加工主要组分β(1，3)-葡聚糖在细胞壁生物合成中起重要作用(Popolo等人，2008)。Gasl(PID22914)编码β-1，3-葡聚糖基转移酶，该酶为能够分解和连接β-1，3-葡聚糖的GPI(和/或葡聚糖)-锚定蛋白。在许多真菌基因组中存在多种旁系同源物，包括里氏木霉，其具有五种旁系同源物。单独的研究已经显示，gasl基因(或如烟曲霉中已知的gell基因)的突变影响真菌细胞壁结构，并且可导致形态改变以及对荧光增白剂(Calcofluor White)、刚果红和十二烷基硫酸钠的超敏性(Schirawski，J.等人，2005；Mouyna，I.等人，2005)。本公开提供了Gasl与改变的形态相关的实验证据。

不希望受理论的限制，据信丝状真菌中gasl表达和/或活性的改变会干扰细胞壁合成，从而产生更紧凑的细胞形态，该形态表征为较短菌丝和外观更像酵母。

里氏木霉Gasl(jgi|Trire2|22914)蛋白的预测氨基酸序列在下面作为SEQ ID NO：1示出：

MSLSKLSVSLLALAGSAIAGDLPSITAKGSKFFYPNGTQFFIKGVAYQQDVGQAGSTDSSTSTFIDPLSSEANCKRDVPLLKQLGTNVIRTYAIDPKADHSACMKLLNDAGIYVFSDLGEPSLSINRDTPAWNTELFDRYKAVVDEMSQYPNVIGYFAGNEVSNAKNNTGASAYVKAAVRDTKAYIKSKKYRWQGVGYAANDDVDIRAEIADYFNCGDQDEAIDFWGYNIYSWCGQSSMQKSGYDEQTTFFSNYSVPVFFAEYGCNLPSGAAARIFQETAALYSDEMTKVFSGGIVYMYFEEDNDYGLVKVNNGAVSKLKDFSALQTQVTKADPKGVDADDYKPTNKPASCPALTDDWQAINSLPPTPDASLCTCMQSSLSCVHADDLDTKDFGDIFGFTCGKSPEVCAGINGDPSTGVYGAYSMCEDAAKLDYVLDAYYQSQKKASTACDFNGQAQVVSPKAASTCSAALASASAINKQAATATAPVGAGSTSGSKGAATSTNAAVAGRPVSHLLSMGEISVALYMGVAMLAGGAMIVL

尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)Gasl蛋白的氨基酸序列在下面作为SEQ ID NO：2示出：

MKFSAAIVAAAATAASAKLEPITMKGSKLFYSNGTQFFMKGVAYQQDTAAAGETNDKTTKYIDPLADEEACKRDIPLLKQLGTNIIRTYAINPKADHKACMKLLDAGIYVISDLSEPSVSINRDDPKWDVELYERYIGVVDELGQYDNVVGFFAGNEVSNNVSNTQASAFVKAAVRDTKKHIKSKFSRWLGVGYASNDDVDIREQIADYFNCGDDDSRIDYWGYNIYSWCGKSSMQDSGYSDQAKFFEDYSVPVFFAEYGCNEPDGAAGRIFDETTALYEEKVMTDVFSGGIVYMYFQEANDYGLVKISKNGDAVKQKDFAQLQKKANAAKPSGVEEDSYKPTGKAATCPEQSKNWKANSVLPPVPDSDLCDCMVKSRSCVPADNLKAKDFNDIFGYICGQDKKICTAINANATAGIYGAYSMCSNEAKLAYILDAYYTSQKSAADACDFKGKATTQKAESQDSCKSALASASKINEEVATATHAVASSSTGGSNSSSEDDENFGLQAASIARVFSLGDFAVGAYMAVAGVVGAGMVLL

黑曲霉CBS513.88Gel3(Gasl)蛋白的氨基酸序列在T面作为SEQ IDNO：3示出：

MKLSLAVGAALMGSALAVDIDPIVIKGSKFFYSSNNTQFYIRGVAYQDDYTGNSSSGYTDPLANPTLCKRDIPILQELNTNVIRVYAIDPTKDHTTCMNLLAAAGIYVISDLSDPTQSIDRSDPTWETSLYTRYTNVIDELIQYNNTLAFFAGNEVSNDVATTDASAFVKAAVRDMKAYIKSQGYRSIGVGYATNDDSDIRVNMADYFNCGSEDESIDFWGYNIYSWCGDSSYTKSGYDERTEEFRNYSVPVFFSEYGCNTVQPRKFTDIKALFGDQMNDVWSGGIVYMYFQTDNDYGLVSAIDSTSVSKLADFTYYSSQIASATPSGTNKASYTPTNTALQSCPAVTSKSWLATSSPLPPTPNQELCTCMDNASGCVVKDSVSSSDYDDLFSTVCGFTSCDGIFHNGTTGTYGAYSMCGAKQQLNFVLDKYWKEQGKKADACGFDGSATTTATVKATGTCSALMKEAGTAGTGTVTSKPTGTAAGSSSASGTGGVSAVGSGSAIISIGAWQVGAYVVTGVVAGLGMVLL

米曲霉RIB40Gel3蛋白的氨基酸序列在下面作为SEQ ID NO：4示出：MKLSSIVAGASLFASSVIAADLDPIIIKGSKFFYKSNDTQFYIRGVAYQQEYSGPDSSANSFKDPLADADACKRDVPYLEKLGTNTIRVYAIDPKSDHKECMSLLSDAGIYVIADLSSPGDSINRNEPKWDNDLYNRYVTVVDELSQYSNVIGFFAGNEVSNSENTTSASAFVKAAVRDTKQYIKAKNYRSMGVGYATSDDSSIRKNMANYFNCNGADDSIDFWGYNVYSWCGDSNYEKSGYASRTEEFKDYTVPVFFAEYGCNAVQPRKFTEVQALYGDKMADVWSGGIVYMYFQEENNYGLVSVDGNKVSTKADFSYLSKCELASATPSGTKKGDYQPTNTALQSCPTVDDKWLATSSPLPPSPNQDLCSCMEESLSCALKDKVSGEQLDKLFGTVCGYDVCDGITTNATTGKYGAYSVCTPQQQLSYAINLYYQNQKAKGNGDKACDFNGAATTQSSKSGGSACSALLKEAGTSGTGTVTSSPTGTAGSGASDGAAASSSGSAGGLVAPSSVNVGIFQLGAYVVTAMVAGAGMIVL

串珠状赤霉(Gibberella moniliformis)Gasl蛋白的氨基酸序列在下面作为SEQ ID NO：5示出：

MKFSAAIVAAAATAASAKLEPITMKGSKLFYSNGTQFFMKGVAYQQDTAAAGQTNTKETKYIDPLADEDACKRDIPLLKQLGTNIIRTYAIDPTADHKACMKLLDDAGIYVISDLSEPSVSINRDDPKWDVELYERYIGVVDELGQYDNVVGFFAGNEVSNNVSNTEASAFVKAVVRDTKKHIKSKFSRWLGVGYASNDDVDIREQIADYFNCGDDDSRIDYWGYNIYSWCGKSSMEDSGYTDQAKFFENYSVPVFFAEYGCNEPDGAAGRIFDETTALYDEKIMTEVFSGGIVYMYFQEANDYGLVKINKNDDAVKLKDFSALQSKVNAAKPTGVEEDSYKPTGKAATCPEQSKNWKANSVLPPVPDSDLCDCMVKSRSCVPADNLKAKDFNDIFGYICGQDKKICTAINANATAGIYGAYSMCSDEAKLAYILDAYYVSQKSAADACDFKGKATTQKAESQSSCSSALASASKINEEVATATHAVASESTGGTNSSSEDDENFGLQAASIARVFSLGDFAVGAYMAVAGIVGAGMVLL

在本发明组合物和方法的一些实施例中，产量水平被改变的Gasl蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：1、2、3、4或5具有指定程度的总氨基酸序列同一性，例如，与SEQ ID NO：1、2、3、4或5具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或甚至至少约99％的同一性。编码每条氨基酸序列的核苷酸序列可从BLAST搜索每一相应的蛋白质来鉴别，如本领域技术人员已知的。

在本发明组合物和方法的一些实施例中，被破坏的gasl基因编码与SEQ ID NO：1、2、3、4或5的氨基酸序列具有指定程度的总氨基酸序列同一性的Gasl蛋白，例如，与SEQ ID NO：1、2、3、4或5具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或甚至至少约99％的同一性。

本文提供的氨基酸序列信息容易使得技术人员能鉴别任何丝状真菌中的Gasl蛋白和编码Gasl蛋白的核酸序列，以及能在gasl基因中做任何适当的破坏以影向Gasl蛋白的产生。编码SEQ ID NO：1、2和3的多核苷酸序列可在GenBank或JGI数据库中找到，如本领域技术人员已知的。

在另一方面，提供了改变丝状真菌细胞的形态的方法。与亲本细胞生长和细胞发酵液粘度相比，变异丝状真菌细胞在固体培养基上表现出改变的生长形态并且在深层培养中培养时产生具有不同粘度的细胞发酵液。

在一些情形中，该方法包括利用合适的遗传方法破坏亲本株中的gasl基因，其中在有氧发酵过程中与亲本株的细胞相比，gasl破坏的变异株在深层培养有氧发酵过程中产生的细胞发酵液需要减少的搅拌量来维持预选的溶氧量，或在预选的搅拌量下维持增加的溶氧量。这类方法可用于以上文及别的地方所述的任何方式破坏gasl基因，如本领域技术人员已知的。优选地，利用序列特异性的分子生物学方法(与化学诱变相反，化学诱变通常不靶向特定的核酸序列)通过遗传操作进行gasl基因的破坏。然而，化学诱变也可以用于实现令人满意的结果。

在一些实施例中，粘度降低表型被引入其中从而产生粘度降低菌株的亲本株已包含旨在以高水平表达的所关注的基因。这样，本发明方法避免了将所关注基因引入预先存在的粘度降低菌株来进行生产的需要。因而，本发明方法可用于从已包含所关注的基因的亲本株产生丝状真菌细胞的粘度降低变异株。

VI.实用性

已知丝状真菌的粘度降低菌株可用于改善深层培养物中的氧气和营养物质的分布、降低搅拌深层培养物所需的能量量以及增加培养物中存在的细胞群，从而导致蛋白质产量增加。此外，本发明的丝状真菌变异株提供优于以前描述的粘度降低菌株的明显优势。

第一，本发明的变异株可具有完全确定的基因组，从而使得它们十分适于后续的遗传操作、互补、交配等。第二，本发明菌株的蛋白质产生不受不利影响，例如不受导致伴随的粘度变更的操作的影响。第三，粘度降低菌株可基本上从任何亲本株产生，包括已产生期望高水平表达的蛋白质(即所关注的蛋白质)、已编码选择性标记或已包含在生产宿主中理想的其他特征的亲本株。因而，本发明菌株和方法消除了将编码所关注的蛋白质的基因转移进预先存在的粘度降低的生产菌株中的需要。

本发明的菌株和方法可用于在丝状真菌的深层培养物中生产商业上重要的蛋白质。商业上重要的蛋白质包括例如纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶、裂解酶、蛋白酶、激酶、淀粉酶、支链淀粉酶、脂肪酶、酯酶、过水解酶、转移酶、漆酶、过氧化氢酶、氧化酶、还原酶、叶绿素酶、疏水蛋白、凝乳酶、碳酸酐酶、胸苷酸合酶(hymidylate synthase)、二氢叶酸还原酶、酪氨酸激酶、多药耐药蛋白(如ABC P-gp蛋白)、CAD(氨甲酰磷酸合酶、天冬氨酸转氨甲酰酶、二氢乳清酸酶)、拓扑异构酶、核糖核苷酸还原酶和抗体以及能够在丝状真菌中表达的其他酶和非酶蛋白质。这类蛋白质可适合于工业、医药、动物健康以及食品和饮料用途。

下列带编号的段落进一步描述了本发明组合物和方法的多个方面和实施例：这些带编码的段落每一者的主题可单独使用或与任何其他带编号的段落的主题结合使用，如所指出的那样。

1.在一个方面，提供了衍自亲本株的丝状真菌变异株，该变异株包含能使变异株的细胞与亲本株的细胞相比产生改变量的功能性Gasl蛋白的遗传变更，其中变异株的细胞在深层培养有氧发酵过程中，(i)与亲本株的细胞相比，产生出需要改变的搅拌量来维持预选的溶氧量的细胞肉汤，和/或(ii)与亲本株的细胞相比，产生出在预选的搅拌量下维持改变的溶氧量的细胞肉汤。

2.在段落1的变异株的一些实施例中，功能性Gasl蛋白的改变量为减少量，并且变异株在深层培养有氧发酵过程中，(i)与亲本株的细胞相比，产生出需要减少的搅拌量来维持预选的溶氧量的细胞发酵液，和/或(ii)与亲本株的细胞相比，产生出在预选的搅拌量下维持增加的溶氧量的细胞发酵液。

3.在段落1或2的变异株的一些实施例中，所述遗传变更包括亲本株中存在的gasl基因的破坏。

4.在段落3的变异株的一些实施例中，破坏gasl基因是缺失gasl基因的全部或部分所致。

5.在段落3的变异株的一些实施例中，破坏gasl基因是缺失包含gasl基因的基因组DNA的一部分所致。

6.在段落3的变异株的一些实施例中，破坏gasl基因是诱变gasl基因所致。

7.在段落3-6中任一者的变异株的一些实施例中，破坏gasl基因是用位点特异性重组进行。

8.在段落3-7中任一者的变异株的一些实施例中，破坏gasl基因是与在gasl基因的遗传基因座处引入选择性标记相结合进行。

9.在段落1-8中任一者的变异株的一些实施例中，该变异株不产生功能性Gasl蛋白。

10.在段落1-8中任一者的变异株的一些实施例中，该变异株不产生Gasl蛋白。

11.在段落1-10中任一者的变异株的一些实施例中，该变异株还包含编码所关注的蛋白质的基因。

12.在段落1-11中任一者的变异株的一些实施例中，还包含sfb3基因的破坏。

13.在段落1-12中任一者的变异株的一些实施例中，还包含至少一个选自sfb3基因、sebl基因、mpgl基因、crzl基因和tps2的基因的破坏。

14.在段落1-13中任一者的变异株的一些实施例中，变异株每单位量生物质产生与亲本株基本上相同的量或更多的蛋白质。

15.在段落1-14中任一者的变异株的一些实施例中，丝状真菌为盘菌亚门物种。

16.在段落1-15中任一者的变异株的一些实施例中，丝状真菌为木霉属物种。

17.在段落1-16中任一者的变异株的一些实施例中，丝状真菌为里氏木霉。

18.在另一方面，提供了制备丝状真菌细胞的变异株的方法，该方法包括：将遗传变更引入丝状真菌细胞的亲本株中，与亲本株的细胞相比较该遗传变更改变了功能性Gasl蛋白的产生，从而产生变异丝状真菌细胞，该变异丝状真菌细胞在深层培养有氧发酵过程中，(i)与亲本株的细胞相比，产生出需要改变的搅拌量来维持预选的溶氧量的细胞发酵液，和/或(ii)与亲本株的细胞相比，产生出在预选的搅拌量下维持改变的溶氧量的细胞发酵液。

19.在段落18的方法的一些实施例中，遗传变更减少或防止功能性Gasl蛋白的产生，从而产生变异丝状真菌细胞，该变异丝状真菌细胞在深层培养有氧发酵过程中，(i)与亲本株的细胞相比，产生出需要减少的搅拌量来维持预选的溶氧量的细胞发酵液，和/或(ii)与亲本株的细胞相比，产生出在预选的搅拌量下维持增加的溶氧量的细胞发酵液。

20.在段落18或19的方法的一些实施例中，遗传变更包括利用遗传操作破坏亲本丝状真菌细胞中的gasl基因。

21.在段落18-20中任一者的方法的一些实施例中，遗传变更包括利用遗传操作缺失亲本丝状真菌细胞中的gasl基因。

22.在段落18-21中任一者的方法的一些实施例中，遗传变更利用位点特异性遗传重组来进行。

23.在段落18-22中任一者的方法的一些实施例中，破坏gasl基因是与在gasl基因的遗传基因座处引入选择性标记相结合进行。

24.在段落18-23中任一者的方法的一些实施例中，破坏gasl基因是与破坏sfb3基因相结合进行。

25.在段落18-24中任一者的方法的一些实施例中，破坏gasl基因是与破坏至少一个选自sbfl基因、sebl基因、mpgl基因、crzl基因和tps2基因的基因相结合进行。

26.在段落18-25中任一者的方法的一些实施例中，变异株每单位量生物质产生与亲本株基本上相同的量或更多的蛋白质。

27.在段落18-26中任一者的方法的一些实施例中，丝状真菌为盘菌亚门物种。

28.在段落18-27中任一者的方法的一些实施例中，丝状真菌为木霉属物种。

29.在段落18-28中任一者的方法的一些实施例中，丝状真菌为里氏木霉。

30.在段落18-29中任一者的变异株的一些实施例中，亲本株还包含编码所关注的蛋白质的基因。

31.在段落30的方法的一些实施例中，在引入所述减少或防止功能性Gasl蛋白的产生的遗传变更之前，编码所关注的蛋白质的基因存在于亲本株中。

32.在另一方面，提供了由段落11的变异株产生的所关注的蛋白质。

33.在另一方面，提供了通过段落18-31中任一者的方法产生的丝状真菌的变异株。

34.在另一个方面，提供衍自亲本株的丝状真菌变异株，该变异株包含：

(a)遗传变更，所述遗传变更导致(i)与所述亲本株的细胞相比，在深层培养物中需要减少的搅拌量来维持预选的溶氧量，和/或(ii)与所述亲本株的细胞相比，在预选的搅拌量下维持深层培养物中增加的溶氧量，和

(b)编码所关注的蛋白质的基因，其中在(a)中的遗传变更之前所述编码所关注的蛋白质的基因存在于该变异株中。

35.在段落34的变异株的一些实施例中，遗传变更包含亲本株中存在的gasl基因的破坏。

36.在段落35的变异株的一些实施例中，破坏gasl基因是与在gasl基因的遗传基因座处引入选择性标记相结合进行。

37.在段落35或36的变异株的一些实施例中，破坏gasl基因是与破坏至少一个选自sfb3基因、sebl基因、mpgl基因、crzl基因和tps2基因的基因相结合进行。

38.在段落35-37中任一者的变异株的一些实施例中，破坏gasl基因是与破坏sebl基因相结合进行。

根据本说明，本发明菌株和方法的这些及其他方面和实施例对技术人员将是显而易见的。如下实例旨在进一步举例说明(但不限制)所述菌株和方法。

实例

实例1.从里氏木霉突变体Morph77B7缺失gasl基因

里氏木霉Morph菌株缺失四个主要的纤维素酶基因，包括cbhI、cbhII、egII和egIV，这使得其特别适于在缺少纤维素酶本底或在减少的纤维素酶本底的情况下表达其他蛋白质。参见WO05/001036。

A.产TrGA菌株Morph77B7

此前将上述Morph菌株用处于CBH1启动子控制下的天然木霉葡糖淀粉酶基因(TrGA)进行了转化，amdS用作标记。随后分离含有两个串联拷贝的葡糖淀粉酶(TrGA29-9)的转化株，并将随机化学诱变用于产生突变体(77B7)。随后通过5-氟-乳清酸(FOA)选择分离自发的pyr2突变衍生物。

B.gasl破环盒的产生

从突变体Morph77B7缺失里氏木霉gasl(PID22914)。使用标准的分子生物学程序制备gasl破坏盒质粒pRATT247(图1)。该质粒包括具有一2.6Kb区的DNA序列(左旁侧序列)，该区与5′非翻译区上游55bp的DNA序列及邻接的上游序列同源。该质粒中还包括的是具有一2.7Kb区的DNA序列(右旁侧序列)，该区域与跨越gasl基因的第二个外显子的一部分的DNA序列及邻接的下游序列同源。这些序列设计用于靶向gasl基因并用间插盒序列置换基因组在所述左旁侧序列和右旁侧序列之间的区域(Scaffold 18上的区域182010至182428(JGI里氏木霉基因组数据库v2))。这些间插序列包括来自深绿木霉(Trichoderma atroviride)的pyr2选择标记，旨在使与待转化菌株的基因组中的内源性里氏木霉pyr2的同源性最小。紧邻该pyr2选择标记上游的是该标记3′端的同向重复副本，其有利于后续失去该标记以及分离转化株/破坏株(disruptant)的有用pyr2突变衍生物。通过PCR使用引物RPG111和RPG381扩增该gasl破坏盒。汇集多份PCR反应物并用标准的分子生物学程序纯化以用于后续步骤。

gasl基因的核酸序列获自JGI数据库：蛋白质ID：22914，名称：estExt_fgeneshl_pm.C_180019，可得自http：//genome.Jgi-psf.org/cgi-bin/dispGeneModel?db＝Trire2&id＝22914，(The Genome Portal of theDepartment of Energy Joint Genome Institute(美国能源部联合基因组研究所)I.V.Grigoriev，H.Nordberg，I.Shabalov，A.Aerts，M.Cantor，D.Goodstein，A.Kuo，S.Minovitsky，R.Nikitin，R.A.Ohm，R.Otillar，A.Poliakov，I.Ratnere，R.Riley，T.Smirnova，D.Rokhsar和I.Dubchak.Nucleic Acids Res(《核酸研究》)20110：gkr947v1-gkr947)，如下所公开的。非翻译区用斜体表示，并且5’和3’旁侧为上游或下游序列，编码序列为粗体，内含子为小写字母(SEQ ID NO：12)：

TCTGCTCCAGGGCGCCGCTTGAAAGGAGCAGACCTCTTTTCGCATCTTTCTTTTTTGCTTTTGCAACTTAATTCATCAGTCCTTTTTGACATCGTTTTTTTTGAGGGCGGCCGCCTCGCACAGTTCTGGCCTTTCAGTCACTCCTTAAGACAAACAACCATCATTTACATTCTATATCGTTCCTTGACGCCTTTTTGAATCTCTTCGTCGCCTGACCGAGCACGAGAAGCACACGTCCAATCGCTACAGCATCAACTCAAGAACCGCAAGTTTCACGACTACTTTCACCAGAACCGCCAAGATGAGCTTGTCCAAGCTCTCCGTCTCCCTGCTCGCACTGGCTGGCAGCGCCATTGCTGGCGATCTCCCGTCCATCACGGCCAAGgtgagccacttttcgtccccagagtttccctcgtctcgaacgggagatcagagagctgtccgagggatcgaacaaacgatcagcaaccgtgagatcagcccgctaatcgaccatctttccgacttgtagGGCTCCAAGTTCTTCTACCCCAACGGCACCCAGTTCTTCATCAAGGGTGTTGCGTACCAGCAGGATGTTGGCCAGGCCGGAAGCACCGACTCCAGCACCTCGACCTTCATCGACCCCCTCTCCAGCGAGGCCAACTGCAAGCGTGACGTCCCTCTGCTGAAGCAGCTGGGCACCAACGTGATCCGAACCTACGCCATCGACCCCAAGGCCGACCACTCCGCCTGCATGAAGCTGCTCAACGATGCCGGCATCTACGTCTTCTCCGACCTGGGCGAGCCCTCTCTGTCCATCAACCGTGACACCCCTGCCTGGAACACCGAGCTGTTCGACCGCTACAAGGCCGTCGTCGACGAGATGTCCCAGTACCCCAACGTCATCGGCTACTTCGCCGGTAACGAGGTGAGCAACGCCAAGAACAACACTGGCGCCTCCGCCTACGTCAAGGCCGCTGTCCGCGACACCAAGGCCTACATCAAGTCCAAGAAGTACCGCTGGCAGGGTGTCGGCTACGCCGCCAACGACGATGTCGACATTCGTGCCGAGATTGCCGACTACTTCAACTGCGGTGACCAGGATGAGGCTATCGACTTCTGGGGCTACAACATCTACTCGTGGTGTGGCCAGAGCTCCATGCAAAAGTCCGGCTACGACGAGCAGACCACCTTCTTCTCCAACTACTCTGTCCCCGTCTTCTTCGCCGAGTACGGCTGCAACCTGCCCAGCGGCGCCGCTGCCCGTATCTTCCAGGAGACTGCTGCTCTGTACTCTGACGAGATGACCAAGGTCTTTAGCGGTGGTATTGTCTACATGTACTTTGAGGAGGACAACGACTATGgtaggtggtcattcttatgactgaacttcagcagggtcgctaacacgtttcccagGTCTCGTCAAGGTCAACAACGGCGCCGTCTCCAAGCTCAAGGACTTCAGCGCTCTCCAGACCCAGGTTACCAAGGCCGACCCCAAGGGTGTTGACGCCGATGACTACAAGCCCACCAACAAGCCCGCCAGCTGCCCTGCCCTGACCGACGACTGGCAGGCCATCAACAGCCTTCCCCCCACCCCTGATGCCAGCCTTTGCACTTGCATGCAGAGCTCTCTGTCCTGCGTTCACGCCGACGACCTCGACACCAAGGACTTTGGCGACATCTTCGGCTTCATCTGCGGCAAGTCCCCCGAGGTCTGCGCTGGCATCAACGGTGACCCTTCCACTGGTGTCTACGGCGCCTACAGCATGTGCGAGGACGCCGCCAAGCTCGACTACGTCCTTGACGCCTACTACCAGTCCCAGAAGAAGGCCTCCACCGCCTGCGACTTCAACGGCCAGGCTCAGGTCGTCAGCCCCAAGGCCGCCTCCACCTGCTCTGCCGCCCTGGCCTCTGCCAGCGCCATCAACAAGCAGGCCGCCACTGCCACCGCCCCCGTCGGTGCCGGTTCCACCTCTGGCAGCAAGGGCGCTGCCACCAGCACCAACGCTGCTGTTGCCGGCCGCCCTGTTTCCCACCTGCTCAGCATGGGCGAGATCTCCGTTGCCCTGTACATGGGTGTCGCCATGCTGGCCGGTGGTGCCATGATTGTCCTGTAAAGGGGATAGTCCGAGGGCCTGTTTGTTTTAAAAATTTCTGCCGGGTTTTTTGTATGTAGATTGGAGGTTCTTTTATAGGAAAGTGAAATAATTCATTGTTTTTGGTTCTTGATCATTCTTCTGTTTTTTATTAGAGCGGTTCTTTTTCTCTTGGGAACGAAGCTTTTTCTTTCTTCGATTGCTAGAGGCATCTTTTGGGTTGCGTGTCATGCGGCTTGCGCTATTAGAACGGATGGTCTTGATAGCACTTATTGACTTTTATGATTCTTGATATTTACCCCCTTGGACCACTTTCATCATAGCATGTATGAAAAC

C.菌株Morph77B7Δgasl的产生

利用PEG介导的转化用所述gasl破坏盒转化菌株Morph TrGA77B7Δpyr2，并涂布接种于含有山梨醇的Vogel氏基本培养基上以根据通过pyr2标记获得的尿苷原养型选择候选者。分离单独的转化株并通过转移至Vogel氏基本培养基进行繁殖。将PCR分析用于鉴别其中gasl破坏盒通过同源重组在gasl基因座处整合的转化株。通过用两个引物对扩增具有预期大小的DNA片段来确认Δgasl破坏盒子在gasl基因座处的同源整合。引物对RPG392和RPG253扩增了从该破坏盒区的5′端的外侧开始并在3′区内结束的DNA片段。引物对RPG393和RPG273扩增了在该破坏盒的5′区内开始并在该破坏盒的3′端外侧结束的DNA片段。将所产生的具有确认的gasl破坏盒同源整合的菌株命名为Morph77B7Δgasl。

表1：实例1中所用的引物

观察到由上述程序获得的Morph77B7Δgasl在液体培养中具有改变的形态，具有比Morph77B7亲本短的菌丝。在液体培养基中，与含有Morph77B7亲本的培养物相比，含有Morph77B7Δgasl突变体的培养物在培养过程中也显示出较高的溶氧水平(表2)。

将菌株Morph77B7和Morph77B7Δgasl在深层(液体)培养中于相似条件下培养，并比较它们的生长表型。简而言之，将每种菌株的孢子独立地添加至具有侧挡板和底挡板二者的3L烧瓶中的500mL基础培养基。在高压灭菌30分钟后，添加无菌60％葡萄糖至27.5g/L的终浓度。将培养物在振荡培养箱中于34℃培养48小时。

48小时后，将每个烧瓶的内容物独立地添加至容纳有9.5L培养基的14L发酵罐中，该培养基含有4.7g/L KH₂PO₄、1.0g/L MgSO₄·7·H₂O、4.3g/L(NH₄)₂SO₄和2.5mL/L相同痕量元素溶液。将这些组分在121℃下一起加热灭菌30分钟。将60％葡萄糖和0.48％CaCl₂·2·H₂O单独高压灭菌、冷却并添加至发酵罐至终浓度为75g/L葡萄糖和0.6g/L CaCl₂·2·H₂O。用28％NH₃将该培养基调节至pH3.5并在整个培养阶段将温度维持在34℃。

当在顶部空间没有增添的压力时将溶氧(DO)探针校准至100％(即0巴表压，1巴绝对压力)。然后将顶部空间中的压力设定为0.7巴(表压)，之后在添加接种培养物之前该氧探针读数为170％。该发酵罐容纳有两个四叶涡轮，其通过最初设定为500rpm的变速马达提供混合。

当培养物生长时，DO含量水平下降，至少部分是由于丝状真菌菌丝增殖而引起的发酵液粘度增加的结果。当DO含量水平下降至低于40％时，增加搅拌速率以将DO含量水平维持在40％。达到750rpm搅拌时，将允许DO含量水平下降至低于40％。如果DO含量水平不下降至低于40％，则在发酵运行期间不必增加搅拌速率，并且初始搅拌速率高于必要速率。当葡萄糖完全消耗时，测量每个发酵罐中产生的生物质的量，发现对于两种菌株而言是基本上相同的。

在给定的搅拌水平下每个发酵罐中的DO含量水平，以及维持给定DO含量水平所需的搅拌量是由于不同的菌株生长表型引起的不同发酵液的粘度的间接量度。尽管仅变动一个变量(例如DO含量或搅拌)并测量另一个变量将是理想的，但希望防止DO含量水平下降至低于40％以确保在每个发酵罐中产生足够的生物质，从而使得能在不同菌株的生长特性之间进行更有意义的比较。

一般来讲，若有必要增加搅拌速率来维持目标DO含量水平，则可通过供应给驱动发酵罐涡轮的马达的功率量来估计搅拌量，其提供了与发酵液粘度相关的尺度。具体地讲，搅拌悬浮培养物所需的额外功率与搅拌速率的三次方成比例。

如表2中所示，与亲本Morph77B7相比，Morph77B7Δgasl的发酵液粘度降低。在间歇式培养阶段结束，当所有葡萄糖已消耗时，两种菌株均已达到类似的生物质浓度。到该间歇式培养阶段结束，看见Morph77B7对照菌株搅拌增加至616rpm，并且然后看到DO含量水平下降低至40％。菌株Morph77B7Δgasl不要求如此多的能量来实现相同的生物质浓度。搅拌速率从未增加至高于500rpm，并且％DO从未下降至低于115％。与Morph77B7相比，在Morph77B7Δgasl中蛋白质产量未受不利地影响(未示出)。

表2.Morph77B7与Morph77b7Δgasl相比的发酵液粘度

实例2.改变Sfb3、Sebl、Mpgl、Crzl和Tps2产量中的至少一者所产生的累加效果

A.破环sbf3时的粘度降低

Sfb3基因(也称为Lstl)之前只在出芽酵母(即酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))中得到表征，在出芽酵母中其编码与围绕运输小泡(其将蛋白质从内质网转运到高尔基体)的COPII外壳蛋白缔合的蛋白质。Sfb3以及Sfb2是Sec24的同源物，所有所述基因参与将特定货物蛋白质包装进小泡中。

如表3中所示，从菌株29-9Δsfb3破坏sfb3基因导致这样的菌株，该菌株在培养阶段结束时维持溶解氧处于40％所需的最高搅拌速率降低。在这些培养条件下，初始菌株(29-9)需要比70H2(化学诱变的29-9)或29-9Δsfb3菌株多2.6倍的功率来维持40％的DO和产生所述生物质量。菌株70H2和29-9Δsfb3在悬浮培养中具有相似的粘度特性，并且产生相似水平的所关注蛋白质(TrGA)，从而证明可通过破坏sfb3基因来给丝状真菌赋予粘度降低的生长表型。Sfb3蛋白的改变导致粘度改变还在于2011年8月25日提交的作为国际专利申请No.PCT/US2011/049164提交的、于2012年3月1日公布的PCT专利公开No.WO2012/027580A1中描述，将其以引用方式并入本文。

表3.生长期结束时维持DO为40%所需的搅拌速率

菌株	搅拌速率	相对于500rpm时的基线的相对功率增加
			29-9	750	(750/500)³＝3.4
70H2	539	(539/500)³＝1.3
			29-9Δsfb3	540	(540/500)³＝1.3

B.破环sebl时的粘度降低

来自深绿木霉的Sebl为STRE-元件-结合蛋白，并且据信sebl基因为酵母msn2/4基因和构巢曲霉msnA基因的直系同源物。要注意的是，sebl基因不能补足酵母中的msn2/4基因，所以可能不是功能性同源物(Peterbauer，C.等人((2002)Molecular Genetics and Genomics(《分子遗传学和基因组学》)268：223-31)。Sebl涉及渗透胁迫应答但非该应答所必需的，但是已发现与改变的形态(尤其是在破坏sebl时导致低粘度表型的那些形态)相关。关于sebl破坏的细节可见于2011年4月22日提交的美国临时专利申请No.61/478,160，将其以引用的方式全文并入本文。

如表4中所示，从菌株Morphl/lΔku80缺失sebl基因导致发酵液粘度降低的菌株。在间歇式培养阶段结束，当所有葡萄糖已消耗时，两种菌株均已达到类似的生物质浓度。到培养阶段结束，对照菌株见到搅拌增加至最大750rpm，然后见到DO下降低至29％。sebl缺失菌株不要求如此多的能量来实现相同的生物质浓度。搅拌速率从未增加至高于500rpm且DO仅下降低至55％。

表4.具有和不具有sebl基因的Morphl/1Δku80的发酵液粘度

C.破环mpgl时的粘度降低

mpgl基因编码GTP：a-D-甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶。mpgl基因的过表达可增加GDP-甘露糖水平，其可在蛋白质糖基化的早期阶段起主要调节作用。

如表5中所示，与亲本MAGI相比，MAGI10-8g(mpgl缺失型变异株)的发酵液粘度降低。在间歇式培养阶段结束，当所有葡萄糖已消耗时，两种菌株均已达到类似的生物质浓度。到培养阶段结束，MAGI对照菌株见到搅拌增加至最大750rpm，然后见到DO下降低至35％。菌株MAGI10-8g不要求如此多的能量来实现相同的生物质浓度。当％DO降低至40％时搅拌速率稍微增加至513rpm。与MAGI相比，MAGI10-8g中蛋白质产量未受不利地影响(未示出)。关于mpgl破坏的细节可见于2011年4月22日提交的美国临时专利申请No.61/478,162，将其以引用的方式全文并入本文。

表5.MAGI与MAGI10-8g相比的发酵液粘度

D.破坏crzl时的粘度降低

在真菌中，已显示钙调磷酸酶介导的Ca²⁺信号传导为许多生物体中的生长、发育以及毒力所需。其对于适应多样的环境条件(包括高的阳离子水平和碱性pH)而言是必要的。基因crzl编码钙调磷酸酶调节转录因子。当磷酸酶钙调磷酸酶被Ca²⁺/钙调蛋白激活时，Crzlp转录因子去磷酸化。其然后进入核并诱导许多基因表达，这些基因中的许多编码具有细胞壁相关功能的蛋白质(Yoshimoto等人，2002；Lagorce等人，2003；Garcia等人，2004；Karababa等人，2006；Pardini等人，2006；Munro，C.等人，2009)。缺失crzl或同源物可导致菌丝形态改变(Kothe，G.和Free，S.1998；Prokisch，H.等人1997)。

如上所述制备里氏木霉Morph菌株。从突变体Morph77B7缺失里氏木霉crzl(PID36391)。利用PEG介导的转化用crzl破坏盒转化菌株Morph TrGA77B7Δpyr2，并涂布接种于含有山梨醇的Vogel氏基本培养基上以根据通过pyr2标记获得的尿苷原养型选择候选者。如表6中所示，与亲本Morph77B7相比，Morph77B7Δcrzl的发酵液粘度降低。在间歇式培养阶段结束，当所有葡萄糖已消耗时，两种菌株均已达到类似的生物质浓度。到该间歇式培养阶段结束，看见Morph77B7对照菌株搅拌增加至616rpm，并且然后看到DO含量水平下降低至40％。菌株Morph77B7Δcrzl不要求如此多的能量来实现相同的生物质浓度。搅拌速率从未增加至高于500rpm，并且％DO从未下降至低于100。关于crzl破坏的细节可见于2011年4月29日提交的美国临时专利申请No.61,480,610，将其以引用的方式全文并入本文。

表6.Morph77B7与Morph77b7Δcrzl相比的发酵液粘度

E.破坏tpsl时的粘度降低

基因tps2编码涉及二糖海藻糖的合成的海藻糖-磷酸磷酸酶。海藻糖为胁迫诱导的糖，该糖可缓冲变性蛋白质在细胞质和ER中的重新折叠(Singer，M等人，1998；Simola，M等人，2000)。各种各样的生物体响应多种胁迫大量产生该二糖。在酵母中，海藻糖使高温下的蛋白质稳定并且帮助热损害的蛋白质重新折叠(Simola，M等人，2000)。

如上所述制备里氏木霉Morph菌株。从突变体Morph77B7缺失里氏木霉tps2(PID48707)。利用PEG介导的转化用tps2破坏盒转化菌株Morph TrGA77B7Δpyr2，并涂布接种于含有山梨醇的Vogel氏基本培养基上以根据通过pyr2标记获得的尿苷原养型选择候选者。如表7中所示，与亲本Morph77B7相比，Morph77B7Δtps2的发酵液粘度降低。在间歇式培养阶段结束，当所有葡萄糖已消耗时，两种菌株均已达到类似的生物质浓度。到该间歇式培养阶段结束，看见Morph77B7对照菌株搅拌增加至616rpm，并且然后看到DO含量水平下降低至40％。菌株Morph77B7Δtps2不要求如此多的能量来实现相同的生物质浓度。搅拌速率从未增加至高于500rpm，并且％DO从未下降至低于110。关于tpsl破坏的细节可见于2011年4月29日提交的美国临时专利申请No.61,480,629，将其以引用的方式全文并入本文。

表7.Morph77B7与Morph77b7Δtps2相比的发酵液粘度

尽管为了清楚的理解已通过示例和实例更详细地描述了上述组合物和方法，但本领域技术人员将显而易见的是可作出某些改变和修改。因而，所述描述不应理解为限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书描述。

本文引用的全部出版物、专利以及专利申请特此全文以引用方式并入以用于所有目的、且达到与犹如每个单独的专利公开、专利或专利申请被特别和单独地指出以便如此以引用方式并入相同的程度。

参考文献

以下参考文献和本文引用的另外的参考文献特此以引用方式并入：

Hughes，H.和Stephens，D.J.(2008)Cell Biol.(《细胞生物学》)129：129-51.

Karhinen，L.等人，(2005)Traffic6：562-74.

Mouyna，I.等人，(2005)Molecular Microbiology(《分子生物学》)56：1675-88.

Passolunghi，S.等人，(2010)Microbial Cell Factories(《微生物细胞工厂》)9：7-17.

Peng，R.等人，(2000)J.Biol.Chem.(《生物化学杂志》)275：11521-28.

Popolo,L等人，(2008)J.Biol.Chem.(《生物化学杂志》)283：18553-18565

Roberg，K.J.等人，(1999)J.Cell.Biol.(《细胞生物学杂志》)145：659-72.

Schirawski，J.等人，(2005)Plant Cell(《植物细胞》)17：3532-3543.

Shimoni，Y.等人，(2000)J.Cell.Biol.(《细胞生物学杂志》)151：973-84.

Turchini，A.等人，(2000)J. Bacteriol.(《细菌学杂志》)182：1167-71.

Claims

1.一种衍自亲本株的丝状真菌变异株，所述变异株包含使所述变异株的细胞与所述亲本株的细胞相比产生改变量的功能性Gasl蛋白的遗传变更，其中所述变异株的细胞在深层培养有氧发酵过程中，(i)与所述亲本株的细胞相比，产生出需要改变的搅拌量来维持预选的溶氧量的细胞发酵液，和/或(ii)与所述亲本株的细胞相比，产生出在预选的搅拌量下维持改变的溶氧量的细胞发酵液。

2.根据权利要求1所述的变异株，其中功能性Gasl蛋白的所述改变量为减少量，并且所述变异株在深层培养有氧发酵过程中，(i)与所述亲本株的细胞相比，产生出需要减少的搅拌量来维持预选的溶氧量的细胞发酵液，和/或(ii)与所述亲本株的细胞相比，产生出在预选的搅拌量下维持增加的溶氧量的细胞发酵液。

3.根据权利要求1或2所述的变异株，其中所述遗传变更包含所述亲本株中存在的gasl基因的破坏。

4.根据权利要求3所述的变异株，其中破坏所述gasl基因是缺失所述gasl基因的全部或部分所致。

5.根据权利要求3所述的变异株，其中破坏所述gasl基因是缺失包含所述gasl基因的基因组DNA的一部分所致。

6.根据权利要求3所述的变异株，其中破坏所述gasl基因是诱变所述gasl基因所致。

7.根据权利要求3-6中任一项所述的变异株，其中破坏所述gasl基因是使用位点特异性重组进行。

8.根据权利要求3-7中任一项所述的变异株，其中破坏所述gasl基因是与在所述gasl基因的遗传基因座处引入可选择标记相结合进行。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的变异株，其中所述变异株不产生功能性Gasl蛋白。

10.根据权利要求1-8中任一项所述的变异株，其中所述变异株不产生Gasl蛋白。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的变异株，其中所述变异株还包含编码目的蛋白质的基因。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的变异株，还包含sfb3基因的破坏。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的变异株，还包含破坏至少一个选自sfb3基因、sebl基因、mpgl基因、crzl基因和tps2基因的基因。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的变异株，其中所述变异株每单位量生物质产生的蛋白质量与所述亲本株基本上相同或更多。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的变异株，其中所述丝状真菌是盘菌亚门(Pezizomycotina)物种。

16.根据权利要求1-15中任一项所述的变异株，其中所述丝状真菌是木霉属(Trichoderma)物种。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的变异株，其中所述丝状真菌是里氏木霉(Trichoderma reesei)。

18.一种制备丝状真菌细胞的变异株的方法，包括：将遗传变更引入丝状真菌细胞的亲本株中，与所述亲本株的细胞相比所述遗传变更改变了功能性Gasl蛋白的产生，从而产生变异丝状真菌细胞，所述变异丝状真菌细胞在深层培养有氧发酵过程中，(i)与所述亲本株的细胞相比，产生出需要改变的搅拌量来维持预选的溶氧量的细胞发酵液，和/或(ii)与所述亲本株的细胞相比，产生出在预选的搅拌量下维持改变的溶氧量的细胞发酵液。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述遗传变更减少或防止功能性Gasl蛋白的产生，从而产生变异丝状真菌细胞，所述变异丝状真菌细胞在深层培养有氧发酵过程中，(i)与所述亲本株的细胞相比，产生出需要减少的搅拌量来维持预选的溶氧量的细胞发酵液，和/或(ii)与所述亲本株的细胞相比，产生出在预选的搅拌量下维持增加的溶氧量的细胞发酵液。

20.根据权利要求18或19所述的方法，其中所述遗传变更包括利用遗传操作破坏亲本丝状真菌细胞中的gasl基因。

21.根据权利要求18-20中任一项所述的方法，其中所述遗传变更包括利用遗传操作缺失亲本丝状真菌细胞中的gasl基因。

22.根据权利要求18-21中任一项所述的方法，其中所述遗传变更是使用位点特异性遗传重组进行。

23.根据权利要求18-22中任一项所述的方法，其中破坏所述gasl基因是与在所述gasl基因的遗传基因座处引入可选择标记相结合进行。

24.根据权利要求18-23中任一项所述的方法，其中破坏gasl基因是与破坏sfb3基因相结合进行。

25.根据权利要求18-24中任一项所述的方法，其中破坏gasl基因是与破坏至少一个选自sfb3基因、sebl基因、mpgl基因、crzl基因和tps2基因的基因相结合进行。

26.根据权利要求18-25中任一项所述的方法，其中所述变异株每单位量生物质产生的蛋白质量与所述亲本株基本上相同或更多。

27.根据权利要求18-26中任一项所述的方法，其中所述丝状真菌是盘菌亚门物种。

28.根据权利要求18-27中任一项所述的方法，其中所述丝状真菌是木霉属物种。

29.根据权利要求18-28中任一项所述的方法，其中所述丝状真菌是里氏木霉。

30.根据权利要求18-29中任一项所述的方法，其中所述亲本株还包含编码目的蛋白质的基因。

31.根据权利要求30所述的方法，其中在引入所述减少或防止功能性Gasl蛋白的产生的遗传变更之前，所述编码目的蛋白质的基因存在于所述亲本株中。

32.一种目的蛋白质，所述蛋白质由根据权利要求11所述的变异株产生。

33.一种丝状真菌变异株，所述丝状真菌变异株通过根据权利要求18-31中任一项所述的方法产生。

34.一种衍自亲本株的丝状真菌变异株，所述变异株包含：

(a)遗传变更，所述遗传变更导致(i)与所述亲本株的细胞相比，在深层培养物中需要减少的搅拌来维持预选的溶氧量，和/或(ii)与所述亲本株的细胞相比，在预选的搅拌量下维持深层培养物中增加的溶氧量，和

(b)编码目的蛋白质的基因，

其中所述编码目的蛋白质的基因在(a)中的所述遗传变更之前存在于所述变异株中。

35.根据权利要求34所述的变异株，其中所述遗传变更包含所述亲本菌株中存在的gasl基因的破坏。

36.根据权利要求35所述的变异株，其中破坏所述gasl基因是与在所述gasl基因的遗传基因座处引入可选择标记相结合进行。

37.根据权利要求35或36所述的变异株，其中破坏所述gasl基因是与破坏至少一个选自sfb3基因、sebl基因、mpgl基因、crzl基因和tps2基因的基因相结合进行。

38.根据权利要求35-37中任一项所述的变异株，其中破坏所述gasl基因是与破坏sebl基因相结合进行。