BR112021008030A2

BR112021008030A2 - processo de produção de enzimas por uma capa pertencente a um fungo filamentoso

Info

Publication number: BR112021008030A2
Application number: BR112021008030-9A
Authority: BR
Inventors: Fadhel Ben Chaabane; Celine Cohen
Original assignee: IFP Energies Nouvelles
Priority date: 2018-11-26
Filing date: 2019-11-04
Publication date: 2021-07-27
Also published as: EP3887503A1; FR3088934A1; CN113195703A; CN117987396A; US20220017933A1; CA3117434A1; WO2020108923A1

Abstract

PROCESSO DE PRODUÇÃO DE ENZIMAS POR UMA CAPA PERTENCENTE A UM FUNGO FILAMENTOSO. A presente invenção refere-se a um processo de produção de enzimas por uma cepa pertencente a um fungo filamentoso, o dito processo compreendendo duas etapas: (a) uma primeira etapa de crescimento dos fungos, na presença de pelo menos um substrato carbonado de crescimento, em um bioreator agitado e aerado em fase batch, a um pH inferior ou igual a 4,6; (b) uma segunda etapa de produção de enzimas, a partir do meio de cultura obtido na primeira etapa (a), na presença de pelo menos um substrato carbonado indutor, a um pH inferior ou igual a 4,6.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PRO- CESSO DE PRODUÇÃO DE ENZIMAS POR UMA CAPA PERTEN- CENTE A UM FUNGO FILAMENTOSO". Campo da invenção

[001] A presente invenção refere-se a um processo de produção de celulases por um fungo filamentoso, necessárias para a hidrólise enzimática de biomassa lignocelulósica realizada, por exemplo, em processos de produção de suco açucarados chamados de segunda geração (2G). Esses sucos açucarados podem ser utilizados para pro- duzir outros produtos por via química ou via bioquímica/fermentar (por exemplo, álcoois como biocarabauarantes do tipo etanol, ou ainda bu- tanol ou outras moléculas, por exemplo, solventes tais como acetona e outras moléculas bioaçucaradas...). As celulases podem ser emprega- das igualmente em outros processos, notadamente na indústria quími- ca, petrolífera ou têxtil.

[002] A criação de processos economicamente viáveis de produ- ção de biocarburantes de segunda geração (2G), se for tomado este exemplo particular de realização, é objeto de numerosos estudos. Es- tes últimos são produzidos, notadamente, a partir de substratos ligno- sos como diferentes madeiras (folhudas e resinosas, miscanthus, ou TCR, que é o acrônimo para Taillis à Croissance rapide), esses copro- dutos provenientes da agricultura (palhas de trigo, palhas de arroz, es- pigas de milho, etc.) ou outras indústrias agroalimentares, de papel, etc. Eles representam menos problemas de concorrência de uso dos termos agrícolas com a alimentar, em relação aos biocarburantes chamados de primeira geração, que são produzidos a partir de cana de açúcar, milho, trigo ou beterraba.

[003] A biomassa lignocelulosa se caracteriza por uma estrutura complexa constituída de três principais frações: a celulose (35 a 50%), que é um polissacarídeo essencialmente constituído de hexoses; he-

micelulose (20 a 30%), que é um polissacarídeo essencialmente cons- tituído de pentoses; e lignina (15 a 25%), que é um polímero de estru- tura complexa e de alto peso molecular, composto de álcoois aromáti- cos ligados por ligações éter. Essas diferentes moléculas são respon- sáveis por propriedades intrínsecas da parede vegetal e se organizam em um emaranhado complexo. Dentre os três polímeros de base que integram a biomassa lignocelulósica, a celulose e a hemicelulose são os que permitem a produção de sucos açucarados 2G.

[004] De maneira clássica, o processo de sua transformação em biocaraburante do tipo etanol compreende várias etapas: o pré- tratamento permite tornar a celulose acessível às enzimas que são ce- lulases. A etapa de hidrólise enzimática permite a transformação da celulose em açúcares, como glicose, que são transformados em se- guida em etanol quando da etapa de fermentação geralmente pela le- vedura Sccharomyces cerevisiae. Enfim, a etapa de destilação vai permitir separa e recuperar o etanol do mosto de fermentação. Deve- se notar, como evocado mais acima, que se pode escolher também parar o processo na obtenção dos açúcares do tipo glicose, afim de valorizar os mesmos como tais, ou ainda tratá-los de maneira diferente para obter outros álcoois ou outras moléculas de base biológica. Estado da técnica

[005] Os diferentes estudos técnico-econômicos demonstram que a redução do custo das celulases é um dos pontos-chaves dos pro- cessos de produção biológica de etanol a partir das matérias-primas lignocelulósicas. Atualmente, as celulases industriais são produzidas principalmente por um fungo filamentoxo Trichoderma reesei, em ra- zão de seu grande poder de secreção.

[006] Desde os anos 1970, a transformação de materiais lignoce- lulósicos em etanol, após hidrólise dos polissacarídeos constitutivos em açúcares fermentescíveis, foi objeto de numerosos trabalhos. Po-

demos citar, por exemplo, os trabalhos de referência do National aRe- newable Energy Laboratory (Processo Design and Economics for Bio- chemical Coinversion of Lignocellulosic Biomass to Ethanol, Humbrrd et al, NREL/TP-5100-57764, May 2011).

[007] Os materiais ligno-celu8lósicos são materiais celulósicos, isto é, constituídos em mais de 90% em peso de celulose e/ou lignoce- lulósicos, isto é, constituídos de celulose, hemicelulose, que são polis- sacarídeos essencialmente constituídos de pentoses e de hexoses, bem como de lignina, que é uma macromolécula de estrutura comple- xa e de alto peso molecular, à base de compostos fenólicos.

[008] A madeira, as palhas, as espigas de milho são os materiais lignocelululósicos mais utilizados, mas outras fontes, culturas florestais dedicadas, e resíduos de plantas alcooligenas, açucareiras e cerealei- ras, produtos e resíduos da indústria de papel e produtos de transfor- mação dos materiais lignocelulósicos são utilizáveis. São constituídos, na maioria, de cerca de 35 a 50% de celulose, de 20 a 30% de hemi- celulose e de 15 a 25# de lignina.

[009] O processo de transformação bioquímica dos materiais lig- nocelulósicos em etanol compreende uma etapa de pré-tratamento físico-químico, seguido de uma etapa de hidrólise enzimática utilizando um coquetel enzimático, de uma etapa de fermentação etanólica dos açúcares liberados, a fermentação etanólica e a hidrólise enzimática podendo ser conduzidas simultaneamente, e de uma etapa de purifi- cação do etanol.

[0010] O coquetel enzimático é uma mistura de enzimas celulolíti- cas (igualmente chamadas de celulases) e/ou hemicelulolíticas. As en- zimas celulolíticas apresentam três grandes tipos de atividades: endo- glucanases, exoglucanases e celobiases, estas últimas sendo chama- das igualmente de Beta-glucosidases. As enzimas hemiceluloloíticas apresentam notadamente atividades xilanases.

[0011] A hidrólise enzimática é eficaz e se efetua em condições brandas. Em compensação, o custo das enzimas permanece muito elevado, representando de 20 a 50% do custo de transformação do material lignocelulósico em etanol. Por isso, muitos trabalhos foram conduzidos para reduzir esse custo: a otimização da produção de en- zimas primeiramente, selecionando os micro-organismos hiperproduto- res e melhorando os processos de produção das ditas enzimas, a di- minuição da quantidade de enzimas em hidrólise em seguida, otimi- zando a etapa de pré-tratamento, melhorando a atividade específica dessas enzimas, e otimizando a realização da etapa de hidrólise enzi- mática.

[0012] Numerosos trabalhos se propuseram a compreender os mecanismos de ação e de expressão do coquetel enzimático. Afinali- dade é fazer secretar o coquetel mais apropriado à hidrólise de mate- riais lignocelulosícos modificando os micro-organismos.

[0013] Trichoderma araeesei é o micro-organismo mais utilizado para a produção de celulases. As cepas selvagens têm a faculdade de exercer, na presença de um substrato indutor, a celulose, por exemplo, o complexo enzimático considerado como o melhor adaptado para a hidrólise da celulose. As enzimas do complexo enzimático contêm três grandes tipos de atividades: as endoglucanases, as exoglucanases e as celobiases e outras proteínas que possuem propriedades indispen- sáveis Há hidrólise dos materiais lignocelulósicos são produzidas igualmente por Trichoderma reesei, as xilanases, por exemplo. A pre- sença de um substrato induytor é indispensável à expressão das en- zimas celulólíticas e/ou hemicelulolíticas. A natureza do substrato car- bonado tem uma forte influência sobre a composição do complexo en- zimático. É o caso das xiloses, que, associadas a um substrato carbo- nado indutor como a celulose ou a lactose, permitem melhorar signifi- cativamente a atividade da dita xilanase. A regulação dos genes de celulases em diferentes fontes de carbono foi estudada detalhadamen- te. São induzidos na presença de celulose, de seus produtos de hidró- lise, como a celobiose, ou de certos oligossacarídeos como a lactose ou a soforose (cf. Illén et al, 1997; Appl.Environ.Microbiol. 63: 1306).

[0014] As técnicas de genética clássica por mutação permitiram a seleção de açúcares de Trichoderma reesei hiperprodutoras de celula- ses tais como as cepas MCG77 (Gallo – patente US4275167), MCg 80 (Allen, AlL. Et Andreotti, R. E., Biotechnol-Bioengi 1982, 12, 451- 459 1982), RUT C30 (Montenecourt, B.S. et Eveleight, D.E., Appl. En- viron, Microbiol. 1977. 34,777-782) e CL847 (Durand et al, 1984, Proc. Colloque SFM "Génétique des microorganimes industriels", Pa- ris, H. HESLOT Ed, pp 39-50).

[0015] O processo de produção de celulases por Trichoderma ree- sei foi objeto de melhoras importantes com vista a uma extrapolação em escala industrial. Para obter boas produtividades em enzimas, é necessário prover uma fonte de carbono rapidamente assimilável para o crescimento de Trichoderma reesei, e um substrato indutor que per- mita a expressão das celulases e a secreção no meio de cultura. A ce- lulose pode desempenhar dois papéis; entretanto, ela é de difícil utili- zação no estado industrial e foi proposto substituí-la por fontes de car- bono solúveis, do tipo glicose, xilose ou lactose, a lactose desempe- nhando igualmente o papel de substrato indutor. Outros açúcares so- lúveis como celobiose e soforose foram descritas como indutores, mas são relativamente onerosos para serem utilizados no estado industrial. Constatou-se que as produções de celulases por Trichoderma reesei, com substratos solúveis, são muito inferiores àquelas obtidas sobre celulose em "batch". Isso se deve ao efeito repressor dos açúcares facilmente assimiláveis, de forte concentração. A alimentação contínua em modo fed-batach dos substratos carbonados solúveis permitiu ele- var a repressão catabólica, limitando a concentração residual das cul-

turas e otimizando a quantidade de açúcar que permite obter um me- lhor rendimento e uma melhor produtividade enzimática.

[0016] A patente FR-B-2555603 propõe um protocolo que permite chegar a uma concentração de proteínas da ordem de 35 a 40 g/L com uma produtividade da ordem de 0,2 g/L e que consiste em duas etapas: uma primeira etapa de crescimento no m odo "batch", em que é necessário prover uma fonte de carbono rapidamente assimilável para o crescimento de Trichoderma reesei, depois uma etapa de pro- dução em modo "fed-batch" utilizando um substrato indutor (exemplo: a lactose) que permite a expressão das celulases e a secreção no meio de cultura. O fluxo ótimo aplicado está compreendido entre 35 e 45 mg.g-1.h-1 (miligramas de substrato indutor por miligrama de bio- massa e por hora). Pode-se citar igualmente a patente EP-B-2744899 que propõe uma melhora selecionando notadamente um biorreator que tem um coeficiente de transferência volumétrica de oxigênio KLa particular associado a uma seleção particular simultaneamente da concentração em substrato carbonado de crescimento na primeira etapa e de um nível de fluxo que limita a fonte de carbono na segunda etapa.

[0017] Verificou-se, entretanto, que se podia ater a formação de uma mousse, na etapa de crescimento mais particularmente. Pode tra- tar-se de uma mousse chamada "seca", a saber, ser constitutiva de uma dispersão de gás em uma fase líquida, e que, portanto, tem uma densidade próxima daquela de um gás e que se forma no topo do bior- reator. Pode-se tratar também de uma mousse chamada "úmida", que é uma mousse de extensão/aumento do volume reacional devido ao aprisionamento de bolhas de gás (de ar) no líquido. Sua densidade é mais elevada do que a mousse seca (pois rua razão gás/líquido é mais baixa\). Quer se trate de uma, da outra, ou de uma mistura desses dois tipos de mousse, elas apresentam um verdadeiro problema de condução industrial do processo.

[0018] De fato, para citar apenas alguns de seus inconvenientes, sua presença complica seriamente a regulação do PH que é usual- mente realizada na etapa de crescimento, já que a medição do Ph tor- na-se mais difícil de realização / menos confiável na presença de mo- usse e, além disso, o acréscimo do agente regulador de pH para man- ter o pH no valor desejado é mais complicado, pois é mais difícil con- trolar sua repartição no conjunto do meio reacional. Além disso, é ne- cessário utilizar em capacidade mínima os biorreatores, para deixar um espaço suficiente acima do meio reacional líquido, para evitara transbordamento.

[0019] Várias soluções já foram propostas para lutar contra a for- mação de mousse. Uma primeira solução consistiu em acrescentar agentes antimousse ao meio reacional na etapa de crescimento. A uti- lização de agentes antimousse é certamente eficaz para recolocara em suspensão líquido a mousse, mas ela não é desprovida de incon- veniente. Para citar alguns: a recolocação em suspensão líquida da mousse acarreta um grande aumento do pH, perturbando muito a re- gulação de pH que é preciso conduzir, ou até uma passagem não de- sejada da etapa de crescimento para a etapa de produção. Isso pode ser provocado pelo fornecimento maciço de reagentes (açúcares) blo- queados na superfície por causa da mousse, que, quando ela baixa sob o efeito do antimousse, entram brutalmente em contato com a bi- omassa em grande quantidade. O acréscimo de agentes antimousse provoca igualmente uma baixa da concentração de oxigênio dissolvido no meio (pois faz coalescer as bolhas de ar), o que pode ter um impac- to sobre os micro-organismos que são aeróbicos estritos ou sobre sua produtividade. Além disso, esses agentes são frequentemente à base de óleos, que não se eliminam sozinhos: uma vez terminada a produ- ção de enzimas, se for efetuada a separação entre as enzimas e o resto da biomassa (os fungos), notadamente por técnicas convencio- nais utilizando meios de filtração por membrana, esses agentes an- timousse são suscetíveis de colmatar as membranas, e portanto po- de ser necessário ter que acrescentar uma etapa de separação desses agentes uma vez terminada a produção, sem a qual se chega a más performances de separação. Seu acréscimo apresenta ainda um custo de produção suplementar.

[0020] Outra solução foi considerada no pedido de patente EP 1204738: trata-se de lutar contra esse fenômeno de formação de mo- usse, modificando geneticamente a cepa de fungo utilizada, a fim de que a cepa não secrete hidrofobinas, e notadamente os HFBII, consi- derados responsáveis pela formação de mousse. Entretanto, essa so- lução é difícil de realiza, pois é preciso fazer modificações genéticas em cada uma das cepas de interesse.

[0021] A invenção tem o objetivo de prover um processo de produ- ção de aperfeiçoado, evitando ou limitando pelo menos o fenômeno de formação de mousse, sem acarretar alguns dos inconvenientes citados anteriormente, e notadamente sem acarretar complicação na condu- ção doo processo nem requerer a realização de modificações genéti- cas específicas nos micro-organismos. Sumário da invenção

[0022] A invenção inicialmente tem como objeto um processo de produção de enzimas por uma cepa pertencente a um fungo filamen- toso, o dito processo compreendendo duas etapas;

[0023] Uma primeira etapa de crescimento dos fungos, na presen- ça de pelo menos um substrato carbonado de crescimento, em um biorreator agitado e aerado em fase batch, a um pH inferior ou igual a 4,6;

[0024] Uma segunda etapa de produção de enzimas, a partir do meio de cultura obtido na primeira etapa (a), na presença de pelo me-

nos um substrato carbonado indutor, a um pH inferior ou igual a 4,6.

[0025] Portanto, de acordo com a invenção, escolhe-se realiza não apenas a segunda etapa de produção de enzimas a um pH relativa- mente ácido, mas igualmente a primeira etapa de crescimento, até há pouco realizada a pHs menos ácidos, por exemplo, de pelo menos 5. Enquanto que se esperaria que operar a primeira etapa a um pH tão ácido conduziria a um retardamento do crescimento dos micro- organismos, verificou-se que não houve nada, e que, além disso, de maneira totalmente surpreendente, evitava-se ou limitava-se gran- demente o aparecimento de mouse nessa etapa. Baixando assim o pH na etapa de crescimento, resolve-se o problema da formação de mo- usse sem impactar no rendimento de produção de enzimas no final.

[0026] De preferência, regula-se o pH da etapa de crescimento para mantê-lo em uma faixa requerida. De preferência, regula-se tam- bém o pH da etapa de produção. A regulação se faz de maneira co- nhecida, notadamente por acompanhamento do pH continuamente ou sequencialmente com sensores ad hoc, e acréscimo (de ácido ou de base) durante a etapa para seguir a instrução. Alternativamente pode- se controlar o pH de uma e/ou da outra das etapas utilizando uma so- lução tampão.

[0027] A solução da invenção é notadamente simples, pois nada faz predizer que modificar, para uma acidez mais forte, nas proporções razoáveis (sem descer, de preferência abaixo de 3,5 ou 3,6 ou 3,7), o pH quando do crescimento ia ter consequências sobre o fenômeno complexo da formação de mousse. Ela é muito vantajosa em termos de condução de produção industrial: - o biorreator no qual a etapa de crescimento é realizada está totalmente equipado para regular o pH nesses valores, portanto não á nenhuma dificuldade em realizar a in- venção com biorreatores convencionais; - uma vez que não á ou a pouca mousse formada, pode-se calcular mais exatamente o tamanho do biorreator, e aumentar seu volume útil (não é mais necessário pre- ver um volume suplementar "perdido" destinado a conter eventuais transbordamentos de mousse excessivos); - não é mais necessário acrescentar agentes antimousse, ou pode-se pelo menos reduzir grandemente seu teor, ou se evita as- sim um aditivo que depois é difícil de separar; - é mais fácil pilotar o biorreator, pois, na ausência de mo- usse, a regulação de pH, o acréscimo controlado de substrato carbo- nado, etc. são muito facilitados.

[0028] De preferência, o pH na etapa (a) de crescimento e/ou na etapa (b) de produção é de pelo menos 3, 5, e notadamente inferior ou igual a 4,4, estando compreendido notadamente entre 3,5 e 4,4 ou en- tre 3,8 e 4,4; assim se aproxima o pH da etapa de crescimento do pH da etapa de produção.

[0029] De preferência, o pH em etapa de crescimento é mantido em pelo menos 3,6, notadamente pelo menos 3,7 ou pelo menos 3,8.

[0030] De preferência, o pH em etapa de crescimento é mantido em 4,4 no máximo.

[0031] De acordo com uma modalidade, o pH na etapa (a) de crescimento é substancialmente idêntico ao pH na etapa (b) de produ- ção. Se, notadamente, as duas etapas são conduzidas no mesmo bior- reator, escolher os mesmos pH simplifica assim a regulação do pH em toda a duração do processo. Pode-se ter assim a mesma instrução de regulação nas duas etapas ou utilizar a mesma solução tampão.

[0032] De acordo com outra modalidade, o pH na etapa (b) de produção pode ser escolhido mais ácido do que o pH na etapa (a) de crescimento, por exemplo, de pelo menos 0,3 a 0,6, notadamente um pH mais ácido (mais fraco, portanto) de 0,4 a 0,6.

[0033] Vantajosamente, o pH, quando da etapa (a) de crescimen- to, é regulado por acréscimo controlado de um composto nitrogenado,

notadamente amoníaco, que desempenha simultaneamente o papel de agente básico e de agente fonte de nitrogênio para o crescimento dos micro-organismos.

[0034] Vantajosamente, a etapa (b) de produção é operada em modo batch, fed-batch ou continuamente ou de acordo com vários desses modos sucessivamente.

[0035] Opcionalmente, o processo de acordo com a invenção pode compreender uma etapa intermediária (c) entre a etapa (a) e a etapa (b), esta etapa intermediária (c) sendo uma etapa de diluição do meio de cultura obtido na etapa (a) de crescimento.

[0036] Além disso, a etapa (a) de crescimento e a etapa (b) de produção podem ser realizadas no m esmo biorreator ou em dois rea- tores distintos, com transferência do meio reacional de um reator para o outro. O primeiro caso é o m ais simples, com um só reator evita-se ter que transferir o meio reacional. O segundo caso permite adaptar com precisão as características e os equipamentos de cada um dos biorreatores em função das necessidades de cada uma das etapas.

[0037] De preferência, quando da primeira etapa (a) de crescimen- to, a concentração em substrato carbonado de crescimento está esco- lhida entre 15 e 60 g/l.

[0038] De preferência, a segunda etapa (b) de produção é operada com um fluxo que limita substrato carbonado indutor, notadamente compreendido entre 30 e 140 mg.g-1.h-1, (isto é, entre 30 e 140 gra- mas por grama de biomassa e por hora), de preferência entre 35 e 45 mg.h-1.h-1, de preferência com uma solução aquosa de substrato car- bonado indutor a uma concentração compreendida entre 200 e 600 g/l.

[0039] A cepa utilizada no processo de acordo com a invenção é preferivelmente uma cepa de Trichoderma reesei ou de Trichoderma reesei modificada por mutação, seleção ou combinação genética. Mas é inútil modificá-la geneticamente com a finalidade de impedir a forma-

ção de hidrofobinas quando do seu crescimento. Pode-se tratar nota- damente das cepas CL847, RUTC30, MCG77 ou MCG80 menciona- das anteriormente.

[0040] O processo de acordo com a invenção produz preferivel- mente enzimas celulolíticas e/ou hemicelulolíticas (celulases).

[0041] Vantajosamente, o processo de acordo com a invenção é operado na ausência de agentes antimousse, notadamente na etapa (a) de produção. Não mais ter que recorrer a agentes antimousse é muito vantajoso economicamente. Além disso, o acréscimo desses agentes pode acarretar problemas de limitação de transferência de oxigênio do ar fornecido ao biorreator para a fase líquida compreen- dendo os fungos, o que é prejudicial ao seu crescimento. Esses agen- tes podem apresentar ainda problemas quando da filtração do meio de cultura no fim da etapa de produção.

[0042] A invenção tem também como objeto o uso das enzimas obtidas pelo processo descrito anteriormente para a hidrólise enzimáti- ca de biomassacelulósica/hemicelulósica terrestre ou marinha.

[0043] A invenção será descrita a seguir detalhadamente com o auxílio de exemplos de realização não limitativos. Lista das figuras

[0044] A figura 1 representa fotos de biorreatores utilizados de acordo com exemplos conforme e não conformes ao processo da in- venção com uma cepa, fotos tomadas durante a etapa de crescimento do processo.

[0045] A figura 2 representa fotos dos biorreatores utilizados de acordo com exemplos conformes e não conformes ao processo da in- venção com uma cepa diferente, fotos tomadas durante a etapa de crescimento do processo.

[0046] A figura 3 é um gráfico que representa a concentração em grama por litro de biomassa e de proteínas produzida de acordo com um exemplo comparativo.

[0047] A figura 4 é um gráfico que representa a concentração em grama por litro de biomassa e de proteínas produzida de acordo com um exemplo comparativo.

[0048] A figura 5 é um gráfico que representa a concentração em grama por litro de biomassa e de proteínas produzida de acordo com um exemplo de realização da invenção. Descrição dos modos de realização

[0049] A presenta invenção criou um processo de produção de en- zimas, notadamente de celulases, que permite evitar o aparecimento da mousse. Pareceu, de maneira surpreendente que o fato de traba- lhar quando do crescimento a baixos pHs (inferiores a 4,6, notadamen- te inferiores ou iguais a 4,4) não retarda o crescimento do micro- organismo e permite evitar o aparecimento da mousse.

[0050] O modo de condução do processo compreende 2 fases: - uma fase em modo batch, que dura preferivelmente entre 30 e 50 horas, com um pH vantajosamente inferior ou igual a 4,4 e com uma concentração em substrato carbonado de 15 a 60 g/L; - uma fase em modo fed-batch, que dura preferivelmente entre 100 e 200 horas, notadamente entre 100 e 150 horas, vantajo- samente a um pH inferior ou igual a 4,4 igualmente, e com um fluxo que imita fonte de carbono de 35 a 140mg.g-1.h-1, e preferivelmente entre 35 e 45 mg.h-1.h-1.

[0051] As cepas industriais utilizadas pertencem à espécie Tricho- derma areesei, modificadas para melhorar as enzimas celulolíticas e/ou hemicelulolíticas pelos processos de mutação-seleção, como por exemplo, a cepa CL847 (um desses processos está notadamente des- crito na patente US4762788). Cepas melhoradas pelas técnicas de recombinação genética podem ser utilizadas igualmente. Essas cepas são cultivadas em fermentadores agitados e aerados em condições compatíveis com seu crescimento e a produção de enzimas.

[0052] As fontes de carbono principais podem ser açúcares solú- veis, como a lactose, a glicose ou a xilose:

[0053] O substrato carbonado de crescimento está escolhido pre- ferivelmente dentre lactose, glicose, xilose, resíduos obtidos após fer- mentação etanólicas dos açúcares monoméricos dos hidrolizados en- zimáticos de biomassa celulósica, e/ou um extrato bruto de pentoses hidrossolúveis provenientes do pré-tratamento de uma biomassa celu- lósica.

[0054] O substrato carbonado indutor está escolhido preferivel- mente dentre lactose, celobiose, soforose, resíduos obtidos após fer- mentação etanólica dos açúcares monoméricos dos hidrolizados en- zimáticos de biomassa celulósica e/ou um extrato bruto de pentoses hidrossolúveis procedente do pré-tratamento de uma biomassa celuló- sica

[0055] Esse tipo de resíduo/extrato poder utilizado, portanto, tam- bém como fonte de carbono total, isto é, simultaneamente para o cres- cimento do micro-organismo e a indução do sistema de expressão. Essa fonte de carbono é utilizável mais particularmente pelas cepas melhoradas geneticamente e notadamente as cepas recombinantes.

[0056] As condições operacionais de pH e de temperatura, para a etapa de crescimento e a etapa de produção, são as seguintes: - pH entre 3,5 e 4,4; - temperatura entre 20 e 35ºC. Preferivelmente escolhe-se um pH de 4,4 e uma temperatura de 27ºC durante a fase de cresci- mento e um pH de 4 ou de 4,4 igualmente, e uma temperatura de 25ºC durante a fase de produção em modo fed-batch.

[0057] A vvm (taxa de aeração expressa em volume de ar por vo- lume de meio reacional e por minuto) aplicada durante o processo está compreendida entre 0,3 e 1,5 min-1 e a rpm (velocidade de rotação)

deve permitir regular a pressão em O2 entre 20% e 60%. Preferivel- mente escolhe-se uma aeração de 0,3 a 0,5 vvm e uma agitação que permita regular a pressão em O2 a 30% ou 40%.

[0058] De acordo com sua natureza, o substrato carbonado esco- lhido para a obtenção da biomassa é introduzido no fermentador antes de esterilização, ou é esterilizado separadamente e introduzido no fermentador após esterilização. A concentração em substrato carbo- nado está compreendida entre 200 e 600 g/L de acordo com o grau de solubilidade dos substratos carbonados utilizados (notadamente no que se refere ao substrato indutor). Exemplos

[0059] Uma pré-cultura de cepas é realizada em 2 frascos de Fer- nbach com um volume útil de 500 mL, que são semeados com um respectivo tubo de esporos de T reesei TR3002 e CL847. Elas são colocadas em um incubador de referência comercial INFORS HT Multi- tron a 30º C, com uma agitação orbital de 150 rpm durante 72 horas. Elas são despachadas em seguida sobre 8 frascos esterilizadas a vá- cuo (80 mL por frasco), que servirão para semear cada fermenta- dor/biorreator.

[0060] As condições operacionais de produção de celulases a par- tir das cepas obtidas no fim da pré-cultura são as seguintes:

[0061] As experiências comportam duas fases: - uma fase de crescimento em glicose a uma temperatura de 27ºC e um pH (regulado pelo amoníaco 5,5M), de 4,0 a 5,5 de acordo com as experiências. A aeração é fixada em 0,2 L/min (0,3 vvm) e a instrução de p O2 é fixada em 40%. Ela é mantida constante graças à agitação, - uma fase de produção de enzimas induzida por um fluxo que limita a solução de fed-batch após 30 horas de cultura. A solução é injetada com um débito constante de 0,5 g de substrato carbonado por hora. A instrução de temperatura é modificada para 25º C. esta fase dura entre 160 e 220 horas de acordo com a disponibilidade do substrato e o desenrolar da experiência.

[0062] Uma retirada de amostra é realizada a cada dia com acom- panhamento do peso seco, das concentrações em glicose, lactose, galactose, xilose. Sobrenadantes de cultura de 5 mL são estocados a 4ºC para as dosagens enzimáticas e proteínas realizadas no fim da cultura. Exemplo 1:

[0063] O exemplo 1 é realizado a partir da cepa TR3002. Esta ce- pa está descrita nas publicações: Bem Chaabane F, Jourdier E, Licht R, Cohen C and Monof F (2012) "Kinetic characterization of Tricho- derma reesei CL747 R3002: an engineered strain producing highly iimproved cellullyytic cocktail". Journal of Chemistry and Chemical En- gineering 6 (2), 109-117, e Ayrinhac C, Marageot A, Ferreira NL, em Chaabane F,Monot F, Ravoat G, Sonet J. – M and Fouraage L (2011) "Improved saccharification of wheat straw for biofuel productiojn using an engineered secreto-me of Trichoderma reasei". Organic Process Reseach and Development 15 (1), 275-278.

[0064] - A fase de crescimento é realizada a pH 4 a 27º C e com uma concentração de glicose de 15 g/L

[0065] - a fase de produção é realizada a pH 4 a 25ºC, com uma concentração em lactose de 220 g/L, correspondendo a um débito es- pecífico de lactose de fed-batch de 45 mg por grama de biomassa e por hora. Exemplo 2: (comparativo)

[0066] O exemplo 2 é realizado a partir da cepa TR3002.

[0067] - A fase de crescimento é realizado a pH 4, 8 a 27ºC e com uma concentração de glicose de 15 g/L

[0068] - a fase de produção é realizada a pH 4,8 a 25º C, com uma concentração em lactose de 220 g/L, correspondendo a um débito es- pecífico de lactose de fed-batch de 45 mg por grama de biomassa e por hora. Exemplo 3: (comparativo)

[0069] O exemplo 3 é realizado a partir da cepa TR3002.

[0070] - A fase de crescimento é realizada a pH 5,5 a 27º C e com uma concentração de glicose de 15 g/L

[0071] - a fase de produção é realizada a pH 5,5 a 27º C com uma concentração em lactose de 220 g/L, correspondente a um débito es- pecífico de lactose de fed-batch de 45 mg por grama de biomassa e por hora. Exemplo 4:

[0072] O exemplo 4 é realizado a partir da cepa TR3002.

[0073] - A fase de crescimento é realizada a pH 4,4 a 27ºc e com uma concentração de glicose de 15 g/L

[0074] - a fase de produção é realizada a pH 4,4 a 25ºC, com uma concentração em lactose de 220 g/L, correspondendo a um débito es- pecífico de lactose de fed-batch de e45 mg por grama de biomassa e por hora. Exemplo 5:

[0075] O exemplo 5 é realizado a partir da cepa CL847. Esta cepa está descrita nas seguintes publicações: - Joudier E, Pough L, Larro- che C, Monot F and Bem Chaabarn F (2012) "A new stoichimetric mi- niaturization strategy for screening of industrial microbial strains: appli- cation to celulase hyper-producing Trichoderma reesei strains " Micro- bial Cell Factoreis 11, (Impact Factor: 3,60), e Jourdier E, Bem Chaa- bane F, Poughon L, Larroche C and Monot F(*2012) "Simple Kinetic Model f Cellulase Production by Trichoderma Reesei for Productivity or Yiel Maximjizatiaon". Chemical Engineering Transactions 27, 313-318.

[0076] - A fase de crescimento é realizada a pH 4 a 27º C e com uma concentração de glicose de 15 g/L

[0077] - a fase de produção é realizada a pH 4 a 25º C, com uma concentração em lactose de 220 g/L, correspondendo a um débito es- pecífico de lactose de fed-batch de 45 mg por grama de biomassa e por hora. Exemplo 6:

[0078] O exemplo 6 é realizado a partir da cepa CL847.

[0079] - A fase de crescimento é realizada a pH 4,4 a 27º C e com uma concentração de glicose de 15 g/L

[0080] - a fase de produção é realizada a pH 4,4 a 25º C, com uma concentração em lactose de 220 g/L, correspondendo a um débito es- pecífico de lactose de fed-batch de 45 mg por grama de biomassa e por hora. Exemplo 7 (comparativo)

[0081] O exemplo 7 é realizado a partir da cepa CL847.

[0082] - A fase de crescimento é realizada a pH 4,8 a 27º C e com uma concentração de glicose de 15 g/L

[0083] - a fase de produção é realizada a pH 4,8 a 25º C, com uma concentração em lactose de 220 g/L, correspondendo a um débito es- pecífico de lactose de fed-batch de 45 mg por grama de biomassa e por hora. Exemplo 8: (comparativo)

[0084] O exemplo 8 é realizado a partir da cepa CL847.

[0085] - A fase de crescimento é realizada a pH 5,5 a 27º C e com uma concentração de glicose de 15 g/L

[0086] - a fase de produção é realizada a pH 5,5 a 25º C, com uma concentração em lactose de 220 g/L, correspondendo a um débito es- pecífico de lactose de fed-batch de 45 mg por grama de biomassa e por hora.

Tabela 1 Referência cepa pH de cres- Observação visual exemplo cimento Exemplo 1 TR3002 4 Sem mousse Exemplo 2 TR3002 4,8 Aparecimento da mousse desde 24 horas depois con- tinuamente Exemplo 3 TR3002 5,5 Aparecimento da mouse desde 24 horas e depois continuamente Exemplo 4 TR3002 4,4 Sem mousse Exemple 5 CL847 4 Sem mousse Exemplo 6 CL847 4,4 Sem mousse Exemplo 7 CL847 4,8 Aprecimento da mousse desde 24 horas e depois continuamente até a espo- rulação Exemple 8 CL847 5,5 Aprecimento da mousse desde 24 horas e depois continuamente até a espo- rulação

[0087] As figuras 1 e 2 representam fotografias dos biorreatores dos exemplos 1,2,3,4,5,6,7,8 após 24h: (a referência 1 corresponde ao exemplo 1, e assim por diante). Da tabela 1 e das figuras 1 e 2 consta- ta-se que, qualquer que seja a cepa utilizada (CL847 ou TR3002), um pH superior ou igual a 4,8 em fase de crescimento acarreta a produção de mousse desde 24 horas. Depois essa mousse não é controlável, o que se traduz pala parada das fermentações a um pH tão elevado, pois há transbordamento ou esporulação. As culturas com um pH infe- rior ou igual a 4,4 não tem mousse.

[0088] Para verificar se a seleção do pH de crescimento em valo- res de no máximo 4,4 conforme a invenção tinha, além disso, um im- pacto sobre a performance da cepa, calculou-se para isso a velocida-

de específica de produção de proteínas qp. Essa velocidade específica qp é igual a rp/X, com rp a produtividade em proteínas em g/L, e X a concentração em biomassa em g/L. os valores de qp obtidos são os seguintes: Exemplo 1 (pH 4 crescimento, cepa TR3002): qp = 28,4 mgP/gX/h Exemplo 2 (pH 4,8 crescimento, cepa TR3002): qp = 27,7 mgP/gX/h Exemplo 4 (pH 4,4 crescimento, cepa TR3002): qp = 25,4 mgP/gX/h Exemplo 5 (pH 4 crescimento, cepa CL847): qp = 8,5 mgP/gX/h Exemplo 6 (pH 4,4 crescimento, cepa CL847): qp = 9,4 mgP/gX/h

[0089] Para os exemplos 7 e 8 os valores de qp não são significa- tivamente diferentes daqueles dos exemplos 5 e 6, de modo que a formação de mousse não começou, a formação de mouse tendo inter- rompido em seguida as experimentações para esses dois exemplos.

[0090] Constata-se, portanto, que, para uma dada cepa, baixar o pH de crescimento não teve impacto significativo sobre a velocidade específica qp, nem sobre a produtividade global do processo. De fato, a concentração final de proteínas, para uma mesma duração de pro- dução, não está tampouco afetada pelo abaixamento do pH de cres- cimento: obtêm-se quantidades em torno de 40g/L para os exemplos com a cepa TR3002, qualquer que seja o pH de crescimento, e as quantidades em torno de 25g/L para os exemplos com a cepa CL847, qualquer que seja o pH de crescimento.

[0091] A figura 3 indica a produção em g/L de biomassa (linha com pontos) e de proteínas (linha com triângulos) em função do tempo ex- presso em hora para o exemplo 2 comparativo, a figura 4 representa o mesmo tipo de gráfico para o exemplo 1 de acordo com a invenção e a figura 5 para o exemplo 4 de acordo com a invenção: a comparação desses gráficos confirma que a produção em proteínas permanece no m esmo nível, quer se abaixe que não o pH de crescimento. Vê-se também (exemplo 4, figura 5) que adotar o mesmo pH para o cresci-

mento e a produção não impacta tampouco negativamente a produção de proteínas.

[0092] Foram avaliados igualmente os níveis de atividade enzimá- tica das enzimas produzidas, pela medição da atividade chamada pa- pier filtre (Fpase). Este método permite dosar a atividade global do po- ol enzimático (endoglucanases e exoglucanases). A atividade Fpasse é medida em papier Whatman no. 1 (procedimento recomendado pela comissão biotecnológica IUPAC): determina-se a tomada de ensaio da solução enzimática que realiza 4% de avanço da criação enzimática em 60 minutos. O princípio da atividade papier filtro é determinar por dosagem no DNS (ácido dinitrossalicílico) a quantidade de açúcares reduzidos procedentes de um papier Whatman no. 1.

[0093] Os valores de Fpase obtidos para os 8 exemplos, e tradu- zindo, portanto, a atividade global do coquetel enzimático e, conse- quentemente, sua qualidade, representam valores clássicos para as cepas utilizadas, a saber: compreendidas entre 0,8 e 1 IU/mg.

[0094] Conclui-se que, se a invenção permite evitar a formação de maneira particularmente simples e eficaz, ela não tem impacto negati- vo nem sobre o rendimento de produção das enzimas nem sobre sua qualidade.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Processo de produção de enzimas por uma cepa per- tencente a um fungo filamentoso, caracterizado pelo fato de que o dito processo compreende duas etapas: (a) uma primeira etapa de crescimento dos fundos, na presença de pelo menos um substrato carbonado de crescimento, em um biorreator agitado e aerado em fase batch, a um pH inferior ou igual a 4,6; (b) uma segunda etapa de produção de enzimas, a partir do meio de cultura obtido na primeira etapa (a), na presença de pelo menos um substrato carbonado indutor, a um pH inferior ou igual a 4,6.

2. Processo de acordo com a reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que o pH na etapa (a) de crescimento e/ou na etapa (b) de produção é inferior ou igual a 4,4, notadamente com- preendido entre 3,5 e 4,4.

3. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que o pH na etapa (a) de crescimento é substancialmente idêntico ao pH na etapa (b) de produ- ção.

4. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, carac- terizado pelo fato de que o pH na etapa (b)de produção é mais ácido do que o pH na etapa (a) de crescimento.

5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que o pH, quando da etapa (a) de crescimento, é regulado por acréscimo controlado de um composto nitrogenado, notadamente amoníaco.

6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que a etapa (b) de pro- dução é operada em modo batch, fed-batch ou continuamente ou de acordo com vários desses modos sucessivamente.

7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa intermediária (c) entre a etapa (a) e a etapa (b), esta etapa in- termediária (c) sendo uma etapa de diluição do meio de cultura obtido na etapa (a) de crescimento.

8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que, quando da primeira etapa (a) de crescimento, a concentração de substrato carbonado de crescimento está compreendida entre 15 e 60 g/l.

9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que a segunda etapa (b) de produção é operada com um fluxo que limita substrato carbonado indutor, notadamente compreendido entre 30 e 140 mg.g-1.h-1, e prefe- rivelmente entre 35 e 45 mg.g-1.h-1, e preferivelmente com uma solu- ção aquosa de substrato carbonado indutor em uma concentração compreendida entre 200 e 600 g/l.

10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que a cepa utilizada é uma cepa de Trichoderma reesei ou de Trichoderma reesei modificada por mutação seleção ou recombinação genética.

11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que as enzimas são en- zimas celulolíticas e/ou hemicelulolíticas.

12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que ele é operado na au- sência de agentes antimousse, notadamente na etapa (a) de produ- ção.

13. Uso das enzimas obtidas pelo processo como definido em qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que é para a hidrólise enzimática de biomassa celulósi- ca/hemicelulósica terrestre ou marinha.