EP3887503A1 - Procede de production d'enzymes par une souche appartenant a un champignon filamenteux - Google Patents

Procede de production d'enzymes par une souche appartenant a un champignon filamenteux

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EP3887503A1
EP3887503A1 EP19797284.7A EP19797284A EP3887503A1 EP 3887503 A1 EP3887503 A1 EP 3887503A1 EP 19797284 A EP19797284 A EP 19797284A EP 3887503 A1 EP3887503 A1 EP 3887503A1
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EP
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growth
production
stage
enzymes
strain
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EP19797284.7A
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Fadhel Ben Chaabane
Celine Cohen
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Original Assignee
IFP Energies Nouvelles IFPEN
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Publication date
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    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the invention relates to a process for the production of cellulases by a filamentous fungus, necessary for the enzymatic hydrolysis of lignocellulosic biomass implemented, for example, in the processes for producing so-called second generation (2G) sweet juices.
  • 2G second generation
  • sugary juices can be used to produce other products chemically or biochemically / fermentatively (for example, alcohols such as
  • ethanol-type biofuels or butanol or other molecules, for example solvents such as acetone and other bio-based molecules .
  • Cellulases can also be used in other processes, especially in the chemical, paper and textile industries.
  • 2nd generation biofuels (known as "2G"), if we take this particular example of implementation, is the subject of numerous studies.
  • the latter are produced, in particular, from woody substrates such as different woods (hardwoods and conifers, miscanthus, or "TCR", which is the acronym for Quick Growth Coppice), by-products from agriculture (wheat straw , rice straw, corn cobs, etc ...) or other food industries, paper mills, etc ...
  • TCR which is the acronym for Quick Growth Coppice
  • biofuels first generation which are produced from sugar cane, corn, wheat or beet.
  • Lignocellulosic biomass is characterized by a complex structure made up of three main fractions: cellulose (35 to 50%), which is a polysaccharide essentially made up of hexoses; hemicellulose (20 to 30%), which is a polysaccharide essentially consisting of pentoses; and lignin (15 to 25%), which is a polymer of complex structure and of high molecular weight, composed of aromatic alcohols linked by ether bonds. These different molecules are responsible for the intrinsic properties of the plant wall and are organized into a complex tangle.
  • cellulose and hemicellulose are those which allow the production of 2G sweet juices.
  • the process of its transformation into an ethanol-type biofuel comprises several stages:
  • the pretreatment makes it possible to make the cellulose accessible to the enzymes which are cellulases.
  • the enzymatic hydrolysis stage allows the transformation of cellulose into sugars, such as glucose, which are then transformed into ethanol during the fermentation stage by generally the yeast Saccharomyces cerevisiae.
  • the stage of distillation will separate and recover the ethanol from the fermentation wort. Note, as mentioned above, that one can also choose to stop the process for obtaining sugars of the glucose type, in order to valorize them as such, or even treat them differently to obtain other alcohols or bio-based molecules.
  • Lignocellulosic materials are cellulosic materials, that is to say made up of more than 90% by weight of cellulose, and / or lignocellulosic, that is to say made up of cellulose, hemicelluloses, which are polysaccharides essentially consisting of pentoses and hexoses as well as lignin, which is a macromolecule of complex structure and of high molecular weight, based on phenolic compounds.
  • Wood, straw, corn cobs are the most used lignocellulosic materials, but other resources, dedicated forest crops, residues of alcohol-producing plants, sugar and cereals, products and residues of the paper industry and products processing lignocellulosic materials can be used. Most of them are made up of about 35 to 50% cellulose, 20 to 30% hemicellulose and 15 to 25% lignin.
  • the process for the biochemical transformation of lignocellulosic materials into ethanol comprises a physico-chemical pretreatment step, followed by an enzymatic hydrolysis step using an enzymatic cocktail, a step of ethanolic fermentation of the released sugars, ethanolic fermentation and the enzymatic hydrolysis can be carried out simultaneously, and a step of purifying the ethanol.
  • the enzyme cocktail is a mixture of cellulolytic (also called cellulase) and / or hemicellulolytic enzymes.
  • Cellulolytic enzymes exhibit three main types of activity: endoglucanases, exoglucanases and cellobiases, the latter also being called b-glucosidases.
  • Hemicellulolytic enzymes in particular exhibit xylanase activities.
  • the enzymatic hydrolysis is effective and takes place under mild conditions.
  • the cost of enzymes remains very high, representing from 20 to 50% of the cost of transforming the lignocellulosic material into ethanol. Therefore, a lot of work has been done to reduce this cost: optimizing the production of enzymes first, by selecting hyperproductive microorganisms and improving the production processes of said enzymes, decreasing the amount of enzymes in hydrolysis then, by optimizing the pretreatment step, by improving the specific activity of these enzymes, and by optimizing the implementation of the enzymatic hydrolysis step.
  • Trichoderma reesei is the most used microorganism for the production of cellulases. Wild strains have the ability to excrete, in the presence of an inducing substrate, cellulose for example, the enzyme complex considered to be best suited for the hydrolysis of cellulose.
  • the enzymes in the enzyme complex contain three main types of activity: endoglucanases, exoglucanases and cellobiases and other proteins with properties essential for the hydrolysis of lignocellulosic materials are also produced by Trichoderma reesei, xylanases for example .
  • the presence of an inducing substrate is essential for the expression of cellulolytic and / or hemicellulolytic enzymes.
  • the nature of the carbon substrate has a strong influence on the composition of the enzyme complex. This is the case with xyloses, which, combined with a carbon-inducing substrate such as cellulose or lactose, makes it possible to significantly improve the so-called xylanase activity.
  • xyloses which, combined with a carbon-inducing substrate such as cellulose or lactose, makes it possible to significantly improve the so-called xylanase activity.
  • the regulation of cellulase genes on different carbon sources has been studied in detail. They are induced in the presence of cellulose, its hydrolysis products, such as cellobiose, or certain oligosaccharides such as lactose or sophorose (cf. Ilmén et al., 1997; Appl. Environ. Microbiol. 63: 1298-1306 .)
  • the process for the production of cellulases by Trichoderma reesei has undergone significant improvements with a view to extrapolation to an industrial scale.
  • To obtain good productivities in enzymes it is necessary to provide a source of carbon quickly assimilated for the growth of Trichoderma reesei, and an inducing substrate which allows the expression of cellulases and the secretion in the culture medium.
  • Cellulose can play these two roles; however, it is difficult to use at the industrial stage and it has been proposed to replace it with soluble carbon sources, of the glucose, xylose or lactose type, the lactose also playing the role of an inducing substrate.
  • Patent FR-B-2 555 603 proposes a protocol which makes it possible to achieve a protein concentration of the order of 35 to 40 g / L with a productivity of the order of 0.2 g / L / h and which consists of two stages: a first stage of growth in "batch" mode where it is necessary to provide a source of carbon quickly assimilated for the growth of Trichoderma reesei, then a stage of production in "fed-batch” mode using a inducing substrate (example: lactose) which allows the expression of cellulases and secretion in the culture medium.
  • the optimal flux applied is between 35 and 45 mg.g Vh 1 (milligrams of inducing substrate per milligram of biomass and per hour).
  • patent EP-B-2,744,899 proposes an improvement by selecting in particular a bioreactor having a coefficient of volumetric transfer of oxygen KLa associated with a particular selection both of the concentration of carbonaceous growth substrate in the first step and a limiting flux level of carbon source in the second step.
  • a foam during the growth stage in particular. It may be a so-called “dry” foam, ie constituting a dispersion of gas in a liquid phase, and which therefore has a density close to that of a gas and which forms in the upper part of the bioreactor. It can also be a so-called “wet” foam, which is a foam for extending / increasing the reaction volume due to the trapping of gas bubbles (of air) in the liquid. Its density is higher than dry foam (because its gas / liquid ratio is lower). Whether it is one or the other, or a mixture of these two types of foam, they present a real problem of industrial process control.
  • a first solution consisted in adding anti-foaming agents to the reaction medium during the growth step.
  • anti-foam agents is certainly effective in resuspending the foam in liquid form, but it is not without its drawbacks.
  • the resuspension of the liquid in liquid causes a sharp increase in pH, largely disrupting the pH regulation that must be carried out, or even an unwanted changeover from the growth stage to the production. This can be caused by the massive supply of reagents (sugars) blocked on the surface due to the foam, which, when it collapses under the effect of the anti-foam, suddenly come into contact with the biomass. large quantity.
  • anti-foaming agents also causes a decrease in the concentration of dissolved oxygen in the medium (because it coalesces the air bubbles), which can have an impact on microorganisms which are strict aerobes or on their productivity.
  • these agents are often based on oils, which cannot be eliminated on their own: once the production of enzymes is complete, if the separation is carried out between the enzymes and the rest of the biomass (the fungi ), in particular by conventional technologies using membrane filtration means, these defoaming agents are capable of clogging the membranes, and it may therefore be necessary to have to add a step of separation of these agents once the production is complete , without which poor separation performance results. Their addition also has an additional production cost.
  • the invention therefore aims to develop an improved enzyme production process, avoiding or at least limiting the foaming phenomenon, without causing at least some of the above drawbacks, and in particular without causing any complication in the conduct of the nor compel them to make specific genetic modifications to microorganisms.
  • the invention firstly relates to a process for the production of enzymes by a strain belonging to a filamentous fungus, said process comprising two stages:
  • step (b) a second step of producing enzymes, from the culture medium obtained in the first step (a), in the presence of at least one inducing carbon substrate, at a pH less than or equal to 4.6.
  • the pH of the growth stage is regulated to keep it within the required range.
  • the pH of the production stage is also regulated.
  • the regulation is done in a known manner, in particular by monitoring the pH continuously or sequentially with ad hoc sensors, and adding (acid or base during the step to remain at the set point.
  • the pH of one and / or the other of the steps using a buffer solution.
  • the solution of the invention is surprisingly simple, since there was nothing to suggest that modifying, towards a higher acidity, in reasonable proportions (without going down, preferably below 3.5 or 3.6 or 3.7), the pH during growth was going to have consequences on the complex phenomenon of foaming. It is very advantageous in terms of industrial production management: - the bioreactor in which the growth step is carried out is fully equipped to regulate the pH to these values, so there is no difficulty in implementing it the invention with conventional bioreactors; - since there is no or very little foam formed, it is possible to calculate the size of the bioreactor as accurately as possible, and to increase its useful volume (it is no longer necessary to provide an additional “lost” volume intended to contain possible excessive foam overflows);
  • the pH in stage (a) of growth and / or in stage (b) of production is at least 3.5, and in particular less than or equal to 4.4, it is in particular between 3.5 and 4.4 or between 3.8 and 4.4: this brings the pH of the growth stage closer to the pH of the production stage.
  • the pH in the growth stage is maintained at at least 3.6, in particular at least 3.7 or at least 3.8.
  • the pH in the growth stage is maintained at at most 4.4.
  • the pH in stage (a) of growth is substantially identical to the pH in stage (b) of production. If, in particular, the two stages are carried out in the same bioreactor, choosing the same pH thus simplifies the regulation of the pH over the entire duration of the process. It is thus possible to have the same regulation instruction on the two stages or to use the same buffer solution.
  • the pH in stage (b) of production can be chosen more acidic than the pH in stage (a) of growth, for example at least 0.3 to 0.6, in particular a more acidic pH (lower therefore) from 0.4 to 0.6.
  • the pH, during stage (a) of growth is regulated by controlled addition of a nitrogenous compound, in particular of ammonia, which plays both the role of basic agent and of source agent d for the growth of microorganisms.
  • step (b) of production takes place in batch, fed-batch or continuous mode or according to several of these modes successively.
  • the method according to the invention may comprise an intermediate step (c) between step (a) and step (b), this intermediate step (c) being a step of diluting the culture medium obtained at growth stage (a).
  • stage (a) of growth and stage (b) of production can be carried out in the same bioreactor or in two separate reactors, with transfer of the reaction medium from one reactor to the other.
  • the first case is the simplest, with a single reactor we avoid having to transfer the reaction medium.
  • the second case makes it possible to precisely adapt the characteristics and equipment of each of the bioreactors according to the needs of each of the stages.
  • the concentration of carbonaceous growth substrate is chosen to be between 15 and 60 g / l.
  • the second stage (b) of production is carried out with a limiting flux of inducing carbon substrate, in particular between 30 and 140 mg.g Vh 1 , (that is to say between 30 and 140 grams per gram of biomass and per hour), preferably between 35 and 45 mg.g Vh 1 , and preferably with an aqueous solution of inducing carbon substrate at a concentration of between 200 and 600 g / l.
  • a limiting flux of inducing carbon substrate in particular between 30 and 140 mg.g Vh 1 , (that is to say between 30 and 140 grams per gram of biomass and per hour), preferably between 35 and 45 mg.g Vh 1 , and preferably with an aqueous solution of inducing carbon substrate at a concentration of between 200 and 600 g / l.
  • the strain used in the process according to the invention is preferably a strain of Trichoderma reesei or of Trichoderma reesei modified by selection mutation or genetic recombination. But there is no need to genetically modify it in order to prevent the formation of hydrophobins during its growth. These may include strains CL847, RutC30, MCG77, or MCG80 mentioned above.
  • the process according to the invention preferably produces cellulolytic and / or hemicellulolytic enzymes (cellulases).
  • the method according to the invention is operated in the absence of anti-foaming agents, in particular during step (a) of production. No longer having to use anti-foaming agents is very advantageous economically.
  • the addition of these agents can cause problems in limiting the transfer of oxygen from the air supplied to the bioreactor towards the liquid phase comprising the fungi, which harms their growth. These agents can also pose problems during the filtration of the culture medium at the end of the production stage.
  • the subject of the invention is also the use of the enzymes obtained by the process described above for the enzymatic hydrolysis of terrestrial or marine cellulosic / hemicellulosic biomass.
  • FIG. 1 represents photos of the bioreactors used according to examples conforming and not conforming to the process of the invention with a strain, photos taken during the growth step of the process.
  • FIG. 2 represents photos of the bioreactors used according to examples conforming and not conforming to the process of the invention with a different strain, photos taken during the growth step of the process.
  • Figure 3 is a graph showing the concentration in grams per liter of biomass and protein produced according to a comparative example.
  • FIG. 4 is a graph representing the concentration in grams per liter of biomass and proteins produced according to an exemplary embodiment of the invention.
  • FIG. 5 is a graph representing the concentration in grams per liter of biomass and proteins produced according to an exemplary embodiment of the invention.
  • the present invention has developed a process for the production of enzymes, in particular cellulases, which makes it possible to prevent the appearance of foam. It has surprisingly appeared that working during growth at low pH (less than 4.6, in particular less than or equal to 4.4) does not slow the growth of the microorganism and makes it possible to avoid the appearance of the foam.
  • the method of conducting the process has 2 phases:
  • phase in batch mode which preferably lasts between 30 and 50 hours, with a pH advantageously less than or equal to 4.4 and with a concentration of carbon substrate of 15 to 60 g / L preferably
  • a phase in fed-batch mode which preferably lasts between 100 and 200 hours, in particular between 100 and 150 hours, advantageously at a pH less than or equal to 4.4 also, and with a limiting flux of carbon source from 35 to 140mg.g 1 .h 1 , and preferably between 35 and 45 mg.g Vh 1 .
  • the industrial strains used belong to the species Trichoderma reesei, modified to improve the cellulolytic and / or hemicellulolytic enzymes by mutation-selection processes, such as for example the CL847 strain ((one of these processes is described in particular in US Pat. No. 4,762,788 Strains improved by genetic recombination techniques can also be used, which are cultivated in agitated and aerated fermenters under conditions compatible with their growth and the production of enzymes.
  • the main sources of carbon can be soluble sugars such as lactose, glucose or xylose:
  • the carbonaceous growth substrate is preferably chosen from lactose, glucose, xylose, the residues obtained after ethanolic fermentation of the monomeric sugars of the enzymatic hydrolysates of cellulosic biomass, and / or a crude extract of water-soluble pentoses originating from the pretreatment of a cellulosic biomass.
  • the inducing carbon substrate is preferably chosen from lactose, cellobiose, sophorose, the residues obtained after ethanolic fermentation of the monomer sugars of the enzymatic hydrolysates of cellulosic biomass, and / or a crude extract of water-soluble pentoses originating from the pretreatment of a biomass cellulosic.
  • This type of residue / extract can therefore also be used as a total carbon source, that is to say both for the growth of the microorganism and the induction of the expression system.
  • This carbon source can be used more particularly by genetically improved strains and in particular recombinant strains.
  • the operating conditions of pH and temperature, for the growth stage and the production stage are as follows:
  • a pH of 4.4 is preferably chosen and a temperature of 27 ° C during the growth phase and a pH of 4 or 4.4 also, and a
  • vvm (aeration rate expressed in volume of air per volume of reaction medium and per minute) applied during the process is between 0.3 and 1.5 min 1 and the rpm (speed of rotation) must make it possible to regulate the pressure in 0 2 between 20% and 60%.
  • aeration of 0.3 to 0.5 vvm and a stirring enabling the pressure to be adjusted to 0 2 to 30% or 40% are chosen.
  • the carbon substrate chosen for obtaining the biomass is introduced into the fermenter before sterilization, or is sterilized separately and introduced into the fermenter after sterilization.
  • the concentration of carbon substrate is between 200 and 600 g / L depending on the degree of solubility of the carbon substrates used (in particular as regards the inducing substrate).
  • a preculture of the strains is carried out in 2 Fernbach flasks with a useful volume of 500 ml, which are inoculated with each a tube of spores of T reesei TR3002 and CL847. They are placed in an INFORS HT Multitron commercial reference incubator at 30 ° C, with orbital shaking of 150 rpm for 72 hours. They are then dispatched to 8 vacuum sterilized flasks (80 mL per flask) which will be used to inoculate each fermenter / bioreactors.
  • the operating conditions for the production of cellulases from the strains obtained at the end of preculture are as follows:
  • the experiments have two phases.
  • a sample is taken each day with monitoring of the dry weight, glucose, lactose, galactose, xylose concentrations.
  • Culture supernatants of 5 mL are stored at 4 ° C. for the enzymatic assays and proteins produced at the end of the culture.
  • Example 1 is carried out from the strain TR3002. This strain is described in the following publications: Ben Chaabane F, Jourdier E, Licht R, Cohen C and Monot F (2012)
  • the production phase is carried out at pH 4 at 25 ° C, with a lactose concentration of 220 g / L, corresponding to a specific fed-batch lactose flow rate of 45 mg per gram of biomass and per hour.
  • Example 2 is carried out from the strain TR3002.
  • the growth phase is carried out at pH 4.8 at 27 ° C and with a glucose concentration of 15 g / L
  • the production phase is carried out at pH 4.8 at 25 ° C, with a lactose concentration of 220 g / L, corresponding to a specific fed-batch lactose flow rate of 45 mg per gram of biomass per hour.
  • Example 3 is made from the strain TR3002.
  • the growth phase is carried out at pH 5.5 at 27 ° C and with a glucose concentration of 15 g / L
  • the production phase is carried out at pH 5.5 at 25 ° C, with a lactose concentration of 220 g / L, corresponding to a specific fed-batch lactose flow rate of 45 mg per gram of biomass per hour.
  • Example 4 is made from the strain TR3002.
  • the growth phase is carried out at pH 4.4 at 27 ° C and with a glucose concentration of 15 g / L
  • the production phase is carried out at pH 4.4 at 25 ° C, with a lactose concentration of 220 g / L, corresponding to a specific fed-batch lactose flow rate of 45 mg per gram of biomass per hour.
  • Example 5 is carried out from the strain CL847.
  • This strain is described in the following publications: - Jourdier E, Poughon L, Larroche C, Monot F and Ben Chaabane F (2012) "A new stoichiometric miniaturizationstrategy for screening of industrial microbial strains: application to cellulase hyper-producing Trichoderma reesei strains” .
  • Microbial Cell Factories 1 1, 70 Impact Factor: 3.60
  • Jourdier E, Ben Chaabane F, Poughon L Jourdier E, Ben Chaabane F, Poughon L
  • the growth phase is carried out at pH 4 at 27 ° C and with a glucose concentration of 15 g / L
  • the production phase is carried out at pH 4 at 25 ° C, with a lactose concentration of 220 g / L, corresponding to a specific fed-batch lactose flow rate of 45 mg per gram of biomass and per hour.
  • Example 6 is made from the CL847 strain.
  • the growth phase is carried out at pH 4.4 at 27 ° C and with a glucose concentration of 15g / L
  • the production phase is carried out at pH 4.4 at 25 ° C, with a lactose concentration of 220 g / L, corresponding to a specific fed-batch lactose flow rate of 45 mg per gram of biomass per hour.
  • Example 7 is carried out from the CL847 strain.
  • the growth phase is carried out at pH 4.8 at 27 ° C and with a glucose concentration of 15 g / L
  • the production phase is carried out at pH 4.8 at 25 ° C, with a lactose concentration of 220 g / L, corresponding to a specific fed-batch lactose flow rate of 45 mg per gram of biomass per hour.
  • Example 8 is made from the CL847 strain.
  • the growth phase is carried out at pH 5.5 at 27 ° C and with a glucose concentration of 15 g / L
  • FIGS. 1 and 2 represent photographs of the bioreactors of examples 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8 after 24 hours: (the reference 1 corresponds to example 1, and so on).
  • Figure 3 indicates the production in g / L of biomass (line with dots) and proteins (line with triangles) as a function of time expressed in hours for comparative example 2
  • Figure 4 represents the same type of graph for example 1 according to the invention
  • FIG. 5 for example 4 according to the invention: the comparison of these graphs confirms that the protein production remains at the same level, whether or not the growth pH is lowered .
  • the enzyme activity levels of the enzymes produced were also evaluated by measuring the activity known as filter paper ("FPase").
  • FPase filter paper
  • This method allows to measure the overall activity of the enzyme pool (endoglucanases and exoglucanases).
  • the FPase activity is measured on Whatman N ° 1 paper (procedure recommended by the IUPAC biotechnology commission): the test portion of the enzymatic solution is determined, which achieves 4% progress in the enzymatic reaction in 60 minutes.
  • the principle of the filter paper activity is to determine by dosage at DNS (dinitrosalicylic acid) the amount of reduced sugars from Whatman N ° 1 paper.
  • the FPase values obtained for the 8 examples, and therefore reflecting the overall activity of the enzymatic cocktail, and therefore its quality, have conventional values for the strains used, namely between 0.8 and 1 IU / mg.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de production d'enzymes par une souche appartenant à un champignon filamenteux, ledit procédé comprenant deux étapes : (a) une première étape de croissance des champignons, en présence d'au moins un substrat carboné de croissance, dans un bioréacteur agité et aéré en phase batch, à un pH inférieur ou égal à 4,6; (b) une deuxième étape de production d'enzymes, à partir du milieu de culture obtenu à la première étape (a), en présence d'au moins un substrat carboné inducteur, à un pH inférieur ou égal à 4,6.

Description

PROCEDE DE PRODUCTION D’ENZYMES PAR UNE SOUCHE APPARTENANT A UN
CHAMPIGNON FILAMENTEUX
Domaine technique
L'invention est relative à un procédé de production de cellulases par un champignon filamenteux, nécessaires pour l'hydrolyse enzymatique de biomasse lignocellulosique mise en oeuvre, par exemple, dans les procédés de production des jus sucrés dits de seconde génération (2G). Ces jus sucrés peuvent être utilisés pour produire d’autres produits par voie chimique ou voie biochimique/fermentaire (par exemple, des alcools comme des
biocarburants du type éthanol, ou encore du butanol ou d’autres molécules, par exemple des solvants tels que l’acétone et d’autres molécules biosourcées...). Les cellulases peuvent également être employés dans d’autres procédés, notamment dans l’industrie chimique, papetière ou textile.
La mise au point de procédés économiquement viables de production de biocarburants de 2ème génération (dite « 2G »), si l’on prend cet exemple particulier de mise en oeuvre, fait l’objet de nombreuses études. Ces derniers sont produits, notamment, à partir de substrats ligneux comme différents bois (feuillus et résineux, miscanthus, ou « TCR », qui est l’acronyme pour Taillis à Croissance Rapide), des coproduits issus de l’agriculture (pailles de blé, pailles de riz, rafles de maïs, etc...) ou d’autres industries agroalimentaires, papetières, etc... Ils posent moins de problèmes de concurrence d'usage des terres agricoles avec l'alimentaire, par rapport aux biocarburants dits de première génération qui sont produits à partir de canne à sucre, maïs, blé ou betterave.
La biomasse lignocellulosique se caractérise par une structure complexe constituée de trois principales fractions: la cellulose (35 à 50%), qui est un polysaccharide essentiellement constitué d'hexoses ; l'hémicellulose (20 à 30%), qui est un polysaccharide essentiellement constitué de pentoses ; et la lignine (15 à 25%), qui est un polymère de structure complexe et de haut poids moléculaire, composé d'alcools aromatiques reliés par des liaisons éther. Ces différentes molécules sont responsables des propriétés intrinsèques de la paroi végétale et s'organisent en un enchevêtrement complexe. Parmi les trois polymères de base qui intègrent la biomasse lignocellulosique, la cellulose et l'hémicellulose sont ceux qui permettent la production de jus sucrés 2G.
De façon classique, le procédé de sa transformation en biocarburant de type éthanol comprend plusieurs étapes : Le prétraitement permet de rendre la cellulose accessible aux enzymes qui sont des cellulases. L'étape d'hydrolyse enzymatique permet la transformation de la cellulose en sucres, comme le glucose, qui sont ensuite transformés en éthanol lors de l'étape de fermentation par en général la levure Saccharomyces cerevisiae. Enfin l'étape de distillation va permettre de séparer et récupérer l'éthanol du moût de fermentation. A noter, comme évoqué plus haut, que l’on peut aussi choisir d’arrêter le procédé à l’obtention des sucres de type glucose, afin de les valoriser en tant que tels, ou encore les traiter différemment pour obtenir d’autres alcools ou molécules biosourcées.
Technique antérieure
Les différentes études technico-économiques démontrent que la réduction du coût des cellulases est un des points-clés des procédés de production biologique d'éthanol à partir des matières premières lignocellulosiques. A l'heure actuelle, les cellulases industrielles sont principalement produites par un champignon filamenteux, Trichoderma reesei, en raison de son fort pouvoir de sécrétion.
Depuis les années 1970, la transformation de matériaux lignocellulosique en éthanol, après hydrolyse des polysaccharides constitutifs en sucres fermentescibles, a fait l'objet de nombreux travaux. On peut citer par exemple les travaux de référence du National Renewable Energy Laboratory (Process Design and Economies for Biochemical Conversion of Lignocellulosic Biomass to Ethanol, Humbird et al., NREL/TP-5100-57764, May 201 1 ).
Les matériaux ligno-cellulosiques sont des matériaux cellulosiques, c'est-à-dire constitués à plus de 90% poids de cellulose, et/ou lignocellulosique, c'est-à-dire constitués de cellulose, d’hémicelluloses, qui sont des polysaccharides essentiellement constitués de pentoses et d'hexoses ainsi que de lignine, qui est une macromolécule de structure complexe et de haut poids moléculaire, à base de composés phénoliques.
Le bois, les pailles, les rafles de maïs sont les matériaux ligno-cellulosiques les plus utilisés, mais d'autres ressources, cultures forestières dédiées, résidus de plantes alcooligènes, sucrières et céréalières, produits et résidus de l'industrie papetière et des produits de transformation des matériaux ligno-cellulosiques sont utilisables. Ils sont constitués pour la plupart d'environ 35 à 50 % de cellulose, de 20 à 30 % d'hémicellulose et de 15 à 25 % de lignine.
Le procédé de transformation biochimiques des matériaux ligno-cellulosiques en éthanol comprend une étape de prétraitement physico-chimique, suivie d'une étape d'hydrolyse enzymatique utilisant un cocktail enzymatique, d'une étape de fermentation éthanolique des sucres libérés, la fermentation éthanolique et l’hydrolyse enzymatique pouvant être conduites simultanément, et d'une étape de purification de l'éthanol. Le cocktail enzymatique est un mélange d’enzymes cellulolytiques (également appelées cellulases) et/ou hémicellulolytiques. Les enzymes cellulolytiques présentent trois grands types d'activités : endoglucanases, exoglucanases et cellobiases, ces dernières étant également appelées b-glucosidases. Les enzymes hémicellulolytiques présentent notamment des activités xylanases.
L'hydrolyse enzymatique est efficace et s'effectue dans des conditions douces. En revanche, le coût des enzymes reste très élevé, représentant de 20 à 50% du coût de transformation du matériau lignocellulosique en éthanol. De ce fait, beaucoup de travaux ont été conduits pour réduire ce coût : l’optimisation de la production d'enzymes d'abord, en sélectionnant les microorganismes hyperproducteurs et en améliorant les procédés de production desdites enzymes, la diminution de la quantité d'enzymes en hydrolyse ensuite, en optimisant l’étape de prétraitement, en améliorant l'activité spécifique de ces enzymes, et en optimisant la mise en œuvre de l’étape d’hydrolyse enzymatique.
De nombreux travaux se sont attachés à comprendre les mécanismes d'action et d'expression du cocktail enzymatique. Le but est de faire sécréter le cocktail le plus approprié à l'hydrolyse des matériaux ligno-cellulosiques en modifiant les microorganismes.
Trichoderma reesei est le microorganisme le plus utilisé pour la production de cellulases. Les souches sauvages ont la faculté d'excréter, en présence d'un substrat inducteur, la cellulose par exemple, le complexe enzymatique considéré comme le mieux adapté à l'hydrolyse de la cellulose. Les enzymes du complexe enzymatique contiennent trois grands types d'activités : les endoglucanases, les exoglucanases et les cellobiases et d'autres protéines possédant des propriétés indispensables à l'hydrolyse des matériaux ligno-cellulosiques sont également produites par Trichoderma reesei, les xylanases par exemple. La présence d'un substrat inducteur est indispensable à l'expression des enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques. La nature du substrat carboné a une forte influence sur la composition du complexe enzymatique. C'est le cas des xyloses, qui, associé à un substrat carboné inducteur comme la cellulose ou le lactose, permet d'améliorer significativement l'activité dite xylanase. La régulation des gènes de cellulases sur différentes sources de carbone a été étudiée dans le détail. Ils sont induits en présence de cellulose, de ses produits d'hydrolyse , comme le cellobiose, ou de certains oligosaccharides comme le lactose ou le sophorose (cf. Ilmén et al., 1997; Appl. Environ. Microbiol. 63: 1298-1306.)
Les techniques de génétique classique par mutation ont permis la sélection de souches de Trichoderma reesei hyperproductrices de cellulases telles que les souches MCG77 (Gallo - brevet US 4,275,167), MCG 80 (Allen, A.L. et Andreotti, R.E., Biotechnol- Bioengi 1982, 12, 451 -459 1982), RUT C30 (Montenecourt, B. S. et Eveleigh, D.E., Appl. Environ. Microbiol. 1977, 34, 777-782) et CL847 (Durand et al, 1984, Proc. Colloque SFM "Génétique des microorganismes industriels". Paris. H. HESLOT Ed, pp 39-50).
Le procédé de production de cellulases par Trichoderma reesei a fait l'objet d'améliorations importantes en vue d’une extrapolation à l'échelle industrielle. Pour obtenir de bonnes productivités en enzymes, il est nécessaire d'apporter une source de carbone rapidement assimilable pour la croissance de Trichoderma reesei, et un substrat inducteur qui permet l'expression des cellulases et la sécrétion dans le milieu de culture. La cellulose peut jouer ces deux rôles ; cependant, elle est difficile d'utilisation au stade industriel et il a été proposé de la remplacer par des sources de carbone solubles, de type glucose, xylose ou lactose, le lactose jouant également le rôle de substrat inducteur. D'autres sucres solubles comme le cellobiose et le sophorose ont été décrits comme inducteurs, mais ils sont relativement onéreux pour être utilisés au stade industriel. On a aussi constaté que les productions de cellulases par Trichoderma reesei, avec des substrats solubles, sont très inférieures à celles obtenues sur cellulose en "batch". Ceci est dû à l'effet répresseur des sucres facilement assimilables, à forte concentration. L'alimentation en continu en mode fed-batch des substrats carbonés solubles a permis de lever la répression catabolique en limitant la concentration résiduelle dans les cultures et en optimisant la quantité de sucre permettant d'obtenir un meilleur rendement et une meilleure productivité enzymatique.
Le brevet FR-B-2 555 603 propose un protocole qui permet d'aboutir à une concentration en protéines de l'ordre de 35 à 40 g/L avec une productivité de l'ordre de 0,2 g/L/h et qui consiste en deux étapes : une première étape de croissance en mode "batch" où il est nécessaire d'apporter une source de carbone rapidement assimilable pour la croissance de Trichoderma reesei, puis une étape de production en mode "fed-batch" utilisant un substrat inducteur (exemple: le lactose) qui permette l'expression des cellulases et la sécrétion dans le milieu de culture. Le flux optimal appliqué est compris entre 35 et 45 mg.g Vh 1 (milligrammes de substrat inducteur par milligramme de biomasse et par heure). On peut également citer le brevet EP-B-2 744 899 qui en propose une amélioration en sélectionnant notamment un bioréacteur ayant un coefficient de transfert volumétrique d’oxygène KLa particulier associé à une sélection particulière à la fois de la concentration en substrat carboné de croissance dans la première étape et d’un niveau de flux limitant de source de carbone dans la seconde étape.
Il s’est avéré, cependant, qu’il pouvait y avoir la formation d’une mousse, lors de l’étape de croissance plus particulièrement. Il peut s’agir d’une mousse dite « sèche », à savoir être constitutive d’une dispersion de gaz dans une phase liquide, et qui a donc une densité proche de celle d’un gaz et qui se forme en partie haute du bioréacteur. Il peut aussi s’agir d’une mousse dite « humide », qui est une mousse d’extension/d’augmentation du volume réactionnel dû à l’emprisonnement de bulles de gaz (d’air) dans le liquide. Sa densité est plus élevée que la mousse sèche (car son ratio gaz/liquide est plus faible). Qu’il s’agisse de l’une, de l’autre, ou d’un mélange de ces deux types de mousse, elles présentent un vrai problème de conduite industrielle du procédé.
En effet, pour ne citer que certains de leurs inconvénients, leur présence complique sérieusement la régulation du pH qui est usuellement réalisée lors de l’étape de croissance, puisque la mesure du pH devient plus difficile à réaliser / moins fiable en présence de mousse, et qu’en outre l’ajout de l’agent régulateur de pH pour maintenir le pH à la valeur voulue est plus compliqué, car il est plus difficile de contrôler sa répartition dans l’ensemble du milieu réactionnel. En outre, il est nécessaire d’utiliser à moindre capacité les bioréacteurs, pour laisser un espace suffisant au- dessus du milieu réactionnel liquide, pour éviter tout débordement.
Plusieurs solutions ont déjà été proposées pour lutter contre la formation de mousse. Une première solution a consisté à ajouter des agents anti-mousse au milieu réactionnel lors de l’étape de croissance. L’utilisation d’agents anti-mousse est certes efficace pour remettre en suspension liquide de la mousse, mais elle n’est pas dénuée d’inconvénients. Pour en citer quelques-uns : la remise en suspension liquide de la mousse entraîne une forte augmentation du pH, perturbant largement la régulation de pH qu’il faut mener, voire un basculement non voulu de l’étape de croissance à l’étape de production. Ceci peut être provoqué par l’apport massif en réactifs (sucres) bloqués en surface du fait de la mousse, qui, lorsqu’elle s’effondre sous l’effet de l’anti-mousse, viennent brutalement en contact avec la biomasse en grande quantité. L’ajout d’agents anti-mousse provoque également une baisse de la concentration d’oxygène dissous dans le milieu (car il fait coalescer les bulles d’air), ce qui peut avoir un impact sur les microorganismes qui sont aérobies stricts ou sur leur productivité. En outre, ces agents sont souvent à base d’huiles, qui ne s’éliminent pas toutes seules : une fois la production d’enzymes terminée, si l’on effectue la séparation entre les enzymes et le reste de la biomasse (les champignons), notamment par des technologies conventionnelles utilisant des moyens de filtration par membrane, ces agents anti-mousse sont susceptibles de colmater les membranes, et il peut donc être nécessaire d’avoir à ajouter une étape de séparation de ces agents une fois la production terminée, sans laquelle on aboutit à des mauvaises performances de séparation. Leur ajout présente, en outre, un coût de production supplémentaire.
Une autre solution a été envisagée dans la demande de brevet EP-1 204 738 : il s’agit de lutter contre ce phénomène de moussage en modifiant génétiquement la souche de champignon utilisée, afin d’éviter que la souche ne sécrète des hydrophobines, et notamment les HFBII, jugées responsables de la formation de mousse. Cependant, cette solution est lourde à mettre en oeuvre, puisqu’elle nécessite de procéder à ces modifications génétiques sur chacune des souches d’intérêt.
L’invention a alors pour but de mettre au point un procédé de production d’enzymes amélioré, évitant ou limitant tout au moins le phénomène de moussage, sans engendrer certains au moins des inconvénients précités, et notamment sans engendrer de complication dans la conduite du procédé ni contraindre à réaliser des modifications génétiques spécifiques sur les microorganismes.
Résumé de l’invention
L’invention a tout d’abord pour objet un procédé de production d’enzymes par une souche appartenant à un champignon filamenteux, ledit procédé comprenant deux étapes :
(a) une première étape de croissance des champignons, en présence d'au moins un substrat carboné de croissance, dans un bioréacteur agité et aéré en phase batch, à un pH inférieur ou égal à 4,6 ;
(b) une deuxième étape de production d'enzymes, à partir du milieu de culture obtenu à la première étape (a), en présence d'au moins un substrat carboné inducteur, à un pH inférieur ou égal à 4,6.
On choisit donc selon l’invention de réaliser non seulement la deuxième étape de production d’enzymes à un pH relativement acide, mais également la première étape de croissance, jusque-là plutôt réalisée à des pH moins acides, de par exemple au moins 5. Alors qu’on se serait attendu à ce qu’opérer la première étape à un pH aussi acide conduirait à un ralentissement de la croissance des microorganismes, il s’est avéré qu’il n’en a rien été, et, qu’en outre, de façon tout-à-fait surprenante, on évitait ou limitait grandement l’apparition de mousse lors de cette étape. En abaissant ainsi le pH lors de l'étape de croissance, on règle le problème du moussage sans impacter le rendement de production d’enzymes au final.
De préférence, on régule le pH de l’étape de croissance pour le maintenir dans la gamme requise. De préférence, on régule aussi le pH de l’étape de production. La régulation se fait de façon connue, notamment par suivi du pH en continu ou séquentiellement avec des capteurs ad hoc, et ajout (d’acide ou d base en cours d’étape pour rester à la consigne. Alternativement on peut contrôler le pH de l’une et/ou l’autre des étapes en utilisant une solution tampon.
La solution de l’invention est étonnamment simple, puisque rien ne laissait présager que modifier, vers une plus forte acidité, dans des proportions raisonnables (sans descendre, de préférence en dessous de 3,5 ou 3,6 ou 3,7), le pH lors de la croissance allait avoir des conséquences sur le phénomène complexe du moussage. Elle est très avantageuse en termes de conduite de production industrielle : - le bioréacteur dans lequel l’étape de croissance est réalisée est tout-à-fait équipé pour réguler le pH à ces valeurs, il n’y donc aucune difficulté à mettre en œuvre l’invention avec des bioréacteurs conventionnels ; - puisqu’il n’y a pas ou très peu de mousse formée, on peut calculer au plus juste la taille du bioréacteur, et augmenter son volume utile (il n’est plus nécessaire de prévoir un volume supplémentaire « perdu » destiné à contenir d’éventuels débordements de mousse excessifs) ;
- il n’est plus nécessaire d’ajouter des agents anti-mousse, ou on peut tout au moins en réduire très fortement la teneur, on évite ainsi un additif qu’il est ensuite difficile de séparer ;
- il est plus facile de piloter le bioréacteur, puisque, en l’absence de mousse, la régulation de pH, l’ajout contrôlé de substrat carboné etc ... sont grandement facilités.
De préférence, le pH à l’étape (a) de croissance et/ou à l’étape (b) de production est d’au moins 3,5, et notamment inférieur ou égal à 4,4, il est notamment compris entre 3,5 et 4,4 ou entre 3,8 et 4,4: on vient ainsi rapprocher le pH de l’étape de croissance du pH de l’étape de production.
De préférence, le pH en étape de croissance est maintenu à au moins 3,6, notamment au moins 3,7 ou au moins 3,8.
De préférence, le pH en étape de croissance est maintenu à au plus 4,4.
Selon un mode de réalisation, le pH à l’étape (a) de croissance est sensiblement identique au pH à l’étape (b) de production. Si, notamment, les deux étapes sont conduites dans le même bioréacteur, choisir les mêmes pH simplifie ainsi la régulation du pH sur toute la durée de procédé. On peut ainsi avoir la même consigne de régulation sur les deux étapes ou utiliser la même solution tampon.
Selon un autre mode de réalisation, le pH à l’étape (b) de production peut être choisi plus acide que le pH à l’étape (a) de croissance, par exemple d’au moins 0,3 à 0,6, notamment un pH plus acide (plus faible donc) de 0,4 à 0,6.
Avantageusement, le pH, lors de l’étape (a) de croissance, est régulé par ajout contrôlé d’un composé azoté, notamment de l’ammoniaque, qui joue à la fois le rôle d’agent basique et d’agent source d’azote pour la croissance des microorganismes. Avantageusement, l’étape (b) de production s’opère en mode batch, fed-batch ou continu ou selon plusieurs de ces modes successivement.
Optionnellement, le procédé selon l’invention peut comprendre une étape intermédiaire (c) entre l’étape (a) et l’étape (b), cette étape intermédiaire (c) étant une étape de dilution du milieu de culture obtenu à l’étape (a) de croissance.
En outre, l’étape (a) de croissance et l’étape (b) de production peuvent être réalisées dans le même bioréacteur ou dans deux réacteurs distincts, avec transfert du milieu réactionnel d’un réacteur à l’autre. Le premier cas est le plus simple, avec un seul réacteur on évite d’avoir à transférer le milieu réactionnel. Le second cas permet d’adapter précisément les caractéristiques et équipements de chacun des bioréacteurs en fonction des besoins de chacune des étapes.
De préférence, lors de la première étape (a) de croissance, la concentration en substrat carboné de croissance est choisie comprise entre 15 et 60 g/l.
De préférence, la deuxième étape (b) de production est opérée avec un flux limitant de substrat carboné inducteur, notamment compris entre 30 et 140 mg.g Vh 1, (c’est-à-dire entre 30 et 140 grammes par gramme de biomasse et par heure), de préférence entre 35 et 45 mg.g Vh 1 , et de préférence avec une solution aqueuse de substrat carboné inducteur à une concentration comprise entre 200 et 600 g/l.
La souche utilisée dans le procédé selon l’invention est de préférence une souche de Trichoderma reesei ou de Trichoderma reesei modifiée par mutation sélection ou recombinaison génétique. Mais il est inutile de la modifier génétiquement dans le but d’empêcher la formation d’hydrophobines lors de sa croissance. Il peut s’agir notamment des souches CL847, RutC30, MCG77, ou MCG80 mentionnées plus haut.
Le procédé selon l’invention produit de préférence des enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques (des cellulases).
Avantageusement, le procédé selon l’invention est opéré en l’absence d’agents anti-mousse, notamment lors de l’étape (a) de production. Ne plus avoir recours à des angents anti mousse est très avantageux économiquement. En outre, l’ajout de ces agents peut entraîner des problèmes de limitation de transfert d’oxygène de l’air fourni au bioréacteur vers la phase liquide comprenant les champignons, ce qui nuit à leur croissance. Ces agents peuvent en outre poser des problèmes lors de la filtration du milieu de culture en fin d’étape de production.
L’invention a également pour objet l’utilisation des enzymes obtenues par le procédé décrit précédemment pour l’hydrolyse enzymatique de biomasse cellulosique/hémicellulosique terrestre ou marine.
L’invention sera ci-après décrite plus en détails à l’aide d’exemples de réalisation non limitatifs.
Liste des figures
La figure 1 représente des photos des bioréacteurs utilisés selon des exemples conformes et non conformes au procédé de l’invention avec une souche, photos prises pendant l’étape de croissance du procédé.
La figure 2 représente des photos des bioréacteurs utilisés selon des exemples conformes et non conformes au procédé de l’invention avec une souche différente, photos prises pendant l’étape de croissance du procédé.
La figure 3 est un graphe représentant la concentration en gramme par litre de biomasse et de protéines produite selon un exemple comparatif.
La figure 4 est un graphe représentant la concentration en gramme par litre de biomasse et de protéines produite selon un exemple de réalisation de l’invention.
La figure 5 est un graphe représentant la concentration en gramme par litre de biomasse et de protéines produite selon un exemple de réalisation de l’invention.
Description des modes de réalisation
La présente invention a mis au point un procédé de production d’enzymes, notamment de cellulases, permettant d’éviter l’apparition de la mousse. Il est apparu de manière surprenante que le fait de travailler lors de la croissance à des bas pH (inférieurs à 4,6 notamment inférieurs ou égaux à 4,4) ne ralentit pas la croissance du microorganisme et permet d’éviter l’apparition de la mousse.
Le mode de conduite du procédé comporte 2 phases:
- Une phase en mode batch qui dure de préférence entre 30 et 50 heures, avec un pH avantageusement inférieur ou égal à 4,4 et avec une concentration en substrat carboné de 15 à 60 g/L préférence
- Une phase en mode fed-batch qui dure de préférence entre 100 et 200 heures, notamment entre 100 et 150 heures, avantageusement à un pH inférieur ou égal à 4,4 également, et avec un flux limitant de source de carbone de 35 à 140mg.g 1.h 1, et de préférence entre 35 et 45 mg.g Vh 1. Les souches industrielles utilisées appartiennent à l'espèce Trichoderma reesei, modifiées pour améliorer les enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques par les procédés de mutation-sélection, comme par exemple la souche CL847 ((un de ces procédés est notamment décrit dans le brevet US 4,762,788). Des souches améliorées par les techniques de recombinaison génétique peuvent être également utilisées. Ces souches sont cultivées en fermenteurs agités et aérées dans des conditions compatibles avec leur croissance et la production des enzymes.
Les sources de carbone principales peuvent être des sucres solubles comme le lactose, le glucose ou le xylose :
Le substrat carboné de croissance est choisi de préférence parmi le lactose, le glucose, le xylose, les résidus obtenus après fermentation éthanolique des sucres monomères des hydrolysats enzymatiques de biomasse cellulosique, et/ou un extrait brut de pentoses hydrosolubles provenant du prétraitement d'une biomasse cellulosique.
Le substrat carboné inducteur est choisi de préférence parmi le lactose, le cellobiose, le sophorose, les résidus obtenus après fermentation éthanolique des sucres monomères des hydrolysats enzymatiques de biomasse cellulosique, et/ou un extrait brut de pentoses hydrosolubles provenant du prétraitement d'une biomasse cellulosique.
Ce type de résidu /extrait peut donc être utilisé aussi comme source de carbone totale, c'est- à-dire à la fois pour la croissance du microorganisme et l'induction du système d'expression. Cette source de carbone est utilisable plus particulièrement par les souches améliorées génétiquement et notamment les souches recombinantes.
Les conditions opératoires de pH et de température, pour l’étape de croissance et l’étape de production, sont les suivantes :
- pH entre 3,5 et 4,4 ;
- température entre 20 et 35 °C. On choisit de préférence un pH de 4,4 et une température de 27°C durant la phase de croissance et un pH de 4 ou de 4,4 également, et une
température de 25°C durant la phase de production en mode fed-batch.
La vvm (taux d'aération exprimé en volume d'air par volume de milieu réactionnel et par minute) appliquée durant le procédé est comprise entre 0,3 et 1 ,5 min 1 et la rpm (vitesse de rotation) doit permettre de réguler la pression en 02 entre 20% et 60%. On choisit de préférence une aération de 0,3 à 0,5 vvm et une agitation permettant de réguler la pression en 02 à 30 % ou 40%.
Selon sa nature, le substrat carboné choisi pour l'obtention de la biomasse est introduit dans le fermenteur avant stérilisation, ou est stérilisé séparément et introduit dans le fermenteur après stérilisation. La concentration en substrat carboné est comprise entre 200 et 600 g/L selon le degré de solubilité des substrats carbonés utilisés (notamment en ce qui concerne le le substrat inducteur).
Exemples
Une préculture des souches est réalisé dans 2 fioles de Fernbach avec un volume utile de 500 mL, qui sont ensemencées avec chacune un tube de spores de T reesei TR3002 et CL847. Elles sont placées dans un incubateur de référence commerciale INFORS HT Multitron à 30 °C, avec une agitation orbitale de 150 rpm pendant 72 heures. Elles sont ensuite dispatchées sur 8 fioles stérilisées à vide (80 mL par fiole) qui serviront à ensemencer chaque fermenteur/bioréacteurs.
Les conditions opératoires de production de cellulases à partir des souches obtenues en fin de préculture sont les suivantes :
Les expériences comportent deux phases .
- une phase de croissance sur glucose à une température de 27 °C et un pH (régulé par de l'ammoniaque 5,5 M), allant de 4,0 à 5,5 selon les expériences. L'aération est fixée à 0,2 L/min (0,3 vvm) et la consigne de P 0 est fixée à 40 %. Elle est maintenue constante grâce à l'agitation,
- une phase de production d'enzymes induite par un flux limitant de la solution de fed-batch après 30 heures de culture. La solution est injectée avec un débit constant de 0,5 g de substrat carboné par heure. La consigne de température est modifiée à 25 °C. Cette phase dure entre 160 et 220 heures selon la disponibilité du substrat et le déroulement de l’expérience.
Un prélèvement est réalisé chaque jour avec suivi du poids sec, des concentrations en glucose, lactose, galactose, xylose. Des surnageants de culture de 5 mL sont stockés à 4 °C pour les dosages enzymatiques et des protéines réalisés en fin de culture.
Exemple 1 :
L’exemple 1 est réalisé à partir de la souche TR3002. Cette souche est décrite dans les publications suivantes : Ben Chaabane F, Jourdier E, Licht R, Cohen C and Monot F (2012)
« Kinetic characterization of Trichoderma reesei CL847 TR3002: an engineered strain producing highly improved cellulolytic cocktail ». Journal of Chemistry and Chemical
Engineering 6 (2), 109-1 17, et Ayrinhac C, Margeot A, Ferreira NL, Ben Chaabane F, Monot F, Ravot G, Sonet J.-M and Fourage L (201 1 )“Improved saccharification of wheat straw for biofuel production using an engineered secretome of Trichoderma reesei”. Organic Process Research and Development 15 (1 ), 275 - 278. - La phase de croissance est réalisée à pH 4 à 27°C et avec une concentration de glucose de 15 g/L
- la phase de production est réalisée à pH 4 à 25°C, avec une concentration en lactose de 220 g/L, correspondant à un débit spécifique de lactose de fed-batch de 45 mg par gramme de biomasse et par heure.
Exemple 2 : (comparatif)
L’exemple 2 est réalisé à partir de la souche TR3002 .
- La phase de croissance est réalisée à pH 4, 8 à 27°C et avec une concentration de glucose de 15 g/L
- la phase de production est réalisée à pH 4,8 à 25°C, avec une concentration en lactose de 220 g/L, correspondant à un débit spécifique de lactose de fed-batch de 45 mg par gramme de biomasse et par heure.
Exemple 3 : (comparatif)
L’exemple 3 est réalisé à partir de la souche TR3002.
- La phase de croissance est réalisée à pH 5,5 à 27°C et avec une concentration de glucose de 15 g/L
- la phase de production est réalisée à pH 5,5 à 25°C, avec une concentration en lactose de 220 g/L, correspondant à un débit spécifique de lactose de fed-batch de 45 mg par gramme de biomasse et par heure.
Exemple 4 :
L’exemple 4 est réalisé à partir de la souche TR3002 .
- La phase de croissance est réalisée à pH 4,4 à 27°C et avec une concentration de glucose de 15 g/L
- la phase de production est réalisée à pH 4,4 à 25°C, avec une concentration en lactose de 220 g/L, correspondant à un débit spécifique de lactose de fed-batch de 45 mg par gramme de biomasse et par heure.
Exemple 5 :
L’exemple 5 est réalisé à partir de la souche CL847. Cette souche est décrite dans les publications suivantes : - Jourdier E, Poughon L, Larroche C, Monot F and Ben Chaabane F (2012) « A new stoichiometric miniaturizationstrategy for screening of industrial microbial strains: application to cellulase hyper-producing Trichoderma reesei strains ». Microbial Cell Factories 1 1 , 70 (Impact Factor : 3,60), et Jourdier E, Ben Chaabane F, Poughon L,
Larroche C and Monot F (2012)“Simple Kinetic Model of Cellulase Production by Trichoderma Reesei for Productivity or Yield Maximization”. Chemical Engineering
Transactions 27, 313-318.
- La phase de croissance est réalisée à pH 4 à 27°C et avec une concentration de glucose de 15 g/L
- la phase de production est réalisée à pH 4 à 25°C, avec une concentration en lactose de 220 g/L, correspondant à un débit spécifique de lactose de fed-batch de 45 mg par gramme de biomasse et par heure.
Exemple 6 :
L’exemple 6 est réalisé à partir de la souche CL847.
- La phase de croissance est réalisée à pH 4, 4 à 27°C et avec une concentration de glucose de 15g/L
- la phase de production est réalisée à pH 4,4 à 25°C, avec une concentration en lactose de 220 g/L, correspondant à un débit spécifique de lactose de fed-batch de 45 mg par gramme de biomasse et par heure.
Exemple 7 (comparatif)
L’exemple 7 est réalisé à partir de la souche CL847 .
- La phase de croissance est réalisée à pH 4,8 à 27°C et avec une concentration de glucose de 15 g/L
- la phase de production est réalisée à pH 4,8 à 25°C, avec une concentration en lactose de 220 g/L, correspondant à un débit spécifique de lactose de fed-batch de 45 mg par gramme de biomasse et par heure.
Exemple 8 : (comparatif)
L’exemple 8 est réalisé à partir de la souche CL847 .
- La phase de croissance est réalisée à pH 5,5 à 27°C et avec une concentration de glucose de 15 g/L
- la phase de production est réalisée à pH 5,5 à 25°C, avec une concentration en lactose de 220 g/L, correspondant à un débit spécifique de lactose de fed-batch de 45 mg par gramme de biomasse et par heure. L’observation visuelle de l’apparition ou de la non-apparition de mousse donne les résultats regroupés dans le tableau 1 ci-dessous
Tableau 1
Les figures 1 et 2 représentent des photographies des bioréacteurs des exemples 1 ,2, 3, 5, 6, 7, 8 après 24 h : (la référence 1 correspond à l’exemple 1 , et ainsi de suite).
Du tableau 1 et des figures 1 et 2, on constate que, quelle que soit la souche utilisée (CL847 ou TR3002), un pH supérieur ou égal à 4,8 en phase de croissance entraîne la production de mousse dès 24 heures. Par la suite, cette mousse n’est pas contrôlable, ce qui se traduit par l’arrêt des fermentations à un pH aussi élevé, car il y a débordement ou sporulation. Les cultures avec un pH inférieur ou égal à 4,4 n’ont, quant à elles, pas moussé.
Pour vérifier si la sélection du pH de croissance à des valeurs d’au plus 4,4 conformément à l’invention avait, par ailleurs, un impact sur la performance de la souche, on a calculé pour cela la vitesse spécifique de production de protéines qp Cette vitesse spécifique qp est égale à rp/X, avec rp la productivité en protéines en g/L/h, et X la concentration en biomasse en g/L. Les valeurs de qp obtenues sont les suivantes :
Exemple 1 (pH 4 croissance, souche TR3002) : qp = 28,4 mgP/gX/h
Exemple 2 (pH 4,8 croissance, souche TR3002): qp = 27,7 mgP/gX/h
Exemple 4 (pH 4,4 croissance, souche TR3002 ): qp = 25,4 mgP/gX/h Exemple 5 (pH 4 croissance, souche CL847 ): qp = 8,5 mgP/gX/h
Exemple 6 (pH 4,4 croissance, souche CL847 ): qp = 9,4 mgP/gX/h
Pour les exemples 7 et 8, les valeurs de qp ne sont pas significativement différentes de celles des exemples 5 et 6, tant que le moussage n’a pas démarré, le moussage ayant ensuite interrompu les expérimentations pour ces deux exemples.
On constate donc que, pour une souche donnée, abaisser le pH de croissance n’a pas eu d’impact significatif sur la vitesse spécifique qp, ni sur la productivité globale du procédé. En effet la concentration finale en protéines, pour une même durée de production, n’est pas non plus affectée par l’abaissement du pH de croissance : on obtient des quantités autour de 40g/L pour les exemples avec la souche TR3002 quel que soit le pH de croissance, et des quantités autour de 25g/L pour les exemples avec la souche CL847 quel que soit le pH de croissance.
La figure 3 indique la production en g/L de biomasse (ligne avec des points) et de protéines (ligne avec des triangles) en fonction du temps exprimé en heure pour l’exemple 2 comparatif, la figure 4 représente le même type de graphe pour l’exemple 1 selon l’invention, et la figure 5 pour l’exemple 4 selon l’invention : la comparaison de ces graphes confirme que la production en protéines reste au même niveau, qu’on abaisse ou non le pH de croissance. On voit aussi (exemple 4, figure 5) qu’adopter le même pH pour la croissance et la production n’impacte pas non plus négativement la production de protéines.
On a également évalué les niveaux d’activité enzymatique des enzymes produites, par la mesure de l’Activité dite papier filtre (« FPase ») . Cette méthode permet de doser l'activité globale du pool enzymatique (endoglucanases et exoglucanases). L'activité FPase est mesurée sur papier Whatman N° 1 (procédure recommandée par la commission biotechnologique IUPAC) : on détermine la prise d'essai de la solution enzymatique qui réalise 4 % d’avancement de la réaction enzymatique en 60 minutes. Le principe de l'activité papier filtre est de déterminer par dosage au DNS (acide dinitrosalicylique) la quantité de sucres réduits issue d'un papier Whatman N°1.
Les valeurs de FPase obtenues pour les 8 exemples, et traduisant donc l’activité globale du cocktail enzymatique, et donc sa qualité, présentent des valeurs classiques pour les souches utilisées, à savoir comprises entre 0,8 et 1 IU /mg.
On en conclut que si l’invention permet d’éviter le moussage de façon particulièrement simple et efficace, elle n’a pas d’impact négatif par ailleurs ni sur le rendement de production des enzymes, ni sur leur qualité.

Claims

Revendications
1. Procédé de production d’enzymes par une souche appartenant à un champignon filamenteux, caractérisé en ce que ledit procédé comprend deux étapes :
(a) une première étape de croissance des champignons, en présence d'au moins un substrat carboné de croissance, dans un bioréacteur agité et aéré en phase batch, à un pH inférieur ou égal à 4,6 ;
(b) une deuxième étape de production d'enzymes, à partir du milieu de culture obtenu à la première étape (a), en présence d'au moins un substrat carboné inducteur, à un pH inférieur ou égal à 4,6.
2. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que le pH à l’étape (a) de croissance et/ou à l’étape (b) de production est inférieur ou égal à 4,4, notamment compris entre 3,5 et 4,4.
3. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le pH à l’étape (a) de croissance est sensiblement identique au pH à l’étape (b) de production.
4. Procédé selon l’une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le pH à l’étape (b) de production est plus acide que le pH à l’étape (a) de croissance.
5. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le pH, lors de l’étape (a) de croissance, est régulé par ajout contrôlé d’un composé azoté, notamment de l’ammoniaque.
6. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l’étape (b) de production s’opère en mode batch, fed-batch ou continu ou selon plusieurs de ces modes successivement.
7. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’il comprend une étape intermédiaire (c) entre l’étape (a) et l’étape (b), cette étape intermédiaire (c) étant une étape de dilution du milieu de culture obtenu à l’étape (a) de croissance.
8. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que, lors de la première étape (a) de croissance, la concentration en substrat carboné de croissance est comprise entre 15 et 60 g/l.
9. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la deuxième étape (b) de production est opérée avec un flux limitant de substrat carboné inducteur, notamment compris entre 30 et 140 mg.g Vh 1, et de préférence entre 35 et 45 mg.g 1.h 1, et de préférence avec une solution aqueuse de substrat carboné inducteur à une concentration comprise entre 200 et 600 g/l.
10. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la souche utilisée est une souche de Trichoderma reesei ou de Trichoderma reesei modifiée par mutation sélection ou recombinaison génétique.
1 1. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les enzymes sont des enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques.
12. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’il est opéré en l’absence d’agents anti-mousse, notamment lors de l’étape (a) de production.
13. Utilisation des enzymes obtenues par le procédé selon l’une des revendications précédentes pour l’hydrolyse enzymatique de biomasse cellulosique/hémicellulosique terrestre ou marine.
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