FI108863B - Parannettu biotekninen tuotantomenetelmä - Google Patents

Description

108863 PARANNETTU BIOTEKNINEN TUOTANTOMENETELMÄ

Keksinnön tausta 5 Tämä keksintö koskee uutta menetelmää vaahdon muodostuksen vähentämiseksi mikro-organismien kasvatuksen aikana patenttivaatimuksen 1 johdanto-osan mukaisesti, uutta tuotantoisäntäkantaa, patenttivaatimuksen 10 johdanto-osan mukaisesti sekä menetelmää tuotteen tuottamiseksi mikro-organismia kasvattamalla patenttivaatimuksen 21 johdanto-osan 10 mukaisesti.

Kun mikro-organismeja kasvatetaan nestemäisellä kasvatusalustalla laboratorioastioissa tai pienen tai suuren mittakaavan bioreaktoreissa, vaahtoaminen on yleisesti ilmenevä seikka. Se on ongelmana erityisesti ilmastetussa bioreaktorissa tai, kuten niitä yleensä kutsutaan, 15 fermentorikasvatuksissa. Biokemiallisesti määritelmä "fermentointi" tarkoittaa prosessia, jossa hiivat tuottavat etanolia anaerobisella aineenvaihdunnalla. Tiettyjen valikoitujen j mikrobien modernia aseptista pinnanalaista (submerssi-) "fermentointia" käytetään ! solumassan, proteiinien, kuten entsyymien ja vasta-aineiden, ja muiden aineenvaihduntatuotteiden, kuten antibioottien, aminohappojen ja orgaanisten happojen " t: 20 tuottamiseen. Yleisimmät teollisuuden fermentoinnissa käytetyt mikro-organismit ovat sieniä, , , erityisesti rihmasieniä ja hiivoja, sekä bakteereja, kuten Bacillus spp., Escherichia coli ja

Streptomyces spp.

• * : : Tyypillisesti vain 70-80% fermentaatioastian tilavuudesta täytetään nesteellä, ja kaasutila > 25 täyttää tankin ylimmän osan. Nesteen ilmastuksen ja sekoituksen yhdistelmä edistää vaahdon muodostumista nesteen pinnalle ja normaalisti kaikki ilmastetut fermentointiliemet : '. j vaahtoavat, mikä on syynä siihen, että tarvitaan suuri kaasutila. Vaahto estää kaasumassan siirtymistä liemestä kaasutilaan, mikä pakottaa vaahdon ulos astiasta ja kontaminoi ; · järjestelmän, kun kokoon lysähtänyt vaahto palaa takaisin fermentoriin. Tämä tarkoittaa, että : ” ’: 30 fermentointeihin tulisi aina sisältyä jonkinlainen vaahdonsäätelymenetelmä. Kaksi : kaupallisissa fermentoinneissa yleisimmin käytettyä menetelmää ovat mekaaniset :' ‘ ‘; vaahdonrikkojat ja/tai vaahdonestoaineiden lisääminen.

108863 2

Mekaaninen vaahdonrikkoja on suurinopeuksinen sekoitin, joka on suunniteltu paljolti kuten keskipakopumpun juoksupyörä. Vaahto johdetaan juoksupyörään, jossa suuret mekaaniset voimat rikkovat sen kasaan. Tämä ei sovellu herkille organismeille. Sekoitin täytyy kiinnittää omaan akseliinsa ja sitä käytetään riippumatta pääsekoittajasta. Tämä vaatii erillisen 5 sekoittimen tiivisteen, joka on mahdollinen kontaminaatiolähde ja muiden ongelmien aiheuttaja. Mekaaniset vaahdonrikkojat muodostavat myös huomattavan menoerän.

Kemialliset vaahdonestoaineet rikkovat vaahdot muuttamalla niiden pintajännitysominaisuuksia. Steriili vaahdonestoaine pumpataan fermentoriin yleensä 10 automaattisesti lisäysastiasta. Vaahdonestoaineen lisääminen saa aikaan mahdollisen kontaminaatioriskin, koska polymeerisiä vedettömiä nestemäisiä aineita on vaikea steriloida. Vaahdonestoainetta ei voi valita ainoastaan sen perusteella, miten hyvin se sopii fermentaatioon, vaan pitäen perustana myös tuotteen talteenottoa, konsentrointia ja puhdistusta alavirran prosessoinnissa. Esimerkiksi erityisesti silikonipohjaiset 15 vaahdonestoaineet voivat jopa erittäin pieninä konsentraatioina vähentää dramaattisesti suodoksen virtausta tietyntyyppisten membraanisuodattimien läpi. Hydrofobiset vaahdonestoaineet sitoutuvat hydrofobisiin ultrasuodatusmembraaneihin, alentaen suodatusvirtausta, ja ne voivat muuttaa ratkaisevasti membraanien todellista molekyylipaino-cut-offia.

20

Ensimmäiset fermentoinnissa käytetyt vaahdonestoaineet olivat silikonipohjaisia nestemäisiä , . aineita. Viime aikoina on käytetty yleisesti öljypohjaisia vaahdonestoaineita, joiden ,! ’ kemiallinen rakenne koostuu esim. etyleeni- ja propyleenioksidien polymeereistä *it; pitkäketjuisten rasvahappojen esterien kanssa. Kaikilla vaahdonestoaineilla on 25 "sameutumispiste", "cloud point", jonka yläpuolella ne ovat olennaisesti veteen ;·. liukenemattomia. Vaahdonestoaineiden toiminnalliset ominaisuudet tulevat esiin lämpötiloissa, jotka ovat sameutumispisteen yläpuolella. Sen vuoksi vaahdonestoaineen •: · ·: sameutumispisteen tulisi olla fermentointilämpötilan alapuolella. Kuitenkin esimerkiksi : membraanisuodatus tulisi tehdä lämpötiloissa, jotka ovat sameutumispisteen alapuolella niin, 30 että vaahdonestoaine olisi vesiliukoinen, jolloin sillä olisi mahdollisimman pieni vaikutus suodatustapahtumaan. On saatavilla vaahdonestoaineita, joiden sameutumispisteet eroavat . : ·. toisistaan suuresti.

3 108863

Koska suurin osa vaahdonestoaineista on hydrofobisia, niitä on vaikea steriloida. Ne saattavat myös muodostaa huomattavan menoerän. Hyvän vaahdonestojäijestelmän tulisi sisältää myös mahdollisuus vähentää automaattisesti ilman virtausta ja sekoitusnopeutta kun vaahtoaminen 5 peittää alleen koko jäijestelmän ja fermentori on vaarassa tyhjentyä. Tämä on välttämätöntä, jotta vältetään voimansiirtojärjestelmän vauriot, joita ilmenee, jos fermentori tyhjenee ylivaahtoamisen vuoksi.

Koska vaahdonestoaineet toimivat pilkkomalla ilman täyttämiä kuplia sekä 10 fermentointiliemessä että sen yläpuolella, ne vähentävät huomattavasti hapen siirtymisnopeutta. Detergentit sitä vastoin yleensä parantavat hapen siirtymisnopeutta. Kim vaahdonestoaineita ja detergenttejä on läsnä samanaikaisesti, ne saavat aikaan toisiaan kompensoivan vaikutuksen. Hapen siirtymisnopeuksien aleneminen vaahdonestoaineiden lisäämisen vuoksi johtaa liuenneen hapen tasojen alenemiseen vakiosekoituksella ja -15 ilmastuksella. Vaahdonestoaineet vähentävät pintajännitystä, mikä johtaa alentuneisiin volymetrisiin massansiirtokertoimen arvoihin (kLa). Tämä saa aikaan lisääntyneen ilmastus- ja sekoitustarpeen, mikä puolestaan lisää vaahdonmuodostusta ja tekee taas puolestaan välttämättömäksi vaahdonestoaineen lisäämisen, mikä taas puolestaan lisää vaahdonestoaineen aiheuttamia ongelmia. Vaahtoamisen ja sekoituksen/ilmastuksen 20 positiiviset feedback-vaikutukset edustavat suurinta ongelmaa monissa kaupallisissa fermentointiprosesseissa. Vielä eräs käytännön haitta on anturien alentunut herkkyys ja > I t t . nopeutunut vanheneminen vaahdonestoaineiden polymeeriosien aiheuttamien tukkeumien : *, vuoksi.

. : *. 25 Teollisissa fermentoinneissa käytetyt tuotantokasvatusalustat sisältävät usein liukenemattomia polymeerejä. Näiden liukenemattomien kasvatusalustan osien läsnäolo pahentaa huomattavasti vaahtoamisongelmaa fermentoinnin aikana. Kasvatuksen aikana muodostunut vaahto yhdistyy kasvatusalustasta peräisin olevien käyttämättömien kiinteiden partikkelien ' it>! kanssa muodostamaan komposiittivaahdon, jolla on vahvat fysikaaliset ominaisuudet ja ei-• · 30 toivottavan korkea pysyvyys. Tämä vaahto-kiinteäainekonglomeraatti voi pysyä kiinnittyneenä :' “: astian seinämiin ja muihin fermentorin ylätilan teräsrakenteisiin riippumatta alapuolen tuesta niin että kontakti liemen ja vaahtokerrosten välillä häviää. Vaahdonestoaineen lisääminen 4 108863 fermentointiin ei sen vuoksi onnistu pilkkomaan sekundäärisen vaahdon rakennetta. Näin ollen ylimmän vaahtokerroksen ja vaahdonestoanturin käijen välisen kontaktin syntymisen jälkeen seuraava automaattinen vaahdonestoaineen lisääminen ei pilko vaahtokerrosta. Tässä tapauksessa vaahdonestoaineen lisäämistä saattaa, ja usein näin käykin, jatkua loputtomiin 5 kunnes lisäyssäiliö tyhjenee. Siitä huolimatta että vaahdonestoainetta lisätään jatkuvasti, konglomeraattivaahtokerros jatkaa nousemistaan fermentorin yläosaan, tunkeutuen lopulta poistoputkeen ja tukkien poistoaukon suodattimen. Tämä puolestaan estää ilman kulkemisen liemen läpi ja liuenneen hapen määrä laskee nollaan, mikä johtaa tuhoisiin vaikutuksiin tuotantoprosessille. Tämä koko sykli voi tapahtua niin lyhyessä ajassa kuin 1-2 tunnissa.

10

Mikrobilaji, sen morfologia ja konsentraatio vaikuttaa hapen siirtymisnopeuteen. Lajit, joiden morfologia on mutkikkaampi (pelletit verrattuna filamentteihin, pellettien hapentarve ja -otto ei ole merkitsevästi suurempi, mutta maksimaalinen hapen siirtymisnopeus on selvästi suurempi) johtavat alhaisempiin hapen siirtymisnopeuksiin. Rihmastojen suurten 15 konsentraatioiden aiheuttama lisääntynyt viskositeetti (pseudoplastiset homeet) johtaa alentuneisiin hapen siirtymisnopeuksiin.

Rihmaston morfologia vaikuttaa myös prosessin tuottavuuteen ja kinetiikkaan. Joissain tapauksissa pienet pelletit ovat optimaalisia halutun tuotteen tuottamiselle, kun taas toisissa 20 tapauksissa rihmastomaisen kasvun on havaittu olevan optimaalinen. Morfologia vaikuttaa , myös viljelynesteen alavirran prosessointiin ja suodatusominaisuuksiin, sillä suuremmat I » . . partikkelit on helpompi erotella esim. alipainerumpusuodatuksella. Pellettien muodossa > i · . t* tapahtuva kasvu johtaa yleensä siihen, että niiden välissä oleva viljelmäneste on kirkkaampaa ,,,,: ja sen viskositeetti on alhaisempi kuin tapauksessa, jossa rihmasto kasvaa dififuusisti.

« · 25 » » · .\ Koska vaahdon muodostus fermentoinnin aikana aiheuttaa useita ongelmia, on olemassa suuri tarve uusille tavoille estää vaahdon muodostuminen tai vähentää sitä.

i ' * I · > ·

KEKSINNÖN YHTEENVETO

> « » 30 » ; ’ “: Tämän keksinnön tarkoituksena on eliminoida ongelmat, joita alalla on aiemmin esiintynyt, ja tuottaa ratkaisu ongelmiin, joita erilaisten mikro-organismien kasvatuksen aikana esiintyvä » ·

. I

5 108863 vaahtoaminen aiheuttaa. Tämä keksintö tarjoaa käyttöön täysin uuden tavan ratkaista vaahtoamisongelma niin, että vaahdonestoaineiden tarve on äärimmäisen pieni, tai että niitä ei tarvita lainkaan.

5 Tällä keksinnöllä saadaan erityisesti aikaan menetelmä mikro-organismien kasvatuksen aikana esiintyvään vaahdonmuodostukseen liittyvien proteiinien, polypeptidien tai peptidien eliminoimiseksi tai vähentämiseksi. Menetelmä käsittää haluttujen mikro-organismien geneettisen muuntamisen niin, että ne eivät tuota proteiineja, polypeptidejä tai peptidejä, jotka liittyvät vaahdonmuodostukseen, tai tuottavat niitä olennaisesti vähemmän. Tällaiset 10 proteiinit, polypeptidit tai peptidit voidaan ottaa talteen vaahdosta, joita mikro-organismien viljely tuottaa. Mikro-organismit valitaan joukosta, johon kuuluvat hiivat, sienet, bakteerit, kasvisolut ja eläinsolut. Edullisesti ne ovat tuotantokantoja, joita käytetään haluttujen proteiinien, polypeptidien, aineenvaihduntatuotteiden tai biomassan tuottamiseen. Tyypillisesti tällaiset kannat ovat geneettisesti muunnettuja tuottamaan näitä tuotteita 15 tehokkaalla tavalla.

Eräs tämän keksinnön tavoite on menetelmä mikro-organismin kasvatuksen aikana muodostuvan vaahdon määrän vähentämiseksi, jolloin menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: - muunnetaan mikro-organismia sellaisella tavalla, ettei mikro-organismi tuota olennaista 20 määrää proteiineja, polypeptidejä tai peptidejä, jotka liittyvät vaahdon muodostumiseen mikro-organismin kasvatuksen aikana, ja - kasvatetaan mikro-organismia sopivissa kasvatusolosuhteissa.

,,: Menetelmää luonnehtii erityisesti se, mitä patenttivaatimuksen 1 tunnusmerkkiosassa ’. 25 esitetään.

I »

Mikro-organismin "muuntaminen" on edullisesti "geneettistä muuntamista", mikä tarkoittaa, i että vähintään yhtä DNA-sekvensseistä tai sen osista, jotka koodittavat proteiineja, #: polypeptidejä tai peptidejä, jotka liittyvät vaahdon muodostumiseen, muunnetaan niin, ettei se 30 ilmenny ja/tai erity. Geneettinen muuntaminen käsittää erilaisia menetelmiä, jotka on ; ‘ “: suunnattu haluttua proteiinia, polypeptidiä tai peptidiä koodattavan DNA-sekvenssin ; *. säätelyalueeseen, tai erilaisia menetelmiä, joilla DNA-sekvenssi voidaan inaktivoida; näitä on 6 108863 esimerkiksi mutageneesi tai deleetio, tai geneettinen muuntaminen käsittää erilaisia menetelmiä, jotka on suunnattu DNA-sekvensseihin, jotka koodittavat vaahdonmuodostukseen liittyvien proteiinien, polypeptidien tai peptidien tuotantoa sääteleviä proteiineja. Tämän keksinnön mukainen geneettinen muuntaminen tehdään edullisesti 5 inaktivoimalla vaahdonmuodostukseen liittyvien proteiinien, polypeptidien tai peptidien haluttu DNA-sekvenssi tai sekvenssit. Edullisemmin geneettinen muuntaminen tehdään poistamalla haluttu DNA-sekvenssi tai sekvenssit. Edullisuus johtuu siitä, että deleetio on voimakkain tekniikka vähentää vaahdonmuodostukseen liittyvien proteiinien, polypeptidien tai peptidien vaikutusta.

10

Ne molekyylit, jotka liittyvät kasvatuksen aikana tapahtuvaan vaahdonmuodostukseen, ovat erilaisia proteiineja, polypeptidejä tai peptidejä, jotka voidaan ottaa talteen mikro-organismin kasvatuksen aikana muodostuneesta vaahdosta, tai niiden säätelyproteiineja. Tällaiset molekyylit käsittävät proteiineja, polypeptidejä tai peptidejä, jotka säätelevät vaahdon 15 muodostumisesta vastuussa olevien proteiinien, polypeptidien tai peptidien tuotantoa. Edullisesti ne ovat proteiineja, polypeptidejä tai peptidejä, jotka ovat vaahtoa muodostavia, toisin sanoen jotka ovat vastuussa vaahdon muodostumisesta. Tällaiset proteiinit, polypeptidit tai peptidit käsittävät hydrofobisia tai amfipaattisia proteiineja, polypeptidejä tai peptidejä, hydrofobiineja tai amfipaattisia pinta-aktiivisia molekyylejä. Edullisesti 20 vaahdonmuodostukseen liittyvät proteiinit, polypeptidit tai peptidit ovat hydrofobiineja.

j ’ ’ Hydrofobiinit kuuluvat sienten kaikkein runsaimmin tuottamiin proteiineihin. Kaikkien • < * ‘’ sienten, joiden hydrofobiinin tuotantoa on tähän mennessä tutkittu, on osoitettu tuottavan yhtä ’ , tai useampaa hydrofobiinia.

_ 25 Koska monien tuotantomikrobi-isäntien tiedetään tuottavan vaahtoa muodostavia proteiineja, t · · polypeptidejä tai peptidejä kasvatuksen aikana, tätä keksintöä voidaan soveltaa monien ....: erilaisten mikro-organismien kasvatuksen yhteydessä esiintyvän vaahdonmuodostusongelman .' * ‘: ratkaisemiseen.

, · · · .30 Erään tämän keksinnön mukaisen edullisen suoritusmuodon mukaisesti mikro-organismi on » ·

» * I

'. sieni. Edullisemmin sieni on Trichoderma.

* » I

7 108863 Tämän keksinnön edullisen suoritusmuodon mukaisesti proteiinit, polypeptidit tai peptidit, joiden tuotantoa eliminoidaan tai vähennetään, ovat Trichoderman hydrofobiineja.

Tämän keksinnön erittäin edullisen suoritusmuodon mukaisesti hydrofobiinit ovat 5 hydrofobiini I (HFBI) tai hydrofobiini II (HFBII). Keksintöön kuuluu, että muunnetaan Trichoderma-kantaa geneettisesti siten, ettei se tuota olennaisia määriä HFBI:ta ja/tai HFBII:ta. Edullisesti hydrofobiinia I (HFBI) tai hydrofobiinia II (HFBII) tai kumpaakin koodittavat DNA-sekvenssit inaktivoidaan Trichoderma-kannassa.

10 Tämän keksinnön vielä erään edullisen suoritusmuodon mukaisesti mikro-organismi kuuluu bakteereihin. Isäntäkanta voi olla mikä tahansa bakteeri-isäntä, joka tuottaa proteiineja, polypeptidejä tai peptidejä, jotka liittyvät kasvatuksen aikaiseen vaahdonmuodostukseen. Edullisesti isäntäkanta on E. coli, tai se kuuluu sukuun Streptomyces.

15 Tämän keksinnön vielä eräs tavoite on uusi tuotantoisäntäkanta, jota on geneettisesti muunnettu niin, ettei se tuota olennaisia määriä yhtä tai useampaa proteiinia, polypeptidiä tai peptidiä, jotka liittyvät vaahdonmuodostukseen kasvatettaessa ei-muunnettua tuotantoisäntäkantaa.

20 Erityisemmin tuotantoisäntäkantaa luonnehtii pääasiassa se, mitä esitetään patenttivaatimuksen 10 tunnusmerkkiosassa.

Tämän keksinnön vielä eräs tavoite on tuote, jota tämän keksinnön mukaisella menetelmällä kasvatettu mikro-organismi tuottaa. Tuote voi olla mikä tahansa luonnollinen tai 25 yhdistelmäproteiini, peptidi, aineenvaihduntatuote, antibiootti, fuusioproteiini tai jopa solut sinänsä. Tuote on edullisesti rekombinanttituote.

Tällä keksinnöllä saadaan aikaan useita etuja. Kun mikro-organismin kasvatuksen aikana f · · ·. muodostuu vähän tai olennaisesti ei lainkaan vaahtoa, ei tarvita lainkaan vaahdonestoaineita, I * · .•.30 tai niitä tarvitaan vain pieniä määriä. Tämä johtaa olennaisesti helpompaan alavirran I * · prosessointiin.

8 108863

Kasvattamalla tämän keksinnön mukaisesti muunnettua mikro-organismia, vähenee ylivaahtoaminen olennaisesti tai sitä ei esiinny lainkaan. Näin ollen saanto on suurempi kun tuotantohävikit ovat pienemmät.

5

Eräs selvä etu on myös siinä, että kontaminaatioriski on merkitsevästi alhaisempi kun ei ole tarvetta lisätä vaikeasti steriloitavissa olevia vaahdonestoaineita, ja koska kasvatusalusta ei tule yhteyteen bioreaktorilaitteiston pinnan tai muiden mahdollisesti ei-aseptisten alueiden kanssa.

10 Tämän keksinnön mukaisesti kasvatusalusta takertuu vähemmän fermentorin pintoihin, elektrodeihin, sekoittajaan jne. Näin ollen solumassan jakaantuminen fermentoriin on homogeenisempaa. Lisäksi elektrodien toiminta paranee, mikä puolestaan parantaa fermentoinnin säädeltävyyttä.

15 Tämän keksinnön tuloksena kokonaistuottavuus paranee. Yksi tai useampi seuraavista parametreistä: tuotteen/proteiinin erittymisen taso, spesifinen tuottavuus/proteiinitaso tai tuottavuus/fermentaatiotaso (enemmän nestettä fermentorissa) suurenee verrattuna tasoihin viljelmissä, joita ei ole muunnettu tämän keksinnön mukaisesti.

20

Vielä eräs etu on siinä, että tuottavuus paranee muuntuneen morfologian vuoksi.

:.:,: Inaktivoimalla yksi tai useampi hydrofobiinigeeni on mahdollista säädellä kannan morfologiaa : ’*· rihmamaisen tai pellettejä muodostavan kasvutavan välillä.

% »IM· ‘ ' 25 Keksintö on erityisen edullinen kun kasvatetaan mikro-organismeja kasvatusalustalla joka käsittää liukenemattomia aineosia. Vaahdonestoaineet eivät voi pilkkoa tehokkaasti , komposiitti vaahtoa, joka muodostuu mikrobien aineenvaihdunnan tuottamasta ... proteiinipitoisesta vaahdosta ja hyödyntämättömistä kiinteistä partikkeleista. Tämän • keksinnön mukaisesti vaahtoa ei muodostu lainkaan tai muodostuu vain vähäinen määrä, ja •;;; 30 niin ollen hajoamaton sekundäärirakenteinen vaahto ei vaikeuta kasvatusta.

9 108863

LYHYT SELOSTUS KUVISTA

Kuvio 1 esittää 2868 ep:n genomista sekvenssiä hfll (SEQ ID No 1), joka sisältää proteiinia koodittavan (ja intronit) ja reunustavat sekvenssit (kaikkia alakloonattuja reunustavia sekvens-j 5 sejä ei ole sekvensoitu), hft>l:n geenisekvenssi on alleviivattu. Muni restriktiokohdat, joita käytettiin merkkigeenin kloonauksessa, on lihavoituja alleviivattu.

Kuvio 2 esittää 3585 ep:n genomisen sekvenssin hfl>2 (SEQ ID No 2), joka sisältää proteiinia koodittavat sekvenssin (ja intronit) ja reunustavat sekvenssit. A/h2-geenisekvenssi on alleviivattu. Bgll- ja EcoRV-restriktiokohdat, joita käytettiin merkkigeenin kloonauksessa, on liha-10 voituja alleviivattu. Kloonausvektorin polylinkkerisekvenssi on kursivoituja kloonaustarkoi-tukseen käytetyt restriktiokohdat polylinkkerissä on alleviivattu.

Kuvio 3 esittää plasmidia pTNS24 Kuvio 4 esittää plasmidia pTNS 27 Kuvio 5 esittää plasmidia pMQ 113 15 Kuvio 6 esittää plasmidia pTH 1 Kuvio 7 esittää plasmidia pTH2

Kuvio 8 esittää Trichoderma-kantojen kasvatusparametrejä fermentorikasvatuksessa laktoosil-! la(DO= liuennut happi)

Kuvio 9 esittää liukoisen proteiinin tuotantoa fermentorikasvatuksessa selluloosakasvatusalus-20 talla.

Kuviot 10 ja 11 esittävät Trichoderma QM9414 AA/hi-kantojen kasvua ja morfologiaa glukoosilla.

. ·. · Kuvio 12 esittää Trichoderman Rut C30 AA/b2-kannan kasvatusta laktoosilla.

• 25 KEKSINNÖN YKSITYISKOHTAINEN KUVAUS ------------ •. · ' Määritelmä kasvatus tarkoittaa tässä mitä tahansa menetelmää, jota käytetään mikrobisolujen kasvattamiseen laboratorioastiassa tai suuressa mittakaavassa. Tämä keksintö on erityisen '. : edullinen käytettäväksi bioreaktorikasvatuksissa, jotka ovat ilmastettuja ja/tai sekoitettuja.

·;·’ 30

Kasvu- tai kasvatusalusta tulisi valita kyseessä olevan mikro-organismin mukaan. Jotta saavutettaisiin mikro-organismin optimaalinen kasvu ja/tai halutun tuotteen optimaalinen ; *,; tuotanto, ravinteiden, ilmastuksen ja pH-olojen tulee olla optimaaliset mikro-organismille.

: : Kasvatusalusta voi haluttaessa olla alusta, joka ei indusoi kasvatuksen aikana muodostuvaan 35 vaahtoon liittyvien proteiinien tai polypeptidien tuotantoa, tai joka estää sitä.

10 108863 Määritelmä fermentointi tarkoittaa tässä mitä tahansa bioreaktorikasvatusta, edullisesti kasvatuksia, joissa käytetään sekoitusta ja/tai ilmastusta. Fermentori on edullisesti tavallinen fermentori, mutta keksintöä voidaan soveltaa pneumaattiseen tai muihin fermentorityyppeihin.

5 Määritelmä mikro-organismi tarkoittaa tässä bakteeri-, hiiva-, sieni-, kasvi- ja eläinsoluja. Edullisesti keksintöä sovelletaan sieniin tai bakteereihin, edullisemmin sieniin.

Sieni-isäntäkannat käsittävät tässä keksinnössä seuraavia: Aspergillus spp., Trichoderma 10 spp., Neurospora spp., Fusarium spp., Penicillium spp., Humicola spp., Tolypocladium geodes, Kluyveromyces spp., Pichia spp., Hansenula spp., Candida spp., Yarrowia spp, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces spp.

Bakteeri-isäntäkannat käsittävät tässä keksinnössä seuraavia: Bacillus spp. Zymomonas spp. 15 ja Actinomycetales, kuten Streptomyces spp., Nocardia spp. ja Escherichia coli

Tuotantoisäntäkanta tarkoittaa tässä mitä tahansa mikro-organismia, joka valitaan, tai jota muunnetaan geneettisesti tuottamaan tehokkaasti haluttua tuotetta, ja joka on hyödyllinen teollisiin sovellutuksiin. Isäntäkanta on edullisesti rekombinanttikanta, jota on muunnettu 20 geeniteknologian keinoin, tuottamaan tehokkaasti kiinnostuksen kohteena olevaa tuotetta.

Määritelmä geneettinen muuntaminen käsittää rekombinantti-DNA-teknologian tai : ’· geeniteknologian, solufuusion ja hybridisaation, mutageneesin, indusoidun polyploidian, : ‘ konjugaation, transduktion, transformaation ja perinnöllisen aineksen injektion soluun.

25 ’·' Mikro-organismin geneettinen muuntaminen niin, ettei se tuota olennaisia määriä vähintään , yhtä proteiinia tai peptidiä, joka liittyy vaahdonmuodostukseen kasvatettaessa muuntamatonta mikro-organismikantaa, käsittää sen, että DNA-sekvenssejä, jotka koodittavat vähintään yhtä • proteiinia, polypeptidiä tai peptidiä, jotka liittyvät vaahdonmuodostukseen, muunnetaan ;;; 30 erilaisilla geneettisillä menetelmillä niin, että ne eivät ilmenny tai erity. Vaihtoehtoisesti muunnetaan geneettisesti DNA-sekvenssejä, jotka koodittavat vaahtoa muodostavien ’ proteiinien, polypeptidien tai peptidien tuotantoa sääteleviä säätelyproteiineja, tai DNA- 11 108863 sekvenssejä, jotka koodittavat vaahtoa muodostavia proteiineja, polypeptidejä tai peptidejä. Geneettinen muuntaminen käsittää lisäksi sen, että muunnetaan geneettisesti vaahdonmuodostukseen liittyviä proteiineja, polypeptidejä tai peptidejä koodittavien geenien säätelyalueita. Tämän keksinnön edullisen suoritusmuodon mukaisesti vaahtoa muodostavia 5 proteiineja, polypeptidejä tai peptidejä koodittavat DNA-sekvenssit inaktivoidaan. Inaktivointi voidaan tehdä millä tahansa sopivalla tavanomaisella tai molekyylibiologiaan kuuluvalla menetelmällä, joka on alalla hyvin tunnettu. Muuntaminen tehdään edullisesti yhdistelmä-DNA-tekniikoilla, kuten paikkasuunnatulla mutageneesillä tai deleetiolla. Edullisimmin inaktivointi tehdään poistamalla valittua proteiinia, polypeptidiä tai peptidiä koodittava DNA-10 sekvenssi.

Viljelystä saadut tuotteet voivat edullisesti sisältää haluttuja proteiineja, polypeptidejä, peptidejä, aineenvaihduntatuotteita tai solumassaa.

15 Ilmentyvät proteiinit, polypeptidit tai peptidit, jotka liittyvät vaahdonmuodostukseen, viittaavat tässä mihin tahansa molekyyleihin, jotka liittyvät vaahdonmuodostukseen mikro-organismin kasvatuksen aikana, ja jotka ovat otettavissa talteen vaahdosta, joka muodostuu mikro-organismin kasvatuksen aikana. Joukkoon kuuluu vaahtoa muodostavia proteiineja, polypeptidejä tai peptidejä sekä proteiineja, polypeptidejä tai peptidejä, jotka säätelevät 20 vaahtoa muodostavien proteiinien tai peptidien tuotantoa. Edullisesti joukko käsittää * *' hydrofobisia tai amfipaattisia proteiineja, polypeptidejä tai peptidejä, hydrofobiineja tai » » · amifipaattisia pinta-aktiivisia molekyylejä ja proteiineja, polypeptidejä tai peptidejä.

*' ’ ‘ Edullisesti vaahdonmuodostukseen liittyvät proteiinit tai peptidit ovat hydrofobiineja.

t · ! !.. 25 Esimerkkejä molekyyleistä, jotka ovat vastuussa vaahdonmuodostuksesta kasvatuksen aikana * · · ovat hydrofobiset, amfipaattiset proteiinit ja peptidit. Hydrofobiinit ovat eritettyjä ,,,.: amfipaattisia proteiineja, joilla on kiinnostavat fysikaaliskemialliset ominaisuudet, ja joita on .···. viime aikoina havaittu rihmasieniltä (Wessels, 1994; Wösten ja Wessels, 1997; Kershaw ja I « ·

Talbot, 1998). Ne kuvattiin ensin DNA-tasolla (Schuren ja Wessels, 1990) ja myöhemmin , · · ·. 30 tunnistettiin proteiineiksi, jotka ovat aktiivisia sienen pinnan ja ympäristön välisessä » » · t I · ! 108863 12 vuorovaikutuksessa. Vaikka nimitystä "hydrofbbiini" on käytetty aiemmin tarkoittamaan mitä tahansa hydrofobista materiaalia mikrobien pinnalla, Wessels käytti nimitystä hydrofobiini näiden proteiinien nimenä (Wessels et ai., 1991a,b). Hydrofobiinit kuuluvat sienten kaikken runsaimmin tuottamiin proteiineihin, ja kaikki tähän mennessä tutkitut sienet ovat tuottaneet 5 yhtä tai useampaa hydrofobiinia.

Eräs näille proteiineille ominainen piirre on niiden lievä hydrofobisuus. Ne ovat yleensä pieniä proteiineja, noin 70-160 aminohappoa, ja sisältävät kuudesta kymmeneen, yleensä kahdeksan, i j kysteiiniaminohappoa konservoituneen mallin mukaisesti. Kahdeksan kysteiiniaminohapon j 10 (Cys) sijoitus on konservoitunut: X2-38 - Cys - X5.9 - Cys - Cys - Xj 1.39 - Cys - Xg.23 - Cys - X5-9 -Cys - Cys Xö-is - Cys - X2-13, jossa X tarkoittaa mitä tahansa muuta aminohappoa. On kuitenkin myös karakterisoitu multimodulaarisia proteiineja, joissa on yksi tai useampia hydrofobiinidomeeneja ja esim. proliinia runsaasti sisältäviä tai asparagiini/glysiinitoistoja, tai hydrofobiineja, jotka sisältävät vähemmän kuin kahdeksan kysteiiniaminohappoa (Lora et ai., 15 1994; Lora et ai., 1995; Amtz ja Tudzynski, 1997; de Vries et ai. 1999).

Hydrofobiinit on jaettu kahteen luokkaan hydropatiaprofiiliensa ja fysikaaliskemiallisten ominaisuuksiensa perusteella (Wessels, 1994). Luokan I hydrofobiinit muodostavat erittäin liukenemattomia komplekseja, kun taas Luokan Π hydrofobiinimuodostumat ovat vähemmän 20 stabiileja ja ne ovat liukoisia esim. 60-prosenttiseen etanoliin ja 2-prosenttiseen SDS:ään.

’; ’ ‘ Kuitenkin todennäköisimmin jotkin hydrofobiinit ilmentävät ominaisuuksia, jotka ovat näiden ' . kahden luokan välillä. Vaikka enemmän kuin 30 hydrofobiinien geenisekvenssiä on julkaistu i., (Wösten ja Wessels, 1997), vain muutamat näistä proteiineista on eristetty ja tutkittu. Nykyisin suurin osa proteiinitiedoista on Schizophyllum communen SC3-hydrofobiineista (Luokka 1), 25 Ophiostoma uimin kerato-ulmiinista ja Cryponectria parasitican krypariinista (Luokka II).

. ·, ; Muihin eristettyihin hydrofobiineihin kuuluvat ainakin S. communen SC4, Agaricus bisporuksen

* I I

.···, ABH1 ja ABH2 ja Neurospora crassan E AS.

t. · > Hydrofobiinien luonteenomaisin piirre on, että ne ryhmittyvät itsekseen / 30 hydrofiilisille/hydrofobisille rajapinnoille. Niiden ryhmittyminen hydrofiilisen soluseinän ja !.. * hydrofobisen ympäristön (ilma, öljy, maa) rajapinnoille saa aikaan, että uudet rakenteet peittyvät ' "* amfipaattisella membraanilla. Solupinnan muuntuminen hydrofiilisestä hydrofobiseksi tekee i i 13 108863 mahdolliseksi ilmarihmaston muodostumisen, edistää itiöiden leviämistä tuulen avulla, pitää yllä avoimia ilmatunneleita itiöemissä ja välittää rihmojen tarttumista ja pinnan hydrofobisuuden signaalinvälitystä. Hydrofobiinit tekevät paikalliset rihmat vettä hylkiviksi ja vettä pidättäviksi. Lisäksi ne osallistuvat monimutkaisiin rihmojen välisiin vuorovaikutuksiin.

5

Hydrofobiinit eivät ainoastaan ryhmity soluseinän ja ilman tai nesteen rajapinnoille vaan myös hydrofiilisen soluseinän ja hydrofobisen kiinteän aineen rajapinnalle. Hydrofobiinit liimaavat sienirihmoja ja hydrofobisia pintoja tiiviisti yhteen (Wösten et ai. 1994a). Rihmojen adheesio kiinteälle pinnalle johtuu hydrofobiinimembraanin amfipaattisesta luonteesta, ts. kumpikin puoli 10 on vuorovaikutuksessa j omman kumman kahdesta pinnasta kanssa.

Hydrofobiinit ryhmittyvät myös neste-ilma-rajapinnoille. Useita hydrofobiineja, kuten S. communen SC3:a, Coprinus cinereuksen COHlrtä, A. bisporuksen ABH3:a ja Pleurotus i ostreatuksen POH2:ta ja POH3:a erittyy kasvatusalustaan (Wösten et ai., 1999). Rihmasienilajit, 15 kuten Aspergillus nidulans, A. niger, A. oryzae, Neurospora erossa ja Penicillium chrysogenum tuottavat kasvatusalustaan amfipaattisia proteiineja, todennäköisimmin hydrofobiineja (de Vries et ai., 1993, Wessels, 1997).

Hydrofobiinit erittyvät monomeereinä, mutta kun ne kohtaavat ilma-vesi-rajapinnan, tai 20 rajapinnan, jonka pinta on hydrofobinen, ne aggregoituvat suuremmiksi polymeerisiksi :··· komplekseiksi. Tämä muodostunut ohut kerros on hydrofobinen yhdeltä puoleltaan ja : : : hydrofiilinen toiselta puoleltaan. SC3-ryhmittymät, samoin kuin kerato-ulmiinin ja krypariinin I *· ryhmittymät (Wessels, 1997), muodostuvat kaasu-neste- tai öljy-nesterajapinnoille, stabiloiden siten ilmakuplat tai öljypisarat veteen. Puhdistetun SC3-hydrofobiinin ryhmittyminen :* 25 amfipaattiseksi kerrokseksi tapahtuu myös hydrofiilisille ja hydrofobisille pinnoille (Wösten et « · · ' ·' * αί, 1993; Wösten et ai., 1994b). Tämä kalvo kiinnittyy erittäin voimakkaasti pinnalle, eikä esim.

kuuma detergentti riko sitä. Kerroksen hydrofobinen puoli ilmentää hydrofiilisillä pinnoilla ’ / ominaisuuksia, jotka ovat samankaltaisia kuin teflonilla (Wessels 1994). Ravistelemalla SC3-hydrofobiinia sisältäviä liuoksia, proteiinimonomeerit muodostavat 10 nm sauvamaisia • > ·: 30 aggregaatteja. Nämä rakenteet ovat samanlaisia kuin sienten ilmarakenteiden pinnoilla.

14 108863

Kirjallisuudesta tunnetaan useita biosurfaktantteja, jotka vähentävät veden pintajännitystä (Wosten ja Wessels, 1997). Proteiinien pinta-aktiivisuus on yleensä matala, mutta hydrofobiinit kuuluvat pinta-aktiivisiin molekyyleihin; niiden pinta-aktiivisuuskapasiteetti on vähintään samanlainen kuin perinteisten biosurfaktanttien, kuten glykolipidien, 5 lipopeptidien/lipoproteiinien, fosfolipidien, neutraalien lipidien ja rasvahappojen (Wosten ja Wessels, 1997). Itse asiassa SC3-hydrofobiini on kaikkein voimakkain tunnettu biosurfaktantti. Se alentaa veden pintajännitystä 24 mJm2 :iin konsentraationa 50 pg/ml, mikä johtuu konformaatiomuutoksesta monomeerien itsenäisen ryhmittymisen aikana amfipaattiseksi kalvoksi (Wösten ja Wessels, 1997). Samoin kuin SC3-hydrofobiinin, myös T. reesein HFBI-10 ja HFBII-hydrofobiinien on osoitettu alentavan veden pintajännitystä (keksijöiden julkaisemattomat tulokset). Alentunut pintajännitys saa aikaan stabiilimpia kaasukuplia, ja näin hydrofobiinit ja muut amfipaattiset polypeptidit stabiloivat vaahtoa.

Hydrofobiinin kaltaisten molekyylien ominaisuudet vaihtelevat. Esimerkiksi kykyä muodostaa 15 sauvamaisia muodostelmia ei ole todettu kaikilla hydrofobiineilla (kuten joillain luokan Π hydrofobiineilla), tai niillä saattaa olla heikompi taipumus muodostaa stabiileja aggregaatteja (Russo et ai, 1982; Carpenter et ai, 1992). Toinen ryhmä sienten amfipaattisia proteiineja ovat vettä hylkivät proteiinit (Kershaw ja Talbot, 1998). Muun tyyppisillä proteiineilla ja polypeptideillä, jotka ovat vastuussa vaahdon muodostumisesta, saattaa siis olla ainoastaan 20 joitakin ominaisuuksia, joita hydrofobiineilla on. Tällaisia esimerkkejä ovat SapB ja « , . streptofaktiini, jotka ovat pinta-aktiivisia peptidejä, joita Streptomyces coelicor ]a vastaavasti S.

’ tendae erittävät kasvatusalustaan (Willey et ai., 1991, Richter et ai., 1998).

• · • I » * · · ! *

Mikrobien amfipaattiset pinta-aktiiviset molekyylit, joiden pääluokat ovat glykolipidit, • · )*. 25 lipoaminohapot ja lipopeptidit, lipoproteiinit, lipopolysakkaridit, fosfolipidit, mono- ja diglyseridit sekä rasvahapot (Cameotra ja Makkar, 1998; Lang ja Wullbrandt, 1999), ovat ;··: proteiineja, joiden molekyylirakenteet muodostavat hydrofiilisen osan, joka voi koostua “ : mono-, oligo- tai polysakkarideista, aminohapoista tai peptideistä, tai karboksylaatti- tai ‘; fosfaattiryhmistä, ja hydrofobisen osan, joka koostuu tyydyttyneistä tai tyydyttymättömistä : *"; 30 (hydroksi)rasvahapoista tai rasva-alkoholeista. Esimerkkejä tämän tyyppisistä molekyyleistä . ovat Bacillus licheniformiksen lipopeptidit ja B. subtiliksen surfaktiini (Wosten ja Wessels, at» : 1997).Kuitenkin toisin kuin näillä pinta-aktiivisilla aineilla, hydrofobiinien pinta-aktiivisuus 15 108863 ei ole riippuvainen lipidimolekyylistä vaan ilmeisimmin aminohapposekvenssi yksin saa sen aikaan. SC3:n glykaaniosa sijaitsee pääasiassa proteiinin hydrofiilisessä osassa, ja todennäköisesti vastaa proteiinin tämän osan hydrofiilisyydestä. Useat hydrofobiinit eivät kuitenkaan ole glykosyloituneita, eikä minkään niistä ole esitetty olevan lipoproteiini. Lisäksi 5 hydrofobiinien pinta-aktiivisuus näyttää riippuvan konformaatiomuutoksesta molekyylin kokoonpanon aikana ennemmin kuin diffuusiorajoitteisesta adsorptiosta rajapinnoille (van der Wegt et ai., 1996, Wösten ja Wessels, 1997).

Hyvin vähän tiedetään hydrofobiinien 2D- ja 3D-rakenteista ja niistä muutoksista, joita 10 tapahtuu niiden kokoonpanon aikana. Kummankin hydrofobiiniluokan oletetaan kuitenkin sisältävän kaksi domeenia, joita kumpaakin stabiloi kaksi disulfidisiltaa (Wösten ja Wessels, 1997).

Strategiat hydrofobiinien ja muiden hydrofobisten/amfipaattisten proteiinien ja polypeptidien 15 löytämiseksi ja inaktivoimiseksi ovat alalla hyvin tunnettuja ja niihin kuuluu tekniikoita, kuten genomisten tai cDNA-kiijastojen seulominen hybridisaatiotekniikoilla käyttäen homologisia/heterologisia DNA-fragmentteja ja oligonukleotideja, jotka on suunniteltu proteiinia/peptidiä koodittavalla alueella sijaitsevien konservoituneiden alueiden perusteella. Hydrofobiinien sekvenssien diversiteetti tarkoittaa kuitenkin sitä, että hydrofobiinin kaltaisten ' 20 geenien eristäminen sekvenssihomologian perusteella saattaa osoittautua vaikeaksi. On '·’·* olemassa muutamia raportteja, joissa on hyödynnetty nukleiinihappojen samanlaisuutta • * eristettäessä hydrofobiinigeeni käyttäen heterologista hybridisaatiota (esim. Munoz et ai.

1997).

25 Alan ammattilainen tietää kuitenkin useita tekniikoita, joissa hyödynnetään puhdistettua : proteiinia vastaavan geenin eristämiseksi. Kun vaahdonmuodostukseen liittyvät proteiinit,

t I

. · · *. polypeptidit tai peptidit on puhdistettu, vastaavat geenit eristetään käyttäen sopivia ' . tekniikoita, kuten esim. ilmentämiskirjastojen seulomista käyttäen puhdistettuja proteiineja ... vastaan nostatettuja vasta-aineita tai genomisen ja/tai cDNA-kiijastojen kloonausta tai • 30 seulomista PCR-tekniikalla käyttäen oligonukleotideja, jotka on suunniteltu N-terminaalisten ;,, ‘ tai sisäisten proteiinisekvenssien pohjalta.

16 108863

Vaahdonmuodostukseen liittyvät proteiinit, polypeptidit tai peptidit voidaan puhdistaa niiden ominaisuuksien perusteella. Ne voidaan ottaa talteen vaahdosta, joka muodostuu kannan kasvatuksen aikana, ja joka syntyy kuplittamalla kaasua kasvatusalustan läpi. Vaahtoon liittyvät proteiinit, polypeptidit ja peptidit voidaan edelleen ottaa talteen aggregaateista, joita 5 syntyy kasvatusalustan jäädytyksen yhteydessä. Proteiinit, polypeptidit tai peptidit, joiden tuotannon estäminen on hyödyllistä tämän keksinnön mukaisella tavalla, voidaan saada myös lisäämällä kannan solut, solu-uutteet tai kasvatusalusta vesipitoiseen kaksifaasijäqestelmään (ATPS) ja ottamalla talteen proteiinit, jotka erottuvat hydrofobisen faasimateriaalin sisältävään faasiin, jonka on osoitettu sisältävän hydrofobiinit (Hyytiä et ai. 1999).

10

Patenttihakemuksessa WO 96/41882 esitetään hydrofobiinien tuotanto syötävistä sienistä elintarviketeollisuuden tarkoituksiin. Julkaisussa kuvataan hydrofobiinien yli-ilmentäminen, mutta siinä ei esitetä niiden inaktivointia.

15 Tämän keksinnön mukaisesti mikro-organismikantaa muunnetaan geneettisesti niin, ettei se tuota olennaista määrää vähintään yhtä proteiinia, polypeptidiä tai peptidiä, joka liittyisi vaahdonmuodostukseen muuntamatonta mikro-organismi-isäntää kasvatettaessa. Olennainen määrä tarkoittaa tässä sitä, että isäntäkanta tuottaa vähintään 50 % vähemmän amfipaattisia proteiineja, polypeptidejä tai peptidejä, edullisesti 60-80 %, kaikkein edullisimmin 80-100 % 20 vähemmän amfipaattisia proteiineja, polypeptidejä tai peptidejä verrattuna muuntamattomaan ' * » lähtöisäntäkantaan.

, Kasvatuksen aikaisen vaahdonmuodostuksen vähentäminen tarkoittaa tässä, että !,. vaahdonuodostusta vähennetään vähintään 30 %, edullisesti 40-80 %, kaikkein edullisimmin 25 80-100 % verrattuna vaahdonmuodostukseen muuntamattoman lähtökannan kasvatuksen aikana.

Vähennetty vaahdonmuodostus johtaa vaahdonestoaineiden määrän vähentämiseen ja fermentoinnin työtilavuuden kasvuun. Vaahdonestoaineen väheneminen on vähintään 30 %, , . 30 edullisesti 40-80 %, kaikkein edullisimmin 80-100 %. Fermentoinnin työtilavuuden kasvu on I ·

» » I

,;. vähintään 5 %, edullisesti 10-20 %.

17 108863

Deleetiovektori tarkoittaa tässä vektoria, joka käsittää merkkigeeniä ja niin sanottuja reunustavia alueita koodittavat DNA-sekvenssit, jotka tekevät mahdolliseksi poistaa haluttu geeni tuotantoisännän genomista ja korvata se merkkigeenillä. Merkkigeeni voi olla amd S Aspergillus nidulansista, hph E.colista, tai mikä tahansa kiqallisuudesta tunnettu dominantti 5 tai auksotrofinen valintamerkkigeeni. Vektori voi olla pUC-saqan kloonausvektori tai mikä tahansa muu yleisesti saatavilla oleva kloonausvektori. Deleetiokasetti (joka käsittää valittua merkkigeeniä ja reunustavia alueita koodittavat DNA-sekvenssit) on poistettavissa vektorin genomista restriktioentsyymeillä.

10 Tätä keksintöä kuvaavat esimerkit, joissa inaktivoitiin yksi tai useampi hydrofobiinia koodittava DNA-sekvenssi sieni-isäntäkannoissa. Jo yhden hydrofobiinia koodittavan DNA-sekvenssin inaktivointi vaikutti merkitsevästi vaahdonmuodostukseen.

Tätä keksintöä kuvaa erityisesti esimerkki, jossa Trichoderma reesein genomista deletoidaan 15 hfbl- ja/tai hfl>2-geenit. Näiden geenien kloonaus ja eristys ja vastaavien proteiinien HFBI ja HFBII puhdistus on kuvattu Nakari-Setälän tohtorinväitöskhjassa (Nakari-Setälä, T., VTT:n Julkaisuja 254, Espoo 1995) (Nakari-Setälä et ai. 1996; Nakari-Setälä et ai. 1997). Väitöskiqassa T. reesein HFBIdla ja HFBIIrlla oletettiin olevan rooli kiinnittymisessä substraatteihin tai olevan vastuussa itiöiden hydrofobisuudesta, mutta näiden proteiinien 20 biologiset roolit olivat suurelta osin tuntemattomia ennen tätä keksintöä. Näin ollen niiden | ' · merkittävä rooli fermentoinnin aikaisessa vaahdonmuodostuksessa, kuten tässä keksinnössä j : on osoitettu, oli yllättävä piirre. Tässä keksinnössä osoitettiin, että jo yhden hydrofobiinia koodittavan geenin deleetio Trichoderma reesein genomista johti merkitsevään I ; ; ; vaahdonmuodostuksen vähenemiseen muunnetun Trichoderma-isänmn fermentoinnin aikana. 25 , ·. ; Jotta poistettaisiin hfol- ja hft>2-geenit Trichoderma reesein genomista, rakennettiin näiden . · ’, geenien deleetiovektorit. Vektorissa hfbl geeni korvattiin a/mfö-geenillä ja vektorissa hfb2 ‘ . geeni korvattiin E. colin hph-geenillä, joka koodittaa hygromysiini B-fosfotransferaasia.

• _ Kloonausvektori oli yksi pUC-saqan vektoreista, pUC 18.

Kuten esimerkissä 2 on kuvattu, eri T. reesei -kannat (QM 9414 ja Rut-C-30) transformoitiin deleetiovektoreilla transformointimenetelmillä, jotka ovat alalla tunnettuja, ja hfb-geenien 30 i •8 108863 poistaminen varmistettiin transformanteista. Transformantteja, joissa oli hft>l\n, tai hft>2:n tai kummankin deleetio, kasvatettiin ravistelupulloissa erilaisilla kasvatusalustoilla, joilla oli glukoosia, sorbitolia tai laktoosia hiilenlähteinä. Tulokset osoittivat, ettei n, hfl>2:n tai kummankin geenin deleetiolla ollut negatiivista vaikutusta T. reesein entsyymien tuotantoon.

5 Joissain tapauksissa entsyymien tuotto oli jopa parempi kuin T. reesein emokannan tuotto.

A/Z?7-geenin deleetion tuloksena soluseinät, ΔΑ/W-sienirihmat, jotka kasvoivat glukoosilla ravistelupulloviljelmissä, näyttävät ohuemmilta kuin kontrollirihmat, ja kanta muodosti myös suuria pellettejä kasvatuksen aikana. Transformantin kasvu heikkeni jonkin verran 10 kasvatuksen keskivaiheilla, mutta deleetiokanta saavutti isäntäkannan kasvatuksen myöhemmissä vaiheissa. A/Z>2-geenin deleetiolla ei ollut vaikutusta transformantin morfologiaan, kun sientä kasvatettiin laktoosilla ravisteltavissa nesteviljelmissä, eikä kasvuvauhdissa osoitettu eroa transformantin ja isäntäkannan välillä.

15 T. reesei Rut C30 -kantaa, joka oli muunnettu sisältämään hfb2-deleetio genomissaan, kasvatettiin myös laktoosilla ja selluloosalla fermentorissa. Vaahdonestoaineen kulutusta, pH-arvoa, kasvua ja proteiinin ja entsyymin tuotantoa seurattiin. Tulokset osoittivat selvästi, että yhden hydrofobiinigeenin deleetio vähensi merkitsevästi vaahdonmuodostusta. Erityisesti T. reesei Rut-C30:n kasvatuksessa selluloosalla, jolloin kasvatusalusta sisältää liukenemattomia : 20 selluloosapolymeerejä, muodostui suuri määrä melko stabiilia vaahtoa, ja sen vuoksi vaahdonestoaineen kulutus oli suuri. Transformantin kasvatus laktoosilla ei tarvinnut • * ‘ vaahdonestoainetta ja selluloosalla tarvittavan vaahdonestoaineen määrä kasvatuksen aikana • ’ oli ainoastaan 12 % kontrolli viljelmän tarvitsemasta määrästä. Vaahdonestoaineen • * · alentuneella kulutuksella oli useita positiivisia vaikutuksia. Suurimpana etuna saavutetaan 25 paljon helpompi alavirran prosessointi.

hfl>2-geenin deleetiolla ei ollut merkitsevää vaikutusta transformanttikannan kasvuun fermentorissa testatuissa olosuhteissa. A/Z?2-geenin deleetiolla ei myöskään ollut selvää ,., negatiivista vaikutusta transformantin ekstrasellulaarisen proteiinin ja entsyymin tuotantoon.

'. ‘ 30 ; ’ · Esimerkkinä proteiinituotteen tuotannosta käytettiin tässä hydrofobiinin kaltaisen proteiinin käsittävien fuusiomolekyylien tuottamista. Tuotantoisäntäkantaa muunnettiin niin, ettei se j 19 108863 tuottanut vaahdonmuodostukseen liittyviä proteiineja tai polypeptidejä, ja sama isäntä j j transformoitiin tuottamaan fuusiomolekyyliä, joka käsitti amfipaattisen proteiinin ja kiinnostuksen kohteena olevan molekyylin, lisäpuhdistusta varten vesipitoisessa kaksifaasijäijestelmässä (ATPS).

5

Seuraavat esimerkit on tarkoitettu kuvaamaan tätä keksintöä, eikä niitä tule pitää tätä keksintöä millään tavalla rajoittavina.

ESIMERKIT

10

Esimerkki 1

Vektorien rakentaminen hfl>l- ja/tai Ä/Z>2-geenien deletoimiseksi Trichoderma reesein genomista 15 hfbl (SEQ ID 1, kuvio 1) -geenin deletoimiseksi T. reesein genomista rakennettiin plasmidi, jossa hfl>l:tä koodittava alue korvattiin Aspergillus nidulansin amdS-geenillä, joka koodittaa asetamidaasia. Plasmidi pEAlO (Nakari-Setälä et ai. Eur. J. Biochem. (1996) 235:248-255), jossa oli noin 5.8 ke:n Sali-fragmentti, joka sisälsi hftjhiz koodittavan geenin ja reunustavat t - · · ' 20 alueet, pilkottiin Munl:llä ja tehtiin tylppäpäiseksi T4 DNA -polymeraasilla. Saatu ‘ vektorifragmentti, josta puuttui hfol :n koodittavat alueet ja jotkin reunustavat alueet sisältävä ; '' noin 950 ep:n Munl-fragmentti, puhdistettiin agaroosigeelistä ja ligoitiin 3.2 ke:n amdS-• » · * · fragmenttiin, joka oli irrotettu p3SR2:sta (Hynes et ai. Mol. Cell Biol. (1983) 3:1430-1439; • » · !,. Tilbum et ai. Gene (1983) 26:205-221) SphLllä ja XbaLllä ja tehty tylppäpäiseksi T4 DNA-• · * 25 polymeraasilla. Saatu plasmidi on pTNS24 (kuvio 3). Se sisältää deleetiokasetin, jossa ,·, ; sijaitsee amdS-geeni, ja noin 2.7 ke:n ja vastaavasti 2 ke:n 5'- ja 3'-ei-koodittavat alueet

• » I

• I

. · · *. hft>l :sta. Deleetiokasetti voidaan irrottaa vektorista SalLllä.

... hfo2-geenin poistamiseksi (SEQ ID 2, kuvio 2) T. reesein genomista rakennettiin plasmidi, 30 jossa hft>2\Xa, koodittava alue korvattiin E. colin ApA-geenillä, joka koodittaa hygromysiini B- !,. ‘ fosfotransferaasia. hft>2-geenin 1.2 ke:n 5’-reunustava alue irrotettiin plasmidista pTNS8 (Nakari-Setälä et ai. Eur. J. Biochem. (1997) 248:415-423) HindIII:lla ja BglLllä, tehtiin 20 108863 tylppäpäiseksi T4 DNA-polymeraasilla ja puhdistettiin agaroosigeelistä. Puhdistettu fragmentti ligoitiin pAR021:teen (Penttilä et ai. patenttihakemus FI 990667), joka oli katkaistu Xholrlla ja tehty tylppäpäiseksi T4 DNA -polymeraasilla, mistä saatiin pTNS26. pAR021 on olennaisesti sama kuin pRLMex30 (Mach et ai. Curr. Genet. (1994) 6:567-570) 5 ja se sisältää E. colin hph-geenin toiminnallisesti liitettynä T. reesein 730 ep:n pkil-promoottoriin ja 1 ke:n cM2-terminaattorisekvenssiin. hfl>2:n 3'-reunustavan alueen liittämiseksi deleetiokasettiin pTNS26 pilkottiin EcoRV.llä, käsiteltiin SAP:lla (katkaravun alkalinen fosfataasi, Boehringer-Mannheim) ja ligoitiin 1.7 ke:n EcoRV hfb2 3’ -reunustavan alueen fragmenttiin, joka oli irrotettu pTNS8:sta. Tuloksena saadussa plasmidissa pTNS27 10 (kuvio 4) A/Z>2-geenin sekä 5’ että 3’ ei-koodittavat alueet reunustavat ApA-ilmentämiskasettia samassa orientaatiossa. Deleetiokasetti voidaan vapauttaa vektorista SphI.llä ja Spehllä.

Esimerkki 2

Trichoderman transformaatio ja ΔΑ/δ-kloonien puhdistus 15

Trichoderma reesei -kannat QM9414 (VTT-D-74075), Rut-C30 (VTT-D-86271) ja QM9414 Ahfl)l (VTT-D-99724) transformoitiin olennaisesti kuten aiemmin on kuvattu (Penttilä et ai., Gene (1987) 61:155-164) käyttäen 3-13 pg plasmideja pTNS24 ja pTNS27 tai deleetiokasettej a, j otka irrotettiin niistä sopivilla restriktioentsyymeillä.

20 • » * * * • * · ' Saadut Amd+ ja Hyg+ -transformantit siveltiin kolme kertaa maljoille, jotka sisälsivät » · · [ . asetamidia ja vastaavasti hygromysiiniä (Penttilä et ai. (1987) Gene 61:155-164). Sen jälkeen • · tehtiin itiösuspensiot transformanteista, joita oli kasvatettu Potato Dextrose -agarilla (Difco).

» · · • * · 25 Southem-analyysit tehtiin sen varmistamiseksi, että A/h-geenit oli poistettu genomeista. Amd+ ’ : ja Hyg+ -transformantteja kasvatettiin minimaalialustalla (Penttilä et ai. (1987) Gene 61:155- 164), joka sisälsi 3% glukoosia ja 0.2% peptonia genomisen DNA:n eristämiseksi käyttäen Easy-DNA -pakkausta (Invitrogen). Noin 2 pg DNA:ta pilkottiin Pvuhlla Ahfbl- * · transformanttien tapauksessa ja NcoLlla AA/h2-transformanttien tapauksessa. Tehtiin , ‘ ; 30 southem-hybridisaatiot noin 5.8 ke:n ja 3.8 ke:n genomisilla fragmenteilla, jotka sisälsivät • I 1 . hfbl- ja hfb2-geenit ja reunustavat alueet. Isäntäkannassa hybridisaatio koettimien 21 108863 kanssa johtaa kummassakin tapauksessa yhteen suureen signaaliin, kun taas transformanteilla saadaan kaksi pienempää signaalia, jos A/A-geeni on oikein deletoitu.

Itiösuspensiot klooneista, joista A/A-geenit oli deletoitu southem-analyysin perusteella, 5 puhdistettiin yksittäisitiöviljelmiksi valikointialustoilla (jotka sisälsivät joko asetamidia tai hygromysiiniä). Southem-analyysi toistettiin samalla tavalla kuin edellä, jotta saatiin valikoiduksi puhtaat ΔΑ/δ-kloonit.

Muihin tutkimuksiin käytetyt T. reesez-kannat ovat VTT-D-99724 ja VTT-D-99723 (QM9414 10 Ahfbl), VTT-D-99726 (QM9414 Ahfb2), VTT-D-99725 (QM9414 ΔΑ\fbltdifb2) ja VTT-D-99676 (Rut-C30 Ahfb2).

Esimerkki 3 ! 15 Trichoderma QM9414:n kantojen Ahfbl, Ahfb2 ja Ahfbl Ahfb2 entsyymintuotanto glukoosilla, sorbitolilla ja laktoosilla

Kantoja VTT-D-99724 (Ahfil), VTT-D-99726 (Ahfi2), VTT-D-99725 (AhfblAhfb2) ja . niiden isäntäkantaa VTT-D-74075 (QM9414) kasvatettiin ravistelupulloissa 28°C:ssa kolme , . 20 ja seitsemän päivää 50 ml:ssä Trichoderman minimal-alustaa (Penttilä et ai. 1987), johon oli ‘ lisätty 0,2% peptonia ja 2% hiilenlähteenä joko i) glukoosia, ii) sorbitolia tai iii) laktoosia. Aloitus-pH oli 4,8. Kasvatusalustasta otettiin näytteet 3 vrk kasvatuksen jälkeen. Eritetyt • · kokonaisproteiinit analysoitiin Lowryn menetelmällä (1951). Endoglukanaasi- ja . ·:1. endoksylanaasiaktiivisuudet määritettiin IUPAC-standardimenetelmän ja Baileyn et ai. (1992) 25 mukaisesti käyttäen substraatteina hydroksietyyliselluloosaa (HEC,Fluka 54290) ja vastaavasti koivun ksylaania (XYL,Roth 7500). Proteaasiaktiivisuus määritettiin •' ’: semikvantitatiivisesti täplittämällä 5 μΐ viljelmän suodosta 1,5-prosenttisille agar-maljoille ,,..: (pH 5), jotka sisälsivät 1% kuorittua maitoa, ja arvioimalla näytteen proteaasiaktiivisuudesta ’ 1; johtuvien kehien koko.

‘ ; 30 . Aktiivisuusmäärityksistä saadut arvot ja lasketut entsyymiaktiivisuudet eritettyä kokonaisproteiinia kohti on esitetty taulukossa 1. Nämä luvut osoittavat, ettei A/h-geenien 22 108863 deleetiolla ole negatiivista vaikutusta, vaan joissain tapauksissa jopa positiivinen vaikutus sekä glykanaasien että proteaasien tuotantoon; kahden entsyymiryhmän, joiden ilmentäminen on eri säätelymekanismien alaista. Kasvatusliemen pH-arvot kasvatuksen lopussa osoittavat, että samalla kasvatusalustalla kaikki kannat ovat suunnilleen samassa kasvuvaiheessa. Mitään 5 selviä eroja ei näkynyt silmävaraisesti morfologiassa tai solumassan määrässä eri kantojen välillä samalla ravintoalustalla.

Taulukko 1.

Kanta Hiilenlähde HEC XYL Proteaasi nkat/mg nkat/mg kokonaisprot. kokonaisprot.

Isäntä Glukoosi nd nd + QM9414

Ahfbl nd nd +++

Ahft)2 nd nd +

Ahft>lAhfl>2 nd nd ++

Isäntä Sorbitoli - 30 - QM9414 . Ahjbl - 50

Ahfl>2 - 60 ··, Ahft>lAhfb2 - 63 -

Isäntä Laktoosi 78 253 • · QM9414 *

Ahfil 98 202

Ahft)2 89 363 OI AhfblAhfl>2 92 190 ; · ‘ nd, ei määritetty ,,,.: 10 -, ei havaittu 1 08863

Esimerkki 4 23 T. reesei QM9414 Ahfbl -kannan kasvu ja morfologia glukoosilla 5

Kantoja VTT-D-99724 (Ahftil) ja VTT-D-99723 (Ahfbl), jotka olivat peräisin kahdesta erillisestä transformantista, ja niiden isäntäkantaa VTT-D-74075 (QM9414), kasvatettiin myös ravistelupulloissa 28°C :ssa viisi päivää 250 ml:ssa Trichoderman minimal-alustaa (Penttilä et ai. 1987), joka oli puskuroitu pH 6:teen ja johon oli lisätty 3% glukoosia. Kantojen 10 kasvua seurattiin sekä määrittämällä rihmastojen kuivapainot että kvalitatiivisesti kasvatusalustan pH-arvoista eri aikoina.

hfbl-geenin deleetion seurauksena T. reesein kyky kasvaa glukoosilla oli heikentynyt ravistelluissa nesteviljelmissä, kuten voidaan nähdä rihmaston kuivapainosta ja pH-arvoista, 15 jotka on esitetty kuvioissa 10 ja 11. Sienirihmojen ulkonäköä glukoosikasvatuksessa seurattiin valomikroskoopilla deleetiokantojen morfologian tutkimiseksi. Luultavasti HFBI-proteiinin puuttumisen vuoksi soluseinistä, Ahfol-rihmat näyttivät ohuemmilta kuin kontrollirihmat, ja kanta muodosti myös suuria pellettejä kasvatuksen aikana. Tulisi kuitenkin huomata, että kasvatuksen aikana deleetiokanta VTT-D-99723 saavuttaa isäntäkannan biomassan tuotannon •' ’: 20 suhteen.

• « · * 1 · « 1 ·

Esimerkki 5 24 108863 5 Trichoderma Rut C30 AA/ft2-kannan kasvatus laktoosilla ravistelupulloissa

Kantaa VTT-D-99676 (Ahft>2) ja sen isäntäkantaa VTT-D-86271 (Rut-C30) kasvatettiin 28°C:ssa ravistelupulloissa kolme päivää 250 mlrssa Trichoderman minimal-ravintoalustaa I (Penttilä et ai. 1987), joka oli puskuroitu pH 6:teen ja johon oli lisätty 0,2% peptonia ja 2% J 10 laktoosia laktoosisyötöllä. Pulloista otettiin näytteet kasvatuspäivinä 2 ja 3 kasvun ja j proteiinituotannon analyysejä varten. Kasvua analysoitiin kvantitatiivisesti määrittämällä rihmaston kuivapainoa ja kvalitatiivisesti kasvatusalustan pH-arvoista. Kasvueroja ei havaittu transformantin ja isäntäkannan välillä näiden määritysten perusteella, kuten voidaan nähdä j kuviosta 12. Myös transformanttikannan morfologia oli samanlainen kuin isäntäkannan.

15

Eritettyjen endoglukanaasien (HEC) ja sellobiohydrolaasien (MUL) tuotantotasot, jotka määritettiin IUPAC-standardimenetelmän mukaisesti, ja vastaavasti Tilbeurghin et ai. (1988) mukaisesti, on esitetty taulukossa 2. Nämä tulokset osoittavat selvästi, ettei hfl>2-geenin deleetio kontrollikannasta vaikuttanut negatiivisesti entsyymituotantoon.

' ' 20 f · » I · « * • OMI I » * t · I « ' * I » ! : II» % % -ll»« » * •

< I

• I 1 » 25 108863

Taulukko 2.

Kanta t kuivapaino HEC MUL

_g/j_nkat/ml nkat/ml VTT-D- 0 0 0 0 86271 48 3,6 230 3,2 72 5,4 247 9 VTT-D- 0 0 0 0 I 99676 48 4 236 2,7 _72_5J5_214_7 • ·

Esimerkki 6 26 108863

Trichoderma Rut C30 ΔΛ/02-kannan kasvatus laktoosilla fermentorissa

Joidenkin kantojen, mutta ei kaikkien, moderni selluloosantuotantoalusta voi perustua 5 laktoosin käyttöön hiilenlähteenä ja entsyymin indusoijana. Kontrollikanta Rut-C30 tuottaa sellulaaseja tehokkaasti laktoosilla, kun taas esim. kanta QM9414 ei tuota.

Trichoderma reesei Rut-C30:aa ja sen AA/Z>2-transformanttia VTT D-99676 (D-676) kasvatettiin laktoosiin perustuvalla kasvatusalustalla 15 litran laboratoriofermentorissa. Alusta 10 sisälsi laktoosia (Riedel-de Haen, Saksa, tuote 33411) 40 g Γ1, peptonia (Difco, USA, 0118-17) 4,0 g l'1, hiivauutetta (Difco, 0127-17) 1,0 g Γ1, KH2P04 4,0 g Γ1, (NH4)2S04 2,8 g Γ1, MgS04x7H20 0,6 g T1, CaCl2x2H20 0,8 g Γ1 (steriloitu erillään) ja 2,0 ml Γ1 hivenaineliuosta I (Mandels ja Weber 1969). Kasvatusalustaan ei lisätty vaahdonestoainetta ennen sterilointia in situ (123°C/20 min). Kasvatusolosuhteet olivat: lämpötila 29°C, ravistelu 600 rpm, ilmastus ! 15 101 min'1, pH 4,0...5,0.

Näissä kasvatuksissa täysin liukoisella ravintoalustalla oli mahdollista seurata kasvua analysoimalla biomassan kuivapainoa ja laktoosin kulutusta. Kasvuparametrien vertailu kahdessa kasvatuksessa on esitetty kuvioissa [8] A ja B. Tulokset osoittivat selvästi, ettei ' ' 20 A/&2-geenin deleetio kontrollikannasta vaikuttanut merkitsevästi kasvuun. Vaahtoaminen ei ' · ·' ollut suuri ongelma tällä kasvatusalustalla kummankaan kannan ollessa kyseessä.

• ’’ Vaahdonestoaineen kulutus oli 10 ml/15 litraa kannalla Rut-C30, eikä vaahdonestoainetta ;,, käytetty lainkaan kasvatettaessa kantaa D-676.

» · · I · 25 Tällä kasvatusparilla sellulaasin tuotanto oli Ahft>2-karmalla jonkin verran pienempää kuin , · : kontrollikannalla Rut-C30 (taulukko 3). Kokemukset sellulaasin tuotannosta laktoosiin . ·. pohjautuvalla ravintoalustalla ovat kuitenkin osoittaneet, että prosessin olosuhteiden optimointia tulee tehdä kullekin tuotantokannalle yksilöllisesti. Alkavan kataboliittirepression . . vaikutukset laktoosimolekyylin pilkkoutuessa glukoosiksi ja galaktoosiksi tulee välttää 30 sopivilla, kannalle spesifisillä pH:n ja/tai lämpötilan säädöillä.

27 108863

Taulukko 3. Liukoisen proteiinin, sellulaasien (HEC, FPU, IUPAC standardimenetelmä) tuotanto ja vaahdonestoaineen kokonaiskulutus (Struktol J633) T. reesei Rut C30:n ja sen Δ A/&2-transformantin VTT D-99676 kasvatuksissa laktoosialustalla 15 litran laboratoriofermentorissa.

5

Kanta Kuivapaino Prot. HEC FPU Vaahdonesto- g Γ1 g Γ1 nkat ml u ml1 aineen kulutus mil'1

Rut-C30 15,8 5,9 780 3,5 0,7 i I VTT D-99676 14,6 5,0 610 2,1 0,0 10 Esimerkki 7

Trichoderma Rut C30 AÄ/Z>2-kannan kasvatus seUuloosalla fermentorissa

Trichoderma reesei Rut C30:a ja sen Ähfb2-transformanttia VTT D-99676 (D-676) kasvatettiin selluloosa-mäskäysjätealustalla 15 litran laboratoriofermentorissa. Kasvatusalusta 15 sisälsi Solka floc selluloosaa 40 g Γ1, tislaamon mäskäysjätettä 20 g Γ1, KH2PO4 5 g Γ1 ja :**: (NH4)2S04 5 g Γ1. Kasvatusalustaan lisättiin tavanomainen annos vaahdonestoainetta, 5 ml : : (Struktol J633, Schill&Seilacher, Hamburg, Germany) estämään vaahtoamista in-situ- : steriloinnin aikana (123°C/20 min). Kasvatusolosuhteet olivat: lämpötila 29°C, sekoitus 600 rpm, ilmastus 101 min'1, pH 4,0...5,0.

V;! 20

Kiinteisiin aineisiin perustuvalla kasvatusalustalla ei voitu mitata kasvua biomassan tuotannon tai substraatin kulutuksen perusteella, mutta sellulaasin tuotantokäyrät (HEC; FPU) ja ...· liukoinen proteiini (Lowry et ai. 1951) osoittivat melko samanlaisia tuotantonopeuksia ja -: '.: tasoja kontrollikannalle ja transformanttikannoille (kuviot [9] A ja B). Liemen pH-käyrät on ;,, t: 25 myös esitetty kuvioissa kasvuvaiheiden kulun indikaattorina: ensin epämääräinen tai nouseva suuntaus lag-vaiheen ja varhaisen kasvun aikana, laskeva pH pääasiallisen kasvuvaiheen ί ! 28 108863 aikana ja lopulta nouseva suuntaus sekundaarimetabolian/nälkiintymisen aikana. Viljelmistä määritetyt sellulaasi- ja ksylanaasiaktiivisuuksien tuotantotasot on esitetty taulukossa 4. Nämä tulokset osoittavat selvästi, ettei A/Z>2-geenin deleetiolla kontrollikannasta ollut negatiivista vaikutusta entsyymituotantoon. Kaikkien tässä vertailussa käytettyjen 5 entsyymisubstraattien epähomogeenisen luonteen vuoksi tyypillinen vaihtelu analyysituloksissa on alueella ±10% HEC:llejaXYL:lle ja vähintään 15-20% FPU:lle.

Taulukko 4. Liukoisen proteiinin, sellulaasien (HEC, FPU, IUPAC standardimenetelmä) ja ksylanaasin (XYL, Bailey et ai. 1992) tuotanto, ja vaahdonestoaineen kokonaiskulutus 10 (Struktol J633) T. reesei Rut C30:n ja sen AA/h2-transformantin VTT D-99676 kasvatuksissa selluloosa-mäskäysjätealustalla 15 litran laboratoriofermentorissa.

Kanta Prot. HEC FPU XYL Vaahdonesto- g Γ1 nkat ml u ml'1 nkat ml'1 aineen kulutus mlT1

Rut C30 13,9 1600 10,9 1870 3,3 VTT D-99676 16,4 1715 8,9 2240 0,4 15 Pääasiallinen, huomattava ero näiden kahden kasvatuksen välillä oli vaahdonestoaineen kulutuksessa: kannan Rut C30 kontrollikasvatuksen Struktol-kulutus oli 50 ml/15 litraa, kun j'; taas kannan D-676 tapauksessa kulutus oh vain 6,0 ml. Ilmeisesti jälkimmäinen viljelmä vaahtosi ainoastaan yhdessä tapauksessa, juuri ajon loppuessa. Tämä vaahtoaminen johtui oletettavasti entsyymiproteiinien erittymisestä kasvatusalustaan, mikä oli selvästi 20 riippumatonta HFBILn läsnäolosta tai puuttumisesta. Lähes kymmenkertaisella erolla , · vaahdonestoaineen tarpeessa olisi ehdottomasti merkitsevä vaikutus teollisen mittakaavan ; · ·: alavirran (downstream) prosessoinnissa (entsyymin konsentrointi membraanisuodatuksella ja ; ’: mahdollinen kromatografiapuhdistus).

i 1,

Esimerkki 8 29 108863 6Jifl)l&hft>2 Trichoderma Rut-C30 -kannan kasvatus glukoosilla fermentorissa

Trichoderma reesei -kantaa QM9414 (VTT-D-74075) ja sen ÄA/&/AA/&2-transformanttia 5 VTT D-99725 kasvatetaan glukoosipohjaisella kasvatusalustalla 15 litran laboratoriofermentorissa. Ravintoalusta sisältää glukoosia 40 g Γ1, peptonia (Difco, USA, 0118-17) 4,0 g Γ1, hiivauutetta (Difco, 0127-17) 1,0 g l'1, KH2P04 4,0 g T1, (NH4)2S04 2,8 g Γ1, MgS04x7H20 0,6 g Γ1, CaCl2x2H20 0,8 g Γ1 (steriloitu erillään) ja 2,0 ml Γ1 hivenaineliuosta (Mandels ja Weber 1969). Vaahdonestoainetta ei lisätä kasvatusalustaan 10 ennen sterilointia in situ (123°C/20 min). Kasvatusolosuhteet ovat: lämpötila 29°C, ravistelu 600 rpm, ilmastus 10 1 min'1, pH 4,0...5,0.

Kasvatusten aikana analysoidaan morfologiaa, biomassan kuivapainoa, pH:ta, hapen ja vaahdonestoaineen kulutusta ja ekstrasellulaarisen proteiinin tuotantoa (Lowry et ai. 1951) 15 sekä proteaasiaktiivisuutta.

Esimerkki 9 EGIydin-HFBI-fuusioproteiinien (tuotanto T. reesei Ahfl>2 -kannassa fuusioproteiinien , ·. 20 paremman erottelun aikaansaamiseksi ATPS:llä

EGIydin(”EGIcore”)-HFBI-fuusioproteiinin rakentamiseksi hft>l:tä koodittava alue Ser-23:sta ...: STOP-kodoniin monistettiin PCR:llä käyttäen seuraavia alukkeita, 5'-alukkeena ACT ACA

':': CGG AG G AGC TC G ACG ACT TCG AGC AGC CCG AGC TGC ACG CAG AGC

'; ·: AAC GGC AAC GGC (SEQ ID No 3) ja 3'-alukkeena TCG TAC GGA TCC TCA AGC ACC

25 GAC GGC GGT. (SEQ ID No 4) Lihavoitu sekvenssi 5-alukkeessa koodittaa aminohappoja 410-425 EGIrssä ja alleviivattu GAGCTC on Sacl-kohta. 260 ep:n PCR-fragmentti puhdistettiin agaroosigeelistä ja ligoitiin pPCRII T/A -vektoriin (Invitrogen), jolloin saatiin pMQlll.

' . : 30 Seuraavassa vaiheessa rakennettiin 7>/cAoi/erma-ilmentämisvektorit EGIydin-HFBI -luusioproteiinin tuottamiseksi cbhl promoottori- ja terminaattorisekvenssien säätelyn alaisena. Rakenteiden runkona käytetty ilmentämisvektori on pPLE3 (Nakari et ai. (1994) WO

30 108863 94/04673), joka sisältää pUC18-rungon, ja jossa on cbhl-promoottori liitettynä EcoRI paikkaan, cbhl -promoottori on liitetty toiminnallisesti täysipituista egll:tä koodittavaan cDNA-sekvenssiin ja cbhl transkription terminaattoriin. Plasmidi pMQlll katkaistiin Sackllä ja BamHI:llä ja A/bi-sekvenssin sisältävä 260 ep:n fragmentti ligoitiin pPLE3:hen, 5 joka oli katkaistu Saclrllä ja BamHIrllä. Saatu plasmidi pMQl 13 (kuvio 5) sisältää EGIytimen koodittavat sekvenssit liitettynä HFBIriin oman linkkerialueensa välityksellä cbhl-promoottori-ja -terminaattorisekvenssien säätelyn alaisena.

Trichoderma reesei -kanta QM9414 Ahft>2 (VTT-D-99726) transformoitiin oleellisesti kuten 10 on kuvattu aiemmin (Penttilä et ai., Gene (1987) 61:155-164) käyttäen 10 pg plasmidia pMQ113 yhdessä 3 pg Aspergillus nidulansin asetamidaasia koodittavan amdS-geenin sisältävää selektioplasmidia pTOC202 kanssa (Hynes et ai. Mol. Cell Biol. (1983) 3:1430-1439; Tilbum et ai. Gene (1983) 26:205-221).

15 Saadut Amd+ -transformantit siveltiin kaksi kertaa maljoille, jotka sisälsivät asetamidia (Penttilä et ai. (1987) Gene 61:155-164). Sen jälkeen tehdään itiösuspensiot transformanteista, joita on kasvatettu Potato Dextrose agarilla (Difco). EGIydin-HFBI -fuusioproteiinin tuotantoa testataan slot-blottaamalla tai Westem-analyysillä käyttäen EGI ja HFBI spesifisiä . vasta-aineita, ravistelupullo- tai mikrotiitterilevyviljelmistä, jotka on tehty minimal-alustalla, > . 20 johon on lisätty Solka floc-selluloosan ja/tai mäskäysjätteen ja/tai heran seosta.

* ·

Fuusioproteiinia tuottavien kloonien itiösuspensiot puhdistetaan yksi-itiöviljelmiksi • » valintamaljoilla (jotka sisältävät asetamidia). Parhaiden tuottajien määrittelemiseksi * · •: ·. fuusioproteiinin tuotanto analysoidaan jälleen näistä puhdistetuista klooneista, kuten aiemmin » ':'. on kuvattu.

> < · 25 EGIydm-HFBI-fuusioproteiinin erotuskokeita varten ATPS:llä käyttäen : polyoksietyleenidetergenttiä C^-isEOs (Agrimul NRE 1205, Henkel), tässä kokeessa saatua parasta tuotantokantaa, ja kontrollikantoina kantoja VTT-D-98691 (QM9414 kanta tuottaa 'j EGIydin-HFBI:tä), VTT-D-74075 (QM9414) ja VTT-D-99726 (QM9414 Ahfb2) kasvatetaan : 30 28°C:ssa ravistelupulloissa 5-6 vrk, 50-250 ml tilavuudessa Trichoderma n minimal kasvatusalustaa (Penttilä et ai. 1987), johon on lisätty 3% Solka floc -selluloosaa ja 1% mäskäysjätettä.

1 08863 31

Erotuskokeet toteutetaan supematantilla (biomassa eroteltu sentrifugoimalla tai suodattamalla) 10 ml asteikollisissa koeputkissa. Putkiin lisätään ensimmäinen detergentti ja putket täytetään sitten 10 ml:ksi viljelmän supematantilla. Detergentin määrä putkissa 5 lasketaan detergenttien painoprosenttina. Huolellisen sekoituksen jälkeen ravistelijassa erottuminen tapahtuu joko saostumisena painovoiman avulla vesihauteessa vakiolämpötilassa, tai sentrifugoimalla vakiolämpötilassa. Erottelu tehdään yleensä 30 °C:ssa, tavanomainen detergentin määrä on 2-5% (w/v). Erottelun jälkeen kevyemmän ja raskaamman faasin tilavuuksien suhde tarkastetaan ja siitä lasketaan fuusioproteiinin rikastuskerroin.

10 Kevyemmästä ja raskaammasta faasista otetaan myös näytteet analyysiä varten.

Kahden faasin erottelut analysoidaan käyttäen SDS-PAGE-geelejä, mitä seuraa fuusioproteiinien tekeminen näkyviksi Coomassie brilliant blue R-250 (Sigma) -värjäyksellä tai Western blottingilla. Westem-analyysissä käytetään polyklonaalista anti-HFBI-vasta-15 ainetta EGIydin-HFBI-proteiinin osoittamiseksi yhdessä alkaliseen fosfataasiin konjugoidun I anti-kaniini-IgG:n kanssa (Bio-Rad). Alkalisen fosfataasin aktiivisuus osoitetaan kolorimetrisesti BCIP:illä (5-bromi-4-kloori-3-indolyylifosfaatti), jota käytetään yhdessä NBT:n kanssa (nitro blue tetrazolium) (Promega).

' ; : 20 EGI-aktiivisuus osoitetaan käyttämällä substraattina 4-metyyliumbelliferyyli-B-D- *<· sellobiosidia (MUC) (Sigma M 6018) (Van Tilbeurgh H. & Caeyssens M., 1985; Van Tilbeurgh et.ai. 1982). EGI hydrolysoi β-glykosidisidoksen ja vapauttaa fluorogeenista 4-’. * : metyyliumbelliferonia, joka voidaan määrittää käyttäen fluorometria, joka on varustettu 360 ' · ’ * virityssuodattimella ja 455 nm emissiosuodattimella. Myös CBHI hydrolysoi substraattia ja 25 sellobioosin (C-7252, Sigma) lisääminen inhiboi sitä. EGI:ä sisältävää liuosta lisätään _ · sopivana laimennuksena puskuriin, joka sisältää 50 mM natriumasetaattipuskuria (pH 5), 0.6 mM MUC:ia ja 4.6 mM sellobioosia. Seosta kuumennetaan 50°C:seen. Reaktio pysäytetään kymmenen minuutin kuluttua käyttäen 2% Na2CC>3, pH 10. Puhdistettu CBHI osoitetaan ; ' käyttäen samaa määritysmenetelmää kuin EGI:lle ilman inhibiittorina toimivan sellobioosin ·· 30 lisäystä.

32 108863

Erotteluvakio K määritetään päällys- ja vastaavasti aluskerroksen mitattujen konsentraatioiden tai aktiivisuuksien suhteena.

Saanto Y määritellään seuraavasti: 5 YT =—jJ·-= , VB 1 1+ -* —

VT K

jossa YT on päällyskerroksen saanto, VB ja VT ovat päällys- ja vastaavasti aluskerroksen tilavuudet. Aluskerroksen saanto voidaan kuvata vastaavalla tavalla

Perinpohjaisen tutkimuksen vuoksi massatasapainot, ts. kaiken lisätyn proteiinin talteenotto, 10 tarkistetaan aina, jotta varmistetaan, ettei saanto (Y) ole keinotekoisen korkea (esim. mahdollisen proteiinin inaktivaation vuoksi aluskerroksessa). Arvot lasketaan yleensä kokonaisentsyymiaktiivisuuden perusteella (EGI paino plus EGI-fuusio) ja näin ollen arvot ovat aliarvioidut fuusion erottelun suhteen.

15 Esimerkki 10 HFBI-yksiketjuisen vasta-aineen sisältävän fuusioproteiinin tuottaminen T. reesei Ahfl)2 -kannassa ATPS-puhdistusta varten 20 Rakennetaan T. reesei -kanta, joka tuottaa fuusioproteiinia, jossa N-päässä on T. reesein HFBI- proteiini ja C-päässä on yksiketjuinen vasta-aine (ENA5SCFV), joka I t tunnistaa diaryylialkyylitriatsolin pienimolekyylipainoisen johdannaisen. Fuusioproteiini puhdistetaan käyttäen vesipitoista kaksifaasijäijestelmää ! L * , : 25 Diaryylialkyylitriatsolin vastaisten enantiospesifisten Fab-firagmenttien kloonausta varten eristettiin kokonais-RNA antigeenillä immunisoitujen hiirten pernasoluista saadusta hybridoomasolulinjasta käyttäen Promegan uuttoprotokollaa. mRNA-ftaktio puhdistettiin käyttäen Qiagenin Oligotex-dT polyA+ puhdistuspakkausta ja cDNA-synteesi tehtiin Promegan AMV-käänteistranskriptaasijäijestelmällä. Sen jälkeen 30 cDNAdle tehtiin PCR-monistus käyttäen alukeseoksia, jotka olivat spesifisiä kullekin

- I

• > * 33 108863 vasta-aineryhmälle, 9 raskaille ketjuille ja 4 kevyille ketjuille (julkaisun Kabat et ai. mukaisesti; Kabat et. ai, 1991, Sequences of proteins of immunological interest, NIH publication No. 91-3242). Polymerisointi toteutettiin käyttäen Dynazyme-polymeraasia (Finnzymes) ja tavanomaisia olosuhteita, valmistajan ohjeiden 5 mukaisesti. Monistuksen jälkeen sekä raskaat että kevyet ketjut kloonattiin dikistronisena operonina tac-promoottorin alaisena, jota sääteli ilmentämisvektorissa pTI18 oleva laet1 repressori (Takkinen et ai, 1991). Eritystä varten liitettiin Envinia carotovoran pektaattilyaasin PelB-signaalisekvenssi (Takkinen et ai, 1991) sekä raskaille että kevyille ketjuille. Kuuden histidiinin merkki (tag) lisättiin kevyiden 10 ketjujen C-päihin. Saatu plasmidi on pENA5-His.

ENA5SCFV yksiketjuisen vasta-aineen rakentamiseksi raskaiden ja kevyiden ketjujen muuntelevat domeenit monistettiin PCR:llä käyttäen pENA5His:ia templaattina.

Monistettu fragmentti kloonattiin pKKtac-vektoriin (Takkinen et ai. 1991), jolloin ! 15 satiin pENA5SCFV. pENA5SCFV-vektori sisältää koodittavan alueen ENA5SCFV

yksiketjuiselle vasta-aineelle, joka koostuu raskaiden ja kevyiden ketjujen muuntelevista domeeneista, jotka on yhdistetty glysiini-seriini-linkkerillä (Huston et ai 1988 ja 1991) ja C-pään 6 x histidiinitagin. Yksiketjuisen vasta-aineen transkriptiota ja eritystä säätelevät tae promoottori ja vastaavasti pelB signaalisekvenssi (Takkinen

I 1 M

, . 20 et ai. 1991).

. HFBI-ENA5SCFV fuusioproteiinin rakentamista varten pENA5SCFV pilkottiin •; · t NcoLlla ja Xbahlla. ena5scfv-geenin ja histidiinihännän (6 x His) sisältävä fragmentti • « , kloonattiin tylppäpäisenä pTNS29:ään, jolloin saatiin pTHl (kuvio 6). pTNS29- • » · 25 vektori sisältää T. reesein ttfbl:tä koodittavan alueen, jota seuraa linkkerisekvenssi : ’ · t; (ProGlyAlaSerThr SerThrGlyMetGlyProGlyGly) (SEQ ID No 5) cbh 1 -promoottori-•" ‘; ja terminaattorisekvenssien säätelyn alaisena.

» ! > I · · HFBI-ENA5SCFV fuusioproteiinin, joka sisältää trombiinipilkkomiskohdan ‘ . 30 linkkeripeptidissä, rakentamiseksi ena5scfv:tä koodittava alue (Ala-23:sta STOP-» · kodoniin) ja peptidilinkkeri, joka sisälsi trombiinin pilkkomiskohdan (Gly Thr Leu Vai Pro Arg Gly Pro Ala Glu Vai Asn Leu Vai) (SEQ ID No 6) edellään, monistettiin i 34 108863 PCR:n avulla käyttäen templaattina pENA5SCFV ja 5'-alukkeena GAA TTC GGT A CC CTC GTC CCT CGC GGT CCC GCC GAA GTG AAC CTG GTG (SEQ ID No 7) ja 3'-alukkeena TGA ATT CCA TAT GCT AAC CCC GTT TCA TCT CCA G (SEQ ID No 8). Lihavoitu sekvenssi 5'-alukkeessa koodittaa ENA5SCFV:n kuutta 5 ensimmäistä N-terminaalista jäännöstä. Kursivoitu sekvenssi on trombiinin pilkkomiskohta ja alleviivattu GGT ACC on Asp718-paikka. Lihavoitu sekvenssi 3'-alukkeessa koodittaa ENA5SCFV:n kuutta C-terminaalista aminohappoa ja alleviivattu CA TATG on Ndel-kohta. 790 ep:n PCR-ffagmentti puhdistettiin agaroosigeelistä ja ligoitiin pTNS29:ään, jolloin saatiin pTH2 (kuvio 7).

10

Trichoderma reesei -kanta VTT-D-99726 (QM9414 Ahfl>2) ko-transformoidaan olennaisesti kuten aiemmin on kuvattu (Penttilä et ai., Gene (1987) 61:155-164) ! käyttäen 10 pg plasmideja pTHl ja PTH2 ja selektioplasmidina 2 pg pTOC202:ta.

Saadut Amd+ -transformantit sivellään kaksi kertaa maljoille, jotka sisältävät 15 asetamidia. Sen jälkeen tehdään itiösuspensiot transformanteista, joita on kasvatettu Potato Dextrose agarilla (Difco).

Kahden HFBI-ENA5SCFV -fuusioproteiinin tuotanto testataan Westem-analyysillä , HFBI-spesifisellä vasta-aineella ja His-hännän vastaisella vasta-aineella » · , 20 ravistelupulloviljelmistä, joita on kasvatettu minimal-alustalla, johon on lisätty 3 % » ,, ’ laktoosia tai Solka flock selluloosaa ja mäskäysjätettä.

» · · • « : 1 *

Tehdään HFBI-ENA5 fuusioproteiinien erottelukokeet ATPSrllä käyttäen i · · polyoksietyleenidetergenttiä C12-18EO5 (Agrimul NRE 1205, Henkel) tässä 1 · 25 tutkimuksessa saatujen parhaiden tuotantokantojen ja kontrollikannan VTT-D-99726 :' , · (QM9414 Ahft>2) supematanttien kanssa, ja analysoidaan ne kuten esimerkissä 9 on kuvattu.

* · · » • » 35 108863

Kirj allisuusviitteet

Amtz, C. ja Tudzynski, P. (1997) Identification of genes induced in alkaloid-producing cultures of Claviceps sp.. Curr. Genet. 31: 357-360.

Bailey, M.J., Biely, P. ja Poutanen, K. (1992) Interlaboratory testing of methods for assays of 5 xylanase activity. 23:257-270.

Cameotra, S.S. ja Makkar, R.S. (1998) Synthesis of biosurfactants in extreme conditions. Appi. Microbiol. Biotechnol. 50:520-529.

Carpenter, C.E., Mueller, R.J., Kazmierczak, P., Zhang, L., Villalon, D.K. ja VanAlften, N.K. (1992) Effect of a virus on accumulation of a tissue-specific cell surface protein of the fungus 10 Cryphonectria (Endothia) parasitica. Mol. Plant-Microbe Interact. 4:55-61.

de Vries, O.M.H., Fekkes, M.P., Wosten, H.A.B. ja Wessels, J.G.H. (1993) Insoluble hydrophobin complexes in the walls of Schizophyllum commune and other filamentous fungi, Arch Microbiol. 159:330-335.

de Vries, O.M.H., Moore, S., Amtz, C, Wessels, J.G.H. ja Tudzynski, P. (1999) Identification 15 and characterization of a tri-partite hydrophobin from Claviceps fusiformis Eur. J. Biochem. 262:377-385.

Huston, J.S. et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85:5879-5883.

Huston, J.S., Mudgett-Hunter, M., Tai, M.-S., McCartney, J., Warren, F.,

Haber, E. ja Oppermann, H. (1991) Methods Enzymol. 203: 46-88.

20 Hyytiä, T., Selber, K., Qiao, M., Fagerström, R., Kula, M.-R., Nakari-Setälä, T. ja Penttilä, M., (1999). A novel strategy for protein production and purification in Trichoderma reesei.

6th International Trichoderma-Gliogladium Workshop. June 11-13,1999. Hanasaari, Finland.

; ·’ Kaartinen, M., Knowles, J.K.C. ja Teeri, T.T. (1991) An active single-chain antibody containing a cellulase linker domain is secreted by Escherichia coli. Protein Eng. 4:837-841 25 Kershaw, M.J. ja Talbot, N.J. (1998) Hydrophobins and repellents: proteins with fundamental roles in fungal morphogenesis. Fungal Gen. Biol. 23:18-33.

Lang, S. ja Wullbrandt, D. (1999) Rhamnose lipids - biosynthesis, microbial production and ..: application potential. Appi. Microbiol. Biotechnol. 51:22-32.

1 ·; Lora, J.M., de la Cruz, J., Betitez, T., Liobell, A. ja Pintor-Toro, J.A. (1994) A putative 30 catabolite-repressed cell wall protein from the mycoparasitic fungus Trichoderma harzianum.

• ·, Mol. Gen. Genet. 242:461 -466.

Lora, J.M., Pintor-Toro, J.A., Benitez, T. ja Romero, L.C.(1995) Mol. Microbiol. 18:377-382.

36 108863

Lowry, O.H., Rosebrough, N.H., Parr, A.L. ja Randell, R.J. (1951) Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193:265-275 IUPAC (1997) Measurement of cellulase activities. Pure Appi. Chem. 59:257-268 Munoz, G., Nakari-Setälä, T., Agosin, E. ja Penttilä, M. (1997).Hydrophobin gene srhl, 5 expressed during sporulation of the biocontrol agent Trichoderma harzianum. Curr. Genet. 32:225-230.

Nakari-Setälä, T., Aro, N., Kalkkinen, N., Alatalo, E. ja Penttilä, M. (1996). Genetic and biochemical characterization of the Trichoderma reesei hydrophobin HFBI. Eur. J. Biochem. 235:248-255.

10 Nakari-Setälä, T., Aro, N., Ilmen, M., Munoz, G., Kalkkinen, N. ja Penttilä, M. (1997). Differential expression of the vegetative and spore-bound hydrophobins of Trichoderma reesei·. cloning and characterization of the hft)2 gene. Eur. J. Biochem. 248:415-423.

Richter, M., Willey, J.M., Sussmuth, R., Jung, G. ja Fiedler, H.-P. (1998) Streptofactin, a j novel biosurfactant with aerial mycelium inducing activity from Streptomyces tendae. FEMS

I 15 Microbiol Lett 163:165-171.

j i Schuren, F.H.J. ja Wessels, J.G.H. (1990) Two genes specifically expressed in fruiting dikaryons of Schizsophyllum commune: homologgies with gene not regulated by mating-type genes. Gene 90:199-205.

Russo, P.S., Blum, F.D., Ipsen, J.D., Miller, W.G. ja Abul-Haki, Y.J. (1992) The surface 20 activity of the phytotoxin cerato-ulmin. Can. J. Bot. 60:1414-1422. j Takkinen, K., Laukkanen, M.-L., Sizmann, D., Alithan, K., Immonen, T., Vanne, L., Van der

Vegt, W., van der Mei, H.C., Wosten, H.A.B., Wessels, J.G.H. ja Busscher, H.J. (1996) A ; ' comparison of the surface activity of the fungal hydrophobin SC3p with those of other . proteins. Biophys Chem. 51:253-260.

'. _ 25 Van Tilbeurgh, H., Loonties, F.G., De Bruyne, C.K. ja Clayessens, M. (1988). Methods ;·. Enzymol. 160:45-59.

Wessels, J.G.H. (1994) Developmental regulation of fungal cell wall formation. Ann. Rev.

; Phytopathol. 32:413-437.

‘: Wessels, J.G.H. (1997). Hydrophobins: proteins that change the nature of the fungal surface.

.:. 30 Adv. Microbial Physiol. 38:1-45.

37 108863

Wessels, J.G.H, de Vries O.M.H., Äsgeirsdottir, S.A. ja Schuren F.H.J. (1991a) Hydrophobin genes involved in formation of aerial hyphae and fruit bodies in Schizophyllum commune. Plant Cell 3:793-799.

Wessels, J.G.H, de Vries O.M.H., Äsgeirsdottir, S.A. ja Springer, J. (1991b) The thn mutation 5 of Scizophyllum commune, which suppresses formation of aerial hyphae, affects expression of the Sc3 hydrophobin gene. J.Gen.Microbiol. 137:2439-2445.

Willey, J.M., Santamaria, R., Guijarro, J., Geislich, M. ja Losick, R. (1991) Extracellular complementation of a developmental mutation implicates a small sporulation protein in aerial mycelium formation by S. coelicor. Cell 65:641-650.

10 Wosten, H.A.B, de Vries, O.M.H. ja Wessels, J.G.H. (1993) Interfacial self-assembly of a fungal hydrophobin into a hydrophobic rodlet layer. Plant Cell 5:1567-1574.

Wosten, H.A.B., Schuren, F.H.J. ja Wessels, J.G.H. (1994a) Interfacial self-assembly of a hydrophobin into an amphipathic membrane mediates fungal attachment to hydrophobic surfaces. EMBO J 13:5848-5854.

15 Wosten, H.A.B., Äsgeirsdottir, S.A., Krook, J.H., Drenth, J.H.H. ja Wessels, J.G.H. (1994b) The fungal hydrophobin S'C3p self-assembles at the surface of aerial hyphae as a protein membrane constituting the hydrophobic rodlet layer. Eur. J. Cell. Biol. 63:122-129.

Wosten, H.A.B ja Wessels, J.G.W (1997) Hydrophobins, from molecular structure to multiple functios in fungal development. Mucoscience 38:363-374.

20 Wosten, H.A.B., van Wetter, A.-M., Lugones, L.G., van der Mei, H.C., Busscher, H.J. ja Wessels, J.G.H. (1999) How a fungus escapes the water to grow into the air. Current Biology I * I ·’/ 9:85-88.

I , . , J

> % »

I I I

Claims (21)

108863

1. Menetelmä vaahdonmuodostuksen vähentämiseksi mikro-organismin kasvatuksen aikana, tunnnettu siitä, että menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: 5. muunnetaan mikro-organismia siten, ettei mikro-organismi tuota olennaista määrää vähintään yhtä proteiineista, polypeptideistä tai peptideistä, jotka liittyvät vaahdonmuodostukseen kasvatuksen aikana; ja että kasvatuksen aikaiseen vaahdonmuodostukseen liittyvät proteiinit, polypeptidit tai peptidit ovat hydrofobiineja tai hydrofobiinin kaltaisia molekyylejä; ja 10 - kasvatetaan mikro-organismia sopivissa kasvatusolosuhteissa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaahdonmuodostukseen liittyvät proteiinit, polypeptidit tai peptidit ovat hydrofobiineja.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hydrofobiinit ovat Trichoderman HFB I ja/tai HFBII.

4. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1 - 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että muuntaminen käsittää mikro-organismin geneettisen muuntamisen. 20 ♦ .

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että geneettinen • · · ' muuntaminen käsittää vähintään yhden vaahdonmuodostukseen liittyvän proteiinin, ♦ # ♦ polypeptidin tai peptidin tuotantoa säätelevää proteiinia, polypeptidiä tai peptidiä koodittavan . ·: ·. DNA-sekvenssin geneettisen muuntamisen. • ♦ · ;‘:25

6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että geneettinen •: · · · muuntaminen käsittää vähintään yhtä vaahdonmuodostukseen liittyvää proteiinia, polypeptidiä · tai peptidiä koodittavan geenin säätelyalueen geneettisen muuntamisen. • · * ;·“Μ)

7. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että geneettinen :. ’. § muuntaminen käsittää vähintään yhtä vaahdonmuodostukseen liittyvää proteiinia, polypeptidiä • · ....: tai peptidiä koodittavan DNA-sekvenssin geneettisen muuntamisen. 108863

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että geneettinen muuntaminen käsittää vähintään yhtä vaahdonmuodostukseen liittyvää proteiinia, polypeptidiä tai peptidiä koodittavan DNA-sekvenssin inaktivoinnin. 5

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että geneettinen muuntaminen käsittää vähintään yhtä vaahdonmuodostukseen liittyvää proteiinia, polypeptidiä tai peptidiä koodittavan DNA-sekvenssin deleetion.

10. Tuotantoisäntäkanta, tunnettu siitä, että isäntäkantaa on geneettisesti muunnettu siten, ettei se tuota olennaista määrää vähintään yhtä muuntamattoman tuotantoisäntäkannan kasvatuksen aikaiseen vaahdonmuodostukseen liittyvää proteiinia, polypeptidiä tai peptidiä ja että kasvatuksen aikaiseen vaahdonmuodostukseen liittyvät proteiinit, polypeptidit tai peptidit ovat hydrofobiineja tai hydrofobiinin kaltaisia molekyylejä. 15

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen tuotantoisäntäkanta, tunnettu siitä, että i vaahdonmuodostukseen liittyvät proteiinit, polypeptidit tai peptidit ovat hydrofobiineja.

12. Patenttivaatimuksen 10 tai 11 mukainen tuotantoisäntäkanta, tunnettu siitä, että 20 kanta on sienikanta.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen tuotantoisäntäkanta, tunnettu siitä, että * « « ‘ _ . isäntäkanta on Trichoderma-kanta. * » ♦ , ;2£

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen tuotantoisäntäkanta, tunnettu siitä, että proteiinit » 1 · ovat Trichodermcm HFBI tai HFBII tai molemmat. 1'

‘; 15. Patenttivaatimuksen 10 tai 11 mukainen tuotantoisäntäkanta, tunnettu , ·. ; siitä, että isäntäkanta on bakteerikanta. .-30 Λ

16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen tuotantoisäntäkanta, tunnettu siitä, että kanta on ,,,,,· Streptomyces spp. -kanta tai E. coli -kanta. 108863

17. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 10-16 mukainen tuotantoisäntäkanta, tunnettu siitä, että isäntäkantaa on - geneettisesti muunnettu siten, ettei se tuota olennaista määrää vähintään yhtä 5 muuntamattoman tuotantoisäntäkannan kasvatuksen aikaiseen vaahdonmuodostukseen liittyvää proteiinia, polypeptidiä tai peptidiä että kasvatuksen aikaiseen vaahdonmuodostukseen liittyvät proteiinit, polypeptidit tai peptidit ovat hydrofobiineja tai hydrofobiinin kaltaisia molekyylejä; ja että isäntäkantaa on - muunnettu niin, että se kykenee tuottamaan kiinnostuksen kohteena olevaa tuotetta. 10

18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen tuotantoisäntäkanta, tunnettu siitä, että kiinnostuksen kohteena oleva tuote on proteiini tai metaboliitti tai biomassaa.

19. Patenttivaatimuksen 17 mukainen tuotantoisäntäkanta, tunnettu siitä, että 15 kiinnostuksen kohteena oleva tuote on rekombinantti-tuote.

20. Patenttivaatimuksen 17 mukainen tuotantoisäntäkanta, tunnettu siitä, että I isäntäkantaa on geneettisesti muunnettu siten, että se kykenee tuottamaan fuusiomolekyyliä, | joka käsittää kiinnostuksen kohteena olevan molekyylin fuusioituna hydrofobiiniin. 20 • · * · .

, 21. Menetelmä tuotteen tuottamiseksi mikro-organismia kasvattamalla, tunnettu siitä, • · f ,' että menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: • I 4 [ _ . - kasvatetaan vaatimusten 10 - 20 mukaista tuotantoisäntäkantaa sopivissa • · , ·: ·, kasvatusolosuhteissa j a • · · , : '25 - otetaan tuote talteen viljelmästä. > I I * •tilf > f I • I * · » ; " ;30 4, 1 08863