BR112021001743A2

BR112021001743A2 - cepas mutantes de um fungo filamentoso do gênero trichoderma e métodos para a produção de uma proteína e para a produção de uma celulase

Info

Publication number: BR112021001743A2
Application number: BR112021001743-7A
Authority: BR
Inventors: Yusuke KAGAWA; Shingo Hiramatsu; Katsushige Yamada
Original assignee: Toray Industries, Inc.
Priority date: 2018-07-30
Filing date: 2019-07-29
Publication date: 2021-04-27
Also published as: CN118240671A; WO2020027010A1; US12037624B2; AU2019313902A1; EP3831929A1; US20210222221A1; JP7459509B2; CA3108045A1; CN112513249B; CN112513249A; JPWO2020027010A1; EP3831929A4

Abstract

A presente invenção refere-se a: uma cepa mutante de um fungo filamentoso Trichoderma possuindo uma mutação que resulta na perda ou diminuição da função de uma subunidade grande da beta-adaptina, ou uma mutação em uma sequência de aminoácidos que forma a subunidade grande da beta-adaptina; e um método para produzir uma proteína enquanto uma baixa viscosidade em uma solução de cultura durante a cultura é mantida pelo uso da cepa mutante.

Description

“CEPAS MUTANTES DE UM FUNGO FILAMENTOSO DO GÊNERO TRICHODERMA E MÉTODOS PARA A PRODUÇÃO DE UMA PROTEÍNA E PARA A PRODUÇÃO DE UMA CELULASE” CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a uma cepa mutante de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma, sendo a referida cepa mutante capaz de manter uma viscosidade de uma solução de cultura baixa; e a um método de produção de proteína usando a referida cepa mutante.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Os fungos filamentosos do gênero Trichoderma são conhecidos por terem uma alta capacidade de produção de proteínas, e diversos estudos foram feitos até agora sobre a produção de proteínas usando os fungos filamentosos do gênero Trichoderma. Especificamente, os fungos filamentosos do gênero Trichoderma são especialmente utilizados para a produção de uma celulase classificada como enzima de sacarificação entre proteínas que utilizam celulose, lactose, celobiose ou similares como um indutor. A fim de aumentar a quantidade de produção de celulase, várias investigações têm sido feitas até o momento, tais como modificações genéticas, incluindo superexpressão ou deleção de um fator que controla a produção de celulase e otimização das condições de cultivo.

[003] No entanto, os fungos filamentosos do gênero Trichoderma pertencem aos fungos filamentosos aeróbios, que necessitam essencialmente oxigênio para crescimento e produção de proteínas. Os fungos filamentosos do gênero Trichoderma são caracterizados por, nos casos em que os fungos filamentosos são cultivados em meio de cultura líquido, um aumento na viscosidade da solução de cultivo causado pelo crescimento dos fungos filamentosos. O aumento na viscosidade da solução de cultura resulta em uma distribuição desigual de oxigênio e nutrientes. Portanto, é necessário cultivar um fungo filamentoso do gênero Trichoderma sob agitação da solução de cultura ou aumentar a taxa de alimentação de oxigênio para evitar que o grau de saturação de oxigênio dissolvido na solução de cultura diminua, mantendo o grau de saturação igual ou superior a determinado nível. Entretanto, o uso de um tanque de cultivo de maior dimensão resulta em uma diminuição do coeficiente de transferência de oxigênio, sendo necessário, para manter o grau de saturação do oxigênio dissolvido na solução de cultivo a um determinado nível ou acima dele, aumentar ainda mais o número de agitações ou a taxa de alimentação com oxigênio. Entretanto, aumentar o número de agitações representa um problema, pois os corpos dos fungos sofrem danos consideráveis por cisalhamento, enquanto o aumento da taxa de alimentação de oxigênio representa um problema, pois uma quantidade maior de energia é necessária.

[004] Os documentos patentários 1 a 6 descrevem que nos casos em que as proteínas Sfb3, Mpg1, Gas1, Seb1, Crz1, e Tps1 de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma são destruídos ou têm suas produções reduzidas, as cepas mutantes podem ser cultivadas por fermentação aeróbia em cultura submersa, mantendo uma concentração de oxigênio dissolvido com um pequeno número de agitação, em comparação com suas cepas parentais. O Documento Patentário 7 indica que ao destruir um gene BXL1 de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma, a solução de cultura pode ter a diminuição no grau de saturação de oxigênio dissolvido inibida.

LISTA DE CITAÇÕES

[005] Literatura Pantentária: - Documento Patentário 1: JP-T-2013-533751 (O termo “JP-T”, conforme utilizado na presente invenção, designa uma tradução para japonês de um pedido de patente PCT publicado); - Documento Patentário 2: JP-T-2014-513529; - Documento Patentário 3: JP-T-2014-513530;

- Documento Patentário 4: JP-T-2014-513531; - Documento Patentário 5: JP-T-2014-513532; - Documento Patentário 6: JP-T-2014-513533; e - Documento Patentário 7: Publicação internacional WO 2017/170917.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO PROBLEMA TÉCNICO

[006] Como descrito acima, é extremamente importante, na produção de uma proteína usando um fungo filamentoso do gênero Trichoderma, inibir a diminuição na concentração de oxigênio dissolvido na solução de cultura e manter a sua concentração em ou acima de um determinado nível. Acredita-se que na produção de uma proteína pelo cultivo em meio líquido de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma, se a viscosidade da solução de cultura puder ser mantida baixa, não apenas a energia necessária para a agitação pode ser reduzida, como também a redução no grau de saturação de oxigênio dissolvido na solução de cultura pode ser inibida, mesmo no caso de se utilizar uma escala de cultivo ampliada. Um objetivo da presente invenção é obter uma cepa mutante de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma que torna a viscosidade da solução de cultura baixa e fornecer um método para a produção de proteína usando a cepa mutante de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma.

SOLUÇÃO PARA O PROBLEMA

[007] Os presentes inventores fizeram investigações diligentemente a fim de especificar um gene de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma que permite que a solução de cultura mantenha uma viscosidade baixa. Como resultado, os inventores descobriram que uma mutação de uma subunidade grande da beta-adaptina torna possível manter a viscosidade da solução de cultura baixa e inibir a diminuição do grau de saturação do oxigênio dissolvido na solução de cultura. A presente invenção foi realizada com base nesta descoberta.

[008] Mais especificamente, a presente invenção consiste nos seguintes itens de (1) a (8): (1) Uma cepa mutante de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma, cuja cepa mutante possui uma mutação que exclui ou reduz a função de uma subunidade grande da beta-adaptina, em que uma solução de cultura da cepa mutante tem uma viscosidade mais baixa do que uma solução de cultura de uma cepa parental sem a referida mutação que exclui ou reduz a função da subunidade grande da beta-adaptina; (2) Uma cepa mutante de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma, cuja cepa mutante possui uma mutação em uma sequência de aminoácidos que constitui uma subunidade grande da beta-adaptina, em que uma solução de cultura da cepa mutante tem uma viscosidade mais baixa do que uma solução de cultura de uma cepa parental sem a referida mutação na sequência de aminoácidos que constitui a subunidade grande da beta-adaptina; (3) A cepa mutante de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma de acordo com (2), em que a mutação na sequência de aminoácidos é uma mutação em que um resíduo de glutamina que é o 300º resíduo do lado N-terminal da sequência de aminoácidos que constitui a subunidade grande da beta-adaptina foi alterado para um resíduo de aminoácido diferente da glutamina; (4) A cepa mutante de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma de acordo com (3), em que o resíduo de aminoácido diferente de glutamina é lisina; (5) A cepa mutante de um fungo filamentoso do gênero

Trichoderma de acordo com qualquer um de (1) a (4), em que a sequência de aminoácidos que constitui a subunidade grande da beta-adaptina é qualquer uma das sequências de aminoácidos representada pelas SEQ ID NOs: 2 a 10; (6) A cepa mutante de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma de acordo com qualquer um de (1) a (5), em que o fungo filamentoso do gênero Trichoderma é Trichoderma reesei; (7) Um método para a produção de uma proteína, cujo método inclui uma etapa de cultivo da cepa mutante de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma de acordo com qualquer um de (1) a (6); e (8) Um método para a produção de celulase, cujo método inclui uma etapa de cultivo da cepa mutante de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma de acordo com qualquer um de (1) a (6).

EFEITOS VANTAJOSOS DA INVENÇÃO

[009] A cepa mutante de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma da presente invenção não só permite que a solução de cultura retenha uma viscosidade mais baixa do que a cepa original (parental) antes da introdução da mutação, como também pode inibir a diminuição no grau de saturação de oxigênio dissolvido na solução de cultura. Além disso, esta cepa mutante tem um efeito inesperado de que uma proteína, em particular uma celulase, é produzida em uma quantidade melhorada.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[010] A FIG. 1-1 mostra uma comparação entre as sequências gerais de aminoácidos que constituem as subunidades grandes da beta-adaptina possuídas por fungos filamentosos do gênero Trichoderma.

[011] A FIG. 1-2 mostra uma comparação entre as sequências gerais de aminoácidos que constituem as subunidades grandes da beta-adaptina possuídas pelos fungos filamentosos do gênero Trichoderma.

[012] A FIG. 2 mostra mudanças com o tempo transcorrido no grau de saturação de oxigênio dissolvido em soluções de cultura no cultivo de uma cepa QM9414 de Trichoderma reesei e cepa QM9414 mutante I com Arbocel B800.

[013] A FIG. 3 mostra mudanças com o tempo transcorrido na viscosidade das soluções de cultura de uma cepa QM9414 de Trichoderma reesei e cepa QM9414 mutante I com Arbocel B800.

[014] A FIG. 4 mostra mudanças com o tempo transcorrido no grau de saturação de oxigênio dissolvido em soluções de cultura no cultivo de uma cepa QM9414 de Trichoderma reesei e cepa QM9414 mutante II com Arbocel B800.

[015] A FIG. 5 mostra mudanças com o tempo transcorrido na viscosidade das soluções de cultura de uma cepa QM9414 de Trichoderma reesei e cepa QM9414 mutante II com Arbocel B800.

DESCRIÇÃO DE EXEMPLOS DE REALIZAÇÃO

[016] A presente invenção é caracterizada pelo fato de que é introduzida uma mutação em uma cepa parental de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma, que é um micro-organismo que originalmente possui uma excelente capacidade de produção de proteínas, de modo a permitir que a cepa mutante seja cultivada em uma solução de cultura retendo uma baixa viscosidade. A cepa parental de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma a ser usada na presente invenção não está limitada as cepas selvagens e cepas mutantes de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma que foram melhoradas de modo a terem uma maior capacidade de produção de proteínas, assim tais cepas também podem ser favoravelmente utilizadas como cepa parental. Por exemplo, uma cepa mutante com uma propriedade de produção de proteína melhorada obtida pela realização de um tratamento de mutação com um mutagênico, irradiação UV, etc. pode ser utilizada como a cepa parental de uma cepa mutante de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma.

[017] Exemplos específicos de cepas parentais incluem Trichoderma parareesei (ATCC MYA-4777), que é um ancestral da Trichoderma reesei; e as seguintes cepas mutantes conhecidas pertencentes ao Trichoderma reesei: cepa QM6a (NBRC31326), cepa QM9123 (ATCC24449), cepa QM9414 (NBRC31329), cepa PC-3-7 (ATCC66589), cepa QM9123 (NBRC31327), cepa RutC-30 (ATCC56765), cepa CL-847 (Enzyme. Microbiol. Technol., 10, 341-346 (1998)), cepa MCG77 (Biotechnol. Bioeng. Symp., 8, 89 (1978)), cepa MCG80 (Biotechnol. Bioeng., 12, 451-459 (1982)), Trichoderma citrinoviride (ATCC24961), Trichoderma longibrachiatum (ATCC18648), Trichoderma virens (ATCC9645), Trichoderma atroviride (ATCC20476), Trichoderma gamsii (NFCCI2177), Trichoderma asperellum (ATCC52438), Trichoderma harzianum (ATCC20846), e Trichoderma guizhouense. cepa QM6a, cepa QM9419, e cepa QM9123 estão disponíveis pela NBRC (NITE Biological Resource Center), a cepa PC-3-7, cepa RutC-30, Trichoderma citrinoviride, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma virens, Trichoderma atroviride, Trichoderma asperellum e Trichoderma harzianum estão disponíveis pela ATCC (American Type Culture Collection), e Trichoderma gamsii está disponível pela NFCCI (National Fungal Culture Collection of India). Entre estes exemplos, as cepas especialmente preferidas para uso como cepa parental são as cepas pertencentes a Trichoderma reesei.

[018] Uma subunidade grande da beta-adaptina é uma das proteínas que constituem um complexo de proteína adaptadora, que é um tetrâmero. Os complexos de proteínas adaptadoras são amplamente conservados em eucariotos. As proteínas adaptadoras são conhecidas por ligar à clatrina para constituir vesículas que tomam parte no transporte dentro e fora das células e para dentro e fora dos organismos de fungos (Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 101, 14108-14113 (2004)).

[019] Um exemplo preferido dos grandes subunidades da beta-adaptina possuídas pelos fungos filamentosos do gênero Trichoderma é o polipeptídeo constituído por uma sequência de aminoácidos representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 2 a 10. A sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 é derivada de Trichoderma reesei, a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 3 é derivada de Trichoderma citrinoviride, a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 4 é derivada de Trichoderma longibrachiatum, a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO : 5 é derivada de Trichoderma virens, a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 6 é derivada de Trichoderma atroviride, a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 7 é derivada de Trichoderma gamsii, a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 8 é derivada de Trichoderma asperellum, a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 9 é derivada de Trichoderma harzianum, e a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 10 é derivada de Trichoderma guizhouense. Os resultados de um alinhamento das sequências de aminoácidos representados pelas SEQ ID NOs: 2 a 10 são mostrados nas FIGs. 1-1 e 1-2. Conforme mostrado nas figuras FIG. 1-1 e FIG.

1-2, a identidade de sequência para as SEQ ID NOS: 2 a 10 é de 90% ou mais, indicando que as grandes subunidades da beta-adaptina no fungo filamentoso do gênero Trichoderma têm um elevado grau de conservação na sequência de aminoácidos. Além disso, como a FIG. 1-1 mostra, nas sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOs: 2 a 10, um resíduo de glutamina é conservado em comum como o resíduo de aminoácido 300 a partir da extremidade N-terminal. Suas características são explicadas abaixo usando a SEQ ID NO: 2 como exemplo.

[020] O polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 é um polipeptídeo possuído pelo Trichoderma reesei, como afirmado acima, e foi registrado no National Center for

Biotechnology Information como complexo da proteína adaptadora (AP-1), subunidade grande da beta-adaptina (EGR48910) possuída pela cepa QM6a de Trichoderma reesei. Entretanto, a Conserved Domain Architecture Retrieval Tool do National Center for Biotechnology Information revela que do resíduo de aminoácido 14º ao 531º no lado N-terminal há um domínio da região N-terminal da adaptina.

[021] Uma mutação na sequência de aminoácidos que constitui uma subunidade grande da beta-adaptina, na presente invenção, pode ser qualquer deleção, substituição e adição de um aminoácido. É preferível que a mutação seja uma na qual o resíduo de glutamina que é o 300º resíduo de aminoácido a partir do lado N-terminal da sequência de aminoácidos representada por qualquer uma das SEQ ID NOS: 2 a 10 foi alterado para um resíduo de aminoácido diferente da glutamina. É especialmente preferida uma mutação em que o resíduo de glutamina foi alterado para lisina.

[022] Exemplos específicos de genes que codificam o polipeptídeo consistindo da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 incluem a sequência de base representada pela SEQ ID NO: 1.

[023] Exemplos específicos de sequências de bases que codificam a sequência de aminoácidos obtida a partir da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 pela alteração do resíduo de glutamina, que é o resíduo 300º a partir do lado N-terminal por um resíduo de aminoácido diferente de glutamina incluem a sequência de bases representada pela SEQ ID NO: 1, na qual a citosina como base 1.080 foi alterada para adenina. Esta mutação resulta em uma mutação na qual o 300º resíduo de aminoácido do lado N-terminal da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 é alterado de glutamina para lisina.

[024] A cepa mutante de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma da presente invenção pode ser uma cepa mutante na qual uma função de uma subunidade grande da beta-adaptina foi excluída ou reduzida.

[025] A frase “uma função de uma subunidade grande da beta-adaptina é excluída ou reduzida” significa uma perda total ou parcial do polipeptídeo, uma alteração do todo de todo ou de parte do domínio em um(alguns) aminoácido(s) diferente(s) ou uma combinação deles. Mais especificamente, essa frase significa que a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 passa a ter uma identidade de sequência de 80% ou menos, em relação à sequência de aminoácidos da subunidade grande da beta-adaptina descrita acima. A identidade de sequência é preferencialmente de 50% ou menos, mais preferencialmente de 20% ou menos, mais preferencialmente de 10% ou menos, mais preferencialmente de 5% ou menos, mais preferencialmente de 3% ou menos, mais preferencialmente de 1% ou menos, e mais preferencialmente de 0%. Exemplos de métodos para a deleção total ou parcial da subunidade grande da beta-adaptina ou a mudança total ou parcial desta em aminoácido(s) diferente(s) incluem um método em que uma sequência do gene que codifica o polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 sofre uma alteração na fase de leitura ou uma mutação no códon de parada devido à deleção, inserção, substituição de bases, etc.

[026] Os exemplos da redução de uma função de uma subunidade grande da beta-adaptina incluem uma deleção total ou parcial da subunidade grande da beta-adaptina. Também é possível reduzir uma função da subunidade grande da beta-adaptina, introduzindo uma mutação que diminui ou inibe a expressão da subunidade grande da beta-adaptina. A diminuição ou inibição da expressão da subunidade grande da beta-adaptina é atingida causando uma mutação no promotor ou região terminadora de um gene que codifica a subunidade grande da beta-adaptina. Em geral, as regiões promotoras e terminadoras correspondem a uma região de centenas de bases de comprimento antes e depois do gene que participa da transcrição. Sabe-se que, mesmo no caso em que a própria sequência de aminoácidos que constitui uma subunidade grande da beta-adaptina não tenha sofrido uma mutação, tal como uma deleção, substituição ou adição de aminoácido, uma função da proteína é reduzida por uma mutação, tal como uma deleção, substituição ou adição de aminoácido, causada a uma sequência de aminoácido situada fora da subunidade grande da beta-adaptina. Também é conhecido que mesmo no caso em que o próprio gene que codifica uma subunidade grande da beta-adaptina não tenha sofrido uma mutação, como uma deleção, substituição ou adição de bases, uma função da proteína é reduzida por uma mutação, tal como uma deleção, substituição ou adição de bases, em uma sequência de bases situada fora do gene que codifica a subunidade grande da beta-adaptina.

[027] Para a introdução de tais mutações que excluem ou reduzem uma função da subunidade grande da beta-adaptina ou para a introdução de tal mutação na sequência de aminoácidos que constitui a subunidade grande da beta-adaptina, pode-se utilizar métodos de mutação genética conhecidos, como um tratamento de mutação com um mutagênico conhecido por um versado na técnica ou com irradiação UV, etc., recombinação gênica, tal como recombinação homóloga usando um marcador de seleção e uma mutação por transposon.

[028] A cepa mutante de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma da presente invenção tem viscosidade da solução de cultura inferior e é mais eficaz em inibir a diminuição no grau de saturação do oxigênio dissolvido na solução de cultura, quando comparada com a cepa progenitora na qual a mutação não foi introduzida. Assim, a energia necessária para aeração e agitação e frequência de rotação pode ser reduzida. Além disso, uma vez que a frequência de rotação da agitação pode ser ajustada para baixo (menos agitação), os danos por cisalhamento dos corpos de fungos podem ser reduzidos. Essa cepa mutante é mais eficaz no cultivo em grande escala porque são alcançadas reduções na capacidade do ventilador e do motor de agitação necessárias para o arejamento e energia de agitação.

[029] Na presente invenção, a viscosidade de uma solução de cultura é um valor medido de acordo com as seguintes condições, e as soluções de cultura são comparadas na viscosidade pela comparação dos valores máximos medidos sob as seguintes condições. Em primeiro lugar, os esporos da cepa mutante de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma e a cepa parental, que devem ser avaliados, são inoculados em meios de pré-cultivo (um exemplo específico de composições de cultura é mostrado na Tabela 1 fornecida nos Exemplos) para resultar em uma concentração de 1,0 × 105 esporos por mL de meio de pré-cultivo, e o cultivo é conduzido em um agitador sob as condições de 28ºC e 120 rpm até que a quantidade de corpos de fungo fique em torno de 11 g/L. Em seguida, cada um dos meios de pré-cultivo é inoculado, em uma quantidade de 10% (v/v), em um meio de cultura principal mostrado na Tabela 2, ao qual Arbocel B800 (fabricado por J. Rettenmaier & Sohne) foi adicionado em uma quantidade de 100 g/L (p/v), e a cultura submersa é conduzida usando um recipiente fermentador de 5L. Especificamente, após a inoculação do meio de pré-cultura para o meio de cultura principal, a cultura submersa é conduzida sob as condições de 28ºC, 700 rpm, e uma taxa de fluxo de ar de 100 mL/min, enquanto o pH é regulado em 5,0. Para medir a viscosidade do meio de cultura, é usado um viscosímetro rotacional digital. O viscosímetro rotacional digital é previamente submetido à calibração do ponto zero. Às 3 9, 48, 62, 72, 86, 96 e 111 horas após o início do cultivo, a solução de cultura é amostrada e uma porção de 16 mL de cada amostra é imediatamente introduzida em um determinado recipiente. Um fuso é imerso na solução de cultura e girado a uma velocidade de rotação de 0,3 rpm para medir o torque resultante, que é a resistência à viscosidade imposta ao fuso, em temperatura ambiente, medindo assim a viscosidade da solução de cultura. A unidade da viscosidade é centipoise (cP). Um poise é definido como a viscosidade de um fluido que, tendo nele um gradiente de velocidade de 1 cm/seg por cm, tem uma tensão de 1 dina por cm2 ao longo da direção do fluxo em um plano perpendicular à direção do gradiente de velocidade. Como viscosímetro rotacional digital pode-se usar, por exemplo, DV2T (BROOKFIELD Inc.). Como fuso pode ser utilizado, por exemplo, o UL ADAPTOR (BROOKFIELD Inc.).

[030] A cepa mutante de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma da presente invenção exibe uma viscosidade da solução de cultura mais baixa em comparação com a cepa parental na qual a mutação não foi introduzida, nos casos em que as duas cepas são cultivadas sob as mesmas condições. A viscosidade máxima durante o cultivo da mesma é inferior, preferencialmente 100 cP ou maior, mais preferencialmente 200 cP ou maior, mais preferencialmente 400 cP ou maior, mais preferencialmente 500 cP ou maior, ainda mais preferencialmente 600 cP ou maior, ainda mais preferencialmente 700 cP ou maior, ainda mais preferencialmente 800 cP ou maior, ainda mais preferencialmente 900 cP ou maior, especialmente preferencialmente 1.000 cP ou maior.

[031] O grau de saturação do oxigênio dissolvido na solução de cultura pode ser calculado medindo-se uma taxa de utilização de oxigênio na solução de cultura. O termo “taxa de utilização de oxigênio (mM/L/hr)” na presente invenção significa taxa de consumo de oxigênio por L de solução de cultura por unidade de período de tempo medido 24 horas após o início do cultivo. Um método específico para o cálculo é o seguinte. O cultivo é conduzido em condições de cultivo constantes e a alimentação de oxigênio é interrompida 24 horas após o início do cultivo. Os valores da concentração de oxigênio dissolvido (mg/L) (valores DO) determinados em intervalos de 10 segundos são traçados e, em seguida, na curva resultante, três ou mais pontos traçados que declinam logaritmicamente são examinados para a inclinação (A) (unidade; DO/seg). A seguinte Expressão 1 é usada para calcular a taxa de utilização de oxigênio: Taxa de utilização de oxigênio (mM/L/hr) = (−A)×(1/32)×60×60 (Expressão 1).

[032] Para medir os valores de DO, pode-se usar um medidor de DO comercial. Qualquer medidor de DO capaz de medir com precisão os valores DO pode ser usado. Exemplos do medidor de DO incluem eletrodos DO vedados (ABLE Corporation) e sensor de oxigênio dissolvido (fabricado pela Mettler Toledo International Inc.). O medidor de DO é submetido às calibrações de ponto zero e de amplitude. A calibração de ponto zero é realizada com o uso de solução de sulfito de sódio a 2%. A calibração de amplitude é realizada conduzindo aeração e agitação nas mesmas condições que no cultivo real, exceto pela ausência de corpos fúngicos, esperando até que a solução de cultura se torne saturada com oxigênio dissolvido, depois disso, verificando se o medidor indica de forma estável um valor e calibrando o valor para a concentração de saturação do oxigênio dissolvido na temperatura. Nos casos em que o cultivo tanque é pressurizado, para medir valores de DO é necessário formar uma correção da pressão. Além disso, nos casos em que o tanque de cultivo é grande, é necessário realizar uma correção da pressão hidrostática. Ao realizar a correção, a seguinte Expressão 2 é usada para o cálculo: D = DO(1+α+β) (Expressão 2); D: concentração de saturação corrigida de oxigênio dissolvido; DO: concentração de saturação de oxigênio dissolvido em água pura a 1 atm; α: pressão manométrica (kg/cm2); e β: pressão hidrostática [(profundidade (m) do líquido na posição do medidor DO)/10].

[033] O grau de saturação de oxigênio dissolvido é determinado calculando a proporção da concentração de oxigênio dissolvido durante o cultivo para uma concentração de saturação de oxigênio dissolvido no meio de cultura livre de fungo que foi levado a um estado saturado de oxigênio dissolvido por sopragem de ar na solução nas mesmas condições de pH e temperatura que no cultivo, sendo a concentração de saturação de oxigênio dissolvido considerada como 100%. A concentração de oxigênio dissolvido (mg/L) é a concentração de oxigênio dissolvido na água. O termo “concentração de saturação de oxigênio dissolvido” significa a concentração de oxigênio dissolvido em um meio de cultura que, no estado de não conter corpos de fungos, foi feita para ter uma concentração de oxigênio dissolvido constante por aeração e agitação sob as mesmas condições de cultivo como no cultivo real. No cálculo do grau de saturação do oxigênio dissolvido, as condições de cultivo, incluindo as condições de aeração, são mantidas inalteradas durante o período de cultivo. Uma diminuição na demanda de oxigênio resulta em um aumento no grau de saturação do oxigênio dissolvido. O grau de saturação do oxigênio dissolvido é calculado de acordo com a seguinte Expressão 3: Grau de saturação do oxigênio dissolvido (%) = (concentração de oxigênio dissolvido durante o cultivo)/(concentração de saturação do oxigênio dissolvido antes do início do cultivo) × 100 (Expressão 3)

[034] Ao comparar os graus de saturação do oxigênio dissolvido, os valores mínimos são comparados entre si.

[035] Nos casos em que as taxas de utilização de oxigênio ou graus de saturação de oxigênio dissolvido são comparados, é feito uso de resultados medidos através de exames realizados sob as mesmas condições de cultura, incluindo o meio de cultura, a taxa de alimentação de oxigênio, velocidade de agitação, temperatura, volume de cultivo, e quantidade de inoculação. A quantidade de inoculação nos exames é de preferência cerca de 10% (v/v) em relação à solução de cultura principal.

[036] Nos casos em que a cepa mutante de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma da presente invenção e a cepa parental na qual a mutação não foi introduzida são cultivadas nas mesmas condições de oxigênio dissolvido, a cepa mutante fornece um valor mínimo mais alto do grau de saturação de oxigênio dissolvido do que a cepa parental. O valor mínimo da mesma é maior, de preferência 5% ou maior, mais preferencialmente 6% ou maior, mais preferencialmente 7% ou maior, mais preferencialmente 8% ou maior, mais preferencialmente 9% ou maior, mais preferencialmente 10% ou maior, mais preferencialmente 11% ou maior, mais preferencialmente 12% ou maior, mais preferencialmente 13% ou maior, mais preferencialmente 14% ou maior, especialmente preferencialmente 15% ou maior.

[037] É preferível que a cepa mutante de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma da presente invenção não tenha uma capacidade de crescimento menor do que a cepa parental na qual não foi introduzida a mutação. Uma diferença na capacidade de crescimento pode ser determinada medindo a quantidade de corpos de fungos. A quantidade de corpos de fungos é medida como o peso de corpos de fungos secos. Uma porção de 10 mL da solução de cultura é submetida à filtração por sucção usando um papel de filtro qualitativo (Grau 4; GE Healthcare Co.) e o resíduo é seco a 100ºC juntamente com o papel de filtro. O seu peso é medido e uma diferença de peso do papel de filtro entre antes e depois da filtração é considerada como o peso dos corpos secos de fungo.

[038] A cepa mutante de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma da presente invenção pode ter uma mutação genética que melhora a quantidade de produção de proteína, além de ter uma mutação que exclui ou reduz a função de uma subunidade grande da beta-adaptina ou uma mutação na sequência de aminoácidos que constitui uma subunidade grande da beta-adaptina. Exemplos específicos destes incluem uma mutação genética que reduz a função do(s) polipeptídeo(s) representado(s) pela(s) SEQ ID NO: 11 e(ou) SEQ ID NO: 13.

[039] O polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 11 é um polipeptídeo possuído pelo Trichoderma reesei, e foi registrado no National Center for Biotechnology Information como uma proteína prevista EGR50654 cuja cepa QM6a de Trichoderma reesei possui. O polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 11 é um polipeptídeo cuja função é desconhecida, mas a Conserved Domain Architecture Retrieval Tool of National Center for Biotechnology Information divulga que do resíduo de aminoácido 95º ao 277º da extremidade N-terminal há o “domínio médio do fator de iniciação eucariótico 4G” (doravante referido como “domínio MIF4G”) e do resíduo de aminoácido 380º ao 485º do lado N-terminal há o domínio MA-3. Os dois domínios, MIF4G e MA-3, são conhecidos por terem a função de ligação aos DNAs ou RNAs (Biochem. 44, 12265-12272 (2005); Mol. Cell. Biol. 1, 147-156 (2007)).

Presume-se a partir dessas divulgações que o polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 11 tenha pelo menos a função de ligação a um DNA e/ou RNA.

[040] Exemplos específicos de genes que codificam o polipeptídeo consistindo da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 11 incluem a sequência de base representada pela SEQ ID NO: 12.

Exemplos de mutações genéticas que reduzem a função de EGR50654 incluem uma deleção total do Domínio MIF4G e/ou domínio MA-3 possuído por EGR50654, uma deleção parcial do domínio MIF4G e/ou domínio MA-3 e uma mutação do gene que altera a relação de configuração entre o domínio MIF4G e o domínio MA-3. Além disso, a função do polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 11 pode ser reduzida também pela introdução de uma mutação que diminui ou inibe a expressão do polipeptídeo. Exemplos específicos da deleção da função do polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 11 incluem uma mutação na sequência de bases representada pela SEQ ID NO: 12 que deleta qualquer uma das bases de 1.039ª a 1.044ª.

[041] O polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 13 é um polipeptídeo possuído pelo Trichoderma reesei, e foi registrado no National Center for Biotechnology Information como uma proteína prevista EGR44419 cuja cepa QM6a de Trichoderma reesei possui. O polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 13 é um polipeptídeo cuja função é desconhecida, mas a Conserved Domain Architecture Retrieval Tool of National Center for Biotechnology Information divulga que do resíduo de aminoácido 26º ao 499º do lado N-terminal há um domínio transportador de açúcar (e outro). Presume-se partir desta divulgação que o polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 13 pelo menos participa do transporte de açúcar entre o interior e o exterior dos corpos do fungo.

[042] Exemplos específicos de genes que codificam o polipeptídeo consistindo da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 13 incluem a sequência de base representada pela SEQ ID NO: 14.

Exemplos de mutações genéticas que reduzem a função de EGR44419 incluem uma deleção total do domínio transportador de açúcar (e outro) possuído por EGR44419, uma deleção parcial do domínio transportador de açúcar (e outro) e uma mutação genética que altera a relação de configuração do domínio transportador de açúcar (e outro). Além disso, a função do polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 13 pode ser reduzida também pela introdução de uma mutação que reduz ou inibe a expressão do polipeptídeo. Exemplos específicos da deleção da função do polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos representada pela SEQ

ID NO: 13 incluem uma mutação na sequência de bases representada pela SEQ ID NO: 14 que insere onze bases na posição 1.415ª.

[043] A presente invenção se refere ainda a um método para a produção de proteína incluindo uma etapa de cultivo da cepa mutante de um fungo filamentoso pertencente ao gênero Trichoderma na qual uma sequência de aminoácidos que constitui uma subunidade grande da beta-adaptina tem uma mutação.

[044] O método da presente invenção pode produzir eficientemente proteínas excretadas dos corpos dos fungos. As proteínas a serem produzidas não são limitadas, mas as enzimas são preferidas. São mais preferidas enzimas sacarificantes, como celulases, amilases, invertases, quitinases e pectinases. As celulases são especialmente preferidas.

[045] As celulases que podem ser produzidas na presente invenção incluem várias hidrolases, que incluem enzimas com atividade de decomposição contra xilano, celulose e hemicelulose. Exemplos específicos destas enzimas incluem celobiohidrolase (EC 3.2.1.91), que produz celobiose por hidrólise de cadeias de celulose, endoglucanase (EC 3.2.1.4), que hidrolisa cadeias de celulose de porções centrais das mesmas, β-glucosidase (EC

3.2.1.21), que hidrolisa celo-oligossacarídeo e celobiose, xilanase (EC 3.2.1.8), que se caracteriza por atuar na hemicelulose e, em particular, no xilano, e β-xilosidase (EC 3.2.1.37), que hidrolisa o xilo-oligossacarídeo.

[046] A concentração de uma proteína celulase é determinada da seguinte maneira. Uma solução de cultura obtida cultivando um fungo filamentoso do gênero Trichoderma pelo método da presente invenção é centrifugada a 15.000 × g durante 10 minutos e o sobrenadante resultante é recuperado como uma solução de celulase. Em 250 μL de solução do kit de ensaio de proteína Quick Start Bradford (fabricado pela Bio-Rad Laboratories, Inc.) são adicionados 5 μL da solução de celulase que foi diluída. Esta mistura deve repousar à temperatura ambiente durante 15 minutos e então é feita a leitura para determinar a absorbância a 595 nm. A concentração da proteína contida na solução de enzima sacarificante é calculada com base em uma curva de calibração obtida usando soluções de albumina de soro bovino como soluções de referência.

[047] Os métodos para cultivar um fungo filamentoso do gênero Trichoderma na presente invenção não são particularmente limitados. Por exemplo, a cepa pode ser cultivada por cultura líquida usando um tubo de centrífuga, frasco, frasco fermentador, tanque, ou afins, ou por cultura sólida usando uma placa ou semelhante. É preferido cultivar o fungo filamentoso do gênero Trichoderma sob condições aeróbicas, e dentre tais métodos de cultivo é especialmente preferida a cultura submersa realizada em um jarro fermentador ou tanque enquanto é realizada a aeração ou agitação.

[048] A composição do meio de cultura na etapa de cultivo não é particularmente limitada, desde que seja uma composição de meio de cultura onde o fungo filamentoso do gênero Trichoderma possa produzir uma proteína, e pode ser empregada uma composição de meio de cultura conhecida para micro-organismos do gênero Trichoderma. Como fonte de nitrogênio, pode-se utilizar, por exemplo, polipeptona, caldo, CSL ou torta de soja. Um indutor para a produção de proteína pode ser adicionado ao meio de cultura.

[049] No caso da produção de celulases pela presente invenção, a cepa mutante pode ser cultivada em um meio de cultura contendo um ou mais indutores selecionados a partir do grupo que consiste em lactose, celulose e xilano. Para a introdução de celulose ou xilano, pode ser adicionada biomassa contendo celulose ou xilano como um indutor. Os exemplos específicos da biomassa contendo celulose ou xilano incluem não vegetais, tais como plantas de semente, pteridófitas, briófitas, algas, e planta aquáticas, mas também resíduos de materiais de construção. As plantas com sementes são classificadas em gimnospermas e angiospermas, e ambas podem ser utilizadas de maneira favorável. As angiospermas são ainda classificadas em monocotiledôneas e dicotiledôneas. Exemplos específicos das monocotiledôneas incluem bagaço, swichgrass (Panicum virgatum), capim-elefante (Pennisetum purpureum), Erianthus, palha de milho, sabugo de milho, palha de arroz, e palha de trigo, e exemplos específicos de dicotiledôneas incluem polpa de beterraba, e eucalipto, carvalho, e vidoeiro branco.

[050] Quanto à biomassa contendo celulose ou xilano, pode-se utilizar um produto pré-tratado. O método de pré-tratamento não é particularmente limitado, mas podem ser utilizados métodos conhecidos como, por exemplo, tratamento com ácido, tratamento com ácido sulfúrico, tratamento com ácido sulfúrico diluído, tratamento alcalino, tratamento hidrotérmico, tratamento subcrítico, tratamento de moagem fina e tratamento com vapor. A polpa pode ser usada como a biomassa pré-tratada contendo celulose ou xilano.

[051] Os métodos para cultivar a cepa mutante de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma na presente invenção não são particularmente limitados. Por exemplo, a cepa mutante pode ser cultivada por cultura líquida usando um tubo de centrífuga, frasco, frasco fermentador, tanque, ou afins, ou por cultura sólida usando uma placa ou semelhante. No caso em que a cepa mutante é uma cepa mutante de Trichoderma reesei, é preferível cultivar esta cepa mutante em condições aeróbias e, especialmente, é preferida uma cultura submersa realizada em um jarro ou tanque fermentador durante a realização de aeração ou agitação. A taxa de fluxo de ar é preferencialmente de cerca de 0,1-2,0 vvm, mais preferencialmente de 0,3 a 1,5 vvm, e de modo especialmente preferido a taxa de fluxo de ar é de cerca de 0,5 a 1,0 vvm. A temperatura de cultivo é preferencialmente cerca de 25-35ºC, mais preferencialmente 25-31ºC. As condições de pH durante o cultivo são preferencialmente pH 3,0-7,0, mais preferencialmente pH 4,0-6,0. O período de cultivo não é particularmente limitado, desde que o cultivo possa ser conduzido em condições capazes de produção de proteína, até que a proteína seja acumulada em uma quantidade recuperável. Entretanto, o período de cultivo é geralmente de 24-288 horas, preferencialmente 24-240 horas, mais preferencialmente 36-240 horas, ainda mais preferencialmente 36-192 horas.

[052] Os métodos para a recuperação de uma proteína contida na solução de cultura, onde a cepa mutante de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma foi cultivada não estão particularmente limitados, mas a proteína pode ser recuperada por remoção dos corpos dos fungos filamentosos do gênero Trichoderma a partir da solução de cultura. Exemplos de métodos para remover os corpos de fungos incluem centrifugação, separação por membrana e filtro-prensa.

[053] Além disso, no caso em que a solução de cultura na qual a cepa do fungo filamentoso mutante do gênero Trichoderma foi cultivada é utilizada como solução de proteína sem remover o corpo do fungo da mesma, a solução de cultura é preferencialmente tratada de modo que os corpos de fungos dos fungos filamentosos mutantes do gênero Trichoderma não possam crescer na referida solução. Exemplos de métodos de tratamento para prevenir o crescimento dos fungos incluem tratamento com calor, tratamento químico, tratamento ácido/alcalino, e tratamento com UV.

[054] No caso em que a proteína é uma enzima, tal como uma celulase, a solução de cultura a partir da qual os corpos do fungo foram removidos ou quando a solução foi tratada de modo que os corpos do fungo não possam crescer como mencionado acima, pode ser usada diretamente como uma solução de enzima.

E XEMPLOS

[055] A presente invenção é descrita de forma específica a seguir, com referência aos Exemplos.

E XEMPLO DE REFERÊNCIA 1

MÉTODO PARA MEDIR A CONCENTRAÇÃO DE P ROTEÍNA

[056] Foi utilizado um reagente para medir a concentração de proteína (ensaio de proteína Quick Start Bradford, produzido pela Bio-Rad Laboratories, Inc.). 5 μL de uma solução diluída de cultura de fungo filamentoso foram adicionados a 250 μL do reagente de medição da concentração de proteína retornado à temperatura ambiente. Após deixar a mistura em repouso em temperatura ambiente durante 5 minutos, a absorbância a 595 nm foi medida utilizando um leitor de microplacas.

Usando BSA como padrão, a concentração de proteína foi calculada com base na curva de calibração.

E XEMPLO DE REFERÊNCIA 2

CÁLCULO D O GRAU DE SATURAÇÃO DO OXIGÊNIO DISSOLVIDO

[057] O grau de saturação de oxigênio dissolvido foi determinado calculando a proporção da concentração de oxigênio dissolvido durante o cultivo para uma concentração de saturação de oxigênio dissolvido no meio de cultura livre de fungo que foi levado a um estado saturado de oxigênio dissolvido por sopragem de ar na solução nas mesmas condições de pH e temperatura que no cultivo, sendo a concentração de saturação de oxigênio dissolvido considerada como 100%. Como um medidor de DO, foi usado o eletrodo de oxigênio dissolvido selado SDOC-12F-L120 (fabricado pela ABLE Corp.).

E XEMPLO DE REFERÊNCIA 3

MEDIÇÃO DA V ISCOSIDADE DA S OLUÇÃO DE CULTURA

[058] Amostras de solução de cultura coletadas a 39, 48, 62, 72, 86, 96, e 111 horas após o início do cultivo foram examinados quanto à viscosidade (cP) utilizando um viscosímetro rotacional digital DV2T e fuso UL ADAPTADOR (fabricado pela Brookfield Inc.) a uma velocidade de rotação fixada em 0,3 rpm.

EXEMPLO DE REFERÊNCIA 4

MEDIÇÃO DA QUANTIDADE DE CORPOS DE FUNGOS

[059] A quantidade de corpos de fungo contidos em uma solução de cultura foi determinada submetendo a solução de cultura à filtração por sucção com um papel de filtro e tomando a diferença no peso do papel de filtro com corpos de fungo secos antes e depois da filtração por sucção como a quantidade de corpos dos fungos.

EXEMPLO 1 PREPARAÇÃO DE TRICHODERMA REESEI CEPA QM9414 MUTANTE I COM FUNÇÃO DA SUBUNIDADE GRANDE DA BETA-ADAPTINA REDUZIDA

[060] Um fragmento de DNA que consiste na sequência do gene representado pela SEQ ID NO: 15 foi preparado como fragmento de DNA incluindo um gene que codifica o polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2, em que a sequência de aminoácidos que constitui uma subunidade grande da beta-adaptina foi mutado.

Este fragmento de DNA foi usado para transformar a cepa QM9414 de Trichoderma reesei. Assim, foi preparada uma cepa mutante de Trichoderma reesei com função da subunidade grande da beta-adaptina reduzida. Por este método, é obtida uma cepa mutante de Trichoderma reesei em que a citosina como o 1.080º resíduo na SEQ ID NO: 1 foi substituída por adenina para ter um polipeptídeo no qual o 300º resíduo na SEQ ID NO: 2 foi alterado de glutamina para lisina. O gene (amdS) da acetamidase de acetamida (AmdS), capaz de decompor a acetamida, foi utilizado como marcador de seleção para a introdução do fragmento de DNA. Para permitir que o fragmento de DNA que consiste na sequência de base representada pela SEQ ID NO: 15 seja introduzido a montante e a jusante da sequência de DNA contendo amdS, um plasmídeo para introdução de mutações foi preparado de modo a adicionar uma porção homóloga à sequência do gene da cepa de Trichoderma reesei, QM9414.

[061] Especificamente, um fragmento de DNA obtido pelo tratamento de um fragmento de DNA sintetizado mostrado pela SEQ ID NO: 16 com as enzimas de restrição KpnI e NotI foi usado como o fragmento de DNA a montante. Além disso, a PCR foi realizada usando DNA genômico extraído de maneira usual a partir da cepa QM9414 de Trichoderma reesei e oligos DNAs representados pelas SEQ ID NOs: 17 e 18, e o fragmento amplificado resultante foi tratado com enzimas de restrição MluI e SpeI para se obter um fragmento de DNA, que foi usado como o fragmento de DNA a jusante. Os fragmentos de DNA a montante e a jusante foram introduzidos em um plasmídeo contendo amdS usando as enzimas de restrição KpnI e NotI e as enzimas de restrição MluI e Spel, respectivamente, para a construção de um plasmídeo para a introdução de mutações. O plasmídeo para a introdução da mutação foi tratado com as enzimas de restrição ApaI e Ascl, e a cepa QM9414 de Trichoderma reesei (NBRC 31329) foi transformada com o fragmento de DNA obtido mostrado pela SEQ ID NO: 15. A cepa mutante de Trichoderma reesei obtida foi utilizada como cepa QM9414 mutante I nos experimentos seguintes.

[062] As manipulações envolvendo a técnica de biologia molecular foram realizadas como descrito em Molecular cloning, laboratory manual, 1, 2, 3 (1989). Além disso, a transformação foi realizada usando uma técnica padrão, ou seja, um método de PEG de protoplasto e, especificamente, foi realizada como descrito em Gene, 61, 165-176 (1987).

EXEMPLO 2 TESTE DE PRODUÇÃO DE PROTEÍNA USANDO A CEPA QM9414 MUTANTE I (PRÉ-CULTURA)

[063] Após os esporos da cepa QM9414 mutante I preparada no Exemplo 1 serem diluídos com soro fisiológico para a concentração de

1,0x107/mL, 2,5 mL da solução de esporos diluída foram inoculados em 250 mL de meio de pré-cultura mostrado na Tabela 1, a solução foi colocada em um balão com saliências/reentrâncias no fundo (baffled) de 1 mL, e incubada em um agitador sob as condições de 28ºC e 120 rpm durante 72 horas.

TABELA 1 Glicose 20 g Solução de Mandel* 5 200 mL Solução de tartarato de amônio** 10 100 mL Efluente de milho (milhocina) 50 g Solução de elementos vestigiais (traço)*** 1 mL Tween 80 0,5 mL PE-M 1 mL (para 1 L) * A solução de Mandel 5 tem a seguinte composição: 7 g/L (NH4)2SO4; 10 g/L KH2PO4; 2 g/L CaCl22H2O; e 1,5 g/L MgSO47H2O.

** A solução de tartarato de amônio 10 contém 92 g/L de tartarato de amônio.

*** A solução de elementos vestigiais (traço) tem a seguinte composição: 0,3 g/L H3BO3; 1,3 g/L (NH4)6Mo7O244H2O; 5 g/L FeCl36H2O; 2 g/L CuSO45H2O; 0,4 g/L MnCl24H2O; e 10 g/L ZnCl2.

(CULTURA PRINCIPAL)

[064] Arbocel B800 (J. Rettenmaier & Sohne) foi adicionado ao meio de cultura principal mostrado na Tabela 2, e uma investigação em cultura submersa foi conduzida usando um frasco fermentador de 5 L (fabricado pela ABLE & Biott Co., Ltd.). As soluções de pré-cultivo da cepa QM9414 de Trichoderma reesei e da cepa QM9414 mutante I preparadas no Exemplo 1 foram inoculadas em uma quantidade de 250 mL em 2,5 L de meio de cultura principal ao qual o Arbocel B800 foi adicionado. Após a inoculação de cada meio de pré-cultura no meio de cultura principal, a cultura submersa foi conduzida sob as condições de cultivo de 28ºC, 700 rpm, e uma taxa de fluxo de ar de 100 mL/min, enquanto o pH era regulado em 5,0.

TABELA 2 Arbocel B800 (produzido pela J. Rettenmaier & Sohne) 100 g Solução de Mandel* 5 200 mL Efluente de milho (milhocina) 25 g Solução de elementos vestigiais (traço)*** 1 mL Tween 80 0,5 mL PE-M 1 mL (para 1 L) * O mesmo que na Tabela 1.

*** O mesmo que na Tabela 1.

(AMOSTRAGEM DA SOLUÇÃO DE CULTURA)

[065] A cada 39, 48, 62, 72, 86, 96 e 111 horas após o início do cultivo, uma porção de 20 mL da solução de cultura era coletada. Uma porção da solução de cultura coletada foi centrifugada nas condições de 15.000 g e 4ºC por 10 minutos para obter um sobrenadante. O sobrenadante foi filtrado com um filtro de 0,22 μm, e o filtrado foi utilizado como uma solução de celulase nos experimentos seguintes.

(MEDIÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNA)

[066] A concentração de proteína celulase na solução de cultura coletada às 96 horas após o início da cultura foi determinada usando a técnica descrita no Exemplo de Referência 1. Como resultado, a cepa mutante QM9414 forneceu uma concentração de proteína 1,3 vezes superior em valor relativo do que a concentração de proteína obtida com a cepa QM9414 de Trichoderma reesei.

(MEDIÇÃO DO GRAU DE SATURAÇÃO DE OXIGÊNIO DISSOLVIDO NA SOLUÇÃO DE CULTURA)

[067] Utilizando a técnica descrita no Exemplo de Referência 2, o grau de saturação do oxigênio dissolvido em cada solução de cultura foi determinado ao longo do tempo transcorrido. Como resultado, como a FIG. 2 mostra, o grau de saturação de oxigênio dissolvido na solução de cultura da cepa Trichoderma reesei QM9414 diminuiu para um valor mínimo de 1,7% em cerca de 60 horas após o início do cultivo, enquanto o grau de saturação de oxigênio dissolvido na solução de cultura da cepa QM9414 mutante I teve um valor mínimo de 37,6%.

(MEDIÇÃO DA VISCOSIDADE DA SOLUÇÃO DE CULTURA)

[068] Utilizando a técnica descrita no Exemplo de Referência 3, a viscosidade de cada solução de cultura foi medida ao longo do tempo transcorrido. Como resultado, como a FIG. 3 mostra, a solução de cultura da cepa QM9414 de Trichoderma reesei teve uma viscosidade máxima de 1.800 cP ou superior, enquanto que a solução de cultura da cepa mutante de Trichoderma reesei teve uma viscosidade máxima de 800 cP ou menos. Compreendeu-se a partir destes resultados que a cepa QM9414 mutante I permite que a solução de cultura retenha uma baixa viscosidade e seja inibida de diminuir o grau de saturação de oxigênio dissolvido.

(MEDIÇÃO DA QUANTIDADE DE CORPOS DE FUNGOS)

[069] Utilizando a técnica descrita no Exemplo de Referência 4, a quantidade de corpos de fungos contida em cada solução de cultura coletada 72 horas após o início do cultivo no Exemplo 2 (pré-cultura) foi mensurada. Como resultado, a quantidade de corpos de fungos da cepa QM9414 de Trichoderma reesei foi de 11,3 g/L, e a quantidade de corpos de fungos da cepa QM9414 mutante I foi de 11,0 g/L. Nenhuma diferença na quantidade de fungos foi observada entre as duas cepas.

EXEMPLO 3 PREPARAÇÃO DE TRICHODERMA REESEI CEPA QM9414 MUTANTE I COM FUNÇÃO DA SUBUNIDADE GRANDE DA BETA-ADAPTINA REDUZIDA

[070] Uma cepa mutante de Trichoderma reesei com função da subunidade grande de beta-adaptina reduzida foi preparada pela preparação de um fragmento de DNA que consiste na sequência gênica representada pela SEQ ID NO: 19 e usando este fragmento de DNA para transformar a cepa QM9414 de Trichoderma reesei. Por este método, o amdS é inserido entre os resíduos 791º e 792º na SEQ ID NO: 1 para obter uma cepa mutante de Trichoderma reesei com função da subunidade grande da beta-adaptina reduzida. Para a introdução do fragmento de DNA que consiste na sequência de SEQ ID NO: 19, um plasmídeo para a introdução de mutação foi preparado de modo a adicionar uma porção homóloga à sequência do gene da cepa de Trichoderma reesei, QM9414 a montante e a jusante da sequência do fragmento de DNA contendo amdS.

[071] Especificamente, foi realizada uma PCR usando o DNA genômico extraído de maneira usual a partir da cepa QM9414 de Trichoderma reesei e oligos DNAs representados pelas SEQ ID NOs: 20 e 21, e o fragmento amplificado resultante foi tratado com enzimas de restrição AfiII e NotI para se obter um fragmento de DNA, que foi usado como fragmento a montante. Além disso, a PCR foi realizada usando DNA genômico e oligos DNAs representados pelas SEQ ID NOs: 22 e 23, e o fragmento amplificado resultante foi tratado com enzimas de restrição MluI e SpeI para se obter um fragmento de DNA, que foi usado como fragmento a jusante. Os fragmentos de DNA a montante e a jusante foram introduzidos em um plasmídeo contendo amdS usando as enzimas de restrição AfIII e NotI e as enzimas de restrição MluI e Spel, respectivamente, para a construção de um plasmídeo para a introdução de mutações. O plasmídeo para a introdução da mutação foi tratado com as enzimas de restrição AflII e SpeI, e a cepa QM9414 de Trichoderma reesei foi transformada com o fragmento de DNA obtido mostrado pela SEQ ID NO: 19, da mesma maneira que no Exemplo 1. A cepa mutante de Trichoderma reesei obtida foi utilizada como cepa QM9414 mutante II nos experimentos seguintes.

EXEMPLO 4 TESTE DE PRODUÇÃO DE PROTEÍNA USANDO A CEPA QM9414 MUTANTE II

[072] O cultivo foi conduzido pela mesma operação nas mesmas condições que no Exemplo 2, exceto que a cepa QM9414 mutante II foi usada no lugar da cepa QM9414 mutante I preparada no Exemplo 1. A concentração de uma proteína contida na solução de cultura, o grau de saturação de oxigênio dissolvido na solução de cultura e a viscosidade da solução de cultura foram medidos das mesmas maneiras conforme o Exemplo 2.

(MEDIÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNA)

[073] Nos casos em que a concentração de proteína na solução de cultura obtida pelo cultivo da cepa QM9414 de Trichoderma reesei foi considerada como 1, o valor relativo da concentração de proteína na solução de cultura da cepa QM9414 mutante II foi de 1,4. Foi entendido a partir desses resultados que o Trichoderma reesei com função da subunidade grande de beta-adaptina reduzida pode produzir uma proteína em uma quantidade melhor quando cultivada, em comparação com o caso em que a função da proteína não foi reduzida.

[074] Utilizando a técnica descrita no Exemplo de Referência 2, o grau de saturação do oxigênio dissolvido em cada solução de cultura foi determinado ao longo do tempo transcorrido. Como resultado, como a FIG. 4 mostra, o grau de saturação de oxigênio dissolvido na solução de cultura da cepa Trichoderma reesei QM9414 diminuiu para um valor mínimo de 1,9% em cerca de 60 horas após o início do cultivo, enquanto o grau de saturação de oxigênio dissolvido na solução de cultura da cepa QM9414 mutante II teve um valor mínimo de 27,7%.

(MEDIÇÃO DA VISCOSIDADE DA SOLUÇÃO DE CULTURA)

[075] Utilizando a técnica descrita no Exemplo de Referência 3, a viscosidade de cada solução de cultura foi medida ao longo do tempo transcorrido. Como resultado, como a FIG. 5 mostra, a solução de cultura da cepa QM9414 de Trichoderma reesei teve uma viscosidade máxima de 1.900 cP ou maior, enquanto que a solução de cultura da cepa QM9414 mutante II teve uma viscosidade máxima de 1.000 cP ou menos. Compreendeu-se a partir destes resultados que a cepa QM9414 mutante II permite que a solução de cultura retenha uma baixa viscosidade e seja inibida de diminuir o grau de saturação de oxigênio dissolvido.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. CEPA MUTANTE DE UM FUNGO FILAMENTOSO DO GÊNERO TRICHODERMA, caracterizada por possuir uma mutação que exclui ou reduz a função de uma subunidade grande da beta-adaptina, em que uma solução de cultura da cepa mutante tem uma viscosidade mais baixa do que uma solução de cultura de uma cepa parental sem a referida mutação que exclui ou reduz a função da subunidade grande da beta-adaptina.

2. CEPA MUTANTE DE UM FUNGO FILAMENTOSO DO GÊNERO TRICHODERMA, caracterizada por possuir uma mutação em uma sequência de aminoácidos que constitui uma subunidade grande da beta-adaptina, em que uma solução de cultura da cepa mutante tem uma viscosidade mais baixa do que uma solução de cultura de uma cepa parental sem a referida mutação na sequência de aminoácidos que constitui a subunidade grande da beta-adaptina.

3. CEPA MUTANTE DE UM FUNGO FILAMENTOSO DO GÊNERO TRICHODERMA, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pela mutação na sequência de aminoácidos ser uma mutação na qual um resíduo de glutamina que é o 300º resíduo do lado N-terminal da sequência de aminoácidos que constitui a subunidade grande da beta-adaptina foi alterado para um resíduo de aminoácido diferente da glutamina.

4. CEPA MUTANTE DE UM FUNGO FILAMENTOSO DO GÊNERO TRICHODERMA, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo resíduo de aminoácido diferente de glutamina ser lisina.

5. CEPA MUTANTE DE UM FUNGO FILAMENTOSO DO GÊNERO TRICHODERMA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizada pela sequência de aminoácidos que constitui a subunidade grande da beta-adaptina ser qualquer uma das sequências de aminoácidos representada pelas SEQ ID NOs: 2 a 10.

6. CEPA MUTANTE DE UM FUNGO FILAMENTOSO DO GÊNERO TRICHODERMA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizada pelo fungo filamentoso do gênero Trichoderma ser Trichoderma reesei.

7. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UMA PROTEÍNA, caracterizado por compreender uma etapa de cultivo da cepa mutante de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6.

8. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UMA CELULASE, caracterizado por compreender uma etapa de cultivo da cepa mutante de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6.