CN103502430A

CN103502430A - 具有粘度改变表型的丝状真菌

Info

Publication number: CN103502430A
Application number: CN201280019665.6A
Authority: CN
Inventors: E·A·博迪; R·J·普莱特二世
Original assignee: Danisco USA Inc
Current assignee: Danisco USA Inc; Danisco US Inc
Priority date: 2011-04-22
Filing date: 2012-04-20
Publication date: 2014-01-08
Anticipated expiration: 2032-04-20
Also published as: JP6042867B2; US20140127817A1; CA2833756C; AU2012245325B2; EP2699668B1; US9593341B2; DK2699668T3; JP6042870B2; CN103517981B; KR101952467B1; DK2699667T3; US20140315313A1; WO2012145598A1; US9868958B2; CN103517981A; CN103502266A; JP2014513533A; WO2012145592A1; BR112013026535A2; KR20140033049A

Abstract

本发明描述的是与具有改变的生长特性的变异丝状真菌相关的组合物和方法。此类变体非常适于在深层培养中生长，例如用于大规模生产用于商业应用的酶和其他蛋白质。

Description

具有粘度改变表型的丝状真菌

优先权

本专利申请要求于2011年4月22日提交的美国临时申请系列号61/478,162和61/478,160以及各自于2011年4月29日提交的61/480,610、61/480,602和61/480,629的优先权，所述美国临时申请在此以引用的方式全文并入。

技术领域

本发明的菌株和方法涉及丝状真菌中的基因突变，该基因突变产生具有改变的生长特性的菌株变体。此类变体非常适于在深层培养中生长，例如用于大规模生产用于商业应用的酶和其他蛋白质或代谢物。

背景技术

丝状真菌能够高水平表达天然和异源蛋白质，从而使得它们非常适于大规模生产用于工业应用、医药应用、动物健康应用以及食品和饮料应用的酶和其他蛋白质。丝状真菌通常在生物反应器中的菌丝体深层培养中生长，该生物反应器适于将氧和营养物引入培养基（即，肉汤）内并在其中分布。菌丝体的形态特性影响肉汤的流变特性，从而影响生物反应器性能。

一般来讲，肉汤的粘度越高，氧气和营养物质的分布越不均匀，搅拌培养物所需的能量越高。在一些情况下，肉汤的粘度变得足够高而明显妨碍氧气和营养物质的溶解，从而不利地影响真菌的生长。另外，混合粘稠肉汤以及对粘稠肉汤进行充气所需的能量可大大增加生产成本，以及招致在马达和电源供应方面的资本支出较高。

发明内容

描述的是涉及丝状真菌的菌株和方法，所述丝状真菌具有产生粘度改变表型的遗传改变。

在一个方面，提供衍生自亲本株的丝状真菌变异株，该变异株包含引起变异株的细胞与亲本株的细胞相比产生改变量的功能性Crz1蛋白的遗传改变，其中变异株的细胞在深层培养中的好氧发酵过程中产生这样的细胞肉汤，所述细胞肉汤(i)与亲本株的细胞相比，需要改变的搅拌量来维持预选的溶氧量，和/或(ii)与亲本株的细胞相比，在预选的搅拌量处维持改变的溶氧量。

在一些实施例中，功能性Crz1蛋白的改变量为减少量，并且变异株在深层培养中的好氧发酵过程中产生这样的细胞肉汤，所述细胞肉汤(i)与亲本株的细胞相比，需要减少的搅拌来维持预选的溶氧量，和/或(ii)与亲本株的细胞相比，在预选的搅拌量处维持增加的溶氧量。

在一些实施例中，遗传改变包含亲本株中存在的crz1基因的破坏。在一些实施例中，crz1基因的破坏是crz1基因的全部或部分缺失的结果。在一些实施例中，crz1基因的破坏是包含crz1基因的基因组DNA的一部分缺失的结果。在一些实施例中，crz1基因的破坏是crz1基因诱变的结果。

在一些实施例中，crz1基因的破坏使用位点特异性重组进行。在一些实施例中，crz1基因的破坏与在crz1基因的基因座处引入选择性标记组合进行。

在一些实施例中，变异株不产生功能性Crz1蛋白。在一些实施例中，变异株不产生Crz1蛋白。

在一些实施例中，变异株还包含编码所关注的蛋白质的基因。在一些实施例中，变异株还含sfb3基因的破坏。在一些实施例中，变异株还包含seb1基因的破坏。在一些实施例中，变异株还包含sfb3基因和seb1基因的破坏。在一些实施例中，变异株还包含至少一个选自以下的基因的破坏：sfb3基因、seb1基因、mpg1基因、gas1基因和tps2基因。在一些实施例中，变异株每单位量生物质产生与亲本株基本上相同量或更多的蛋白质。

在一些实施例中，丝状真菌为盘菌亚门(Pezizomycotina)物种。在一些实施例中，丝状真菌为木霉属(Trichoderma)物种、曲霉属(Aspergillus)物种、镰刀菌属(Fusarium)物种、足放线病菌属(Scedosporium)物种、青霉属(Penicillium)物种、金孢子菌属(Chrysosporium)物种、头孢霉属(Cephalosporium)物种、篮状菌属(Talaromyces)物种、Geosmithia属物种和链孢霉属(Neurospora)物种。在一些实施例中，丝状真菌可包括但不限于里氏木霉(Trichoderma reesei)（此前分类为长梗木霉(Trichodermalongibrachiatum)和红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)）、黑曲霉(Aspergillusniger)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、解乌头酸曲霉(Aspergillusitaconicus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、土曲霉(Aspergillus terreus)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、多育赛多孢(Scedosporium prolificans)、粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、埃默森篮状菌(Talaromyces(Geosmithia)emersonii)、腐皮镰刀菌（Fusarium venenatum）和Chrysosporiumlucknowense。在一些实施例中，丝状真菌为里氏木霉。

在另一个方面，提供产生丝状真菌细胞变异株的方法，该方法包括：将遗传改变引入丝状真菌细胞的亲本株中，与所述亲本株的细胞相比所述遗传改变改变了功能性Crz1蛋白的产生，从而产生变异丝状真菌细胞，该变异丝状真菌细胞在深层培养中的好氧发酵过程中产生这样的细胞肉汤，所述细胞肉汤(i)与亲本株的细胞相比，需要改变的搅拌量来维持预选的溶氧量，和/或(ii)与亲本株的细胞相比，在预选的搅拌量处维持改变的溶氧量。

在一些实施例中，遗传改变减少或防止功能性Crz1蛋白的产生，从而产生变异丝状真菌细胞，该变异丝状真菌细胞在深层培养中的好氧发酵过程中产生这样的细胞肉汤，所述细胞肉汤(i)与亲本株的细胞相比，需要减少的搅拌来维持预选的溶氧量，和/或(ii)与亲本株的细胞相比，在预选的搅拌量处维持增加的溶氧量。

在一些实施例中，遗传改变包含使用遗传操作破坏亲本丝状真菌细胞中的crz1基因。在一些实施例中，遗传改变包含使用遗传操作缺失亲本丝状真菌细胞中的crz1基因。在一些实施例中，遗传改变使用位点特异性遗传重组进行。

在一些实施例中，crz1基因的破坏与在crz1基因的基因座处引入选择性标记组合进行。在一些实施例中，变异株每单位量生物质产生与亲本株基本上相同量或更多的蛋白质。在一些实施例中，crz1基因的破坏与破坏sfb3基因组合进行。在一些实施例中，crz1基因的破坏与破坏至少一个选自以下的基因组合进行：sfb3基因、seb1基因、mpg1基因、gas1基因和tps2基因。

在一些实施例中，变异株每单位量生物质产生与亲本株基本上相同量或更多的蛋白质。

在一些实施例中，丝状真菌为盘菌亚门(Pezizomycotina)物种。在一些实施例中，丝状真菌为木霉属(Trichoderma)物种、曲霉属(Aspergillus)物种、镰刀菌属(Fusarium)物种、足放线病菌属(Scedosporium)物种、青霉属(Penicillium)物种、金孢子菌属(Chrysosporium)物种、头孢霉属(Cephalosporium)物种、篮状菌属(Talaromyces)物种、Geosmithia属物种和链孢霉属(Neurospora)物种。在一些实施例中，丝状真菌可包括但不限于里氏木霉（此前分类为长梗木霉和红褐肉座菌）、黑曲霉、烟曲霉、解乌头酸曲霉、米曲霉、构巢曲霉、土曲霉、酱油曲霉、日本曲霉、多育赛多孢、粗糙脉孢霉、绳状青霉、产黄青霉、埃默森篮状菌、腐皮镰刀菌和Chrysosporium lucknowense。在一些实施例中，丝状真菌为里氏木霉。

在一些实施例中，亲本株还包含编码所关注的蛋白质的基因。在一些实施例中，在引入减少或防止功能性Crz1蛋白的产生的遗传改变之前，编码所关注的蛋白质的基因存在于亲本株中。在一些实施例中，亲本株内的所关注的蛋白质由内源基因或异源基因编码。

在另一方面，提供由上述变异株中任一者产生的所关注的蛋白质。

在又一方面，提供由上述方法中任一者产生的且具有上述特性中任一者的丝状真菌。

在另一个方面，提供衍生自亲本株的丝状真菌变异株，该变异株包含：(a)遗传改变，所述遗传改变使得(i)与亲本株的细胞相比，需要减少的搅拌来保持深层培养物中预选的溶氧量，和/或(ii)与亲本株的细胞相比，在预选的搅拌量处保持深层培养物中增加的溶氧量；和(b)编码所关注的蛋白的基因，其中所述编码所关注的蛋白的基因在(a)中的遗传改变之前存在于变异株中。

在一些实施例中，所得的变异株的遗传改变包含亲本株中存在的crz1基因的破坏。在一些实施例中，crz1基因的破坏与在crz1基因的基因座处引入选择性标记组合进行。在一些实施例中，crz1基因的破坏与破坏sfb3基因组合进行。在一些实施例中，crz1基因的破坏与破坏seb1基因组合进行。在一些实施例中，crz1基因的破坏与破坏至少一个选自以下的基因组合进行：sfb3基因、seb1基因、mpg1基因、gas1基因和tps2基因。

根据本说明书包括附图，本发明的变异株和方法的这些及其他的方面和实施例将是显而易见的。

附图简述

图1为如实例1中所述的crz1破坏载体pRATT261-crz1D的图谱。

具体实施方式

I.综述

本发明的菌株和方法涉及具有影响其形态和生长特性的遗传修饰的丝状真菌细胞变异株。当在深层培养中培养该变异细胞时，其产生与包含亲本株细胞的细胞肉汤相比具有不同流变特性的细胞肉汤。这些变异株中的一些非常适于大规模生产酶及其他在商业上重要的蛋白质。

II.定义

在详细描述本发明菌株和方法之前，为了清楚起见对如下术语进行定义。未定义的术语应该与它们在相关领域中所用的普通含义一致。

如本文所用，“里氏木霉”是指子囊菌门(Ascomycota)盘菌亚门的丝状真菌。该生物体此前被分类为长梗木霉或被分类为红褐肉座菌。

如本文所用，短语“丝状真菌细胞的变异株”或类似短语是指例如通过遗传操作，衍生自（即得自或可得自）属于盘菌亚门的亲本（或参照）株的丝状真菌细胞的菌株。在本说明书中，亲本株和变异株可描述为具有某些特性，例如遗传修饰、表达变型、形态等；然而，技术人员应当理解在技术上具有此类特性的亲本株或变异株的细胞和“菌株”为了方便起见而提及。

如本文所用，术语“所关注的蛋白质”是指期望在丝状真菌中表达的多肽。此类蛋白质可以是酶、底物结合蛋白质、表面活性蛋白质、结构蛋白质等，并且可以高水平表达，并且可用于商业化的目的。所关注的蛋白质可由相对于变异株和/或亲本株的内源基因或异源基因编码。所关注的蛋白质可细胞内表达或作为分泌蛋白质表达。

如本文所用，短语“基本上无活性”或类似短语，意指特定的活性在混合物中不能检测到或者其存在量不会干扰该混合物的预期目的。

如本文所用，术语“多肽”和“蛋白质”（和/或它们各自的复数形式）可互换使用来指包含肽键连接的氨基酸残基的任何长度的聚合物。本文中使用氨基酸残基的常规单字母或三字母代码。该聚合物可以是线性或分支的，其可包含经修饰的氨基酸，并且其可夹杂有非氨基酸。所述术语还涵盖天然改性或通过干预改性的氨基酸聚合物；所述干预例如是二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或改性，如与标记组分缀合。还包括在该定义中的是例如含有一个或多个氨基酸类似物（包括例如非天然氨基酸等）以及本领域已知的其他修饰的多肽。

如本文所用，功能上和/或结构上类似的蛋白质被视为“相关蛋白质”。此类蛋白质可衍生自不同属和/或种的生物体、或甚至不同纲的生物体（例如细菌和真菌）。相关蛋白还涵盖通过一级序列分析确定、通过二级或三级结构分析确定或通过免疫交叉反应确定的同源物。

如本文所用，术语“衍生的多肽/蛋白质”是指通过在N末端或C末端任一端或这两个末端添加一个或多个氨基酸、在氨基酸序列中的一个或多个不同位点置换一个或多个氨基酸、在蛋白质的任一端或两个末端或在氨基酸序列中的一个或多个位点缺失一个或多个氨基酸和/或在氨基酸序列中的一个或多个位点插入一个或多个氨基酸而衍生自或可衍生自蛋白质的蛋白质。可通过修饰编码天然蛋白质的DNA序列、将该DNA序列转化进合适的宿主中并使该经修饰的DNA序列表达而形成衍生的蛋白质来实现蛋白质衍生物的制备。

相关（和衍生）蛋白质包括“变异蛋白质”。变异蛋白质通过在少数氨基酸残基处的置换、缺失和/或插入而不同于参考蛋白质/亲本蛋白质（例如野生型蛋白质）。变体蛋白与亲本蛋白质间的差异氨基酸残基的数目可以为一个或多个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更多个氨基酸残基。变体蛋白可与参照蛋白具有至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或甚至至少约99或更多的氨基酸序列同一性。变体蛋白与参照蛋白的差别还可在于所选的基序、结构域、表位、保守区等等。

如本文所用，术语“类似序列”是指蛋白质内提供与所关注的蛋白质（即通常是所关注的起始蛋白质）类似的功能、三级结构和/或保守残基的序列。例如，在含有α-螺旋或β-片层结构的表位区域中，类似序列中的置换氨基酸优选维持相同的特异性结构。该术语还指核苷酸序列以及氨基酸序列。在一些实施例中，开发类似序列使得置换氨基酸导致显示类似或改善功能的变体酶。在一些实施例中，所关注蛋白质中的氨基酸的三级结构和/或保守残基位于或接近所关注的区段或片段。因而，若所关注的区段或片段含有例如α-螺旋或β-片层结构，则置换氨基酸优选维持该特异性结构。

如本文所用，术语“同源蛋白”是指具有与参照蛋白类似的活性和/或结构的蛋白质。同源物不一定是进化相关的。因而，预期该术语涵盖从不同生物体获得的相同、类似或对应的酶（例如，就结构和功能而言）。在一些实施例中，希望鉴定具有与参照蛋白类似的四级、三级和/或一级结构的同源物。在一些实施例中，同源蛋白可诱导与参照蛋白类似的免疫应答。在一些实施例中，同源蛋白经工程改造而产生具有所需活性的酶。

序列间的同源性程度可使用本领域中已知的任何合适的方法确定（参见例如Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math《高等应用数学》2:482；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.《分子生物学杂志》，48:443；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA《美国国家科学院院刊》，85:2444；程序，诸如在威斯康星遗传学软件包（Wisconsin GeneticsSoftware Package，得自威斯康星州麦迪逊市遗传学计算机小组(GeneticsComputer Group,Madison,WI)）中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA；和Devereux等人(1984)Nucleic Acids Res《核酸研究》12:387-95）。

例如，PILEUP是测定序列同源性水平的有用程序。PILEUP利用渐进性双序列比对从一组相关序列产生多序列比对。其还可绘出关系树，该关系树示出了用于产生比对的聚类关系。PILEUP使用Feng和Doolittle的渐进式比对方法（Feng和Doolittle，(1987)，(J.Mol.Evol《分子进化杂志》35:351-60）的简化版。该方法类似于Higgins和Sharp((1989)CABIOS5:151-53)所描述的方法。可用的PILEUP参数包括：默认空位权重=3.00，默认空位长度权重=0.10，以及加权的末端空位。可用的算法的另一例子是由Altschul等人（(1990)J.Mol.Biol《分子生物学杂志》215:403-10）和Karlin等人，（(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA《美国国家科学院院刊》90:5873-87）描述的BLAST算法。一种特别有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序（参见，例如，Altschul等人(1996)Meth.Enzymol《酶学方法》266:460-80）。参数“W”、“T”和“X”决定比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用下述作为缺省值：字长(W)11、BLOSUM62评分矩阵（参见，例如，Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA《美国国家科学院院刊》89:10915）比对(B)50次、期望值(E)10、M'5、N'-4和两条链的比较。

如本文所用，在至少两个核酸或多肽的背景下，短语“基本上相似”和“基本上相同”通常意指与参照（例如野生型）序列相比，多核苷酸或多肽包含具有至少约70%同一性、至少约75%同一性、至少约80%同一性、至少约85%同一性、至少约90%同一性、至少约91%同一性、至少约92%同一性、至少约93%同一性、至少约94%同一性、至少约95%同一性、至少约96%同一性、至少约97%同一性、至少约98%同一性或甚至至少约99%同一性或更高同一性的序列。序列同一性可用已知的程序如BLAST、ALIGN和CLUSTAL，使用标准参数测定。（参见，例如，Altschul等人(1990)J.Mol.Biol《分子生物学杂志》215:403-410；Henikoff等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA《美国国家科学院院刊》89:10915；Karin等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA《美国国家科学院院刊》90:5873；以及Higgins等人(1988)Gene《基因》73:237-244）。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)公开获得。另外，可使用FASTA对数据库进行搜索（Pearson等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA《美国国家科学院院刊》85:2444-48）。两个多肽基本上相同的一个指示是第一多肽与第二多肽是免疫交叉反应性的。通常，差别在于保守氨基酸置换的多肽是免疫交叉反应性的。因而，例如，若两个肽差别仅在于保守置换，则多肽基本上与第二多肽相同。两种核酸序列基本上一致的另一个指示是两种分子在严格的条件（如，在中至高严格度的范围内）下彼此杂交。

如本文所用，术语“基因”与术语“等位基因”在关于编码和引导蛋白质或RNA表达的核酸时是同义的。丝状真菌的营养体形式通常是单倍体，因而单拷贝的指定基因（即单个等位基因）足以赋予指定表型。

如本文所用，术语“野生型的”和“天然的”可互换使用并且是指自然中存在的基因、蛋白质或株系。

如本文所用，“缺失基因”是指从宿主细胞的基因组移除基因。当基因包括未紧邻基因的编码序列的控制元件（例如，增强子元件）时，基因的缺失是指编码序列的缺失，以及任选的相邻增强子元件（包括但不限于例如启动子和/或终止序列）的缺失。

如本文所用，“基因的破坏”泛指在宿主细胞中基本上防止细胞产生功能基因产物，例如蛋白质的任何遗传或化学操作，即突变。破坏方法的例子包括完全或部分缺失基因的任何部分，包括多肽编码序列、启动子、增强子或另一调控元件，或者诱变上述者，其中诱变涵盖置换、插入、缺失、倒位以及它们的组合和变型形式，上述突变中的任一者可基本上防止功能基因产物的产生。基因还可使用RNAi、反义或废止基因表达的任何其他方法来破坏。

如本文所用，术语“遗传操作”和“遗传改变”可交换使用并且是指核酸序列的改变/变化。该改变可包括但不限于核酸序列中的至少一个核酸的置换、缺失、插入或化学修饰。

如本文所用，“好氧发酵”是指在存在氧气的情况下的生长。

如本文所用，术语“细胞肉汤”统指液体/深层培养物中的培养基和细胞。

如本文所用，术语“细胞群(cell mass)”是指液体/深层培养物中存在的细胞组分（包括完整的和溶解的细胞）。细胞群可以干重或湿重表示。

如本文所用，术语“流变学”是指研究物质形变和流动的物理学分支。

如本文所用，“粘度”是流体对机械应力（如剪切应力或拉伸应力）引起的形变的抗性的量度。在本发明背景下，粘度还可指包含丝状真菌细胞的细胞肉汤对例如通过转子/叶轮所提供的机械应力的抗性。由于细胞肉汤的粘度可能难以直接测量，可使用粘度的间接量度，如在预选的搅拌量处培养物肉汤的溶氧量、维持预选溶氧量所需的搅拌量、搅拌细胞肉汤以维持所选溶氧量所需的能量量或甚至是固体培养基上的集落形态。

如本文所用，丝状真菌细胞的“粘度改变”变异株是指产生这样的细胞肉汤的变异株，该细胞肉汤与亲本株产生的等价细胞肉汤相比具有减少的或增加的粘度（即，减少的或增加的对剪切或拉伸应力的抗性）。一般来讲，相当的细胞肉汤或等价的细胞肉汤具有相当的细胞群。优选地，关于粘度的任何直接或间接量度，粘度改变的变异株与亲本株之间的差别为至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、或甚至至少50%或更多。本发明描述了用于比较丝状真菌细胞肉汤的粘度的方法。

如本文所用，丝状真菌细胞的“粘度降低”变异株是指产生这样的细胞肉汤的变异株，该细胞肉汤与亲本株产生的等价细胞肉汤相比具有减少的粘度（即减少的对剪切或拉伸应力的抗性）。优选地，关于粘度的任何直接或间接量度，粘度改变的变异株与亲本株之间的差别为至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、或甚至至少50%或更多。

如本文所用，“溶氧”(DO)是指以体积/体积单位测量的液体培养基中存在的氧(O₂)量。在整个发酵过程中，溶氧水平可维持在高的水平，例如170-100%至20%之间、100-80%至20%之间、70%至20%之间、65%至20%之间、60%至20%之间、55%至20%之间、50%至20%之间、45%至20%之间、44%至20%之间、43%至20%之间、42%至20%之间、41%至20%之间、40%至20%之间、35%至20%之间、30%至20%之间以及25%至20%之间。具体地讲，溶氧可在发酵开始时高并且允许随着发酵进行而下降。溶解氧水平可受在其下搅拌例如搅动发酵的速率和/或受空气或氧的添加速率控制。培养物可以400-700rpm搅拌例如搅动，并且溶解氧水平通过改变空气或氧流速和叶轮速度维持超过20%、超过25%、超过30%、超过35%、超过40%、超过45%、超过50%和超过55%或更多。

如本文所用，“主要遗传定子”是指基因或其遗传操作，该基因或其遗传操作是在缺少其他基因或其他基因的遗传操作的情况下赋予指定表型所必要且充分的。然而，特定基因是赋予指定表型所必要且充分的并不排除可通过进一步的遗传操作实现对表型的附加影响的可能性。

如本文所用，“功能性多肽/蛋白质”为具有活性，例如酶活性、结合活性、表面活性性质等，并且尚未被诱变、截短或以其他方式修饰来废止或降低该活性的蛋白质。如所指定的，功能性多肽可以是热稳定性的或不耐热的。

如本文所用，“功能性基因”为能够被细胞组分用于产生活性基因产物，通常是蛋白质的基因。功能性基因是被破坏的基因的对立物，被破坏的基因被修饰而使得它们不能被细胞组分用于产生活性基因产物，或者具有降低的被细胞组分用于产生活性基因产物的能力。

如本文所用，如果变异株与亲本株之间蛋白质的表达差异小于约20%、小于约15%、小于约10%、小于约7%、小于约5%、或甚至小于约3%，则相比于亲本株，变异细胞“维持或保持高的蛋白质表达和/或分泌水平”。

如本文所用，如果宿主细胞已通过遗传方式或化学方式改变而防止产生表现具有野生型蛋白质的特征性活性，尤其是促进菌丝伸长或以其他方式增加液体培养物中丝状真菌的粘度的活性的功能性蛋白质/多肽，则宿主细胞已经“经过修饰而防止产生规定的蛋白质”。此类修饰包括但不限于缺失或破坏编码该蛋白质的基因、修饰该基因而使得所编码的多肽缺少上述活性、修饰该基因以影响翻译后加工或稳定性、以及它们的组合。

如本文所用，“所关注的蛋白质”为期望在丝状真菌细胞的深层培养中产生的蛋白质。一般来讲，所关注的蛋白质在商业上对于工业用途、医药用途、动物健康用途以及食品和饮料用途而言是重要的，从而使得期望它们大量产生。要将所关注的蛋白质与由丝状真菌细胞表达的众多其他蛋白质区分开，后者通常不作为产物被关注，并且主要被视为本底蛋白质污染物。

如本文所用，若相比于亲本株产生的蛋白量，变异株产生的蛋白量减少不超过20%、减少不超过15%、减少不超过10%或甚至减少不超过5%，其中蛋白量被归一化为测定了蛋白产量的细胞的生物质总量，其中生物质可用湿重（如，细胞团块）或干重方式表示，则变异株每单位量生物质产生与亲本株“基本上等量”的蛋白质。

如本文所用，若相比于亲本株，变异株产生的蛋白量增加至少5%、增加至少10%、增加至少15%或更多，其中蛋白量被归一化为测定了蛋白产量的细胞的生物质总量，其中生物质可用湿重（如，细胞团块）或干重方式表示，则变异株较之亲本株“每单位量生物质产生基本上更多的蛋白质”。

如本文所用，“荧光染料”为发荧光的染料。优选的荧光染料与真菌细胞壁中的纤维素和/或几丁质结合。

如本文所用，单数冠词“一个”、“一种”和“所述”涵盖多个指代物，除非上下文明确指明不是这样。特此以引用的方式将本文所引用的所有参考文献全文并入本文。如下缩写/首字母缩写具有如下含义，除非另外规定：

CFU 集落形成单位

EC 酶学委员会

kDa 千道尔顿

kb 千碱基

MW 分子量

w/v 重量/体积

w/w 重量/重量

v/v 体积/体积

wt% 重量%

℃ 摄氏度

H₂O 水

H₂O₂ 过氧化氢

dH₂O或DI 去离子水

dIH₂O Milli-Q过滤的去离子水

DO 溶氧

g或gm 克

μg 微克

mg 毫克

kg 千克

lb 磅

μL和μl 微升

mL和ml 毫升

mm 毫米

μm 微米

mol 摩尔

mmol 毫摩尔

M 摩尔/升

mM 毫摩尔/升

μM 微摩尔/升

nm 纳米

U 单位

ppm 份每一百万份

sec和'' 秒

min和' 分钟

hr和h 小时

EtOH 乙醇

eq. 当量

N 当量浓度

PCR 聚合酶链反应

DNA 脱氧核糖核酸

FOA 氟乳清酸

UV 紫外线

A₅₄₀ 540nm波长处测得的吸光度

CMC 羧甲基纤维素

rpm 转/分钟

Δ 与缺失相关

CER CO₂放出速率

bp 碱基对

III.Crz1蛋白生产

改变的丝状真菌菌株在一个方面，提供衍生自亲本株的丝状真菌变异株，该变异株包含遗传改变，与亲本株相比该遗传改变引起变异株的细胞产生改变量的功能性Crz1蛋白。变异株的细胞随后在深层培养中的好氧发酵期间产生这样的细胞肉汤，与亲本株的细胞相比该细胞肉汤需要改变的搅拌量来维持预选的溶氧量或在预选的搅拌量处维持改变的溶氧量。

在一些情形下，与亲本株的细胞相比该遗传改变引起变异株的细胞产生减少量的功能性Crz1蛋白，并且与亲本株的细胞相比所得的细胞肉汤需要减少的搅拌来维持预选的溶氧量，或在预选的搅拌量处维持更高的溶氧量。在这些情形中，据信与亲本株的细胞群相比，变异株的细胞群表现具有降低的粘度，这是造成如实例中所述的与溶氧量和搅拌相关的观察结果的原因。

功能性Crz1蛋白的量中的减少可由亲本株中存在的crz1基因的破坏引起。因为crz1基因的破坏是将粘度降低表型赋予变异株的主要遗传定子，所以此类变异株仅需要包含破坏的crz1基因，而所有其他基因可保持完整。在一些情形中，与衍生变异株的亲本株相比，该变异株可任选包括另外的遗传改变。此类另外的遗传改变不必赋予粘度降低，但可进一步降低粘度或为变异株赋予其他优点。

破坏crz1基因可使用基本上防止功能性crz1基因产物即Crz1蛋白表达的任何合适方法进行。如本领域技术人员已知的示例性的破坏方法包括但不限于：crz1基因的完全或部分缺失，包括例如Crz1编码序列、启动子、终止子、增强子或另一调控元件的完整或部分缺失；和包括crz1基因的任何部分的染色体部分的完全或部分缺失。破坏crz1基因的具体方法包括在crz1基因例如Crz1编码序列、启动子、终止子、增强子或另一调控元件的任何部分中制造核苷酸置换或插入。优选地，通过利用序列特异性分子生物学技术通过遗传操作（与通过化学诱变相反，化学诱变通常不靶向特定的核酸序列）进行缺失、插入和/或置换（统称突变）。然而，可将化学诱变用于破坏crz1基因。

crz1基因中的突变可降低crz1启动子的效率、降低crz1增强子的效率、干扰crz1mRNA的剪接或编辑、干扰crz1mRNA的翻译、将终止密码子引入Crz1编码序列内以防止全长Crz1蛋白的翻译、改变Crz1蛋白的编码序列以产生活性较低或失活的蛋白质或降低Crz1与其他核蛋白组分的相互作用、改变Crz1蛋白的编码序列以产生较不稳定的蛋白质或靶向该蛋白质用于破坏、引起Crz1蛋白错误折叠或未经正确修饰（例如，通过糖基化进行的修饰）、或干扰Crz1蛋白的细胞运输。

在一个实施例中，这些及其他遗传操作是为了降低或防止功能性Crz1蛋白的表达，或者降低或防止Crz1蛋白的正常生物活性，从而产生导致粘度降低表型的形态改变。

在其他情形中，遗传改变增加或恢复功能性Crz1蛋白的表达，或者增加Crz1蛋白的正常生物活性，从而产生导致粘度增加或恢复表型的形态改变。增加或恢复Crz1功能的示例性遗传改变是将增加拷贝的crz1基因引入细胞内、增加crz1启动子、增强子或其他控制元件的效率、增加编码Crz1蛋白的mRNA的翻译、增加编码Crz1蛋白的mRNA的稳定性、在crz1基因中引入增加Crz1蛋白的活性或稳定性的改变、在crz1基因中引入调节与其他蛋白质或核酸等的相互作用的改变的那些。其他增加或恢复Crz1功能的遗传改变是逆转这样的遗传改变的效应的那些，所述遗传改变减少或防止功能性Crz1蛋白表达。

用于如所述的操作和用途的丝状真菌细胞通常来自子囊菌门盘菌亚门，尤其是具有营养菌丝状态且包含crz1基因的同源物的真菌。此类生物体包括用于生产商业上重要的工业和药用蛋白质的丝状真菌细胞，包括但不限于木霉属物种、曲霉属物种、镰刀菌属物种、足放线病菌属物种、青霉属物种、金孢子菌属物种、头孢霉属物种、篮状菌属物种、白乔史密斯霉属(Geosmithia)物种和链孢霉属物种。具体的生物体包括但不限于里氏木霉（此前分类为长梗木霉或红褐肉座菌）、黑曲霉、烟曲霉、解乌头酸曲霉、米曲霉、构巢曲霉、土曲霉、酱油曲霉、日本曲霉、多育赛多孢、粗糙脉孢霉、绳状青霉、产黄青霉、埃默森篮状菌、腐皮镰刀菌和勒克瑙金孢菌(Chrysosporium lucknowense)。

在真菌中，已显示钙调磷酸酶介导的Ca²⁺信号传导为许多生物体中的生长、发育以及毒力所需。其对于适应多样的环境条件（包括高的阳离子水平和碱性pH）而言是必要的。基因crz1编码钙调磷酸酶调节转录因子。当磷酸酶钙调磷酸酶被Ca²⁺/钙调蛋白激活时，Crz1p转录因子去磷酸化。它随后进入核且诱导大量基因的表达，所述基因中的许多编码具有细胞壁相关功能的蛋白质（Yoshimoto等人，2002；Lagorce等人，2003；Garcia等人，2004；Karababa等人，2006；Pardini等人，2006，Munro,C.等人2009）。crz1或同源物的缺失可导致菌丝形态中的改变（Kothe,G.和Free,S.1998，Prokisch,H.等人1997）。本公开内容提供Crz1与改变的形态相关的实验证据。

不希望受理论的限制，据信丝状真菌中crz1表达和/或活性的改变可改变细胞壁，从而产生特征在于较短菌丝和更像酵母的外观的更紧凑的细胞形态。

使用BLAST搜索丝状真菌和酵母的可公开获得的基因组序列，使用里氏木霉Crz1氨基酸序列作为查询，发现同源物，尽管这些蛋白质的功能迄今为止是未知的。里氏木霉(SEQ ID NO:1)、构巢裸孢壳(E.nidulans)(SEQ ID NO:2)、酿酒酵母(S.cerevisiae)(SEQ ID NO:3)、烟曲霉(SEQ IDNO:4)、马内菲青霉(P.marneffei)(SEQ ID NO:5)和黄曲霉(A.flavus)(SEQ IDNO:6)Crz1蛋白的氨基酸序列显示于下文。

里氏木霉Crz1蛋白的预测氨基酸序列在下面作为SEQ ID NO:1示出：RGRSPSAGGFQSDINQSHSPARSPLAPTNEQPSAGLGVGLGQQQQRAFAAPLHPNYDSFGANGFLGAQANAVDPTNGFDPSASFGQQPATGPDSTLSLNAQAQHNYLSPNLHDGDFSLFPSAAEQGDQYNAPLFEQPPLGDLNAMTSPHSHQSPTPPQLFQPDSLQSPPFNRHQFSSPPTHSRNASLGPEAALLPSQIGDWTQPQFQGHRRTPSEYSDVSSVAPSPHLVSSDTFDADQSGHSPLQRPADVSLYQEVLGIGSFSLADHGSPGYHGRSPSHSPAISPRIMPQQMPDTMQPSFNLIPPNGGFDGVSGYPDLQPSHESFPSLSGGMGGDMHQMAPPAINIDFAPTNSRQGSFEPPKSQMDQDSLTPPERGRPKSRPRAVTDPFHPGSGILPPGNLGSSLGVDLAARSDTASRSLSPLDRSGTSSPASRRRQSTSSVPNNVIALRLADPEYQNSQEAGTSKRMQKHPATFQCTLCPKRFTRAYNLRSHLRTHTDERPFVCTVCGKAFARQHDRKRHESLHSGEKKFVCKGDLKTGGQWGCGRRFARADALGRHFRSEAGRICIKPLLDEEMVERQRQWQEQRMQQNMAQNMANPQVMGMDAGPAYPMDASGNYTLPQALLAQYPALAQMNWSATDMGGGLDDELSGRSSFDASDYDDGDDGGY

构巢裸孢壳Crz1蛋白的氨基酸序列在下面作为SEQ ID NO:2示出：

MDPQDTLQDLGQAPAAHINRSASPSAHAHQQYNNNHNDLTIDPSVTSNSSYPPSSFANNSAPGSEAFAYSSSYLTPATATDHNFARPSLQIPQSFDQGLSHQPAEENFSNLLNSNTGDFDFSLYQGSSPNNTGSDYPSSGLLDPQQSGNQAVNPVDLVSQIPSPHPSNSSQTSPLDQPPSSAMSPPASSPGTFYTPQHSRHTSLDPASAAYMTNVSHPEWQAVMNNSAFHGHRRAPSEVSEVSSAAHSPYLPQHDSFDVADNNPSPLLAAQNDPSLYDNAALGIESFTLSEHHQPQTQGISPHHSPYISPQLMPQHPTDIIPGGPFISAPATNSAYPTPPTEGYPNGGDIGQASQMAPPSINVEFAPPAKAQVFPPEKSTADMDSLSPPPSLRTSRMRSKSDPYAVSISRPRSPSSPSASLDALAASSPRSLSPFNVGRHPYSNPSSREPSPARSARRLSTSSVDSRNYILGLADPQRPGSNNTDSKRVQKHPATFQCTLCPKRFTRAYNLRSHLRTHTDERPFVCTVCGKAFARQHDRKRHEGLHSGEKKFVCRGDLSRGGQWGCGRRFARADALGRHFRSEAGRICIKPLLDEESQERERTLINQQQQHLQPVNQPLMLPGQGTEAQHTGSFILPAALLAQYPALQTLQWDQIPAGTDDTSDIGGRNSFDASSGGEFGFDDDESGISVSGMSTGYASDQGNIYNVDAQGQMLGVNPGEAGYANPNWGK

酿酒酵母Crz1蛋白的氨基酸序列在下面作为SEQ ID NO:3示出：

MSFSNGNMASYMTSSNGEEQSINNKNDIDDNSAYRRNNFRNSSNSGSHTFQLSDLDLDVDMRMDSANSSEKISKNLSSGIPDSFDSNVNSLLSPSSGSYSADLNYQSLYKPDLPQQQLQQQQLQQQQQQQQQQQQQQQKQTPTLKVEQSDTFQWDDILTPADNQHRPSLTNQFLSPRSNYDGTTRSSGIDSNYSDTESNYHTPYLYPQDLVSSPAMSHLTANNDDFDDLLSVASMNSNYLLPVNSHGYKHISNLDELDDLLSLTYSDNNLLSASNNSDFNNSNNGIINTADTQNSTIAINKSKVGTNQKMLLTIPTSSTPSPSTHAAPVTPIISIQEFNEGHFPVKNEDDGTLQLKVRDNESYSATNNNNLLRPDDNDYNNEALSDIDRSFEDIINGRKLKLKKSRRRSSQTSNNSFTSRRSSRSRSISPDEKAKSISANREKLLEMADLLPSSENDNNRERYDNDSKTSYNTINSSNFNEDNNNNNLLTSKPKIESGIVNIKNELDDTSKDLGILLDIDSLGQFEQKVGFKNDDNHENNDNGTFSVKKNDNLEKLDSVTNNRKNPANFACDVCGKKFTRPYNLKSHLRTHTNERPFICSICGKAFARQHDRKRHEDLHTGKKRYVCGGKLKDGKPWGCGKKFARSDALGRHFKTESGRRCITPLYEEARQEKSGQES

烟曲霉Crz1蛋白的氨基酸序列在下面作为SEQ ID NO:4示出：

MASQEMFPELGQSPAPGVKSRGVSRSPHPHQQQQQQQHQQHQGQFTGTVTGLDLDSSIATASSFANSSFDPNSNNVSPSAESYGYTAAGYLSGTPASQTDQNYANSLQIPQSYGTGLVPQFNESRGLPIQQQSQQQHHQQPSLDDNFSDLLNSNATEYDFNTVYQTHSPSSNTAPEYDSSLLLDPQVHQQSHPTQIPSSHSSTSPQISPLEQQQHSSPGPMSTQGSTTVAYYTPQHSRHASLDPATAAFLTSNTHPDWQAVMGNSAAFQGHRRAPSEVSEISSAAPSPYLSQHESFDGVDNNPSPLLAPQNDPSLYDSALGIENFTLSEQHQQHQGFSPAHSPYISPRLMPQQGQEMMPNVPYLSGPAPNTQYPTPPNDMYGNGAEGMMNMSQGTHPSVDIGQASQMAPPSINVEFAPPSRIPSFGPSKPASNLDSLSPPPSSTRSRGRSKSDPYAHPSTSRLRSSSTSSSLDPLAPTTPRSLSPFDSFGRQQQSNPSSRDPSPSRSNRRLSTSSIDSRNYILGLADPQRPGASPNDSKRVQKHPATFQCNLCPKRFTRAYNLRSHLRTHTDERPFVCTVCGKAFARQHDRKRHEGLHSGEKKFVCQGELSRGGQWGCGRRFARADALGRHFRSEAGRICIKPLLDEESQERERSLMDQQQHHLQPLPQQVMVPVDNPHAGNFVLPAALLAQYPALQTLQWDQIAASADDPSDIGGRSSFDASSGNEFGFEDDDSGLSSVSGINAGYSAAGNFY

马内菲青霉Czr1蛋白的氨基酸序列在下面作为SEQ ID NO:5示出：

MENHGQYANRGRSPSASVHSRNVSPSPHHGQHSPYHDPSAAGLMLDASTAGTGYQSNLTFTTAPPLSSSLAPDSNNPDLYNNFLTATTTSQQHDSLAAQNDQFASSVAATFQDQLDQSATHQDANYSNLLNPNPNDYDFTQYAVGGDNAVMQSAFDSSLLLDQQQQQQQQQQQHNTQNVQLMGQGDMTQMGSPNNLLSPEHHSSPGNSHTSPPISSGPFYSPGHSRSASLDPMSAAYMSNHNQAQDWKNMLENHSFQSHRRAPSEHSDVSSVAHSPYAGHHESFDALDGASPSLGAQNDPVLYDNTLAMDSFTLSEQQQGLSPHHSPYISPQMPSQDITSDAFILSGQQNMTQFPTLPHDIFTGQPDDGMLAGTQAPDMSGLDANQMNNMVPPPSINVEFAPPSRMPSFGPGGENDFDALSPPSRGSRGRSKSDPFGRPTPIVRPHSQSVSSTSSLDPAVGSSPRSLSPFDSMGGSRSNPGSRGVSPASRSSIRRQSTSSIERKVILDLADPQRPGATPGESKRTQKHPATFQCNLCPKRFTRAYNLRSHLRTHTDERPFVCTVCGKAFARQHDRKRHEGLHSGEKKFVCRGDLASRGQWGCGRRFARADALGRHFRSEAGRACIKALLDEEAIERNRIFMEQQAQQQAQQQHLQPVPQPLMVPGLDNQAGFTLPAALLAQYPALQNLQWDQIATSGTDDVSDISARNSFDAGSGGEFGFDDDDLSIGSFTGASGQGVIYAGGSHPTSAPNFALEATDPNFTGQEWSQ

黄曲霉Czr1蛋白的氨基酸序列在下面作为SEQ ID NO:6示出：

MASQDTLRDAGQSTADVKNRSVSPSAHPQHQYNNASPGLTLDPSFTVSSFQNSASFNANPNSNSPGADSYSYTAGGYLSPTSAQTLAPPDQAFSHSLQLQSFDPGLVNQLDHSSGLSMQPQLQQHQQPHEENFSTLLNSNPTDFDFSLYPNHSPNSTTASEYDSSLMLDTQMQGHPQQVNQAVNPVDLIGQMPSPHSVTSPQMSPQEQQPHHSSPGPMSPPNSTPGAYYTPQHSRHTSLDPASAAYMTGNAPPDWQSMMGNAAFQGHRRAPSEVSEVSSAAPSPYMSHHESFDGVDNNPSPLLAPQNDPGLYDSSLGIESFTLSEQQQQQQHQQGISPIHSPYISPQLMPQQGNDLIPNMPYISAPAGNRYSCPPTDIYGNGAEGVISMPQGTAMVGDIGQASQMAPPSINVEFAPPAKNPIFPPAKPAADLDSLSPPPSTRRMRSKSDPYAHPASRSRSPVSVSSSLEPLAPSSPRSLSPFDSTGRQPHSNPSSREPSPSRSRRLSTSSIDNRNYILGLADPQRPGASPNDSKRVQKHPATFQCHLCPKRFTRAYNLRSHLRTHTDERPFVCTVCGKAFARQHDRKRHEGLHSGEKKFVCRGDLSRGGQWGCGRRFARADALGRHFRSEAGRICIKPLLDEESQERERTLMDQQNQQHAGHLQPVPQPLMVPGMDGQHANGFVLPAALLAQYPALQNLQWDQITAAAEDPSDIGGRSSFDASSGGEFGFEDDESNLSSVSGMSGYGSPQDNLYVMNNQNQMLNVNPGDSGYA

在本发明的组合物和方法的一些实施例中，在生产水平中改变的Crz1蛋白的氨基酸序列具有指定程度的与SEQ ID NOs:1、2、3、4、5或6的总体氨基酸序列同一性，例如与SEQ ID NOs:1、2、3、4、5或6至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、或甚至至少约99%的同一性。编码每条氨基酸序列的核苷酸序列可从BLAST搜索每一相应的蛋白质来鉴定，如本领域技术人员已知的。

在本发明的组合物和方法的一些实施例中，被破坏的crz1基因编码这样的Crz1蛋白，所述Crz1蛋白与SEQ ID NOs:1、2、3、4、5或6的氨基酸序列具有指定程度的总体氨基酸序列同一性，例如与SEQ ID NOs:1、2、3、4、5或6至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、或甚至至少约99%的同一性。

本文提供的氨基酸序列信息允许技术人员鉴定任何丝状真菌中的Crz1蛋白和编码Crz1蛋白的核酸序列，并且在crz1基因中作出适当的破坏以影响Crz1蛋白的产生。编码SEQ ID NOs:1、2、3、4、5和6的多核苷酸序列可在GenBank或JGI数据库中找到，如本领域技术人员已知的。

在另一方面，提供了改变丝状真菌细胞的形态的方法。与亲本细胞生长和细胞肉汤粘度相比，变异丝状真菌细胞在固体培养基上表现出改变的生长形态并且在深层培养中生长时产生具有不同粘度的细胞肉汤。

在一些情形中，该方法包括使用合适的遗传方法破坏亲本株中的crz1基因，其中在好氧发酵过程中，破坏的crz1变异株在深层培养中的好氧发酵过程中产生的这样细胞肉汤，所述细胞肉汤与亲本株的细胞相比需要减少的搅拌来维持预选的溶氧量，或在预选的搅拌量处维持增加的溶氧量。此类方法可用于以上文及其他地方所述的任何方式破坏crz1基因，如本领域技术人员已知的。优选地，使用序列特异性的分子生物学技术（与通常不靶向特定核酸序列的化学诱变相反），通过遗传操作进行crz1基因的破坏。然而，化学诱变也可用于实现令人满意的结果。

在一些实施例中，粘度降低表型被引入其中从而产生粘度降低菌株的亲本株已包含旨在以高水平表达的所关注的基因。这样，本发明方法避免了将所关注基因引入预先存在的粘度降低菌株来进行生产的需要。因而，本发明方法可用于从已包含所关注的基因的亲本株产生丝状真菌细胞的粘度降低变异株。

VI.实用性

已知丝状真菌的粘度降低菌株可用于改善深层培养物中的氧气和营养物质的分布、降低搅拌深层培养物所需的能量量以及增加培养物中存在的细胞群，从而导致蛋白质产量增加。此外，本发明的丝状真菌变异株提供优于以前描述的粘度降低菌株的明显优势。

首先，本发明的菌株可具有清晰界定的基因组，使得其非常适合后续遗传操作、互补、交配等。其次，例如通过导致伴随的粘度改变的操作，本发明的菌株仍能够具有高水平的蛋白质生产。第三，粘度降低菌株可基本上从任何亲本株产生，包括已产生期望高水平表达的蛋白质（即所关注的蛋白质）、已编码选择性标记或已包括在生产宿主中理想的其他特征的亲本株。因而，本发明菌株和方法消除了将编码所关注的蛋白质的基因转移进预先存在的粘度降低的生产菌株中的需要。

本发明的菌株和方法可用于在丝状真菌的深层培养物中生产商业上重要的蛋白质。商业上重要的蛋白质包括例如纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶、裂解酶、蛋白酶、激酶、淀粉酶、支链淀粉酶、脂肪酶、酯酶、过水解酶、转移酶、漆酶、过氧化氢酶、氧化酶、还原酶、叶绿素酶、疏水蛋白、凝乳酶、碳酸酐酶、胸苷酸合酶(hymidylate synthase)、二氢叶酸还原酶、酪氨酸激酶、多药耐药蛋白（如ABC P-gp蛋白）、CAD（氨甲酰磷酸合酶、天冬氨酸转氨甲酰酶、二氢乳清酸酶）、拓扑异构酶、核糖核苷酸还原酶和抗体以及能够在丝状真菌中表达的其他酶和非酶蛋白质。此类蛋白质可适合于工业、医药、动物健康以及食品和饮料用途。

下列带编号的段落进一步描述了本发明组合物和方法的多个方面和实施例：这些带编码的段落每一者的主题可单独使用或与任何其他带编号的段落的主题结合使用，如所指出的那样。

1.在一个方面，提供衍生自亲本株的丝状真菌变异株，该变异株包含引起变异株的细胞与亲本株的细胞相比产生改变量的功能性Crz1蛋白的遗传改变，其中变异株的细胞在深层培养中的好氧发酵过程中产生这样的细胞肉汤，所述细胞肉汤(i)与亲本株的细胞相比，需要改变的搅拌量来维持预选的溶氧量，和/或(ii)与亲本株的细胞相比，在预选的搅拌量处维持改变的溶氧量。

2.在段落1的变异株的一些实施例中，功能性Crz1蛋白的改变量为减少量，并且变异株在深层培养中的好氧发酵过程中产生这样的细胞肉汤，所述细胞肉汤(i)与亲本株的细胞相比，需要减少的搅拌来维持预选的溶氧量，和/或(ii)与亲本株的细胞相比，在预选的搅拌量处维持增加的溶氧量。

3.在段落1或2的变异株的一些实施例中，遗传改变包含亲本株中存在的crz1基因的破坏。

4.在段落3的变异株的一些实施例中，crz1基因的破坏是crz1基因的全部或部分缺失的结果。

5.在段落3的变异株的一些实施例中，crz1基因的破坏是包含crz1基因的基因组DNA的一部分缺失的结果。

6.在任何权利要求3的变异株的一些实施例中，crz1基因的破坏是crz1基因诱变的结果。

7.在段落3-6中任一者的变异株的一些实施例中，crz1基因的破坏使用位点特异性重组进行。

8.在段落3-7中任一者的变异株的一些实施例中，crz1基因的破坏与在crz1基因的基因座处引入选择性标记组合进行。

9.在段落1-8中任一者的变异株的一些实施例中，变异株不产生功能性Crz1蛋白。

10.在段落1-8中任一者的变异株的一些实施例中，变异株不产生Crz1蛋白。

11.在段落1-10中任一者的变异株的一些实施例中，变异株还包含编码所关注的蛋白质的基因。

12.在段落1-11中任一者的变异株的一些实施例中，还包含sfb3基因的破坏。

13.在段落1-12中任一者的变异株的一些实施例中，还包含至少一个选自以下的基因的破坏：sfb3基因、seb1基因、mpg1基因、gas1基因和tps2。

14.在段落1-13中任一者的变异株的一些实施例中，变异株每单位量生物质产生与亲本株基本上相同量或更多的蛋白质。

15.在段落1-14中任一者的变异株的一些实施例中，丝状真菌为盘菌亚门物种。

16.在段落1-15中任一者的变异株的一些实施例中，丝状真菌为木霉属物种。

17.在段落1-16中任一者的变异株的一些实施例中，丝状真菌为里氏木霉。

18.在另一个方面，提供产生丝状真菌细胞变异株的方法，该方法包括：将遗传改变引入丝状真菌细胞的亲本株中，与所述亲本株的细胞相比所述遗传改变改变了功能性Crz1蛋白的产生，从而产生变异丝状真菌细胞，该变异丝状真菌细胞在深层培养中的好氧发酵过程中产生这样的细胞肉汤，所述细胞肉汤(i)与亲本株的细胞相比，需要改变的搅拌量来维持预选的溶氧量，和/或(ii)与亲本株的细胞相比，在预选的搅拌量处维持改变的溶氧量。

19.在段落18的方法的一些实施例中，遗传改变减少或防止功能性Crz1蛋白的产生，从而产生变异丝状真菌细胞，该变异丝状真菌细胞在深层培养中的好氧发酵过程中产生这样的细胞肉汤，所述细胞肉汤(i)与亲本株的细胞相比，需要减少的搅拌来维持预选的溶氧量，和/或(ii)与亲本株的细胞相比，在预选的搅拌量处维持增加的溶氧量。

20.在段落18或19的方法的一些实施例中，遗传改变包含使用遗传操作破坏亲本丝状真菌细胞中的crz1基因。

21.在段落18-20中任一者的方法的一些实施例中，遗传改变包含使用遗传操作缺失亲本丝状真菌细胞中的crz1基因。

22.在段落18-21中任一者的方法的一些实施例中，遗传改变使用位点特异性遗传重组进行。

23.在段落18-22中任一者的方法的一些实施例中，crz1基因的破坏与在crz1基因的基因座处引入选择性标记组合进行。

24.在段落18-23中任一者的方法的一些实施例中，crz1基因的破坏与破坏sfb3基因组合进行。

25.在段落18-24中任一者的方法的一些实施例中，crz1基因的破坏与至少一个选自以下的基因的破坏组合进行：sfb3基因、seb1基因、mpg1基因、gas1基因和tps2基因。

26.在段落18-25中任一者的方法的一些实施例中，变异株每单位量生物质产生与亲本株基本上相同量或更多的蛋白质。

27.在段落18-26中任一者的方法的一些实施例中，丝状真菌为盘菌亚门物种。

28.在段落18-27中任一者的方法的一些实施例中，丝状真菌为木霉属物种。

29.在段落18-28中任一者的方法的一些实施例中，丝状真菌为里氏木霉。

30.在段落18-29中任一者的变异株的一些实施例中，亲本株还包含编码所关注的蛋白质的基因。

31.在段落30的方法的一些实施例中，在引入减少或防止功能性Crz1蛋白的产生的遗传改变之前，编码所关注的蛋白质的基因存在于亲本株中。

32.在另一方面，提供了由段落11的变异株产生的所关注的蛋白质。

33.在另一方面，提供了通过段落18-31中任一者的方法产生的丝状真菌的变异株。

34.在另一个方面，提供衍生自亲本株的丝状真菌变异株，该变异株包含：

(a)遗传改变，所述遗传改变导致(i)与所述亲本株的细胞相比，在深层培养物中需要减少的搅拌来维持预选的溶氧量，和/或(ii)与所述亲本株的细胞相比，在预选的搅拌量处维持深层培养物中增加的溶氧量，和

(b)编码所关注的蛋白质的基因，其中所述编码所关注的蛋白质的基因在(a)中的遗传改变之前存在于该变异株中。

35.在段落34的变异株的一些实施例中，遗传改变包含亲本株中存在的crz1基因的破坏。

36.在段落35的变异株的一些实施例中，crz1基因的破坏与在crz1基因的基因座处引入选择性标记组合进行。

37.在段落35或36的变异株的一些实施例中，crz1基因的破坏与破坏至少一个选自以下的基因组合进行：sfb3基因、seb1基因、mpg1基因、gas1基因、tps2基因。

38.在段落35-37中任一者的变异株的一些实施例中，crz1基因的破坏与破坏seb1基因组合进行。

根据本说明，本发明菌株和方法的这些及其他方面和实施例对技术人员将是显而易见的。如下实例旨在进一步举例说明（但不限制）所述菌株和方法。

实例

实例1：从里氏木霉突变体Morph77B7中缺失crz1基因

里氏木霉Morph菌株缺失四种主要的纤维素酶基因（包括cbhI、cbhII、egII和egIV），使其在不存在纤维素酶背景或在降低的纤维素酶背景的情况下特别适用于表达其他蛋白质。参见WO05/001036。

A.产TrGA菌株Morph77B7

此前将上述Morph菌株用处于CBH1启动子控制下的天然木霉葡糖淀粉酶基因(TrGA)进行了转化，amdS用作标记。随后分离含有两个串联拷贝的葡糖淀粉酶(TrGA29-9)的转化株，并将随机化学诱变用于产生突变体(77B7)。随后通过5-氟-乳清酸(FOA)选择分离自发的pyr2突变衍生物。

B.crz1破坏盒的生成

从突变体Morph77B7中缺失里氏木霉crz1(PID36391)。

使用标准的分子生物学程序制备crz1破坏盒质粒pRATT261（图1）。该质粒包括具有2.6Kb区的DNA序列，该区与跨越第三个外显子的部分和邻接的上游序列的DNA序列同源（左旁侧）。在该质粒内还包括的是具有2.4Kb区的DNA序列，该区与跨越crz1基因的第三个外显子的部分和邻接的下游序列的DNA序列同源（右旁侧）。这些序列设计为靶向crz1基因，并用间插盒序列替换基因组在所述左旁侧序列和右旁侧序列之间的区域（支架4上的区域122703至123270。这些间插序列包括来自深绿木霉(Trichoderma atroviride)的pyr2选择标记，旨在使与待转化菌株的基因组中的内源性里氏木霉pyr2的同源性降到最低。紧邻该pyr2选择标记上游的是该标记3'末端的同向重复复制区，其有利于后续失去该标记以及分离转化株/破坏株(disruptant)的有用pyr2突变衍生物。通过PCR使用引物RPG486和RPG489扩增这个crz1破坏盒。汇集多份PCR反应物并用标准的分子生物学程序净化以用于后续步骤。

crz1基因的核酸序列得自JGI数据库：蛋白质ID：36391，名称：gw1.4.693.1 ，可在 http://genome.jgi-psf.org/cgi-bin/dispGeneModel？db=Trire2&id=36391处获得，（美国能源部联合基因组研究所(The Genome Portal of the Department of Energy Joint Genome Institute)I.V.Grigoriev,H.Nordberg,I.Shabalov,A.Aerts,M.Cantor,D.Goodstein,A.Kuo,S.Minovitsky,R.Nikitin,R.A.Ohm,R.Otillar,A.Poliakov,I.Ratnere,R.Riley,T.Smirnova,D.Rokhsar和I.Dubchak.Nucleic Acids Res《核酸研究》20110:gkr947v1-gkr947），如下所公开的。非翻译区用斜体表示，并且5'和3'旁侧为上游或下游序列，编码序列为粗体，并且内含子为小写字母(SEQ ID NO:13)：

GAAACGCAGCTCAGACTGTGATTCGCACCGCTGTACGCGTCCTGCCGCTGTGATAGGGCCGCACCCCCCCAGCACCTTGCATTGCTGCCGCCAGTGCACAGCCTCCTCGGAAGGCTGACTGTGGAATCTGCCTCGCGACAACGAGGTACGGAGACAGACAGACCAAGCGCTCGGCCGCCATCATGGCCCATGAACCCCAGCGTGGAAGGTCGCCGTCGGCCGGTGGCTTTCAGTCTGATATAAACCAATCCCACTCGCCGGCACGGAGCCCGCTGGCACCCACAAATGAGCAGCCATCCGCTGGTCTTGGAGTTGGACTCGGCgtcgacctggattcgtcacagcagcaacaacaactgcagcagcagcagcaacagcaacaacaacagcgactccagCAGCAGCAACAACGAGCATTCGCGGCGCCTCTGCATCCCAACTACGACTCCTTTGGCGCAAACGGCTTCCTCGGCGCACAAGCCAACGCCGTCGACCCGACAAACGGCTTTGATCCCAGCGCGAGCTTCGGACAGCAGCCGGCCACCGGCCCCGACTCCACCCTCTCCCTGAACGCCCAGGCGCAACACAACTACCTCTCCCCAAACCTCCACGACGGTGACTTCTCTCTCTTTCCCTCAGCCGCTGAGCAAGGCGATCAGTACAACGCCCCCCTCTTCGAGCAGCCGCCTCTGGGCGACCTCAATGCCATGACCTCCCCGCACTCGCATCAGTCTCCGACCCCTCCACAGCTCTTCCAGCCGGACAGTCTACAGTCGCCTCCCTTCAACCGACATCAGTTCTCGTCGCCGCCAACTCATTCGAGAAATGCTTCCCTAGGACCCGAAGCCGCGCTTCTCCCTAGCCAGATTGGAGACTGGACCCAGCCGCAGTTTCAGGGTCATCGACGAACCCCCTCTGAGTATTCGGACGTCTCCTCCGTGGCCCCTTCGCCCCATCTCGTCAGTTCCGATACGTTCGACGCCGACCAGTCGGGCCACTCGCCTCTGCAGAGGCCCGCGGATGTTAGCCTCTACCAGGAAGTGCTCGGCATCGGATCCTTCAGCCTGGCTGACCACGGTAGTCCCGGGTATCATGGTCGAAGTCCCTCGCACAGTCCAGCCATCAGCCCTCGGATAATGCCCCAGCAGATGCCGGACACCATGCAGCCCTCTTTCAACCTCATTCCGCCCAATGGCGGCTTTGACGGAGTATCAGGATACCCGGACCTGCAACCTAGCCATGAGAGCTTTCCCTCGCTATCAGGCGGCATGGGCGGCGATATGCACCAGATGGCGCCCCCAGCCATCAACATCGACTTTGCGCCGACCAATTCGAGACAGGGCAGCTTTGAGCCGCCCAAGTCGCAGATGGATCAAGATTCGCTAACACCACCAGAAAGAGgtaggtcctcattcactttgcaacatgggtctaccaactgtaggcgcctaactgacgcgggtattacagGTCGTCCAAAATCTCGCCCGAGAGCGGTCACGGACCCGTTCCACCCCGGTAGCGGAATACTGCCCCCTGGCAATCTGGGCTCCTCTCTCGGCGTTGATCTTGCGGCCCGTTCCGACACAGCATCTCGATCCTTATCCCCTCTAGACAGGTCAGGAACCAGCTCACCAGCATCTCGAAGGCGACAATCGACTTCTTCGGTGCCGAACAACGTCATAGCGTTACGCCTGGCGGACCCGGAGTATCAGAACAGCCAAGAAGCCGGCACAAGCAAGCGCATGCAGAAGCACCCGGCGACCTTTCAGTGTACCTTGTGTCCCAAGAGATTCACCAGAGCTTATAACTTGCGCTCTCACCTGCGAACTCATACCGATGAGCGTCCCTTCGTGTGCACTGTCTGCGGTAAAGCATTTGCTCGACAGCATGACAGGAAACGGCACGAAAGTTTGCACTCAGGAGAGAAGAAGTTTGTCTGTAAGGGGGATCTCAAAACTGGTGGACAATGGGGATGCGGCCGACGGTTTGCGCGAGCGGACGCCTTGGGAAGACATTTCCGGTCCGAAGCAGGCAGGATATGCATCAAGCCCCTCCTAGATGAAGAAATGGTCGAAAGGCAACGCCAGTGGCAGGAACAGCGGATGCAGCAGAATATGGCGCAAAACATGGCCAACCCGCAGGTCATGGGCATGGATGCCGGCCCAGCTTATCCTATGGACGCCAGCGGAAATTACACTCTCCCGCAAGCTCTCCTGGCTCAATATCCAGCACTGGCGCAGATGAACTGGTCAGCGACAGATATGGGAGGCGGGCTGGACGATGAGCTCAGCGGAAGGTCGTCATTTGACGCCAGTGACTACGATGACGGTGACGACGGTGGCTACATCAGTAGTTCTGGGGCCAGATATCCAGAAGAAGGCATGAGTCAGAATTATGCCGACATGAATTATATGGGAGACTACGGGCGCTGAGGAGGCTCTCATGAATTCTTTACATCTTCTTTCTCTTCCACACCTAGCTGTCTTCTTTCCCGACCCTCTACCCCAGCCCCATTTTTCGACTTGCTTGTATCCAACCCTTTCCT

C.菌株Morph77B7Δcrz1的生成

利用PEG介导的转化用crz1破坏盒转化菌株Morph TrGA77B7Δpyr2，并涂布接种于含有山梨醇的Vogel's基本培养基上以根据通过pyr2标记获得的尿苷原养型选择候选者。分离单独的转化株并通过转移至Vogel's基本培养基进行繁殖。PCR分析用于鉴定其中crz1破坏盒通过同源重组在crz1基因座处整合的转化株。通过使用两个引物对扩增具有期望大小的DNA片段来验证Δcrz1破坏盒在crz1基因座处的同源整合。引物对RPG492和RPG253扩增从该破坏盒区的5'末端之外开始并在3'区内结束的DNA片段。引物对RPG491和RPG273扩增在该破坏盒的5'区内开始并在该破坏盒的3'末端之外结束的DNA片段。将所生成的具有确认的crz1破坏盒同源整合的菌株命名为Morph77B7Δcrz1。

表1.实例1中所用的引物

观察到由上述程序获得的Morph77B7Δcrz1在液体培养中具有改变的形态，具有比Morph77B7亲本短的菌丝。在液体培养基中，与含有Morph77B7亲本的培养物相比，含有Morph77B7Δcrz1突变体的培养物在生长过程中也显示更高的溶氧水平（表2）。

使菌株Morph77B7和Morph77B7Δcrz1在深层（液体）培养中的相似条件下生长，并比较它们的生长表型。简而言之，将每种菌株的孢子独立地添加至具有侧挡板和底挡板二者的3L烧瓶中的500mL基础培养基。在高压灭菌30分钟后，添加无菌的60%葡萄糖至终浓度为27.5g/L。培养物在34℃下在振荡温箱中生长48小时。

48小时后，将每个烧瓶的内容物独立地添加至容纳有9.5L培养基的14L发酵罐中，该培养基含有4.7g/L KH₂PO₄、1.0g/L MgSO₄·7·H₂O、4.3g/L(NH₄)₂SO₄和2.5mL/L相同痕量元素溶液。将这些组分在121℃下一起加热灭菌30分钟。将含有60%葡萄糖和0.48%CaCl₂·2·H₂O的溶液分开高压灭菌，冷却并添加到发酵罐至终浓度为75g/L葡萄糖和0.6g/L CaCl₂·2·H₂O。用28%的NH₃将培养基调节至pH3.5，并且整个生长期温度保持在34℃。

当在顶部空间没有增加的压力时（即，0巴表压，1巴绝对压力），将溶氧(DO)探针校准至100%。然后将顶部空间中的压力设定为0.7巴（表压），之后在添加接种培养物之前该氧探针读数为170%。该发酵罐容纳有两个四叶涡轮，其通过最初设定为500rpm的变速马达提供混合。

当培养物生长时，DO含量水平下降，至少部分是由于丝状真菌菌丝增殖而引起的肉汤粘度增加的结果。当DO含量水平下降至低于40%时，增加搅拌速率以将DO含量水平维持在40%。达到750rpm搅拌时，将允许DO含量水平下降至低于40%。如果DO含量水平不下降至低于40%，则在发酵运行期间不必增加搅拌速率，并且初始搅拌速率高于必要速率。当葡萄糖完全消耗时，测量每个发酵罐中产生的生物质的量，发现对于两种菌株而言是基本上相同的。

在给定的搅拌水平下每个发酵罐中的DO含量水平，以及维持给定DO含量水平所需的搅拌量是由于不同的菌株生长表型引起的不同肉汤的粘度的间接量度。尽管仅变动一个变量（例如DO含量或搅拌）并测量另一个变量将是理想的，但希望防止DO含量水平下降至低于40%以确保在每个发酵罐中产生足够的生物质，从而允许在不同菌株的生长特性之间更有意义的比较。

一般来讲，若有必要增加搅拌速率来维持目标DO含量水平，则可通过供应给驱动发酵罐涡轮的马达的功率量来估计搅拌量，其提供了与肉汤粘度相关的尺度。具体地讲，搅拌悬浮培养物所需的额外功率与搅拌速率的三次方成比例。

如表2中所示，与亲本Morph77B7相比，Morph77B7Δcrz1具有肉汤粘度中的降低。在间歇式培养阶段结束，当所有葡萄糖已消耗时，两种菌株均已达到类似的生物质浓度。到该间歇式培养阶段结束，看见Morph77B7对照菌株搅拌增加至616rpm，并且然后看到DO含量水平下降低至40%。菌株Morph77B7Δcrz1不要求如此多的能量来实现相同的生物质浓度。搅拌速率从未增加至高于500rpm，并且%DO从未下降至低于100。

表2.Morph77B7与Morph77b7Δcrz1相比的肉汤粘度

菌株	缺失	DO(%)	搅拌速率(rpm)	生物质(g/kg)	CER(mmol/L/h)
						Morph77b7	无	40	616	38	141
Morph77b7Δcrz1	crz1	100	500	39	120

实例2.通过改变Sfb3、Seb1、Mpg1、Gas1和Tps2生产中的至少一个所产生的累加效应

A.破坏sbf3中的粘度降低

Sfb3基因（也称为Lst1）此前只在出芽酵母（即，酿酒酵母）中得到表征，在所述出芽酵母中它编码与围绕运输小泡（其携带蛋白质从内质网到高尔基体）的COPII蛋白外壳结合的蛋白质。Sfb3以及Sfb2是Sec24的同源物，所有所述基因参与将特定货物蛋白质包装进小泡中。

如表3中所示，从菌株29-9Δsfb3破坏sfb3基因导致这样的菌株，该菌株在生长期结束时维持溶解氧处于40%所需的最高搅拌速率降低。在这些培养条件下，初始菌株(29-9)需要比70H2（化学诱变的29-9）或29-9Δsfb3菌株多2.6倍的功率来维持40%的DO和产生所述生物质量。菌株70H2和29-9Δsfb3在悬浮培养中具有相似的粘度特性，并且产生相似水平的所关注蛋白质(TrGA)，从而证明可通过破坏sfb3基因来给丝状真菌赋予粘度降低的生长表型。在Sfb3蛋白中导致粘度改变的改变还在于2011年8月25日作为国际申请号PCT/US2011/049164提交的、于2012年3月1日公布的PCT公开号WO2012/027580A1中描述，将其以引用方式并入本文。

表3.生长期结束时维持DO为40%所需的搅拌速率

菌株	搅拌速率	相对于500rpm时的基线值的相对功率增加值
			29-9	750	(750/500)³=3.4
70H2	539	(539/500)³=1.3
			29-9Δsfb3	540	(540/500)³=1.3

B.破坏seb1中的粘度降低

来自深绿木霉的Seb1为STRE-元件-结合蛋白，并且据信seb1基因为酵母msn2/4基因和构巢曲霉msnA基因的直系同源物。值得注意的是，seb1基因不能补足酵母中的msn2/4基因，所以可能不是功能性同源物（Peterbauer,C.等人（(2002)Molecular Genetics and Genomics《分子遗传学和基因组学》268:223-31）。Seb1涉及渗透胁迫应答但非该应答所必需的，但是已发现与改变的形态（尤其是在破坏seb1时导致低粘度表型的那些形态）相关。关于seb1破坏的细节可见于2011年4月22日提交的美国临时申请号61/478,160，将其以引用的方式全文并入本文。

如表4中所示，从菌株Morph1/1Δku80中缺失seb1基因导致肉汤粘度降低的菌株。在间歇式培养阶段结束，当所有葡萄糖已消耗时，两种菌株均已达到类似的生物质浓度。到培养阶段结束，对照菌株见到搅拌增加至最大750rpm，然后见到DO下降低至29%。seb1缺失菌株不要求如此多的能量来实现相同的生物质浓度。搅拌速率从未增加至高于500rpm且DO仅下降低至55%。

表4.具有和不具有seb1基因的Morph1/1Δku80中的肉汤粘度

C.破坏mpg1中的粘度降低

mpg1基因编码GTP:α-D-甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶。mpg1基因的过表达可增加GDP-甘露糖水平，其可在蛋白质糖基化的早期阶段起主要调节作用。

如表5中所示，与亲本MAGI相比，MAGI10-8g（mpg1缺失型变异株）的肉汤粘度降低。在间歇式培养阶段结束，当所有葡萄糖已消耗时，两种菌株均已达到类似的生物质浓度。到培养阶段结束，MAGI对照菌株见到搅拌增加至最大750rpm，然后见到DO下降低至35%。菌株MAGI10-8g不要求如此多的能量来实现相同的生物质浓度。当%DO降低至40%时搅拌速率稍微增加至513rpm。与MAGI相比，MAGI10-8g中蛋白质产量未受不利地影响（未示出）。关于mpg1破坏的细节可见于2011年4月22日提交的美国临时申请号61/478,162，将其以引用的方式全文并入本文。

表5.MAGI与MAGI10-8g相比的肉汤粘度

菌株	缺失	DO(%)	搅拌速率(rpm)	生物质(g/kg)	CER(mmol/L/h)
						MAGI	无	35	750	39	125
MAGI10-8g	mpg1	40	513	40	128

D.破坏gas1中的粘度降低

Gel/Gas/Phr家族的真菌β(1,3)-葡聚糖基转移酶通过加工主要组分β(1,3)-葡聚糖在细胞壁生物合成中起重要作用（Popolo等人，2008）。gas1(PID22914)编码β-1,3-葡聚糖基转移酶，该酶为能够分解且连接β-1,3-葡聚糖的GPI（和/或葡聚糖）-锚定蛋白。在许多真菌基因组中存在多种旁系同源物，包括里氏木霉，其具有五种旁系同源物。单独的研究已显示，gas1基因（或如烟曲霉中已知的gel1基因）的突变影响真菌细胞壁结构，并且可导致形态改变以及对荧光增白剂(Calcofluor White)、刚果红和十二烷基硫酸钠的超敏性（Schirawski,J.等人2005，Mouyna,I.等人2005）。

里氏木霉Morph菌株缺失四种主要的纤维素酶基因（包括cbhI、cbhII、egII和egIV），使其在不存在纤维素酶背景或在降低的纤维素酶背景的情况下特别适用于表达其他蛋白质。参见WO05/001036。此前将Morph菌株用处于CBH1启动子控制下的天然木霉属葡糖淀粉酶基因(TrGA)进行转化，使用amdS作为标记。随后分离含有两个串联拷贝的葡糖淀粉酶(TrGA29-9)的转化株，并将随机化学诱变用于产生突变体(77B7)。随后通过5-氟-乳清酸(FOA)选择分离自发的pyr2突变衍生物。从突变体Morph77B7中缺失里氏木霉gas1(PID22914)。

使用PEG介导的转化用gas1破坏盒转化菌株Morph TrGA77B7Δpyr2，并涂布接种于含有山梨醇的Vogel's基本培养基，以基于通过pyr2标记获得的尿苷原养型选择候选者。如表6中所示，与亲本Morph77B7相比，Morph77B7Δgas1具有肉汤粘度中的降低。在间歇式培养阶段结束，当所有葡萄糖已消耗时，两种菌株均已达到类似的生物质浓度。到该间歇式培养阶段结束，看见Morph77B7对照菌株搅拌增加至616rpm，并且然后看到DO含量水平下降低至40%。菌株Morph77B7Δgas1不需要同样多的能量（即在搅拌中的rpm增加）来达到相同生物质浓度。搅拌速率从未增加至高于500rpm，并且%DO从未下降至低于115。与Morph77B7相比，在Morph77B7Δgas1中蛋白质生产未受不利影响（数据未示出）。关于gas1破坏的细节可见于2011年4月29日提交的美国临时申请号61,480,602，所述美国临时申请以引用的方式全文并入本文。

表6.Morph77B7与Morph77b7Δgas1相比的肉汤粘度

菌株	缺失	DO(%)	搅拌速率(rpm)	生物质(g/kg)	CER(mmol/L/h)
						Morph77b7	无	40	616	38	141
Morph77b7Δgas1	gas1	115	500	39	147

E.破坏tps1中的粘度降低

基因tps2编码涉及二糖海藻糖的合成的海藻糖-磷酸磷酸酶。海藻糖为胁迫诱导的糖，该糖可缓冲变性蛋白质在细胞质和ER中的再折叠（Singer,M等人1998，Simola,M等人2000）。各种各样的生物体响应多种胁迫大量产生该二糖。在酵母中，海藻糖在高温下稳定蛋白质并且帮助热损害的蛋白质再折叠（Simola,M等人2000）。

如上所述制备里氏木霉Morph菌株。从突变体Morph77B7中缺失里氏木霉tps2(PID48707)。利用PEG介导的转化用tps2破坏盒转化菌株Morph TrGA77B7Δpyr2，并涂布接种于含有山梨醇的Vogel's基本培养基上，以根据通过pyr2标记获得的尿苷原养型选择候选者。如表7中所示，与亲本Morph77B7相比，Morph77B7Δtps2的肉汤粘度降低。在间歇式培养阶段结束，当所有葡萄糖已消耗时，两种菌株均已达到类似的生物质浓度。到该间歇式培养阶段结束，看见Morph77B7对照菌株搅拌增加至616rpm，并且然后看到DO含量水平下降低至40%。菌株Morph77B7Δtps2不要求如此多的能量来实现相同的生物质浓度。搅拌速率从未增加至高于500rpm，并且%DO从未下降至低于110。关于tps1破坏的细节可见于2011年4月29日提交的美国临时申请号61,480,629，将其以引用的方式全文并入本文。

表7.Morph77B7与Morph77b7Δtps2相比的肉汤粘度

菌株	缺失	DO(%)	搅拌速率(rpm)	生物质(g/kg)	CER(mmol/L/h)
						Morph77b7	无	40	616	38	141
Morph77b7Δtps2	tps2	110	500	41	94

尽管为了清楚的理解已通过示例和实例更详细地描述了上述组合物和方法，但本领域技术人员将显而易见的是可作出某些改变和修改。因而，所述描述不应理解为限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书描述。

本文引用的全部出版物、专利以及专利申请特此全文以引用方式并入以用于所有目的、且达到与犹如每个单独的专利公开、专利或专利申请被特别和单独地指出以便如此以引用方式并入相同的程度。

参考文献

以下参考文献和本文引用的另外的参考文献特此以引用方式并入：

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Claims

1.一种衍生自亲本株的丝状真菌变异株，所述变异株包含引起所述变异株的细胞与所述亲本株的细胞相比产生改变量的功能性Crz1蛋白的遗传改变，其中所述变异株的细胞在深层培养中的好氧发酵过程中产生这样的细胞肉汤，所述细胞肉汤(i)与所述亲本株的细胞相比，需要改变的搅拌量来维持预选的溶氧量，和/或(ii)与所述亲本株的细胞相比，在预选的搅拌量处维持改变的溶氧量。

2.根据权利要求1所述的变异株，其中所述功能性Crz1蛋白的改变量为减少量，并且所述变异株在深层培养中的好氧发酵过程中产生这样的细胞肉汤，所述细胞肉汤(i)与所述亲本株的细胞相比，需要减少的搅拌来维持预选的溶氧量，和/或(ii)与所述亲本株的细胞相比，在预选的搅拌量处维持增加的溶氧量。

3.根据权利要求1或2所述的变异株，其中所述遗传改变包含所述亲本株中存在的crz1基因的破坏。

4.根据权利要求3所述的变异株，其中所述crz1基因的破坏是所述crz1基因的全部或部分缺失的结果。

5.根据权利要求3所述的变异株，其中所述crz1基因的破坏是包含所述crz1基因的基因组DNA的一部分缺失的结果。

6.根据任何权利要求3所述的变异株，其中所述crz1基因的破坏是所述crz1基因诱变的结果。

7.根据权利要求3-6中任一项所述的变异株，其中所述crz1基因的破坏使用位点特异性重组进行。

8.根据权利要求3至7中任一项所述的变异株，其中所述crz1基因的破坏与在所述crz1基因的基因座处引入选择性标记组合进行。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的变异株，其中所述变异株不产生功能性Crz1蛋白。

10.根据权利要求1-8中任一项所述的变异株，其中所述变异株不产生Crz1蛋白。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的变异株，其中所述变异株还包含编码所关注的蛋白质的基因。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的变异株，其还包含sfb3基因的破坏。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的变异株，其还包含至少一个选自以下的基因的破坏：sfb3基因、seb1基因、mpg1基因、gas1基因和tps2基因。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的变异株，其中所述变异株每单位量生物质产生与所述亲本株基本上相同量或更多的蛋白质。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的变异株，其中所述丝状真菌为盘菌亚门(Pezizomycotina)物种。

16.根据权利要求1-15中任一项所述的变异株，其中所述丝状真菌为木霉属(Trichoderma)物种。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的变异株，其中所述丝状真菌为里氏木霉(Trichoderma reesei)。

18.一种产生丝状真菌细胞变异株的方法，其包括：将遗传改变引入丝状真菌细胞的亲本株中，与所述亲本株的细胞相比所述遗传改变改变了功能性Crz1蛋白的产生，从而产生变异丝状真菌细胞，所述变异丝状真菌细胞在深层培养中的好氧发酵过程中产生这样的细胞肉汤，所述细胞肉汤(i)与所述亲本株的细胞相比，需要改变的搅拌量来维持预选的溶氧量，和/或(ii)与所述亲本株的细胞相比，在预选的搅拌量处维持改变的溶氧量。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述遗传改变减少或防止功能性Crz1蛋白的产生，从而产生变异丝状真菌细胞，所述变异丝状真菌细胞在深层培养中的好氧发酵过程中产生这样的细胞肉汤，所述细胞肉汤(i)与所述亲本株的细胞相比，需要减少的搅拌来维持预选的溶氧量，和/或(ii)与所述亲本株的细胞相比，在预选的搅拌量处维持增加的溶氧量。

20.根据权利要求18或19所述的方法，其中所述遗传改变包含使用遗传操作破坏亲本丝状真菌细胞中的所述crz1基因。

21.根据权利要求18-20中任一项所述的方法，其中所述遗传改变包含使用遗传操作缺失亲本丝状真菌细胞中的所述crz1基因。

22.根据权利要求18-21中任一项所述的方法，其中所述遗传改变使用位点特异性遗传重组进行。

23.根据权利要求18-22中任一项所述的方法，其中所述crz1基因的破坏与在所述crz1基因的基因座处引入选择性标记组合进行。

24.根据权利要求18-23中任一项所述的方法，其中所述crz1基因的破坏与破坏所述sfb3基因组合进行。

25.根据权利要求18-24中任一项所述的方法，其中所述crz1基因的破坏与至少一个选自以下的基因的破坏组合进行：sfb3基因、seb1基因、mpg1基因、gas1基因和tps2基因。

26.根据权利要求18-25中任一项所述的方法，其中所述变异株每单位量生物质产生与所述亲本株基本上相同量或更多的蛋白质。

27.根据权利要求18-26中任一项所述的方法，其中所述丝状真菌为盘菌亚门物种。

28.根据权利要求18-27中任一项所述的方法，其中所述丝状真菌为木霉属物种。

29.根据权利要求18-28中任一项所述的方法，其中所述丝状真菌为里氏木霉。

30.根据权利要求18-29中任一项所述的方法，其中所述亲本株还包含编码所关注的蛋白质的基因。

31.根据权利要求30所述的方法，其中在引入所述减少或防止功能性Crz1蛋白的产生的遗传改变之前，所述编码所关注的蛋白质的基因存在于所述亲本株中。

32.一种所关注的蛋白质，其由根据权利要求11所述的变异株产生。

33.一种丝状真菌变异株，其通过根据权利要求18-31中任一项所述的方法产生。

34.一种衍生自亲本株的丝状真菌变异株，其包含：

(b)编码所关注的蛋白质的基因，

其中所述编码所关注的蛋白质的基因在(a)中的所述遗传改变之前存在于所述变异株中。

35.根据权利要求34所述的变异株，其中所述遗传改变包含所述亲本株中存在的所述crz1基因的破坏。

36.根据权利要求35所述的变异株，其中所述crz1基因的破坏与在所述crz1基因的基因座处引入选择性标记组合进行。

37.根据权利要求35或36所述的变异株，其中所述crz1基因的破坏与破坏至少一个选自以下的基因组合进行：sfb3基因、seb1基因、mpg1基因、gas1基因和tps2基因。

38.根据权利要求35-37中任一项所述的变异株，其中所述crz1基因的破坏与破坏所述seb1基因组合进行。