KR20140019406A - 거품 제어 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 거품 형성 감소 및 미생물에서 생물계면활성제의 발현의 최대화를 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 미생물로부터의 생물계면활성제를 침전시켜 거품 형성을 감소시키는 결과를 생성하는 것을 포함한다.

Description

거품 제어 방법{METHODS OF FOAM CONTROL}

관련 응용 및 참고 문헌로서의 통합 내용

본 출원은 2011년 3월 29일 출원된 미국 특허 가출원 일련번호 61/469,067호 및 2012년 3월 28일 출원된 미국 특허 가출원 일련번호 13/433,036호를 우선권으로 주장한다. 2009년 6월 9일 출원된 국제 특허 출원 일련번호 PCT/US2009/046783호 [2009년 12월 17일, PCT 공보 번호 WO 2009/152176로 공개] 및 2010년 8월 10일 출원된 PCT/US2010/044964호 [2011년 2월 17일, PCT 공보 번호 WO 2011/019686로 공개]를 참고한다.

전술한 출원 및 거기 인용된 또는 그의 진행 동안의 모든 문서들 ("출원 인용문서") 및 상기 출원 인용문서에서 인용 또는 참조된 모든 문서, 및 명세서에서 또는 참조된 모든 문서 ("본 명세서에서 인용된 문서"), 및 본 명세서에서 인용된 문서에서 인용 또는 참조된 모든 문서와 함께, 본 명세서 또는 본 명세서에서 참고문헌으로 통합된 임의의 문서에서 언급된 임의의 제조자 설명서, 설명, 제품 명세서, 및 임의의 제품에 대한 제품 설명서(product sheets)는 이로써 본 명세서에 참고문헌으로서 통합되며, 본 발명의 실시에 사용될 수 있다 더욱 구체적으로, 모든 참고문헌은, 개별적인 각 문서가 특이적이고 개별적으로 참고문헌으로 통합되는 것으로 나타나는 것과 같이, 동일한 수준으로 참고문헌으로서 통합된다.

본 발명은, 숙주 세포가 세포 밖으로 생물계면활성제(biosurfactant)를 분비하고, 생물계면활성제가 발효 매질 중에 가용성인 경우, 발효 매질 중에서 숙주 세포에 의한 그 생산 동안 거품을 형성하는 생물계면활성제의 거품형성 제어 방법에 관한 것이다. 본 방법은 숙주 세포에 의한 생물계면활성제의 생산과 동시에, 생물계면활성제를 불용화시키는 것을 포함하거나 또는 불용화시키는 것으로 본질적으로 이루어진다. 이러한 방식으로, 불용화된 생물계면활성제가 거품을 형성하지 않음에 따라 거품형성이 제어된다. 이 방법에 의하여, 거품 감소 지수는 1 초과, 및/또는 거품 감소 지수는 2 초과, 및/또는 거품 감소 지수는 3 초과이다. 유사하게, 이 방법에 의하여 추가적 또는 선택적으로, 발효 매질 중 가용성 생물계면활성제의 농도는 약 1 g/㎏ 이하이다. 추가적 또는 선택적으로; 및/또는 생산된 생물계면활성제의 적어도 25%는 불용화된다. 추가적 또는 선택적으로, 본 방법은 거품억제제(antifoam)의 첨가 없이 수행되거나; 또는 생물계면활성제를 불용화하지 않으면서 사용될 수 있는 거품억제제의 양을 감소시키는 능력, 예컨대 생물계면활성제를 불용화하지 않으면서 사용될 수 있는 거품억제제의 양에서 25% 또는 30% 또는 40% 50% 또는 60% 또는 65% 또는 70% 또는 75% 또는 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 초과로 감소시키는 능력을 제공한다. 또한, 추가적 또는 선택적으로, 본 발명은 배치 또는 유가식(fed-batch) 방식으로 수행될 수 있는 한편, 본 발명은 유리하게는 연속적인 이러한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 유리하게는 생물계면활성제가 하이드로포빈(hydrophobin), 예컨대 하이드로포빈 II인 그런한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 유리하게는 생물계면활성제가 당지질, 예컨대 람노리피드(rhamnolipid) 및 소포로리피드(sophorolipid), 또는 지질펩티드, 예컨대 서팩틴(surfactin)인 그러한 방법에 관한 것이기도 하다. 나아가 본 발명은, 본 발명의 방법, 특히 본 발명의 연속적 방법을 수행하기 위한 장치에 관한 것이다. 나아가 본 발명은, 생물계면활성제의 불용화가, 예컨대 염, 알코올, 수 혼화성 유기용매, 수용성 중합체 또는 양이온성 중합체와 같은 침전제를 첨가함으로써, 또는 pH를 변화시키거나 온도를 변화시킴으로서 유도되는 것인, 본 발명의 방법에 관한 것이다.

계면활성제는 각종 산업용으로 널리 사용되는 화학물질이며, 주로 화학적으로 합성된다. 각종 미생물에 의하여 생산된 계면활성제는, 대응되는 합성 계면활성제보다 더욱 높은 생분해성 및 더욱 낮은 독성 프로파일과 같은 독특한 성질로 인하여 관심을 끌고 있다. 그러나, 이러한 생물학적으로 생산된 계면활성제의 이용성 및 비용은, 부분적으로는, 효율적 생산 방법의 결여로 인하여 제한된다.

산업적 규모의 단백질 또는 효소 생산을 위한 효율적인 시스템은 호기성 침수 발효(submerged fermentation)에 이어서 관심 대상의 생성물(들)을 분리하기 위한 수계 회수 단계에 의한 것이다. 그러나, 거품 제어가 효율 달성에 결정적이다.

거품형성은 화학 산업, 특히 생화학 공정에서 심각한 문제이다. 거품은, 특히 공기-액체 계면 부근에서 현저한 전단력을 수반하는 공정, 예컨대 통기, 펌핑 또는 교반을 수반하는 공정에서, 계면활성제 및 단백질과 같은 각종 성분들의 제조시에 원치 않는 결과물로서 종종 생산된다. 호기성 침수 발효는, 미생물이 성장하고, 관심 대상 생성물을 생산하는데 요구되는 산소를 공급하기 위해, 적절한 통기에 의존한다. 미생물에 요구되는 산소를 제공하기 위한 발효 배양액 내로의 공기 도입은 거품을 생성한다. 발효 동안 거품의 존재는 일반적으로 그 수행능에 부정적인 영향을 가지며, 이는 발효기 작업 부피 또는 생산성의 감소, 및 환기구 또는 파이프를 통하여 발효기(fermentation vessel)에서 나오기에 충분한 높이로 액체 발효 배양액 위에서의 거품 기둥 또는 거품 헤드(foam head)의 생산과 같이, "거품 넘침(foam out)"과 관련된 오염의 위험을 포함한다.

거품억제제 또는 소포제와 같은 첨가제는 발효 동안 거품 형성을 완화시키는데 일반적으로 사용된다. 필요에 따라, 거품억제제는 거품을 제어하기 위하여 회수 단계 동안 첨가된다. 일부 회수 공정, 특히 막-기재 분리 공정은, 거품억제제의 존재에 의하여 부정적인 영향을 받는다. 단백질 또는 효소의 최종-이용 응용분야에 따라, 그의 생산 공정 동안 이용된 거품억제제는 제거될 필요가 있거나 또는 없을 수 있다.

그러나, 화학적 방법의 거품 제어는, 특히 제품 품질이 매우 중요한, 식품, 사료 및 제약 산업에서 이들이 일으킬 수 있는 문제(즉, 오염, 물질 이동의 감소)와 관련하여 항상 바람직한 것은 아니다. 거품억제제는 일반적으로 소수성이기 때문에, 이것은 멸균이 어렵고, 이는 식품 및 제약 산업에서 문제가 될 수 있다. 추가적으로, 이들 산업에서의 규제 필요조건은 거품억제제 및 소포제에서의 이용에 적합한 화학물질들을 제한한다.

유감스럽게도, 산업적 규모의 단백질 또는 효소 생산을 위한 기존의 호기성 침수 발효 및 회수 공정은 생물계면활성제, 즉 생물학적으로 생산된 계면활성제 분자의 생산에 효율적으로 적용될 수 없다. 이들 분자의 계면활성성은, 동일한 배양 조건 하에서, 생물계면활성제 분자를 발현하지 않는 동일 미생물이 일으킬 수 있는 것에 비하여, 발효 배양액에서 더욱 많은 거품을 일으킬 것이다.

거품억제제의 첨가는 일반적으로 이러한 문제에 대해 만족스러운 해결책이 아니다. 과다한 거품 형성을 방지하는데 필요한 거품억제제의 많은 양 뿐만 아니라, 계면활성제가 타겟 응용에서 의도되는 것과 같은 기능을 하도록 하는데 거품억제제의 제거가 일반적으로 요구된다. 일부 경우들에서, 많은 양의 거품억제제의 추가 및 발효기 부피의 비교적 낮은 작업 백분율에서의 작동은, 거품형성을 제어하는데 효과적이지 않다. 과다한 거품형성 및 거품억제제의 이용에 의해 제어되지 않는 거품형성과 관련된 도전과제는 다운스트림 회수 단계에서 계속된다. 계면활성제는 그의 세정성에 대한 요구 때문에, 생산 단계 동안 첨가된 거품억제제는 일반적으로 제거되어야만 한다.

본 출원 중 임의의 문서의 인용 또는 확인은, 그러한 문서가 본 발명의 선행 기술로서 이용가능하다는 것을 허가하는 것은 아니다.

본 발명은 부분적으로는, 발효 배양액에의 침전제 첨가가, 생물학적으로 발현되는 계면활성제의 침전뿐 아니라 거품형성에서의 감소라는 결과를 생성한다는 [여기에서 거품은 다시 되돌아가지 않음] 출원인의 놀라운 발견을 기초로 한 것이다.

본 발명은, 미생물에 의하여 발현된 하나 이상의 계면활성제를 포함할 수 있는 수용액의 생산시 거품 제어에 관한 방법 및/또는 이용을 설명한다. 이는 이러한 거품 형성 계면활성제가 불용성으로 되도록 하는, 용액의 적절한 컨디셔닝에 의하여 달성될 수 있다. 적절한 컨디셔닝은 침전, 결정화 및/또는 계면활성제를 불용성으로 만들거나 임계 마이셀(micelle) 농도를 감소시키는 기타 다른 조작을 포함할 수 있다.

본 발명은 숙주 세포가 세포 밖으로 거품형성 생물계면활성제를 분비하고 생물계면활성제가 발효 매질 중에 가용성인 경우, 발효 매질 중에서 숙주 세포에 의한 그 생산 동안 거품을 형성하는 생물계면활성제의 거품형성 제어 방법 및/또는 거품형성 제어의 이용을 포함하는 것으로서, 숙주 세포에 의한 생물계면활성제의 생산과 동시에, 생물계면활성제를 불용화하고, 그로써 불용화된 생물계면활성제가 거품을 형성하지 않음에 따라 거품형성이 제어되는 것을 포함할 수 있다.

본 발명은 숙주 세포가 세포 밖으로 생물계면활성제를 분비하고 생물계면활성제가 발효 매질 중에 가용성인 경우, 발효 매질 중에서 숙주 세포에 의한 그 생산 동안 거품을 형성하는 생물계면활성제의 거품형성 제어 방법 및/또는 거품형성 제어의 이용을 포함하는 것으로서, 숙주 세포에 의한 생물계면활성제의 생산과 동시에, 생물계면활성제를 불용화하고, 그로써 불용화된 생물계면활성제가 거품을 형성하지 않음에 따라 거품형성이 제어되는 것을 포함할 수 있으며, 여기에서 거품 감소 지수는 1초과, 및/또는 거품 감소 지수는 2초과, 및/또는 거품 감소 지수는 3 초과이고; 및/또는 발효 매질 중 가용성 생물계면활성제의 농도는 약 1 g/㎏ 이하이고; 및/또는 생산된 생물계면활성제의 적어도 25%는 불용화되고; 및/또는 본 방법은 거품억제제의 첨가 없이 수행되고; 및/또는 본 방법은 생물계면활성제의 불용화없이 수행된 방법에 비하여, 감소된 양의 거품억제제를 이용하여 수행된다.

본 발명은 공정 조건의 적절한 선택을 통하여 생물계면활성제의 가용성 농도를 감소시킴에 의한, 용액 중에 있는 경우 생물계면활성제에 의하여 유발되는 거품 형성의 감소 또는 제거를 위한 방법 및/또는 이용을 제공한다. 생물계면활성제의 감소된 용해도를 결과로서 초래하는 공정 조건은 그 생물계면활성제의 성질에 따라 달라진다. 이러한 공정 조건은 온도 및/또는 압력과 같은 물리적 조건의 적절한 선택을 포함할 수 있다. 이러한 공정 조건은 생물계면활성제가 존재하는 액체 매질 중의 화학 조성을 더 포함할 수 있다. 이러한 조성물의 가능한 선택은 다양하며, 생물공정(bioprocessing)의 숙련자에게 공지되어 있다. 용해도 조건을 조절하기 위한 화학적 접근방법은 생물계면활성제를 불용화하는 첨가제의 이용을 포함하며, 이는 pH 버퍼 화학물질, 무기 또는 유기산 또는 염기의 염, 알코올, 유기용매, 중합체, 폴리올, 단백질, 흡착제, 핵산, 지질을 포함한다. 이러한 용해도 조절 화학물질의 리스트는 배타적이거나 또는 제한적인 것으로 의도되지 않는다.

본 발명은, 본 명세서에서 제공된 거품 제어 또는 그의 측면(들)을 포함하는 생물계면활성제 제조 방법 및/또는 이용도 포함한다.

따라서, 본 발명은 현장 불용화 또는 발현과 동시적인 불용화, 예를 들어, 미생물에 의하여 발현된 계면활성제(들) 또는 생물계면활성제의 현장 불용화에 관한 것으로, 이는 현장 불용화 또는 발현과 동시적인 불용화, 생물계면활성제의 현장 불용화를 포함하는 생물계면활성제 제조를 위한 배치 공정(들) 또는 연속 공정(들)을 포함한다. 불용화는 침전, 결정화 [EP1320595 Yoneda 등; Syldatk 등/1984; Desai 등/1993로 인함] 및/또는 계면활성제를 불용화하거나 임계 마이셀 농도를 감소시키는 임의의 기타 조작에 의한 것일 수 있다. 유리하게는, 불용화는 예컨대 염, 알코올, 수혼화성 유기 용매, 수용성 중합체 또는 양이온성 중합체 (예컨대, 이에 제한되지는 않지만, C581)와 같은 침전제를 첨가하는 것을 포함하거나 또는 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 불용화는 예컨대 pH 감소와 같은 pH 조절을 포함하거나 또는 이로 본질적으로 이루어진다. 불용화는 예로서, 온도 상승 또는 가열과 같은, 온도 및/또는 압력 조절을 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다. 특히 유리한 실시양태에서, 생물계면활성제 제조에서 거품억제제의 이용은 감소되거나 또는 아주 회피된다. 유리한 실시양태에서, 생물계면활성제, 예로서 하이드로포빈 II와 같은 하이드로포빈은 용액 중에 약 0.1 g/㎏ 미만의 농도로 존재한다.

본 발명은 거품 형성을 일으킬 수 있는 조건점에서, 생물계면활성제의 생산 동안 동시적으로 생물계면활성제를 불용화하는 것을 포함할 수 있고, 이로써 불용화된 생물계면활성제가 거품을 형성하지 않음에 따라, 거품형성이 제어되는, 생산 동안 거품을 형성하는 용액 중에서 생물계면활성제의 거품형성을 제어하기 위한 방법 및/또는 이용에도 관한 것이다.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포에 의한 용액 중 생물계면활성제의 생산과 동시에, 생물계면활성제를 불용화시키고, 거품형성을 제어하는 것을 포함할 수 있는, 생산 동안 거품을 형성하는 생물계면활성제의 거품 형성 제어 방법 및/또는 이용에도 관한 것으로, 상기 거품 형성은 하기와 같이 되도록 제어된다: 거품 감소 지수는 1 초과, 및/또는 거품 감소 지수는 2 초과, 및/또는 거품 감소 지수는 3 초과; 및/또는 용액 중 가용성 생물계면활성제의 농도는 약 1 g/㎏ 이하; 및/또는 생산된 생물계면활성제의 적어도 25%는 불용화됨; 및/또는 본 방법은 거품억제제의 첨가 없이 수행됨; 및/또는 본 방법은 불용화 없이 수행된 방법에 비교하여, 감소된 양의 거품억제제를 이용하여 수행됨.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 조성물 중 조건이 하기와 같이 되도록 조절하여 거품 형성을 감소시키는 것을 포함할 수 있는, 조성물의 조건을 제어하여 생물계면활성제의 생산 동안 거품을 감소시키는 것을 포함할 수 있는 생산 동안 생물계면활성제의 거품 형성을 제어하기 위한 방법 및/또는 이용에 관한 것이다: 거품 감소 지수는 1 초과, 및/또는 거품 감소 지수는 2 초과, 및/또는 거품 감소 지수는 3 초과; 발효 매질 중 가용성 생물계면활성제의 농도가 약 1 g/㎏ 이하; 및/또는 생산된 생물계면활성제의 적어도 25%는 불용화됨; 및/또는 본 방법은 거품억제제의 첨가 없이 수행됨; 및/또는 본 방법은 불용화 없이 수행된 방법에 비교하여, 감소된 양의 거품억제제를 이용하여 수행됨; 및/또는 본 방법은 약 4.0의 pH에서 수행됨.

본 발명의 이익은, 발효, 회수, 조제, 저장, 취급 및 수송을 포함하는 생물계면활성제 가공의 모든 단계에 적용된다. 구체적으로, 이익은 이에 제한되지는 않지만 혼합, 펌핑 및 가스의 방출과 같은 통기를 포함하는 생물계면활성제 가공 단계에 특히 적용된다.

본 발명은 나아가, 본 명세서에 기재된 것과 같은 방법(들) 또는 공정(들) 또는 측면(들)의 실시에 사용된 것을 포함하여, 본 명세서에 기재된 것과 같은 장치를 고려한다.

따라서, 본 발명의 목적은 이전에 알려진 임의의 생성물, 그 생성물의 제조 공정, 또는 그 생성물의 이용방법을 본 발명중에 포함하지 않도록 하는 것으로, 본 출원인이 본 권리를 소유하고 이에 의하여 이전에 알려진 임의의 생성물, 공정 또는 방법에 대한 권리포기를 개시한다. 나아가, 본 발명은, USPTO (35 U.S.C. §112, 첫번째 단락) 또는 EPO (EPC 83항)의 기재된 설명 및 가능화 필요조건을 만족시키지 않는 임의의 생성물, 공정 또는 그 생성물의 제조 또는 그 생성물의 이용 방법을 본 발명의 범주 내에 포함시키고자 하는 것이 아님에 유의하여, 본 출원인이 그 권리를 소유하고 이에 의하여 이전에 알려진 임의의 생성물, 그 생성물의 제조 공정, 또는 그 제품의 이용 방법에 대한 권리포기를 개시한다.

본 개시내용에서, 그리고 특히 특허청구의 범위 및/또는 단락에서, "포함한다(comprises)", "포함된", "포함하는" 등과 같은 용어는 미국 특허법에서 이에 속하는 것으로 고려된 의미를 가질 수 있으며; 예로서, 이들은 "포함하다(includes)", "포함된", "포함하는" 등을 의미할 수 있고; "본질적으로 이루어지는" 및 "본질적으로 이루어진다"와 같은 표현은 미국 특허법에서 이에 주어진 의미를 가질 수 있으며, 예로서 이들은 명백히 상술되지 않은 성분들을 허용하지만, 선행 기술에서 발견되거나 본 발명의 기본적이거나 신규한 특징에 영향을 미치는 성분들은 제외된다.

어느 정도로 이용가능한 기술인, 미국 특허공개공보 제 20100151525호 및 그에 균등한 임의의 문서에 대하여, 예로서 주제 대상(subject matter) 및/또는 특허법(예로서, EP08171868로부터의 우선권이 있거나 또는 그를 주장하거나, 또는 그와 동일한 군에 속함으로써)에 의한 구분을 위하여, "본질적으로 이루어지는" 및 "본질적으로 이루어진다"의 이용이 특히 언급된다. 예로서, 상기 발명에서 카라기난의 임의의 이용은 pH 감소, 특히 예로서 3.0 또는 3.5 미만으로 감소 및/또는 이온 강도의 조절을 수반할 필요는 없고; 그리고, pH의 임의의 감소가 카라기난의 이용 및/또는 이온 강도의 조절을 수반할 필요는 없으며, 이온 강도의 임의의 조절이 pH 감소 및/또는 카라기난 이용을 수반할 필요는 없다. 그러므로, "본질적으로 이루어진다" 및 "본질적으로 이루어지는"이라는 표현은 카라기난의 첨가 및 3.5 또는 3 미만의 pH 를 갖는 것, 또는 카라기난의 첨가, 3.5 또는 3 미만의 pH를 갖는 것 및 이온 강도를 조절하는 것과 같은 선행 기술의 요소들은 배제한다.

특히 기술분야일 수 있는 임의의 문서 내에 있는 특정 용어는 배제시키고자 함도 언급되어야 하겠다. 예로서, '생물계면활성제'라는 용어는 PCT 공보번호 WO 2009/152176호의 효소 주제 대상은 특히 배제하고자 하는 것이다. 유사하게, 첨가된 거품억제제 없이 또는 부재하에서의 실시라는 표현은, 거품억제제(들)의 존재 또는 첨가를 허용하는 문서들, 예로서 미국 특허 공개공보 번호 제 20100291630호 및 그에 균등한 임의의 문서와 구분하고자 하는 것이다.

이들 및 기타 실시양태는 하기 발명의 상세한 설명에 의하여 개시 또는 명백해지며, 이에 포함된다.

예로서 제공된 하기 상세한 설명은, 본 발명을 설명된 특정 실시양태에만 제한하고자 하는 것은 아니며, 첨부된 도면과 연결하여 최선으로 이해될 수 있다.
<도 1>
도 1은, 혼합 후 하이드로포빈 용액 (왼쪽) 및 혼합 및 가열처리된 후 하이드로포빈 용액 (오른쪽)을 나타낸다.
<도 2>
도 2는 변형된 발효법을 이용하여 생산된 하이드로포빈의 MALDI-TOF 스펙트럼을 나타낸다. 7180에서의 피크는 전장 하이드로포빈 분자에 대응한다.
<도 3a 및 3b>
도 3a 및 3b는 대표적인 생물반응기를 나타낸다. 세포, 매질 및/또는 영양소는 유입구 (102)를 통하여 반응기 (100)로 제공될 수 있다. 유입구 (102)는 생물 및/또는 매질의 용기로의 전달을 제어하는데 사용되는 밸브 (104)를 포함할 수 있다. 세포 및 매질은 유입구 (102)를 통하여 제공될 수 있다. 다수의 센서 (106)는 반응기 (100) 전체에 걸쳐 여러 위치에 배치될 수 있다. 센서 (106)는 제어기 (108, 110)에 데이터를 제공한다. 제어기 (108, 110)는 세포, 매질, 영양소, 침전제 및/또는 기타 성분의 양을 제어할 수 있다. 침전된 성분은 센서 (106)를 이용하여 검출될 수 있다. 일부 실시양태에서, 반응기 (100)에는 창 (116)이 존재하여 이용자가 반응기 내의 조건을 관찰하도록 할 수 있다. 제어기 (108)는 배출 밸브 (112)에 연결된다. 제어기 (110)는 밸브 (112)가 열려서 침전물이 배출구 (114)를 통하여 탱크에서 나가도록 지시할 수 있다. 일부 실시양태에서, 사용자 입력은 밸브 (112)를 필요에 따라 개방 및/또는 폐쇄하도록 지시하여 제어하는 것을 가능하게 할 수 있다. 영양소는 유입구 (118)를 이용하여 반응기에 제공될 수 있다. 유입구 (118)는 전달 장치 (120)에 커플링되어 반응기 (100)에 영양소를 제공할 수 있다. 일부 실시양태는 믹서 (122)를 포함하여 반응기 내 성분들의 혼합을 촉진시킨다.
<도 4>
도 4는 실시예 20에 설명된 것과 같은 염화칼슘 처리 후 측정된, 서팩틴을 함유하는바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 발효 배양액 중 거품 형성에서의 감소를 나타낸다.
[발명의 상세한 설명]
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자에 의하여 일반적으로 이해되는 것과 같은 동일한 의미를 갖는다. 하기 약어 및/또는 용어는 명확성을 위해 정의된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "생물계면활성제" 또는 "생물학적으로 생산된 계면활성제"는 거품형성을 유발하는 물질에 속한다. 생물계면활성제 또는 생물학적으로 생산된 계면활성제는, 예컨대 물과 소수성 액체간, 또는 물과 공기간의 계면장력과 같은 표면장력을 감소시킬 수 있으며, 생물학적 계로부터 생산될 수 있거나 또는 수득될 수 있다. 생물계면활성제 또는 생물학적으로 생산된 계면활성제는 단백질, 당지질, 지질펩티드, 지단백질, 인지질, 중성 지방 또는 지방산일 수 있다. 생물계면활성제는 하이드로포빈을 포함한다. 생물계면활성제는 지질펩티드 및 지단백질, 예컨대 서팩틴, 펩티드-지질, 세라웨틴(serrawettin), 비스코신(viscosin), 서브틸리신(subtilisin), 그라미시딘(gramicidin), 폴리믹신(polymyxins)을 포함한다. 생물계면활성제는, 예컨대 람노리피드, 소포로리피드, 트레할로리피드 및 셀로비오리피드(cellobiolipid)와 같은 당지질을 포함한다. 생물계면활성제는, 예컨대 에멀산(emulsan), 바이오다이스퍼산(biodispersan), 만난-지질-단백질, 리포산(liposan), 탄수화물-단백질-지질, 단백질 PA와 같은 중합체를 포함한다. 생물계면활성제는 소포 (vesicle)와 같은 미립자, 섬모(fimbriae), 및 전체 세포를 포함한다. 생물계면활성제는 사포닌과 같은 글리코시드를 포함한다. 생물계면활성제는 피브로인과 같은 섬유상 단백질을 포함한다. 생물계면활성제는 자연 발생적일 수 있거나, 또는 자연에서 발견되지 않는 돌연변이 유발된 또는 유전적으로 조작된 변이체일 수 있다. 이는, 본 발명에 따라 생물계면활성제 용해도 저하에 의한 거품형성 제어를 돕기 위하여, 더욱 낮은 용해도로 조작된 생물계면활성제 변이체를 포함한다. 생물계면활성제는 이에 제한되지는 않지만, 본 명세서에 설명된 것과 같은, 관련 생물계면활성제, 유도체 생물계면활성제, 변이성 생물계면활성제 및 동종성 생물계면활성제를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "생물학적 계"는 미생물, 식물, 진균, 곤충, 척추동물 또는 합성 생물학에 의하여 창출된 생물형태와 같은 살아있는 생물을 포함하거나 또는 이로부터 유래된다. 살아있는 생물은, 고전적인 육종(breeding), 클론 선발, 돌연변이유발 및 유전적 다양성을 창출하기 위한 유사한 방법들에 의하여 수득되는 자연에서 발견되지 않는 변이체일 수 있거나, 또는 이는 재조합 DNA 기술에 의하여 수득된 유전적으로 조작된 생물일 수 있다. 살아있는 생물은 그 전체로 사용될 수 있거나, 또는 기관 배양, 식물 재배품종(cultivar), 현탁 세포 배양, 부착 세포 배양 또는 무세포 제제와 같이 성분의 공급원일 수 있다.
생물학적 계는, 이 계가 생물계면활성제를 격리시키는 경우, 살아있는 세포를 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있다. 생물학적 계는 천연의 공급원으로부터 발견 및 채집될 수 있으며, 이는 경작, 재배될 수 있거나, 또는 이는 산업 조건 하에서 성장될 수 있다. 생물학적 계는 전구체 또는 공급된 영양소로부터 생물계면활성제를 합성할 수 있거나, 또는 그의 환경으로부터 생물계면활성제를 풍부화할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "생산"은 화학적 및 생물학적 생성물의 생산을 위한 제조방법에 관한 것으로, 이에 제한되지는 않지만, 이는 수확, 채집, 압착, 방혈(exsanguination), 잘게 자름(maceration), 균질화, 매싱(mashing), 달임(brewing), 발효, 회수, 고체 액체 분리, 세포 분리, 원심분리, 여과 (예컨대, 진공 여과), 조제, 저장 또는 운송을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "생산 조건"은 본 발명의 방법에 포함된 용매 및/또는 물리적 파라미터의 선택 (예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 온도, 압력, 혼합 또는 pH)을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "용매" 또는 "용액"은, 이에 제한되지는 않지만, 신체 일부, 식물 단편, 살아있거나 또는 죽은 세포와 같은 불용성 생물계면활성제 외의 현탁입자를 포함할 수 있는 액체에 관련된다 [EP1320595 Yoneda 등.; Syldatk 등./1984; Desai 등./1993에 기인].
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "가용성"은 용매 또는 용액에 용해되는 물질에 관련된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "거품"은 액체, 겔 또는 반고체 중에 기포들을 트랩시킴으로써(trapping) 형성되는 물질에 관련된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "오버런(overrun)"은 거품형성된 용액의 부피에서 초기 부피를 빼고, 초기 부피로 나눈 계산 값으로, 분수 또는 백분율로서 나타낸다. 오버런이 0이라 함은 용액이 어떤 거품도 포함하지 않음을 의미한다. 0에 가까운 수는 용액이 매우 적은 거품을 갖는다는 것을 의미한다. 초기 샘플이 이미 거품을 갖는 경우에는, 계산에서 초기 부피는 초기 중량으로 대체한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "거품 감소 지수" 또는 "거품 제어 지수" 또는 "거품 넉아웃(knockout) 지수"는 거품 제어처리 효과의 척도이다. 이는 처리된 용액에 대한 미처리된 용액의 오버런 비율이다. 약 1에 균등한 거품 감소 지수는 미처리 및 처리된 생물계면활성제 용액이 동일한 오버런을 갖는다는 것을 의미하며, 다시말하면, 처리가 어떤 개선도 제공하지 않는다는 것이다. 1 초과의 임의의 수는 거품 감소가 있음을 의미하며, 처리는 개선을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "거품 제어", "거품 감소" 또는 "거품 넉아웃"은 거품을 방지 또는 저지 또는 소실 또는 파괴시킴으로써 용액 중 거품을 감소시키는 작용에 관련된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "폴리펩티드" 및 "단백질"이라는 용어는, 펩티드 결합에 의하여 연결된 아미노산 잔기들을 포함하는 임의의 길이의 중합체를 지칭하는 것으로, 상호전환가능하게 사용된다. 아미노산 잔기에 대한 기존의 1문자 또는 3문자 코드가 본 명세서에서 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있으며, 이는 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 비-아미노산에 의하여 차단될 수 있다. 이 용어는 천연적으로 변경되거나 또는 개재, 예로서, 2황화물 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 포스포릴화, 또는 임의의 기타 조작 또는 변형, 예컨대 라벨링 성분과의 컨쥬게이션에 의하여 변경된 아미노산 중합체도 포함한다. 예로서, 아미노산의 하나 이상의 유사체를 포함하는 폴리펩티드 (예로서, 비천연 아미노산인 D-아미노산, 등 포함) 및 본 기술 분야에 알려진 기타 변형물도 본 정의에 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "배양 용액"은 관심 대상의 생물계면활성제 및 기타 가용성 또는 불용성 성분을 포함하는 액체이다. 이러한 성분은 기타 단백질, 비단백질성 불순물들, 예컨대 세포 또는 세포 파편, 핵산, 다당류, 지질, 화학물질, 예컨대 거품억제제, 응집제, 염, 당류, 비타민, 성장 인자, 침전제 등을 포함한다. "배양 용액"은 "단백질 용액," "액체 매질," "투석여과된 배양액," "청징화된 배양액," "농축물," "조건화(conditioned) 매질," "발효 배양액," "용균 배양액," "용균물," "세포 배양액," 또는 간단히 "배양액"으로도 지칭될 수 있다. 존재하는 경우, 세포는 세균, 진균, 식물, 동물, 인간, 곤충, 합성 세포 등일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "회수"라는 용어는, 생물계면활성제 및 하나 이상의 바람직하지 않은 성분을 포함하는 액체 배양물을, 바람직하지 않은 성분들, 예컨대 물, 세포 및 세포 파편, 기타 단백질, 아미노산, 다당류, 당류, 폴리올, 무기 또는 유기 염들, 산 및 염기 및 미립자 물질의 적어도 일부로부터 그 생물계면활성제를 분리하기 위한 공정에 투입되는 것인 공정을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "생물계면활성제 제품"은, 고객과 같은 최종 사용자에게로의 제공에 적합한 생물계면활성제 제제를 지칭한다. 생물계면활성제 제품은, 기능성 유효기간을 연장시키거나 또는 그 생물계면활성제의 최종 용도 적용을 용이하게하기 위하여 첨가되거나 함유하는, 세포, 세포 파편, 매질 성분, 조제 부형제, 예컨대, 버퍼, 염, 보존제, 환원제, 당류, 폴리올, 계면활성제 등을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, 기능적으로 및/또는 구조적으로 유사한 생물계면활성제는 "관련 생물계면활성제"로 여겨진다. 이러한 생물계면활성제는 상이한 속 및/또는 종의 생물, 또는 심지어 상이한 강(class)의 생물 (예로서, 세균 및 진균)로부터 유래될 수도 있다. 관련 생물계면활성제는, 일차 서열 분석에 의하여 결정되거나, 3차 구조 분석에 의하여 결정되거나, 또는 면역학적 교차 반응성에 의하여 결정되는 동족체도 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "유도체 생물계면활성제"라는 용어는, 하나 이상의 아미노산을 N-말단 및 C-말단 중 하나 또는 이들 모두에 첨가, 아미노산 서열에서 하나 또는 다수의 상이한 위치에서 하나 이상의 아미노산의 치환, 및/또는 단백질의 하나 또는 양 말단에서 또는 아미노산 서열에서 하나 이상의 자리에서 하나 이상의 아미노산의 결실, 및/또는 아미노산 서열에서 하나 이상의 자리에서 하나 이상의 아미노산의 삽입에 의하여 생물계면활성제로부터 유도되는 단백질-기재 생물계면활성제를 지칭할 수 있다. 생물계면활성제 유도체의 제조는 천연 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 변경, 그 DNA 서열로 적합한 숙주의 형질전환, 및 유도체 단백질을 형성하기 위한 변형된 DNA 서열의 발현에 의하여 수행될 수 있다. "유도체 생물계면활성제"는 지질 또는 탄수화물 모이어티(moiety) 중 어느 하나가 합성 동안 또는 합성 후에 단백질 골격에 부착된 생물계면활성제 유도체도 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "유도체 생물계면활성제" 또는 "변이체 생물계면활성제"는, 하나 이상의 지질 및/또는 당류의 첨가, 하나 또는 다수의 상이한 자리에서 하나 이상의 지질 및/또는 당류의 치환, 및/또는 분자의 어느 하나의 말단 또는 양쪽 말단에서 또는 구조물 내의 하나 이상의 자리에서 하나 이상의 지질 및/또는 당류의 결실, 및/또는 구조물 내 하나 이상의 자리에서 하나 이상의 지질 및/또는 당류의 삽입에 의하여 생물계면활성제로부터 유도되는 지질 기재 및/또는 당 기재의 생물계면활성제를 지칭할 수 있다.
관련 (및 유도체) 생물계면활성제는 "변이체 생물계면활성제"를 포함한다. 변이체 단백질-기재의 생물계면활성제는 참조/부모 생물계면활성제, 예로서, 야생형 생물계면활성제와, 적은 수의 아미노산 잔기에서의 치환, 결실, 및/또는 삽입에 의하여 상이하다. 상이한 아미노산 잔기의 수는 하나 이상, 예로서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50 이상의 아미노산 잔기일 수 있다. 변이체 생물계면활성제는, 야생형 생물계면활성제와, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 심지어는 적어도 약 99%, 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 공유한다. 변이체 생물계면활성제는 또한 선택된 모티프, 도메인, 에피토프, 보존 영역 등에서 참조 생물계면활성제와 상이할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "유사 서열"은, 생물계면활성제로서 유사한 기능, 3차 구조 및/또는 보존된 잔기를 제공하는 단백질-기재 생물계면활성제 내 서열을 지칭한다. 예로서, 알파-나선 또는 베타-시트 구조를 포함하는 에피토프 영역에서, 유사 서열 내 대체 아미노산은 바람직하게는 동일한 특이적 구조를 유지한다. 이 용어는 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열도 지칭한다. 일부 실시양태에서, 유사 서열은, 대체 아미노산이 유사하거나 또는 개선된 기능을 나타내는 변이체 효소를 결과로서 생성하도록 개발된다. 일부 실시양태에서, 생물계면활성제에서 아미노산의 3차 구조 및/또는 보존된 잔기는 관심 대상의 절편 또는 단편에 또는 그 가까이에 위치된다. 따라서, 관심 대상의 절편 또는 단편은, 예로서 알파-나선 또는 베타-시트 구조를 포함하며, 아미노산의 대체는 바람직하게는 그 특이적 구조를 유지한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "동종성 생물계면활성제"라는 용어는 참조 생물계면활성제와 유사한 활성 및/또는 구조를 갖는 생물계면활성제를 지칭한다. 동족체는 반드시 진화적으로 관련된 것으로 의도되지는 않는다. 따라서, 용어는, 상이한 생물들로부터 수득된 동일, 유사 또는 대응하는 (즉, 구조 및 기능 면에서) 생물계면활성제(들)을 포함하고자 하는 것이다. 일부 실시양태에서, 참조 생물계면활성제에 유사한 4차, 3차 및/또는 1차 구조를 갖는 동족체를 동정하는 것이 바람직하다.
서열들 간의 동종성 정도는 본 기술분야에서 알려진 임의의 적합한 방법을 이용하여 결정될 수 있다 (예로서, 하기 참조, Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol., 48:443; Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444; Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group, Madison, WI) 중의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA와 같은 프로그램; 및 Devereux 등. (1984) Nucleic Acids Res. 12:387-395).
예로서, PILEUP은 서열 상동성 수준을 결정하는데 유용한 프로그램이다. PILEUP은 점진적, 쌍-위주 (pair-wise) 배열을 이용하여 관련 서열의 군으로부터의 다수의 서열 배열을 만들어낸다. 배열을 만들어내는데 사용되는 클러스터링(clustering) 관계를 나타내는 계도(tree)를 그래프화할 수도 있다. PILEUP은 Feng와 Doolittle, (Feng and Doolittle (1987) J. Mol. Evol. 35:351-360)의 점진적 배열 방법의 단순화를 이용한다. 이 방법은 Higgins와 Sharp (Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-153)에 설명된 것과 유사하다. 유용한 PILEUP 파라미터는 3.00의 디폴트 갭 (default gap) 중량, 0.10의 디폴트 갭 길이 중량, 및 가중화된 말단 갭을 포함한다. 유용한 알고리즘의 또다른 예는 BLAST 알고리즘으로, Altschul 등. (Altschul 등. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; 및 Karlin 등. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787)에 의하여 설명된 것이 있다. 특히 유용한 한 BLAST 프로그램은 WU-BLAST-2 프로그램이다(, Altschul 등 (1996) Meth. Enzymol. 266:460-480 참조). 파라미터 "W," "T," 및 "X"는 배열의 감도 및 속도를 결정한다. BLAST 프로그램은 디폴트로서 11의 단어-길이 (W), 50의 BLOSUM62 기입 매트릭스 (Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 참조) 배열 (B), 10의 기대값 (E), M′5, N′-4, 및 두 가닥 모두의 비교를 이용한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, 적어도 2개의 핵산 또는 폴리펩티드의 맥락에서 "실질적으로 유사한" 및 "실질적으로 동일한"이라는 구는, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가, 참조 (즉, 야생형) 서열과 비교하여, 적어도 약 70% 동일성, 적어도 약 75% 동일성, 적어도 약 80% 동일성, 적어도 약 85% 동일성, 적어도 약 90% 동일성, 적어도 약 91% 동일성, 적어도 약 92% 동일성, 적어도 약 93% 동일성, 적어도 약 94% 동일성, 적어도 약 95% 동일성, 적어도 약 96% 동일성, 적어도 약 97% 동일성, 적어도 약 98% 동일성, 또는 심지어는 적어도 약 99% 동일성, 또는 그 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함한다는 것을 전형적으로 의미한다. 서열 동일성은 표준 파라미터를 이용하여, BLAST, ALIGN 및 CLUSTAL과 같은 알려진 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. (예로서, Altschul, 등 (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; Henikoff 등 (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915; Karin 등 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:5873; 및 Higgins 등 (1988) Gene 73:237-244 참조). BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국가 생물공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)로부터 공개적으로 입수가능하다. 또한, 데이터베이스는 FASTA를 이용하여 검색될 수 있다 (Pearson 등 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448). 두 개의 폴리펩티드들이 실질적으로 동일하다는 표지 하나는, 제 1의 폴리펩티드가 제 2의 폴리펩티드와 면역학적으로 교차반응성이라는 것이다. 전형적으로, 보존성 아미노산 치환물에 의하여 상이한 폴리펩티드는 면역학적으로 교차반응성이다. 따라서, 폴리펩티드는 제 2의 폴리펩티드와 실질적으로 동일하며, 예로서 여기에서 두 개의 폴리펩티드는 보존적 치환에서만 상이하다. 두 개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또다른 표지는, 그 2개의 분자들이 엄격한 조건 (예로서, 중간 내지 높은 엄격성 범위 내) 하에서 서로 혼성화한다는 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "야생형" 및 "천연" 생물계면활성제는 자연에서 발견되는 것들이다. "야생형 서열," 및 "야생형 유전자"라는 용어는 본 명세서에서 상호전환가능하게 사용되며, 숙주 세포에서 천연적이거나 또는 자연발생적인 서열을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 야생형 서열은 단백질 조작 프로젝트의 출발점인 관심대상의 서열을 지칭한다. 자연발생적 단백질을 암호화하는 유전자는 당업자에게 알려진 일반적인 방법에 따라 수득될 수 있다. 본 방법은 계면활성제의 영역을 암호화하는 추정 서열을 갖는 라벨링된 프로브를 합성하고, 그 단백질을 발현하는 생물로부터 게놈 라이브러리를 제조하고, 그 프로브에의 혼성화에 의하여 관심 대상의 유전자에 대한 라이브러리를 스크리닝하는 것을 일반적으로 포함한다. 그 후 양성적으로 혼성화하는 클론을 맵핑(mapping) 및 서열분석한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "불용성" 또는 "불용화"는 용해성이 적거나 매우 적은 화합물에 속한다. 화합물의 불용성 분획은 14,000×g에서 10분 동안 1ml 샘플의 고속 원심분리에 의하여 가용성 분획으로부터 분리될 수 있다. 대안적으로, 불용성 분획은 예로서, Millipore Durapore 1 L 병뚜껑 필터와 같은 0.45μm 막 필터를 통한 여과에 의하여 가용성 분획으로부터 분리될 수 있다. 불용성 분획은 원심분리 후 펠렛 중에 존재할 수 있거나 또는 여과 후 필터 상에 잔류할 것이다. 대안적으로, 이전에는 맑은 용액의 불용화는 탁도 또는 혼탁한 외관에 의하여 검출될 수 있다. 대안적으로, 결정 또는 침전물과 같은 불용성 입자들은 광현미경에 의하여 검출될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "침전"은, 화학 반응에 의하여 또는 물리적 조건의 변화에 의하여 유발된, 화합물 용액으로부터 그 화합물의 불용성 형태의 형성에 관련된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "침전제" 또는 "침전 시약"은 침전을 일으키는 약제에 관련된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "CMC"는, 그 초과의 농도에서는 마이셀이 형성되고 그 계에 첨가된 거의 모든 추가적인 계면활성제들이 마이셀화되는, 계면활성제 농도를 지칭할 수 있는 임계 마이셀 농도(critical micelle concentration)에 관련된 것이다. CMC는 계면활성제의 중요한 특징이다. CMC에 도달하기 전에, 표면 장력은 계면활성제의 농도에 따라 격심하게 변화한다. CMC에 도달한 후, 표면 장력은 비교적 일정하게 유지되거나 또는 더욱 낮은 경사도로 변화한다. 소정의 매질 중 소정의 분산제에 대한 CMC 값은 온도, 압력 및 (때때로 강하게) 다른 표면 활성 물질 및 전해질의 존재 및 농도에 따라 달라진다. 마이셀은 임계 마이셀 온도 초과에서만 형성된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은, CMC 저하는, 용액 중 계면활성제의 농도를 감소시키고 그에 따라 거품 형성을 감소시킨다는 점에서, 생물계면활성제의 용해도 저하와 동일한 효과를 갖는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "숙주 세포"는, 그 안에서 생물계면활성제가 천연적으로 또는 재조합 방법 중 어느 하나에 의하여 생산되는 임의의 세포일 수 있다. 숙주 세포는, 이에 제한되지는 않지만 하기를 포함할 수 있다:아가리쿠스(Agaricus) 종(예로서, 아가리쿠스 바이스포러스(biosporus)), 아그로사이브(Agrocybe) 종(예로서, 아그로사이브 아에게리타(aegerita)), 아젤로마이세스(Ajellomyces) 종, (예로서, 아젤로마이세스 캡술라투스(capsulatus), 아젤로마이세스 더마티티디스(dermatitidis)), 아스퍼질러스 종(예로서, 아스퍼질러스 아르비(arvii), 아스퍼질러스 브레바이페스(brevipes), 아스퍼질러스 클라바투스(clavatus), 아스퍼질러스 두리콜리스(duricaulis), 아스퍼질러스 엘립티쿠스(ellipticus), 아스퍼질러스 플라버스(flavus), 아스퍼질러스 푸미가투스(fumigatus), 아스퍼질러스 푸미사인마투스(fumisynnematus), 아스퍼질러스 렌툴루스(lentulus), 아스퍼질러스 나이거(niger), 아스퍼질러스 오리재(oryzae), 아스퍼질러스 유니래터랄리스(unilateralis), 아스퍼질러스 비리디누탄스(viridinutans)), 바실러스 종(예로서, 바실러스 리체니포르미스 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)), 보베리아(Beauveria) 종(예로서, 보베리아 바시아나 (bassiana)), 칸디다(Candida) 종(예로서, 칸디다 보고리엔시스(bogoriensis), 칸디다 봄바이콜라(bombicola)), 클라바이셉스(Claviceps) 종(예로서, 클라바이셉스 푸시포르미스(fusiformis)), 콕시디오이데스(Coccidioides) 종, (예로서, 콕시디오이데스 포사다실(posadasii)), 코클리오볼러스(Cochliobolus) 종(예로서, 코클리오볼러스 헤테로스트로푸스(heterostrophus)), 크리니펠리스(Crinipellis) 종(예로서, 크리니펠리스 페르니시오사(perniciosa)), 크라이포넥트리아(Cryphonectria) 종(예로서, 크라이포넥트리아 파라시티카(parasitica)), 다비디엘라(Davidiella) 종(예로서, 다비디엘라 타시아나(tassiana)), 딕티오네마(Dictyonema) 종(예로서, 딕티오네마 글라브라툼(glabratum)), 에메리셀라 (Emericella) 종(예로서, 에메리셀라 니둘란스(nidulans)), 에스케리키아(Escherichia) 종(예로서, 에스케리키아 콜라이), 플라물리나(Flammulina) 종(예로서, 플라물리나 벨루티페스(velutipes)), 푸사리움(Fusarium) 종(예로서, 푸사리움 쿨모럼(culmorum)), 지베렐라(Gibberella) 종(예로서, 지베렐라 모닐리포르미스(moniliformis)), 글로메렐라 (Glomerella) 종(예로서, 글로메렐라 그라미니콜라(graminicola)), 그리폴라(Grifola) 종(예로서, 그리폴라 프론도사 (frondosa)), 한세눌라(Hansenula) 종(예로서, 한세눌라 폴리모르파(polymorpha)), 헤테로바시디온(Heterobasidion) 종(예로서, 헤테로바시디온 안노숨(annosum)), 하이포크레아(Hypocrea) 종(예로서, 하이포크레아 제코리나(jecorina), 하이포크레아 릭시 (lixii), 하이포크레아 바이렌스 (virens)), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 종(예로서, 클루이베로마이세스 락티스 (lactis)), 락카리아(Laccaria) 종(예로서, 락카리아 바이컬러(bicolor)), 렌티눌라 (Lentinula) 종(예로서, 렌티눌라 에도데스 (edodes)), 마그나포르테 (Magnaporthe) 종(예로서, 마그나포르테 오리제 (oryzae)), 마라스마이우스 (Marasmius) 종(예로서, 마라스마이우스 클라도필루스 (cladophyllus)), 모닐리오프토라(Moniliophthora) 종(예로서, 모닐리오프토라 페르니시오사(perniciosa)), 네오사르토리아(Neosartorya) 종(예로서, 네오사르토리아 아우레올라 (aureola), 네오사르토리아 펜넬리에 (fennelliae), 네오사르토리아 피쉐리 (fischeri), 네오사르토리아 글라브라 (glabra), 네오사르토리아 하이라츠케 (hiratsukae), 네오사르토리아 니시무레 (nishimurae), 네오사르토리아 오타니 (otanii), 네오사르토리아 슈도피쉐리(pseudofischeri), 네오사르토리아 콴드리칭타 (quadricincta), 네오사르토리아 스파툴라타 (spathulata), 네오사르토리아 스피노사 (spinosa), 네오사르토리아 스트라메니아 (stramenia), 네오사르토리아 우데가웨 (udagawae)), 뉴로스포라 (Neurospora) 종(예로서, 뉴로스포라 크라사 (crassa), 뉴로스포라 디스크레타 (discreta), 뉴로스포라 인터미디아 (intermedia), 뉴로스포라 시토필라 (sitophila), 뉴로스포라 테트라스퍼마(tetrasperma)), 노무라에 (Nomuraea) 종(예로서, 노무라에 릴레이 (rileyi)), 오피오스토마 (Ophiostoma) 종(예로서, 오피오스토마 노보-울미(novo-ulmi), 오피오스토마 퀘르쿠스 (quercus)), 파라콕시디오이데스 (Paracoccidioides) 종(예로서, 파라콕시디오이데스 브라실리엔시스 (brasiliensis)), 파살로라 (Passalora) 종(예로서, 파살로라 풀바 (fulva)), 팍실루스 (Paxillus) 종(예로서, 팍실루스 필라멘토서스 (filamentosus), 팍실루스 인볼로투스 (involutus)), 페니실리움 (Penicillium) 종(예로서, 페니실리움 카멤버티 (camemberti), 페니실리움 크라이소게넘(chrysogenum), 페니실리움 마르네페이 (marneffei)), 플레비옵시스 (Phlebiopsis) 종(예로서, 플레비옵시스 자이간테아 (gigantea)), 피키아 (Pichia) 종(예로서, 피키아 파스토리스 (pastoris)), 피솔리투스 (Pisolithus) (예로서, 피솔리투스 팅토리우스 (tinctorius)),플레우로투스 (Pleurotus) 종, (예로서, 플레우로투스 오스트레아투스 (ostreatus)), 포도스포라 (Podospora) 종(예로서, 포도스포라 안세리나(anserina)), 포스티아 (Postia) 종(예로서, 포스티아 플라센타 (placenta)), 슈도모나스 (Pseudomonas) 종(예로서, 슈도모나스 에루기노삼(aeruginosam), 슈도모나스 플루오레센스 (fluorescens), 슈도모나스 피오시아네아(pyocyanea)), 파이레노포라 (Pyrenophora) 종(예로서, 파이레노포라 트라이티시-레펜티스 (tritici-repentis)), 사카로마이세스 (Saccharomyces) 종(예로서, 사카로마이세스 세레비시에(cerevisiae)), 스키조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces) 종(예로서, 스키조사카로마이세스 폼베 (pombe)), 스키조파일럼 (Schizophyllum) 종(예로서, 스키조파일럼 코뮨 (commune)), 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 종(예로서., 스트렙토마이세스 리비단스 (lividans)), 탈라로마이세스 (Talaromyces) 종(예로서, 탈라로마이세스 스티피타투스 (stipitatus)), 토룰롭시스 (Torulopsis) 종, 트리코더마 (Trichoderma) 종(예로서, 트리코더마 아스페렐룸(asperellum), 트리코더마 아트로비리데(atroviride), 트리코더마 비리데(viride), 트리코더마 리시 (reesii) [이전에는 하이포크레아 제코리나 (Hypocrea jecorina)]), 트리콜로마 (Tricholoma) 종(예로서, 트리콜로마 테레움(terreum)), 운시노카르푸스 (Uncinocarpus) 종(예로서, 운시노카르푸스 리시), 베르티실리움 (Verticillium) 종(예로서, 베르티실리움 다리에 (dahliae)), 잔토닥틸론 (Xanthodactylon) 종(예로서, 잔토닥틸론 플라메움 (flammeum)), 잔토리아 (Xanthoria) 종(예로서, 잔토리아 칼시콜라 (calcicola), 잔토리아 카펜시스 (capensis), 잔토리아 엑타네오이데스 (ectaneoides), 잔토리아 플라메아 (flammea), 잔토리아 카로오엔시스 (karrooensis), 잔토리아 리굴라타 (ligulata), 잔토리아 파리엔티나 (parietina), 잔토리아 터비나타 (turbinata)) 또는 야로위아 (Yarrowia) 종(예로서, 야로위아 리폴리티카 (lipolytica)).
본 발명의 방법은 배양 용액으로부터의 임의의 생물계면활성제의 분리에 적용될 수 있다. 유리하게는, 생물계면활성제는, 미생물에 의해 분비되는 가용성 세포외 생물계면활성제이다. 예시적인 생물계면활성제의 군으로, 섬유성 진균류에 의하여 발현 및/또는 그로부터 유래되는 시스테인-풍부 폴리펩티드의 부류인 하이드로포빈류가 있다. 하이드로포빈은 소형 (약 100 개의 아미노산) 폴리펩티드로, 세포 및 인공제조된 물질을 포함한 물체의 표면 상에 소수성 코팅을 형성하는 그 능력이 알려져 있다. 1991년 스키조파일럼 코뮨에서 처음 발견된, 하이드로포빈은 이제 다수의 섬유성 진균류에서 발견되어 왔다. 소수성 (hydropathy) 및 기타 생물물리학적 성질에서의 차이에 기초하여, 하이드로포빈은 클래스(class) I 또는 클래스 II로서 범주화된다. 하이드로포빈은 보존된 시스틴 잔기의 특징적인 거리 간격 (spacing) 및 소수성 패턴에 기초한 두 개의 상이한 클래스(I 또는 II)로 나누어진다 (Kershaw and Talbot 1998, Fungal Genet Biol 23:18-23 and Wㆆsten 2001, Annu Rev Microbiol 55:625-646). 클래스 II 하이드로포빈의 예로, 예로서, Linder 등 (2005) FEMS Microbiology reviews, 29: 877-96 및 Kubicek 등 (2008) BMC Evolutionary Biology, 8:4 참조.
하이드로포빈의 발현은 발효 동안 다량의 하나 이상의 거품형성 억제제(즉, 거품억제제)의 첨가를 통상적으로 요구한다. 그렇지 않은 경우, 하이드로포빈 폴리펩티드에 의하여 생산된 거품은 통기공 필터를 포화시키고, 환기구를 오염시키고, 압력 누적을 일으키며, 단백질 수율을 감소시킨다. 그 결과, 하이드로포빈의 조(curde) 농도는, 특히 하이드로포빈이 식품 첨가제로서 의도된 경우, 하이드로포빈 제제에 바람직하지 않은, 잔류량의 거품억제제 및 숙주 세포 오염물을 통상적으로 포함한다.
하이드로포빈은 그의 실질적인 분자량보다 더 큰 겉보기 분자량을 갖는 형태로 가역적으로 존재할 수 있으며, 이는 본 발명의 방법을 이용한 회수에 하이드로포빈이 매우 적합하게 되도록 한다. 하이드로포빈을 포함하는 액체 또는 거품은 기재된 바와 같이 단백질 회수를 위하여 발효기로부터 연속적으로 또는 주기적으로 수확될 수 있거나, 또는 발효 작동 종료시에 배치에서 수확될 수 있다.
하이드로포빈은 본 기술분야에 알려진 임의의 클래스 I 또는 클래스 II의 하이드로포빈일 수 있으며, 예로서 하기로부터의 하이드로포빈일 수 있다: 아가리쿠스 종(예로서, 아가리쿠스 바이스포러스), 아그로사이브 종(예로서, 아그로사이브 아에게리타), 아젤로마이세스 종, (예로서, 아젤로마이세스 캡술라투스, 아젤로마이세스 더마티티디스), 아스퍼질러스 종(예로서, 아스퍼질러스 아르비, 아스퍼질러스 브레바이페스, 아스퍼질러스 클라바투스, 아스퍼질러스 두리콜리스, 아스퍼질러스 엘립티쿠스, 아스퍼질러스 플라버스, 아스퍼질러스 푸미가투스, 아스퍼질러스 푸미사인마투스, 아스퍼질러스 렌툴루스, 아스퍼질러스 나이거, 아스퍼질러스 유니래터랄리스, 아스퍼질러스 비리디누탄스), 보베리아 종(예로서, 보베리아 바시아나), 클라바이셉스 종(예로서, 클라바이셉스 푸시포르미스), 콕시디오이데스 종, (예로서, 콕시디오이데스 포사다실), 코클리오볼러스 종(예로서, 코클리오볼러스 헤테로스트로푸스), 크리니펠리스 종(예로서, 크리니펠리스 페르니시오사), 크라이포넥트리아 종(예로서, 크라이포넥트리아 파라시티카), 다비디엘라 종(예로서, 다비디엘라 타시아나), 딕티오네마 종(예로서, 딕티오네마 글라브라툼), 에메리셀라 종(예로서, 에메리셀라 나이둘란스), 플라물리나 종(예로서, 플라물리나 벨루티페스), 푸사리움 종(예로서, 푸사리움 쿨모럼), 지베렐라 종(예로서, 지베렐라 모닐리포르미스), 글로메렐라 종(예로서, 글로메렐라 그라미니콜라), 그리폴라 종(예로서, 그리폴라 프론도사), 헤테로바시디온 종(예로서, 헤테로바시디온 안노숨), 하이포크레아 종(예로서, 하이포크레아 제코리나, 하이포크레아 릭시, 하이포크레아 바이렌스), 락카리아 종(예로서, 락카리아 바이컬러), 렌티눌라 종(예로서, 렌티눌라 에도데스), 마그나포르테 종(예로서, 마그나포르테 오리제), 마라스마이우스 종(예로서, 마라스마이우스 클라도필루스), 모닐리오프토라 종(예로서, 모닐리오프토라 페르니시오사), 네오사르토리아 종(예로서, 네오사르토리아 아우레올라, 네오사르토리아 펜넬리에, 네오사르토리아 피쉐리, 네오사르토리아 글라브라, 네오사르토리아 하이라츠케, 네오사르토리아 니시무레, 네오사르토리아 오타니, 네오사르토리아 슈도피쉐리, 네오사르토리아 콴드리칭타, 네오사르토리아 스파툴라타, 네오사르토리아 스피노사, 네오사르토리아 스트라메니아, 네오사르토리아 우데가웨), 뉴로스포라 종(예로서, 뉴로스포라 크라사, 뉴로스포라 디스크레타, 뉴로스포라 인터미디아, 뉴로스포라 시토필라, 뉴로스포라 테트라스퍼마), 노무라에 종(예로서, 노무라에 릴레이), 오피오스토마 종(예로서, 오피오스토마 노보-울미, 오피오스토마 퀘르쿠스), 파라콕시디오이데스 종(예로서, 파라콕시디오이데스 브라실리엔시스), 파살로라 종(예로서, 파살로라 풀바), 팍실루스 종(예로서, 팍실루스 필라멘토서스, 팍실루스 인볼로투스), 페니실리움 종(예로서, 페니실리움 카멤버티, 페니실리움 크라이소게넘, 페니실리움 마르네페이), 플레비옵시스 종(예로서, 플레비옵시스 자이간테아), 피솔리투스 (예로서, 피솔리투스 팅토리우스), 플레우로투스 종, (예로서, 플레우로투스 오스트레아투스), 포도스포라 종(예로서, 포도스포라 안세리나), 포스티아 종(예로서, 포스티아 플라센타), 파이레노포라 종(예로서, 파이레노포라 트라이티시-레펜티스), 스키조파일럼 종(예로서, 스키조파일럼 코뮨), 탈라로마이세스 종(예로서, 탈라로마이세스 스티피타투스), 트리코더마 종(예로서, 트리코더마 아스페렐룸, 트리코더마 아트로비리데, 트리코더마 비리데, 트리코더마 리시 [이전에는 하이포크레아 제코리나]), 트리콜로마 종(예로서, 트리콜로마 테레움), 운치노카르푸스 종(예로서, 운시노카르푸스 리시), 베르티실리움 (Verticillium) 종(예로서, 베르티실리움 다리에), 잔토닥틸론 (Xanthodactylon) 종(예로서, 잔토닥틸론 플라메움(flammeum)), 잔토리아 종(예로서, 잔토리아 칼시콜라, 잔토리아 카펜시스, 잔토리아 엑타네오이데스, 잔토리아 플라메아, 잔토리아 카로오엔시스, 잔토리아 리굴라타, 잔토리아 파리엔티나 , 잔토리아 터비나타), 등. 하이드로포빈은 예로서, Sunde, M 등 (2008) Micron 39:773-84; Linder, M. 등 (2005) FEMS Microbiol Rev. 29:877-96; 및 Woesten, H. 등 (2001) Ann. Rev. Microbiol. 55:625-46에서 검토되었다.
특히 유리한 실시양태에서, 하이드로포빈은 트리코더마 종(예로서, 트리코더마 아스페렐룸, 트리코더마 아트로비리데, 트리코더마 비리데, 트리코더마 리시 [이전에는 하이포크레아 제코리나])으로부터이며, 유리하게는 트리코더마 리세이(reseei)로부터인 것이다.
클래스 I 및 클래스 II 하이드로포빈 모두는 진균류에서 소수성 계면에서 양쪽성 필름으로 자기조립되는 분비 단백질로 확인되어 왔다. 클래스 I 하이드로포빈의 집합체는 일반적으로 비교적 불용성인 한편, 클래스 II 하이드로포빈의 집합체는 각종 용매에 쉽게 용해된다. 유리하게는, 하이드로포빈은 물에 가용성이며, 이는 하이드로포빈이 물 중에 적어도 0.1%, 바람직하게는 적어도 0.5% 가용성임을 의미한다. 적어도 0.1% 가용성이라 함은 99.9 mL의 물 중의 0.1 g의 하이드로포빈을 20℃에서 30분간 30,000 g로 원심분리처리한 경우 하이드로포빈 침전물이 없음을 의미한다.
출원인은 다른 방법에 의하여 생산된 하이드로포빈 II가 C 말단에서 절단된(clipped) 하나 이상의 아미노산을 결과로서 생성할 수 있음을 관찰하였다. 본 발명의 방법으로부터는, 특히, 하이드로포빈이 침전되거나 또는 불용화되는 경우, 절단은 관찰되지 않았다.
하이드로포빈-유사 단백질 (예로서"채플린(chaplin)")은 예컨대 악티노마이세티 및 스트렙토마이세스 종과 같은 섬유상 세균에서도 동정되어 왔다. (WO01/74864; Talbot, 2003, Curr. Biol, 13: R696-R698). 이들 세균 단백질은, 단지 2개의 시스테인 잔기를 가질 수 있기 때문에, 진균성 하이드로포빈에 대조적으로 단지 하나 이하의 이황화물 브릿지(bridge)를 형성할 수 있다. 이러한 단백질은 하이드로포빈에 대한 기능적 균등물의 예이며, 본 발명의 방법의 생물계면활성제의 범위 내의 또다른 유형이다.
람노리피드는 세균성 계면활성제를 가장 잘 특징화하는 것으로서 종종 인용되는 슈도모나스 에루기노사에 의하여 생산 및/또는 이로부터 유도되는 당지질의 부류이다. 람노리피드에는 두가지 주요 부류인, 모노-람노리피드 및 디-람노리피드가 있으며; 이들은 각각 하나 또는 두 개의 람노오즈 군으로 이루어진다. 람노리피드는 미용 산업에서 보습제, 치약, 콘돔 윤활제 및 샴푸와 같은 제품에 널리 사용되어 왔으며, 유기 금속 및 중금속으로 오염된 곳의 생물학적 환경정화에 효과적이다. 이들은 또한 슈도모나스 에루기노사에 의한, 원유 및 식물성유와 같은 탄화수소 찌꺼기의 분해를 용이하게 한다.
소포로리피드는 칸디다 또는 관련 효모 종들에 의하여 배양 매질 내에서 발견되며 그 안으로 분비되며, 계면활성제로서 공지된다. 하이드록시 지방산의 성질은 n개 또는 n-1개의 탄소 원자 상에 위치된 하이드록실기에 의하여 특징되며; 16, 17 또는 18개의 탄소 사슬 길이는 성장 매질의 조성에 의하여 변경된다. 불포화된 C18 지방산을 갖는 소포로사이드(sophoroside)는 칸디다 보고리엔시스에서 인지되어 왔다. 독특한 소포로리피드가 토룰롭시스(Torulopsis) 종에서 분리되었으며, 이는 거대고리 락톤이라는 점에서 이미 언급된 것들과 상이하며, 여기에서 하이드록시 지방산의 카르복시기는 소포로오스에서 말단 글루코오스의 4' 하이드록실기로 에스테르화되어 있다. 2 개의 아세테이트기 또한 상기 지질 중에 존재한다. 소포로리피드는 그의 양친성 구조로 인하여 계면활성제 활성을 나타낸다. 소포로리피드 생산자 중, 칸디다 봄바이콜라는 소포로리피드 종을 다량으로 생산하기 때문에 가장 많이 연구된 종이다. 소포로리피드는 경질 바닥 청소 및 자동 식기세척기 헹굼 보조 제제에 유용한 것으로 나타났다.
서팩틴은 세균성 환형 지질펩티드로, 항생제로서 일반적으로 사용되는 매우 강력한 계면활성제이다. 이는 그람-양성 내생포자-형성 세균인 바실러스 서브틸리스에 의하여 생산되는 24개 유형의 항생제의 중 하나이다. 서팩틴의 구조는 7개 아미노산의 (L-아스파라긴, L-류신, 글루탐산, L-류신, L-발린 및 2개의 D-류신) 펩티드 고리, 및 이의 세포막 투과능을 가능하게 하는 13 내지 15개 탄소 길이의 소수성 지방산 사슬로 이루어진다. 서팩틴은 다른 계면활성제들과 같이, 그가 용해되어 있는 액체의 표면 장력에 영향을 미친다. 이는 20 μM 의 낮은 농도에서 물의 표면 장력을 72 mN/m에서 27 mN/m로 저하시킬 수 있다.
다음에 기재된 것과 같은 생물계면활성제는 본 발명의 방법에 의하여 생산될 수도 있다: 미국특허 7,906,315; 7,893,015; 7,887,906; 7,858,334; 7,749,203; 7,581,594; 7,556,654; 7,541,321; 7,540,926; 7,473,363; 7,413,643; 7,325,603; 7,226,897; 7,198,680; 6,956,122; 6,921,390; 6,727,223; 6,582,730; 6,475,968; 6,389,820; 6,369,014; 6,346,281; 6,319,898; 6,262,038; 6,063,602; 6,060,287; 6,051,552; 5,866,376; 5,767,090; 5,635,392; 5,551,987; 5,417,879; 5,128,262; 4,943,390 및 4,640,767; 및 미국 특허 출원 공개번호 20110065167; 20110027844; 20100323928; 20100168405;20100144643; 20100143316; 20100004472; 20100000795; 20090288825; 20090269833; 20090203565; 20090170700; 20090148881; 20090098028; 20080296222; 20080293570; 20080193730; 20080085251; 20080023044; 20080023030; 20080020947; 20070249035; 20070249034; 20070215347; 20070134288; 20060106120; 20050271698; 20050266036; 20050227338; 20050176117; 20050106702; 20040251197; 20040244969; 20040231982; 20040156816; 20040152613; 20040022775; 20030096988;20030018306; 20020176895; 20020123077 및 20020120101; 또한, Surfactant Science Series Volume 48, BIOSURFACTANTS, Production Properties Applications, Naim Kosaric, editor, CRC Press 1993 참조.
생물계면활성제 생산을 위한 발효는 생물반응기 또는 발효기 중 액체 발효 매질 내에서 숙주 세포 또는 미생물을 배양함으로써 실시된다. 매질의 조성 (예로서, 영양소, 탄소 공급원 등), 온도 및 pH는 배양물 성장 및/또는 생물계면활성제의 생산을 위한 적절한 조건을 제공하도록 선택된다. 공기 또는 산소-풍부화 공기는 정상적으로는 매질 내로 살포되어 배양물의 호흡을 위한 산소를 제공한다.
본 발명은 생물계면활성제의 침전을 유발하는 임의의 약제 또는 처리를 배양 용액에 첨가하여 생물계면활성제를 불용화하는 것에 관한 것이다. 구체적으로, 생물계면활성제의 침전을 유발하는 임의의 약제 또는 처리는 본 발명의 방법에 의하여 이용될 수 있다. 생물계면활성제의 침전을 유발하는 약제는, 이에 제한되지는 않지만, 염, 중합체, 산, 용매 또는 알코올을 포함한다. 생물계면활성제의 침전을 유발하는 물리적 조건은, 이에 제한되지는 않지만, 열 변화 또는 pH 변화를 포함한다. 당업자는 생물계면활성제의 침전을 유발하는 조건이 침전제, 물리적 조건에서의 변화 또는 이들 둘 모두의 조합을 포함할 수 있음을 이해할 것이다.
구체적으로, 본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 공정에 의하여 생산될 수 있는 생물계면활성제에도 관한 것이다. 예로서, 발효　동안　거품　넘침이　방지된　채로　발효가　여전히　진행되는　한편，　발현된　하이드로포빈을　배양액　중에서　불용성으로　만들기　위하여　발효　매질　및　조건을　변경함에　의한　통상적인　발효　기술의　변경이　본　명세서에서　제시된다. 변경된 발효법을 이용하여 생산된 하이드로포빈의 조성물은 도 2에 나타내었으며, 매스(mass) 7180에서의 피크는 전장 하이드로포빈 분자에 해당한다. 흥미롭게도, 본 명세서에서 제시된 방법에 의하여 생산된 하이드로포빈은, 일반적으로 두 가지 변이체의 혼합물인 자연발생적 하이드로포빈과 다르게, 균질한 생성물을 결과로서 생성한다. 따라서, 본 발명은 도 2에 나타낸 스펙트럼을 갖는 임의의 하이드로포빈도 포함한다.
유리하게는, 침전제는 염이거나 또는 염을 포함한다 - 양이온(들) 및 음이온(들)으로 구성된 산 및 염기의 중화 반응으로부터 야기될 수 있는 이온성 화합물, 예로서 임의의 적합한 음이온(들), 예컨대 할라이드, 예로서 염화물, 불화물, 브롬화물 또는 요오드화물; 구연산염; 초산염; 나이트레이트 (또는 질산염), 아질산염, 탄산염; 황산염; 인산염; 술파메이트; 포스포네이트; 또는 술파메이트; 및 임의의 적합한 양이온, 예로서, 암모늄, 칼슘, 금속 또는 전이금속, 예컨대 알루미늄, 철, 마그네슘, 리튬, 칼륨 또는 나트륨을 포함하는 이온성 화합물. 염은 유리하게는 다중원자(polyatomic) 이온을 포함하고, 더욱 바람직하게는 황산염을 포함한다. 염은 황산암모늄, 황산칼슘, 황산철, 황산마그네슘, 황산칼륨 또는 황산나트륨일 수 있거나 또는 이들을 포함할 수 있다. 특히 유리한 실시양태에서, 염은 황산나트륨이거나 또는 황산나트륨을 포함한다. 또다른 특히 유리한 실시양태에서, 염은 황산암모늄이거나 또는 황산암모늄을 포함한다. 다른 실시양태에서, 염은 초산염, 탄산염, 염화염, 구연산염, 포름산염, 질산염, 또는 염산염일 수 있다.
또다른 실시양태에서, 침전제는 알코올이다. 알코올은 1가(monohydric) 또는 다가 알코올, 예컨대 1가 또는 다가 C_1-C₆ 알코올, 예컨대 메탄올, 에탄올 또는 아이소프로필 알코올일 수 있다.
또다른 실시양태에서, 침전제는 수혼화성 유기 용매이다. 용매는 아세톤 또는 케톤일 수 있다.
또다른 실시양태에서, 침전제는 수용성 중합체이다. 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 또는 다당류, 예컨대 덱스트란일 수 있다. 또다른 실시양태에서, 침전제는 양이온 중합체, 예컨대 이에 제한되지는 않지만 C581 (Cytec Industries, Woodland Park, NJ 07424)이다.
특히 바람직한 실시양태에서, 배양 용액의 pH는 생물계면활성제에 따라 조절된다. 예로서, 생물계면활성제가 하이드로포빈인 경우, pH는 유리하게는 약 4.0 ± 0.5이다. pH는 약 3.9 ± 0.5 내지 약 4.1 ± 0.5, 약 3.8 ± 0.5 내지 약 4.2 ± 0.5, 약 3.7 ± 0.5 내지 약 4.3 ± 0.5, 약 3.6 ± 0.5 내지 약 4.4 ± 0.5, 약 3.5 ± 0.5 내지 약 4.5 ± 0.5, 약 3.4 + 0.5 내지 약 4.6 ± 0.5, 약 3.3 ± 0.5 내지 약 4.7 ± 0.5, 약 3.2 ± 0.5 내지 약 4.8 ± 0.5, 약 3.1 ±0.5 내지 약 4.9 ± 0.5, 약 3.0 ± 0.5 내지 약 5.0 ± 0.5, 약 2.9 ± 0.5 내지 약 5.1 ± 0.5, 약 2.8 ± 0.5 내지 약 5.2 ± 0.5, 약 2.7 ± 0.5 내지 약 5.3 ± 0.5, 약 2.6 ± 0.5 내지 약 5.4 ± 0.5, 약 2.5 ± 0.5 내지 약 5.5 ± 0.5, 약 2.4 ± 0.5 내지 약 5.6 ± 0.5, 약 2.3 ± 0.5 내지 약 5.7 ± 0.5, 약 2.2 ± 0.5 내지 약 5.8 ± 0.5, 약 2.1 ±0.5 내지 약 5.9 ± 0.5 또는 약 2.0 ± 0.5 내지 약 6.0 ± 0.5의 범위일 수 있다.
생물계면활성제가 람노리피드 또는 소포로리피드인 경우, pH는 유리하게는 약 2.5 ± 0.5이다. pH는 약 2.4 ± 0.5 내지 약 2.6 ± 0.5, 약 2.3 ± 0.5 내지 약 2.7 ± 0.5, 약 2.2 ± 0.5 내지 약 2.8 ± 0.5, 약 2.1 ± 0.5 내지 약 2.9 ± 0.5, 약 2.0 ± 0.5 내지 약 3.0 ± 0.5, 약 1.9 ± 0.5 내지 약 3.1 ± 0.5, 약 1.8 ± 0.5 내지 약 3.2 ± 0.5, 약 1.7 ± 0.5 내지 약 3.3 ± 0.5, 약 1.6 ± 0.5 내지 약 3.4 ± 0.5, 약 1.5 + 0.5 내지 약 3.5 ± 0.5, 약 1.4 ± 0.5 내지 약 3.6 ± 0.5, 약 1.3 ± 0.5 내지 약 3.7 ± 0.5, 약 1.2 ± 0.5 내지 약 3.8 ± 0.5, 약 1.1 ± 0.5 내지 약 3.9 ± 0.5, 약 1.0 ± 0.5 내지 약 4.0 ± 0.5, 약 0.9 ± 0.5 내지 약 4.1 ± 0.5, 약 0.8 ± 0.5 내지 약 4.2 ± 0.5, 약 0.7 ± 0.5 내지 약 4.3 ± 0.5, 약 0.6 ± 0.5 내지 약 4.4 ± 0.5 또는 약 0.5 ± 0.5 내지 약 4.5 ± 0.5의 범위일 수 있다.
또다른 실시양태에서, 다른 계면활성제의 유리한 pH는 약 pH 7.0 ± 0.5, 약 pH 7.1 ± 0.5, 약 pH 7.2 ± 0.5, 약 pH 7.3 ± 0.5, 약 pH 7.4 ± 0.5, 약 pH 7.5 ± 0.5, 약 pH 7.6 ± 0.5, 약 pH 7.7 ± 0.5, 약 pH 7.8 ± 0.5, 약 pH 7.9 ± 0.5, 약 pH 8.0 ± 0.5, 약 pH 8.1 ± 0.5, 약 pH 8.2 ± 0.5, 약 pH 8.3 ± 0.5, 약 pH 8.4 ± 0.5, 약 pH 8.5 ± 0.5, 약 pH 8.6 + 0.5, 약 pH 8.7 ± 0.5, 약 pH 8.8 ± 0.5, 약 pH 8.9 ± 0.5, 약 pH 9.0 ± 0.5, 약 pH 9.1 ± 0.5, 약 pH 9.2 ± 0.5, 약 pH 9.3 ± 0.5, 약 pH 9.4 ± 0.5, 약 pH 9.5 ± 0.5, 약 pH 9.6 ± 0.5, 약 pH 9.7 ± 0.5, 약 pH 9.8 ± 0.5, 약 pH 9.9 ± 0.5, 약 pH 10.0 ± 0.5, 약 pH 10.1 ± 0.5, 약 pH 10.2 ± 0.5, 약 pH 10.3 ± 0.5, 약 pH 10.4 ± 0.5, 약 pH 10.5 ± 0.5, 약 pH 10.6 ± 0.5, 약 pH 10.7 ± 0.5, 약 pH 10.8 ± 0.5, 약 pH 10.9 ± 0.5, 약 pH 11.0 ± 0.5, 약 pH 11.1 ± 0.5, 약 pH 11.2 ± 0.5, 약 pH 11.3 ± 0.5, 약 pH 11.4 ± 0.5, 약 pH 11.5 ± 0.5, 약 pH 11.6 ± 0.5, 약 pH 11.7 ± 0.5, 약 pH 11.8 ± 0.5, 약 pH 11.9 ± 0.5, 약 pH 12.0 ± 0.5, 약 pH 12.1 ± 0.5, 약 pH 12.2 ± 0.5, 약 pH 12.3 ± 0.5, 약 pH 12.4 ± 0.5, 약 pH 12.5 ± 0.5, 약 pH 12.6 ± 0.5, 약 pH 12.7 ± 0.5, 약 pH 12.8 ± 0.5, 약 pH 12.9 ± 0.5, 약 pH 13.0 ± 0.5, 약 pH 13.1 ± 0.5, 약 pH 13.2 ± 0.5, 약 pH 13.3 ± 0.5, 약 pH 13.4 ± 0.5, 약 pH 13.5 ± 0.5, 약 pH 13.6 ± 0.5, 약 pH 13.7 ± 0.5, 약 pH 13.8 ± 0.5, 또는 약 pH 13.9 ± 0.5일 수 있다.
앞서 언급된 바와 같이, pH의 조절은 카라기난을 포함할 필요는 없으며, 카라기난의 임의의 이용이 pH 조절, 특히 pH 3.5 또는 3 미만으로 조절을 포함할 필요는 없다. 또한, 0.5 미만, 또는 0.4 미만, 또는 0.3 미만, 또는 0.2 미만으로의 임의의 이온 강도의 조절이 pH를 3.5 또는 3 미만으로의 조절 및/또는 카라기난의 이용을 포함할 필요는 없다. pH를 감소시키는 결과를 일으키는 pH 조절은 산, 예컨대 황산의 첨가에 의하여 달성될 수 있다.
유리하게 거품억제제의 이용을 피하기 위하여, 생물계면활성제, 예로서 하이드로포빈 II와 같은 하이드로포빈의 충분한 침전 또는 불용화를 달성하기에 충분한 양으로, 침전제, 예로서, 첨가된 염, 알코올, 수혼화성 유기 용매 또는 수용성 중합체 또는 양이온성 중합체, 및/또는 pH 조절, 및/또는 온도 조절 및/또는 온도 증가가 부가되거나, 또는 pH 조절이 수행된다. 즉, 불용화는 거품 제어에 유리하다. 다시 말하면, 불용화는 거품을 제어하기 위한 수단으로서 수행되며, 침전제의 양 또는 pH 조절 또는 온도 조절의 양은 거품형성을 제어하기 위한 불용화 양을 유발하도록 하는 것이다. 또한, 침전제의 양 또는 pH 조절 또는 온도 조절의 양은 세포 또는 미생물 성장 및/또는 생물계면활성제의 생산에 좋지않은 영향을 미치지 않는다는 것이 유리하다.
하이드로포빈의 낮은 용해도에 대한 바람직한 pH 범위는 약 3.5- 4.5이다. 다른 계면활성제의 경우, pH 범위는 상당히 상이할 수 있으며 최적 pH 범위는 당업자에 의하여 결정될 수 있다.
하이드로포빈의 경우, pH 범위 3.5 내지 4.5에서, 황산암모늄 또는 황산나트륨의 필요한 농도는 온도 의존적이다. 약 30℃ 내지 약 60℃에서, 바람직한 농도는 약 0.1% 내지 약 5%이다. 약 30℃ 이하에서, 황산나트륨의 농도는 유리하게는 5% 초과, 염의 포화 한계까지이며, 이는 황산나트륨의 경우 약 15%이고, 황산암모늄의 경우 약 30-50%로, 온도에 따라 달라진다.
또다시, 다른 생물계면활성제의 경우, 온도 및 이들 침전물의 농도는 상당히 다를 수 있으며, 각각의 경우에 대하여 실험적으로 결정되어야만 할 것이다.
다른 유리한 실시양태에서, 생물계면활성제는 람노리피드, 소포로리피드 또는 서팩틴일 수 있다. 유리하게는, 람노리피드는 염화나트륨, 염화칼슘, 황산나트륨 및/또는 양이온성 중합체 (이에 제한되지는 않지만, 예컨대 C581)를 이용하여 침전될 수 있다. 유리하게는, 소포로리피드는 염화나트륨, 염화칼슘, 황산나트륨 및/또는 양이온성 중합체 (이에 제한되지는 않지만, 예컨대 C581)를 이용하여 침전될 수 있다. 유리하게는, 서팩틴은 염화나트륨, 염화칼슘, 및/또는 황산나트륨을 이용하여 침전될 수 있다. 또다른 유리한 실시양태에서, 람노리피드, 소포로리피드 및 서팩틴은 바실러스 리체니포르미스, 바실러스 서브틸리스 및/또는 트리코더마 리세이중에서 번식될 수 있다.리터 당 80 g 이상의, 하이드로포빈 무염, 농축 용액은 매우 고온에 의해서만 침전되어 거품형성을 제어할 수 있다. 예로서, 80℃의 온도는 그 온도까지의 가열 동안 형성되었던 어떤 거품도 효과적으로 파괴하였으며, 여기에서 상기 온도에서의 pH는 약 6 내지 7이었다.
하이드로포빈은 실온에서 아이소프로필 알코올을 이용하여 침전될 수 있다. 2 내지 3 부피의 아이소프판올이 물 중의 하이드로포빈 용액 1부피에 첨가된 경우, 하이드로포빈은 침전될 것이다.
또다른 실시양태에서, 물리적 조건은 온도이다.
특히 바람직한 실시양태에서는, 배양 용액의 온도가 조절된다. 본 명세서에서 온도 범위는 생물계면활성제 및 농도에 크게 달라질 수 있으며, 약 20℃ 내지 약 90℃의 범위일 수 있다. 하이드로포빈의 경우, 온도는 30℃ 초과이다. 람노리피드, 소포로리피드 또는 서팩틴의 경우, 온도는 약 20℃ 내지 약 30℃일 수 있다.
거품 제어의 유효성을 시험하기 위한 몇 가지 방법들이 있다. 가장 쉬운 방법은 총 부피에서의 유의한 감소의 증거로 표면 거품을 검사하는 것이다. 연행 공기(Entrained air)는 시간에 따른 액체 밀도의 변화를 기록할 수 있는 밀도계를 갖는 유사한 장치를 이용하여 시험될 수 있다.
유리한 실시양태에서, 거품 제어의 효과는 처리된 용액의 오버런에 의해 측정될 수 있으며, 이는 거품형성된 용액의 부피에서 초기 부피를 빼고, 이를 초기 부피로 나눈 계산 값으로, 분수 또는 백분율로 보고된다. 오버런이 0이면 용액이 거품을 포함하지 않음을 의미한다.
거품 감소 지수도 거품 제어 처리 효과의 척도로서 이용될 수 있다. 이는 처리된 용액에 대한 미처리된 용액의 오버런의 비이다.
또다른 실시양태에서, 거품 감소의 효과는 생물계면활성제의 절대적 및 상대적 불용성의 측정일 수도 있다. 생물계면활성제가 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 불용성인 경우, 거품 감소는 효과적인 것으로 결정될 수 있다.
0.1 g/㎏, 0.5 g/㎏, 1 g/㎏, 2 g/㎏, 3 g/㎏, 4 g/㎏, 5 g/㎏, 6 g/㎏, 7 g/㎏, 8 g/㎏, 9 g/㎏ 또는 10 g/㎏ 미만의 생물계면활성제 (g으로 측정)가 용액 (㎏으로 측정) 중에 존재하는 경우 거품 감소는 효과적인 것으로 결정될 수 있다.
유리한 실시양태에서, 생물계면활성제가 적어도 약 25% 불용성 및/또는 생물계면활성제가 상청액 중에 1 g/㎏ 이하로 존재하는 경우, 거품 감소는 효과적인 것으로 결정될 수 있다.
유리한 실시양태에서, 생물계면활성제가 단백질인 경우, 단백질의 불용성은 침전물 (불용성) 및 상청액 (가용성) 중의 단백질 양을 측정함으로써 정량될 수 있다. 절대적 및 상대적 불용성은, 침전물 (불용성) 및 상청액 (가용성) 중의 단백질을 정량함으로써 결정될 수 있다. 단백질 정량법은 당업자에게 알려져 있다.
침전물 및 용액 중 비-단백질 생물계면활성제의 정량법은 당업자에게 공지이다.
수직 스캐닝과 결합된 다중 광산란은 생성물의 분산 상태를 감독하기 위하여 가장 널리 사용되는 기술이며, 이에 따라 불안정화 현상을 확인 및 정량화한다 [Roland 등, International Journal of Pharmaceutics 263 (2003) 85-94, Lemarchand 등 Pharmaceutical Research, 20-8 (2003) 1284-1292, Mengual 등Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects 152 (1999) 111-123, Bru 등 Particle sizing and characterisation Ed T. Provder and J. Texter (2004)]. 이는 희석없이, 거품을 포함한 어떤 농축 분산액 상에서도 작용한다. 빛을 샘플을 통해 통과시켜 보내면, 이는 기포에 의하여 후방산란된다. 후방산란 강도는 분산된 상의 크기 및 부피 분율에 직접적으로 비례한다. 따라서, 농도에서의 국소적 변화 (배수, 이액(syneresis)) 및 크기에서의 전체적인 변화 (숙성, 연합(coalescence))이 검출 및 감독된다. 전도성 및 탁도가 또한 성장 매질 중 성분의 농도를 감독하는데 사용될 수 있다.
본 발명으로부터의 특정 장점은 생물계면활성제의 생산 공정이 연속적일 수 있다는 것이다. 예로서, 본 발명의 실시에서, 생물반응기 또는 발효기는 가용화된 생물계면활성제, 예로서, 하이드로포빈을 제거하기 위한 수단, 예로서 밸브-제어 유체 도관을 가질 수 있으며, 이를 통하여 가용화된 생물계면활성제가 생물반응기 또는 발효기로부터 제거될 수 있다. 밸브는 밸브의 개폐를 위하여 프로세서 또는 마이크로프로세서와 연결되어 작동될 수 있다. 프로세서 또는 마이크로프로세서는 센서, 예컨대 용액 중 생물계면활성제의 농도 또는 그 변화 또는 용액의 탁도 또는 거품 양과 같은 또다른 파라미터를 표시하는 센서로부터의 신호를 받을 수 있으며, 그 센서 신호에 기초하여, 프로세서 또는 마이크로프로세서는 가용화된 생물계면활성제의 제거를 위한 밸브의 개폐를 지시할 수 있거나; 또는 그 마이크로프로세서 또는 프로세서는, 침전제 및/또는 침전 조건이 부가 또는 적용된 시간, 침전제 농도 달성 및/또는 시간에 따른 것을 포함하는, 침전 조건 달성과 같은 다른 파라미터에 기초하여 밸브의 개폐를 일으킬 수 있다. 생물반응기 또는 발효기는 또한 침전제 또는 유체를 부가하기 위한 수단 또는 침전 조건을 달성하기 위한 기타 조건을 부가하기 위한 수단을 포함할 수 있으며, 예로서 밸브-제어되는 유체 도관 [이에 의하여 침전제, 예로서 유리하게는 용액 중, 염, 알코올 또는 침전 조건을 달성하는 유체, 예로서 pH를 감소시키기 위한 산이 부가될 수 있음]또는 가열기가 있다. 밸브 또는 가열기는 밸브의 개폐를 위한 또는 가열기를 켜고 끄기 위한 프로세서 또는 마이크로프로세서와 연결될 수 있다. 프로세서 또는 마이크로프로세서는 센서, 예컨대 용액 중 생물계면활성제의 농도 또는 그의 변화 또는 거품과 같은 또다른 파라미터를 표시하는 센서로부터의 신호를 받을 수 있으며, 그 센서 신호에 기초하여, 침전제 또는 유체 또는 가용화를 유발하기 위한 기타 수단의 부가를 위하여 프로세서 또는 마이크로프로세서는 밸브의 개폐 또는 가열기의 켜고 끔을 지시할 수 있거나; 또는 마이크로프로세서 또는 프로세서는 다른 파라미터, 예컨대 가용화된 생물계면활성제가 제거된 시간에 기초하여 밸브의 개폐를 일으킬 수 있다. 나아가, 생물반응기 또는 발효기는 생물계면활성제를 생산하는, 매질 및/또는 세포 또는 미생물 또는 매질의 기타 성분을 첨가하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 불가피하게, 가용화된 생물계면활성제의 제거시, 생물계면활성제를 생산하는 일부 매질, 및/또는 세포 또는 미생물 또는 매질의 기타 성분은 가용화된 계면화성제와 함께 손실될 것이고, 생물반응기 또는 발효기는 보충을 위한 수단을 포함한다. 이러한 보충 수단은 예로서 밸브-제어되는 유체 연결 수단일 수 있으며, 이를 통하여 세포 또는 생물 또는 매질 또는 매질의 기타 성분이 생물반응기 또는 발효기로 공급된다. 밸브는 밸브의 개폐를 위하여 프로세서 또는 마이크로프로세서와 연결될 수 있다. 프로세서 또는 마이크로프로세서는 센서, 예컨대 세포 또는 미생물 또는 매질의 기타 성분의 농도 또는 그 변화 또는 용액의 탁도 또는 또다른 파라미터터를 나타내는 센서로부터의 신호를 받을 수 있으며, 그 센서 신호에 기초하여 프로세서 또는 마이크로프로세서는 보충을 위한 밸브의 개폐를 지시할 수 있거나; 또는 마이크로프로세서 또는 프로세서는 시간과 같은 기타 파라미터에 기초하여 밸브의 개폐를 일으킬 수 있다. 세포, 미생물 또는 매질 또는 매질 성분이 가용화된 계면활성제와 함께 수확되는 경우, 그러한 세포, 미생물 또는 매질 또는 매질 성분은 가용화된 생물계면활성제로부터 분리되어, 예로서 보충 수단을 통하여 발효기 또는 생물반응기로 다시 재순환될 수 있다. 상기 내용의 센서는 하나 이상의 센서일 수 있거나 또는 생물반응기 또는 발효기와 연결되어 있을 수 있다.
이러한 방식으로, 생물계면활성제, 예로서 하이드로포빈 II와 같은 하이드로포빈, 람노리피드, 소포로리피드 또는 서팩틴 생산을 위한 매질 및 그를 생산하는 매질을 생물반응기 또는 발효기로 공급하고, 거품이 발생 또는 발생중인 때 또는 현저하게 발생하기 전 또는 매질이 생물반응기 또는 발효기 내에 존재한 일정 시간 후, 침전제 또는 침전 조건이 첨가 또는 적용되며, 예로서, 황산나트륨이 첨가 및/또는 알코올이 첨가 및/또는 가열 적용 및/또는 pH 조절 (유리하게는 저하되는 쪽으로)로써 거품이 제어되고 생물계면활성제는 침전 또는 불용화된다. 불용화된 생물계면활성제는 생물반응기 또는 발효기로부터 제거된다. 그리고 매질 또는 그의 성분, 예로서 세포 또는 미생물, 영양소, 또는 매질의 기타 성분이 생물반응기 또는 발효기로 공급되는데, 이는 즉 매질 또는 그의 성분, 예로서 세포 또는 미생물, 영양소, 또는 매질의 기타 성분이 보충되는 것이다. 선택적으로, 불용화된 생물계면활성제와 떨어져나온 매질 또는 그의 성분, 예로서 세포 또는 미생물, 영양소, 또는 매질의 기타 성분은 생물반응기 또는 발효기로 다시 재순환된다. 이에따라, 생물계면활성제는 연속적으로 생산될 수 있다.
본 방법은 반응기, 예로서 생물반응기 내에서 수행될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "생물반응기"는 생물학적으로 활성인 환경을 뒷받침할 수 있는 임의의 제조된 또는 설계된 장치 또는 시스템을 지칭한다. 예로서, 생물반응기는 그 안에서 하나 이상의 화학적 및/또는 생물학적 공정이 일어나는 용기를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이들 공정은 생물 또는 그러한 생물로부터 유래된 생화학적으로 활성인 물질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 생물 또는 세포는 생물반응기에서 성장할 수 있다. 일부 실시양태에서, 생물은 이용 동안 반응기 내에서 부유되거나 또는 고정화될 수 있다.
이 방법과 함께 사용되는 반응기는, 이에 제한되지는 않지만, 배치 반응기, 유가식 반응기, 연속 반응기, 예컨대 연속 교반 탱크 반응기, 이동 매질, 충전층 (packed bed), 섬유질층, 막 반응기 또는 본 기술분야에서 알려지거나 또는 아직 발견되지 않은 임의의 기타 시스템을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 연속 반응기의 이용은 재료가 반응기를 통하여 연속적으로 펌프되도록 한다. 펌프된 재료의 흐름은 혼합을 촉진할 수 있다. 일부 실시양태에서, 정적 혼합기, 예컨대 배플(baffles), 및/또는 기계적 교반이, 성분들의 혼합을 촉진시키기 위하여 반응기에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 방법은 생물반응기를 이용하여 수행될 수 있다. 세포 및 매질은 이에 제한되지는 않지만, 포트(port), 파이프, 튜브, 호스 및/또는 본 기술분야에 알려진 기타 유입 장치를 포함하는 유입을 통하여 생물반응기로 제공될 수 있다. 세포, 매질, 및/또는 영양소를 반응기로 공급하기 위하여 다수의 유입구가 사용될 수 있다.
하나 이상의 센서, 및 하나 이상의 제어기를 포함하는 제어 시스템을 사용하여 반응기 내 조건을 제어할 수 있다. 제어기는 이에 제한되지는 않지만, 프로세서, 마이크로프로세서 또는 본 기술분야에 알려진 기타 제어기를 포함할 수 있다. 반응기 조건을 제어하는데 이용되는 정보는 하나 이상의 센서 및/또는 이용자로부터 제어기에 제공될 수 있다.
센서는 반응기 내 조건을 측정하는데 사용될 수 있으며, 이는 이에 제한되지는 않지만, pH, 조성, 거품 존재, 거품량, 압력, 침전물의 존재, 침전물의 양 및/또는 본 기술분야에서 알려진 임의의 기타 관련 측정치를 포함한다. 특정 위치에서의 조건을 결정하기 위하여, 다수의 센서가 반응기 주변에 배치될 수 있다. 예로서, 침전물의 양 또는 존재를 결정하기 위한 센서는 일부 실시양태에서 반응기의 바닥에 가장 근접하여 배치될 수 있다. 실시양태는 유입 개구에 가장 근접한, 탱크 내 각종 위치, 및/또는 관심 대상의 임의의 위치에서의 거품의 존재를 결정하기 위한 센서를 포함할 수 있다. 본 기술 분야에서 알려진 임의의 센서가 사용될 수 있다.
일부 실시양태는 관찰을 위하여 탱크에 창 또는 개구를 포함할 수 있다. 일부 반응기는 반응기 내 조건의 관찰을 위하여 반응기 내에 배치된 조명을 포함할 수 있다. 작동자는 탱크 내 조건을 관찰할 수 있으며, 탱크 내 조건을 조절하기 위하여 하나 이상의 제어기에 연결된 사용자 인터페이스로 데이터를 입력할 수 있다.
예로서, 센서 및/또는 사용자 입력으로부터의 데이터에 기초하여, 반응기 내 필요에 따라 밸브를 개폐할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유입시 밸브는 영양소, 버퍼, 매질, 생물 및/또는 기타 성분의 첨가를 제어할 수 있다.
일부 실시양태는 세포가 반응기의 내부 챔버 내에서 성장하도록 하는 것을 포함할 수 있다. 영양소, 매질 및 세포는 관심 대상의 생물의 성장을 최적화하기에 충분한 비율로 반응기에 첨가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 첨가된 재료의 조성은 관심 대상의 성분의 생산을 최적화하기위하여 제어된다. 예로서, 관심 대상의 성분은 단백질 또는 화합물일 수 있다.
일부 실시양태에서, 관심 대상의 성분의 농도가 증가함에 따라, 거품형성이 발생하기 시작할 수 있다. 창 및/또는 센서는 반응기 내에서 거품형성을 탐지하는데 사용될 수 있다. 예로서, 센서 또는 창은, 거품형성이 발생하는지의 여부를 확인하기 위하여 사용될 수 있다. 일단 거품형성이 탐지되면, 제어기는 침전제가 반응기에 첨가되도록 지시할 수 있다. 일부 실시양태에서, 침전제는 관심 대상의 성분이 용액에서 석출되도록 할 수 있다. 침전된 성분은 반응기 바닥에 축적될 수 있다.
일부 실시양태는, 침전물의 존재 여부 및/또는 존재하는 침전물의 양을 결정하기 위하여 반응기의 바닥에 최근접하여 배치된 하나 이상의 센서를 포함할 수 있다. 이들 센서는 하나 이상의 제어기와 통신할 수 있다. 제어기는 침전물을 반응기에서 배출시키기 위하여, 이러한 입력을 반응기 바닥에 최근접한 밸브를 개방할지를 결정하는데 사용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 유입 및 배출시 재료의 이동을 용이하게 하기 위하여 유입 및 배출에 따라 펌프가 이용된다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 일부 실시양태는 반응기 (100)를 이용한 방법의 수행을 포함할 수 있다. 세포, 매질, 및/또는 영양소는 유입구 (102)를 통하여 반응기 (100)로 제공될 수 있다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 유입구 (102)는 생물 및/또는 매질의 용기로의 전달을 제어하는데 사용되는 밸브 (104)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 다수의 유입구가 이용되어 생물 및/또는 매질을 반응기의 상이한 위치들에 전달할 수 있다. 일부 실시양태에서, 도 3에 나타낸 바와 같이, 세포 및 매질은 유입구 (102)를 통하여 제공된다. 다수의 센서 (106)가 반응기 (100) 전체에 걸쳐 여러 위치에 배치될 수 있다. 센서 (106)는 제어기 (108, 110)에 데이터를 제공한다. 제어기 (108, 110)는 세포, 매질, 영양소, 침전제 및/또는 기타 성분을 제어할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제어기는 반응기, 유입구, 및/또는 배출구 내 조건을 제어하기 위해 조절을 할 수 있다.
일부 실시양태는 세포를 반응기의 내부 챔버 내에서 성장하도록 하는 것을 포함할 수 있다. 관심 대상의 성분의 농도가 증가함에 따라 거품형성이 발생 시작할 수 있다. 일부 실시양태에서, 창 및/또는 센서는 반응기에서 거품형성을 탐지하는데 사용될 수 있다. 일단 거품형성이 탐지되면, 침전제를 반응기에 첨가할 수 있다. 일부 실시양태에서, 침전제는 관심 대상의 성분이 용액에서 석출되도록 할 수 있다. 침전된 성분은 센서 (106)를 이용하여 검출될 수 있다. 일부 실시양태에서, 사용자가 반응기 내 조건을 관찰할 수 있도록 창 (116)이 반응기 (100)에 존재할 수 있다.
제어기 (108)는 배출구 밸브 (112)에 연결된다. 제어기 (110)는 침전물이 배출구 (114)를 통하여 탱크에서 나갈 수 있도록 밸브 (112)의 개방을 지시할 수 있다. 일부 실시양태에서, 사용자는 입력은 필요에 따라 밸브 (112)를 개방 및/또는 폐쇄하도록 지시하는 제어를 가능하게 할 수 있다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 공기, 산소 또는 본 기술분야에서 알려진 임의의 기타 영양소를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 영양소는 유입구 (118)를 이용하여 반응기에 제공될 수 있다. 유입구 (118)는 영양소를 반응기 (100)에 제공하기 위하여 전달 장치 (120)에 결합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 전달 장치는 반응기에서 임의의 위치에 배치될 수 있다. 일부 실시양태는 반응기 내 성분의 혼합을 촉진하기 위한 혼합기 (122)를 포함한다.
본 발명 및 이의 장점을 상세하게 설명하였으나, 첨부된 특허청구범위에서 정의되는 바와 같은 본 발명의 기술사상 및 범주에서 벗어나지 않으면서, 다양한 변화, 치환 및 변경이 본 발명에 만들어질 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명은 하기 실시예들에서 더욱 상술될 것이며, 이들 실시예는 단지 예시 목적으로 제공되는 것이지, 본 발명을 어떤 방식으로든 제한하고자 의도된 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 청징화된 미정제 하이드로포빈 용액
황산나트륨과 pH 조절을 이용한, 청징화된 하이드로포빈에서의 거품 형성 감소 방법이 본 실시예에서 제시된다. 하이드로포빈 용액은 기존 생산 방법을 이용하여 수득하였다. 하이드로포빈 용액의 농도는 33 g/㎏이었다. 황산나트륨 처리는 온건하게 혼합하고 용해되도록 두어, 최종 농도 2.5% 중량/중량에 도달하도록 무수 황산나트륨을 첨가함으로써 달성되었다. 1% 황산을 이용하여 pH를 4.0으로 조절하였다. 용액을 16시간 동안 10℃에서 혼합하였다. 2 × 5mL의 Na2SO4로 처리된 농축물을 원심분리하여 액체 부분을 제거하였다. 각 침전물을 최초의 물 중 하이드로포빈 농축물과 동일한 부피로 재현탁시켰다. 스패츌러를 이용하여 침전물들을 해체하고 재현탁시켰다. 2 × 5mL의 미처리된 하이드로포빈 농축물을 제조하였다. 농축물 중 하나 및 Na₂SO₄ 처리된 농축물 중 하나를 진탕하여 혼합하였다.
사진을 촬영하고, 각 튜브의 총 부피를 즉시, 그리고 4시간 후에 기록하였다. 결과를 표 1에 나타내었다. 황산나트륨 처리 용액의 가용성 하이드로포빈 농도는 1 g/L이었다. 황산나트륨 첨가 후 하이드로포빈의 97%가 불용성이었다.
[표 1]

실시예 2: 정제된 하이드로포빈 용액
가열을 이용한 하이드로포빈 용액의 거품 형성 감소 방법이 본 실시예에서 제시된다. 하이드로포빈 용액의 농도는 130 g/㎏이었다. 500 mL 파이렉스 중에 320 g의 하이드로포빈 용액을 혼합했을 때, 거품이 병의 상부 빈 공간을 채웠다(도 1 왼쪽 사진). 또다른 유사하게 혼합된 하이드로포빈 용액을 80℃로 가열한 경우, 퇴적물이 형성되었으며 거품이 붕괴되었다 (도 1 오른쪽 사진). 결과를 표 2에 나타내었다.
[표 2]

실시예 3: 통상의 기술을 이용한 발효
표 3은 재조합 셀룰라아제 또는 재조합 하이드로포빈 중 어느 하나를 발현하는 트리코더마 리세이를 발효시키기 위한 통상적인 시도의 경우, 배양액의 배양액 외관을 설명한다. 발효 매질 및 조건, 및 수확 절차는 동일하였다. 발효 종료시, 발현되는 타겟 분자는 두 경우 모두에서 완전히 가용성이었다. 표 3에 결과를 나타내었다.
[표 3]

실시예 4: 하이드로포빈 배양액 거품 감소
도 3 및 도 4에 나타낸 것과 같이, 통상의 발효 및 수확 기술을 이용하여 재조합 하이드로포빈을 발현한 트리코더마 리세이를 배양함으로써 제조된 발효 배양액 중 거품 감소를 위한 황산나트륨의 이용이 본 실시예에서 제시된다.
수확 배양액을 2.5% 황산나트륨으로 처리하고, 28℃에서 2 시간 동안, 10% 황산을 이용하여 pH를 3.9로 조절하고, 10℃에서 저장하였다. 처리된 배양액은 0.2 g/㎏의 가용성 하이드로포빈을 가졌다.
실시예 5: 하이드로포빈 발효 배양액 거품 감소
통상의 발효 및 수확 기술을 이용하여 재조합 하이드로포빈을 발현한 트리코더마 리세이를 배양함으로써 제조된 발효 배양액 중 거품 감소를 위한 황산암모늄의 이용이 본 실시예에서 제시된다.
수확 배양액을 22℃에서 5% 황산암모늄으로 처리하였다. 결과의 배양액은 처리 후 어떤 거품도 포함하지 않았으며, 바늘 형태의 하이드로포빈 결정을 포함하였다.
실시예 5: 하이드로포빈 발효물 수확 동안 거품 제어
재조합 하이드로포빈을 발현한 통상적으로 발효된 트리코더마 리세이 배양액의 수확 동안 거품의 제어방법이 본 실시예에서 제시된다. 하이드로포빈을 발효하기 위한 기존 방법과 관련된 거품 넘침 문제는 수확 동안 악화되었다. 수확 동안, 발효기의 가압된 내용물은 주위 압력으로 되돌려져야만 하며, 이는 용해된 공기의 아웃개싱(outgassing)을 일으킨다. 놀랍게도, 이러한 거품형성 성향은 침전제, 특이적으로 황산나트륨을 발효 배양액에 첨가함으로써 효과적으로 제어될 수 있다. 배양액 중 하이드로포빈의 침전은 심지어는 감압 동안에도 제어가능한 지점으로 거품형성을 감소시킨다.
발효 종료시 ("발효 종료 배양액"으로 지칭됨), 발효기 작동 파라미터를 하기와 같이 변경시켰다: 기류는 발효기의 빈 상부공간 내로의 공급을 위해 바닥에서 살포기로 방향을 고침, 압력은 137.9 kPa (20 psig)에서 유지, 온도는 28℃에서 유지, 및 교반은 160 rpm에서 유지. 15% 중량/중량 Na₂SO₄ 및 pH 2.8의 황산나트륨 저장 용액을, 결과로서 생성되는 배양액이 Na₂SO₄의 농도 = 2.5 %에 도달할 때까지, 분당 6리터의 속도로 발효기 내로 펌핑하였다. 결과로서 생성되는 배양액은 pH 4 ("Na₂SO₄ / pH 4 감압전 배양액"으로 지칭됨)였다. 그 후, 기류를 1600 LPM에서 100 LPM으로 감소시키는 동시에 압력을 137.9 kPa (20psig)에서 0 Pa (0 psig)로 저하시킴으로써 발효기를 서서히 감압시켰으며, 이들 둘 모두 1시간에 걸쳐 선형적으로 감소시켰다. 배양액은 "Na₂SO₄ / pH 4 감압된 배양액"으로 지칭된다. 감압 후, 배양액은 28℃의 발효기 내에 유지되었으며, 혼합하면서 pH를 감독하고 pH에서의 변화가 관찰되지 않을 때까지 pH를 4로 조절하였다. 배양액은 "Na₂SO₄ / pH 4 수확 배양액(Harvest Broth)으로 지칭하였다.
표 4는 수확 처리의 각종 단계 동안 취한 배양액 샘플의 물리적 외관 결과를 보여준다. 처리는　배양액의　밀도를　0.605 g/mL에서 1.042 g/m로　증가시켰다. 오버런은　출발　중량을　이용하여　계산된다.　처리된　배양액　가용성　하이드로포빈 농도는　0.2 g/㎏로, 미처리된　배양액의　그　농도보다　약 26배　더　낮다.
[표 4]

실시예 7: 하이드로포빈 발효 동안 거품 제어
발효　동안　거품　넘침이　방지된　채로　발효가　여전히　진행되는　한편,　발현된　하이드로포빈을　배양액　중에서　불용성으로　만들기　위하여　발효　매질　및　조건을　변경함에　의한　통상적인　발효　기술의　변경이　본　실시예에서　제시된다. 표 5에 변경사항 및 결과를 나타내었다. 변경이 있는 모든 시험작업(run)에 대한 수확 배양액의 상청액 중 하이드로포빈의 농도는 0.5 g/㎏ 미만이었다.
[표 5]

실시예 8: 하이드로포빈 발효 동안 거품억제제 이용 감소
거품 넘침을 방지하기 위하여 요구되는 거품억제제의 양이 감소된 채로 발효가 여전히 진행되는 한편, 발현된 하이드로포빈을 배양액 중에서 불용성으로 만들기 위하여 발효 매질 및 조건을 변경함에 의한 통상적인 발효 기술의 변경이 본 실시예에서 제시된다.
통상의 발효 시험작업에서는 33 g/㎏의 거품억제제가 측정되었으며, 이는 "하이드로포빈 발효 동안 거품 제어"에서 상기 나타낸 변경된 발효법보다 6.1 - 7.5-배 더 높은 것이었다.
실시예 9: 하이드로포빈 조성물
변경된 발효법을 이용하여 생산된 하이드로포빈의 조성물을 도 2에 나타내었다. 매스 7180에서의 피크는 전장 하이드로포빈 분자에 해당하였다.
실시예 10: 람노리피드의 청징화된 용액 중 거품 감소
청징화된 람노리피드 (제품 JBR515 로트번호 110321, 400 N. Dekora Woods Blvd, Saukville, WI 53080 소재의 Jeneil Biosurfactant Co., LLC로부터 선사받음) 용액 중 거품 형성에서의 감소를, pH 조절, 염화나트륨, 염화칼슘, 황산나트륨 및 양이온 중합체 C581 (Cytec Industries, Woodland Park, NJ 07424) 처리 후 측정하였다. 람노리피드 용액은 0.21 g의 JBR515를 93 g의 탈이온수에 첨가하여 제조하고, 5분 동안 온건히 혼합하였다.
거품 형성에서의 감소를 시험하기 위하여, 제조된 용액 5 g을 깨끗한 15-mL 원뿔형 튜브로 옮겨넣고, 처리 화학물질을 첨가하였으며, 상기 튜브를 그 화학물질이 분산 또는 용해될 때까지 온건하게 뒤집으며 혼합하였다. 처리 용액 및 미처리 용액을 20분 동안 진탕시키고, 디지털 카메라를 이용하여 즉시 샘플 외관을 포착하였다. 샘플의 액체 부분 외관을 미처리 샘플에 대조하여 시각 검사로 평가하였다. 각 진탕 용액이 차지하는 부피를 기록하고, 오버런 및 거품 감소 지수를 계산하여, 표 6에 나타내었다. HACH 2100AN 탁도계 (Hach Company, Loveland, Colorado)를 이용하여 탁도를 측정하고, 표 6에 NTU (네펠로미터 탁도계 단위(Nephelometric Turbidity Units)) 값으로 나타내었다.
[표 6]

실시예 11: 소포로리피드 청징화된 용액 중에서의 거품 감소
청징화된 소포로리피드 (제품 SO_SOPHS 로트번호 10175A, SoliancE, Route de Bazancourt 51110 Pomacle, France) 용액 중 거품 형성에서의 감소를, pH 조절, 염화나트륨, 염화칼슘, 황산나트륨 및 양이온성 중합체 C581 처리 후 측정하였다. 소포로리피드 용액은 0.28 g의 SO_SOPHS를 122 g의 탈이온수에 첨가하여 제조하고, 1 N NaOH를 이용하여 pH를 10.1으로 조절하였다. pH 조절 동안 용액을 온건히 혼합하였다. 거품 형성에서의 감소는 상기 람노리피드 청징화 용액 부분에서 설명된 것과 같이 측정하였다. 각 진탕 용액이 차지하는 부피를 기록하고, 오버런 및 거품 감소 지수를 계산하여, 표 7에 나타내었다. HACH 2100AN 탁도계 (Hach Company, Loveland, Colorado)를 이용하여 탁도를 측정하고, 표 7에 NTU (네펠로미터 탁도계 단위) 값으로 나타내었다.
[표 7]

실시예 12: 서팩틴 청징화 용액 중에서의 거품 감소
청징화된 서팩틴 (부품번호 S3523-50MG, Sigma Alrich, P.O. Box 951524 Dallas, TX 75395-1524) 용액 중 거품 형성에서의 감소를, pH 조절, 염화나트륨, 염화칼슘, 황산나트륨 처리 후 측정하였다. 2.03 g의 탈이온수를 서팩틴을 담고 있는 바이알에 직접 첨가하여 서팩틴 저장 용액을 제조하고, 1N NaOH를 이용하여 pH를 6-7 (pH 스트립지로 측정)로 조절하였다. 8.9 g의 탈이온수를 0.79 g의 저장 용액에 첨가하여, 저장 용액을 더욱 희석시켰다. 거품 형성에서의 감소는 상기 람노리피드 청징화 용액 부분에서 설명된 것과 같이 측정하였다. 샘플의 액체 부분 외관을 미처리 샘플에 대조하여 시각 검사로 평가하였다. 표 8은 수행된 처리 각각에 대한 액체 부분의 오버런, 거품 감소 지수, 및 외관을 보여준다.
[표 8]

표 9는 실온에서 0.5시간 동안 유지된, 처리 및 미처리된 용액에 대한 액체 부분의 오버런, 거품 감소 지수 및 외관을 보여준다.
[표 9]

실시예 13: 람노리피드를 포함하는 바실러스 리체니포르미스 발효 배양액에서의 거품 감소
람노리피드를 포함하는 바실러스 리체니포르미스 발효 배양액 (실시예 10에 기재됨) 중 거품 형성에서의 감소를, pH 조절, 염화나트륨, 염화칼슘, 황산나트륨 및 양이온 중합체 C581 처리 후 측정하였다. 5.65 g의 JBR515을 본 기술분야에서 알려진 기술을 이용하여 생산된 100 g의 바실러스 리체니포르미스 발효 배양액에 첨가하고, 용액을 5분 동안 온건히 혼합하였다. 결과의 배양액 용액의 pH는 6.52였다. 거품 형성에서의 감소는 람노리피드 청징화 용액 부분에서 설명된 것과 같이 측정되었다. 표 10은 수행된 각 처리의 오버런 및 거품 감소 지수를 보여준다.
[표 10]

실시예 14: 람노리피드를 포함하는 트리코더마 리세이 발효 배양액 중 람노리피드
람노리피드를 포함하는트리코더마 리세이 발효 배양액 (실시예 10에 기재됨) 중 거품 형성에서의 감소를, 출발 용액으로부터의 pH 조절 및/또는 염화나트륨, 황산나트륨 및 양이온 중합체 C581 처리 후 측정하였다. 6.53 g의 JBR515을 28 g의 탈이온수 및 본 기술분야에서 알려진 기술을 이용하여 생산된 100 g의트리코더마 리세이 발효 배양액에 첨가하고, pH를 6.15로 조절하고, 5분 동안 온건히 혼합하였다. 거품 형성에서의 감소는 람노리피드 청징화 용액 부분에서 설명된 것과 같이 측정되었다. 거품 형성에서의 감소를 즉시, 그리고 30분 후에 측정하였으며, 이에 따라 감소된 거품형성이 또한 유지되었다. 표 11은 수행된 각 처리에 대한 오버런 및 거품 감소 지수를 나타낸다.
[표 11]

실시예 15: 람노리피드를 포함하는 바실러스 서브틸리스 발효 배양액에서 거품 감소
람노리피드를 포함하는 바실러스 서브틸리스 발효 배양액 (람노리피드 청징화 용액 부분에서 설명됨) 중 거품 형성에서의 감소를, pH 조절 및/또는 염화나트륨, 염화칼슘, 황산나트륨 및 양이온 중합체 C581 처리 후 측정하였다. 2.71 g의 JBR515을 본 기술분야에서 알려진 기술을 이용하여 생산된 40.1 g의 바실러스 서브틸리스 발효 배양액에 첨가하고, 용액을 5분 동안 온건히 혼합하였다. 거품 형성에서의 감소는 람노리피드 청징화 용액 부분에서 설명된 것과 같이 측정되었다. 표 12는 수행된 각 처리에 대한 오버런 및 거품 감소 지수를 보여준다.
[표 12]

실시예 16: 소포로리피드를 포함하는 바실러스 리체니포르미스 발효 배양액에서의 거품 감소
pH 조절, 염화나트륨, 염화칼슘, 황산나트륨 및 양이온 중합체 C581 처리를 이용하여, 소포로리피드를 포함하는 바실러스 리체니포르미스 발효 배양액 (소포로리피드 청징화 용액 부분에서 설명됨) 용액 중 거품 형성에서의 감소를 측정하였다. 7.63 g의 SO_SOPHS를 본 기술분야에서 알려진 기술을 이용하여 생산된 102.2 g의 바실러스 리체니포르미스 발효 배양액에 첨가하고, 용액을 5분 동안 온건히 혼합하였다. 결과의 배양액 용액의 pH는 7.23으로 조절하였다. 거품 형성에서의 감소는 람노리피드 청징화 용액 부분에서 설명된 것과 같이 측정되었다. 표 13은 수행된 각 처리에 대한 오버런 및 거품 감소 지수를 보여준다.
[표 13]

실시예 17: 소포로리피드를 포함하는 트리코더마 리세이 발효 배양액에서의 거품 감소
pH 조절 및/또는, 염화나트륨, 염화칼슘, 황산나트륨 및 양이온 중합체 C581 처리를 이용하여, 소포로리피드를 포함하는 T. 리세이 발효 배양액 (소포로리피드 청징화 용액 부분에서 설명됨) 용액에서 거품 형성의 감소를 측정하였다. 5.5 g의 SO_SOPHS를 28 g의 탈이온수 및 본 기술분야에서 알려진 기술을 이용하여 생산된 100.2 g의 T. 리세이 발효 배양액에 첨가하고, 이 용액을 5분 동안 온건히 혼합하였다. 거품 형성에서의 감소는 람노리피드 청징화 용액 부분에서 설명된 것과 같이 측정되었다. 표 14는 수행된 각 처리에 대한 오버런 및 거품 감소 지수를 나타낸다 (ND-측정되지 않음).
[표 14]

실시예 18: 소포로리피드를 포함하는 바실러스 서브틸리스 발효 배양액에서의 거품 감소
소포로리피드를 포함하는 바실러스 서브틸리스발효 배양액 (소포로리피드 청징화 용액 부분에서 설명됨) 용액 중 거품 형성에서의 감소를, pH 조절 및/또는 염화나트륨, 염화칼슘, 황산나트륨 및 양이온성 중합체 C581 처리를 이용하여 측정하였다. 2.61 g의 SO_SOPHS를 본 기술분야에서 알려진 기술을 이용하여 생산된 40.6 g의 B. 서브틸리스 발효 배양액에 첨가하고, 이 용액을 5분 동안 온건히 혼합하였다. 결과의 배양액의 pH는 7.27이었다. 거품 형성에서의 감소는 람노리피드 청징화 용액 부분에서 설명된 것과 같이 측정되었다. 표 15는 수행된 각 처리에 대한 오버런 및 거품 감소 지수를 나타낸다.
[표 15]

실시예 19: 서팩틴을 포함하는 바실러스 서브틸리스 발효 배양액 중 거품 감소
서팩틴을 포함하는 바실러스 서브틸리스 발효 배양액 (서팩틴 청징화 용액 부분에서 설명됨)에서의 거품 형성에서의 감소를, 이후의 염화나트륨 처리를 이용하여 측정하였다. 2.03 g의 탈이온수를 서팩틴을 담고 있는 바이알에 직접 첨가하여 서팩틴 저장 용액을 제조하고, 1N NaOH를 이용하여 pH를 6-7 (pH 스트립지로 측정)로 조절하였다. 0.71 g의 저장 용액을, 본 기술분야에서 알려진 기술을 이용하여 제조된 1.9 g의 B. 서브틸리스 발효 배양액에 첨가하고, 이 용액을 5분 동안 온건히 혼합하여 저장 용액을 더욱 희석시켰다. 이 서팩틴 포함 배양액을 20 회 진탕시키고, 진탕된 샘플의 외관을 디지털 카메라를 이용하여 포착하였다. 0.022 g의 NaCl을 동일한 서팩틴 포함 배양액에 첨가하고, 20회 진탕하고, 촬영하였다. 추가의 0.046 g 및 0.032 g의 NaCl을 동일한 배양액에 순차적으로 첨가하고, 배양액을 20 회 진탕하고, 촬영하였다. 표 16은 각 처리 후 배양액 중 총 NaCl 농도 및 각 처리 후 대응 오버런 및 거품 감소 지수를 나타낸다.
[표 16]

실시예 20: 서팩틴을 포함하는 바실러스 리체니포르미스 발효 배양액에서의 거품 감소
서팩틴을 포함하는 바실러스 리체니포르미스 발효 배양액 (서팩틴 청징화 용액 부분에서 설명됨)에서의 거품 형성의 감소를, 염화칼슘 처리 후 측정하였다. 2.03 g의 탈이온수를 서팩틴을 담고 있는 바이알에 직접 첨가하여 서팩틴 저장 용액을 제조하고, 1N NaOH를 이용하여 pH를 6-7 (pH 스트립지로 측정)로 조절하였다. 0.71 g의 저장 용액을 본 기술분야에서 알려진 기술을 이용하여 제조된 1.9 g of B. 리체니포르미스 발효 배양액에 첨가하고, 이 용액을 5분 동안 온건히 혼합하여, 저장 용액을 더욱 희석시켰다. 이 서팩틴 포함 배양액을 20 회 진탕시키고, 진탕된 샘플의 외관을 디지털 카메라를 이용하여 포착하였다. 0.025 g의 CaC_l2를 동일한 서팩틴 포함 배양액에 첨가하고, 20 회 진탕하고, 촬영하였다. 추가의 0.021 g CaCl₂를 동일한 포함 배양액에 첨가하고, 20 회 진탕하고, 촬영하였다. 표 17은 각 처리 후 배양액 중 총 염화칼슘 농도 및 각 처리에 따른 대응 오버런 및 거품 감소 지수를 보여준다.
[표 17]

도 4는 상기 기재된 각 처리 후 샘플의 외관을 나타낸다.
본 발명은 하기 번호매긴 단락에 의하여 더욱 설명된다:
1. 숙주 세포가 세포 밖으로 생물계면활성제를 분비하고 생물계면활성제가 발효 매질 중에 가용성인 경우, 발효 매질 중에서 숙주 세포에 의한 그 생산 동안 거품을 형성하는 생물계면활성제의 거품형성 제어 방법으로서, 숙주 세포에 의한 생물계면활성제의 생산과 동시에, 생물계면활성제를 불용화하고, 그로써 불용화된 생물계면활성제가 거품을 형성하지 않음에 따라 거품형성이 제어되는 것을 포함하는 방법.
2. 제 1 단락에 있어서, 생물계면활성제는 하이드로포빈 II, 람노리피드, 소포로리피드 또는 서팩틴을 포함하는 방법.
3. 제 2 단락에 있어서, 불용화는 발효 매질에 침전제의 첨가 및/또는 발효매질의 pH 저하 및/또는 발효 매질의 온도 증가를 포함하는 것인 방법.
4. 제 3 단락에 있어서, 불용화는 발효 매질에 침전제를 첨가하는 것을 포함하는 방법.
5. 제 4 단락에 있어서, 침전제는 염, 알코올, 수혼화성 유기 용매, 수용성 중합체 또는 양이온성 중합체인 방법.
6. 제 5 단락에 있어서, 침전제는 그 음이온으로서 할라이드, 구연산염, 초산염, 나이트레이트, 탄산염; 황산염; 인산염; 술파메이트; 포스포네이트, 술파메이트를 포함하거나, 또는 아질산염이고, 그 양이온으로서 암모늄, 칼슘, 철, 마그네슘, 리튬, 칼륨 또는 나트륨을 포함하는 염인 방법.
7. 제 6 단락에 있어서, 염은 황산염 또는 염화염인 방법.
8. 제 7 단락에 있어서, 염화염은 염화칼슘 또는 염화나트륨이고, 황산염은 황산암모늄 또는 황산나트륨인 방법.
9. 제 5 단락에 있어서, 침전제는 알코올이고, 알코올은 1가 또는 다가 알코올 C_1-C₆ 알코올인 방법.
10. 제 5 단락에 있어서, 침전제 용매는 케톤인 방법.
11. 제 10 단락에 있어서, 케톤은 아세톤인 방법.
12. 제 5 단락에 있어서, 침전제는 폴리에틸렌 글리콜 또는 다당류인 방법.
13. 제 12 단락에 있어서, 다당류는 덱스트란인 방법.
14. 제 9 단락에 있어서, 침전제는 메탄올, 에탄올 또는 아이소프로필 알코올을 포함하는 방법.
15. 제 3 단락에 있어서, 불용화는 발효 매질의 pH 저하 및/또는 발효 매질의 온도 증가를 포함하는 방법.
16. 제 1 내지 제 15 단락 중 어느 하나에 있어서, 거품 감소 지수는 1 초과, 및/또는 거품 감소 지수는 2 초과, 및/또는 거품 감소 지수는 3 초과이고; 및/또는 발효 매질 중 가용성 생물계면활성제의 농도가 약 1 g/㎏ 이하이고; 및/또는 생산된 생물계면활성제의 적어도 25%가 불용화되고; 및/또는 본 방법은 거품억제제 첨가 없이 수행되고; 및/또는 본 방법은, 불용화 없이 가동된 방법에 비교시, 감소된 양의 거품억제제를 이용하여 수행되고; 및/또는 본 방법은 pH를 상승 또는 저하시킴으로써 수행되고 및/또는 본 방법은 온도를 상승 또는 저하시킴으로써 수행되는 방법.
17. 제 1 내지 제 15 단락 중 어느 하나에 있어서, 본 방법은, 발효 매질을 생물반응기로 공급하고, 침전제를 첨가하거나 또는 침전 조건을 적용하고, 불용화된 생물계면활성제를 채집하고, 그리고 발효 매질 또는 그 성분 또는 숙주 세포를 보충하고; 그리고 선택적으로, 불용화된 생물계면활성제와 함께 채집된 임의의 발효 매질 또는 그 성분 또는 숙주 세포를 재순환시키는 것을 포함하는 연속 공정인 방법.
18. 제 16 단락에 있어서, 본 방법은, 발효 매질을 생물반응기로 공급하고, 침전제를 첨가하거나 또는 침전 조건을 적용하고, 불용화된 생물계면활성제를 채집하고, 그리고 발효 매질 또는 그 성분 또는 숙주 세포를 보충하고; 그리고 선택적으로, 불용화된 생물계면활성제와 함께 채집된 임의의 발효 매질 또는 그 성분 또는 숙주 세포를 재순환시키는 것을 포함하는 연속 공정인 방법.
19. 숙주 세포가 세포 밖으로 생물계면활성제를 분비하고 생물계면활성제가 발효 매질 중에 가용성인 경우, 발효 매질 중에서 숙주 세포에 의한 그 생산 동안 거품을 형성하는 생물계면활성제의 거품형성 제어 방법으로서, 숙주 세포에 의한 생물계면활성제의 생산과 동시에, 생물계면활성제를 불용화하고, 그로써 불용화된 생물계면활성제가 거품을 형성하지 않음에 따라 거품형성이 제어되는 것을 포함하고, 여기에서 거품 감소 지수는 1 초과, 및/또는 거품 감소 지수는 2 초과, 및/또는 거품 감소 지수는 3 초과이고; 및/또는 발효 매질 중 가용성 생물계면활성제의 농도는 약 1 g/㎏ 이하이고; 및/또는 생산된 생물계면활성제의 적어도 25%는 불용화되고; 및/또는 본 방법은 거품억제제의 첨가 없이 수행되고; 및/또는 본 방법은 생물계면활성제를 불용화하지 않고 수행된 방법에 비교하여, 감소된 양의 거품억제제를 이용하여 수행되고; 및/또는 본 방법은 pH를 상승 또는 저하시킴으로써 수행되고 및/또는 본 방법은 온도를 상승 또는 저하시킴으로써 수행되는 것인 방법.
20. 제 19 단락에 있어서, 생물계면활성제는 하이드로포빈 II, 람노리피드, 소포로리피드 또는 서팩틴을 포함하는 방법.
21. 제 19 또는 제 20 단락에 있어서, 불용화는 발효 매질에 침전제를 첨가하는 것을 포함하거나 또는 본질적으로 이루어지는 것인 방법.
22. 제 21 단락에 있어서, 침전제는 그 음이온으로서 할라이드, 구연산염, 초산염, 질산염, 탄산염; 황산염; 인산염; 술파메이트; 포스포네이트, 술파메이트를 포함하거나 또는 아질산염이고, 그 양이온으로서 암모늄, 칼슘, 철, 마그네슘, 리튬, 칼륨 또는 나트륨을 포함하는 염을 포함하거나 또는 이로 본질적으로 이루어지는 것인 방법.
23. 제 22 단락에 있어서, 염은 황산염을 포함하거나 또는 본질적으로 이루어지는 것인 방법.
24. 제 21 단락에 있어서, 침전제는 알코올을 포함하거나 또는 알코올로 본질적으로 이루어지는 것인 방법.
25. 생산 동안 거품을 형성하는 용액 중 생물계면활성제의 거품형성 제어 방법으로서:
생물계면활성제의 생산 동안 조건이 거품 형성을 일으킬 수 있는 지점에서, 동시적으로 생물계면활성제를 불용화하고, 이로써 불용화된 생물계면활성제가 거품을 형성하지 않음에 따라 거품형성이 제어되는 것인 방법.
26. 제 25 단락에 있어서, 용액은 발효 매질을 포함하고, 여기에서 생산은 발효 매질 중에서 숙주 세포에 의한 생물계면활성제의 발현을 포함하고, 여기에서 숙주 세포는 생물계면활성제를 세포밖으로 분비하고 그 생물계면활성제는 발효 매질 중에 가용성이고, 이러한 조건이 거품 형성을 일으킬 수 있는 것인 방법.
27. 제 25 단락에 있어서, 생산은 거품 형성을 일으킬 수 있는 조건의 진공 여과를 포함하는 방법.
28. 제 25 단락에 있어서, 생산은 거품 형성을 일으킬 수 있는 조건의 수확을 포함하는 방법.
29. 제 25 단락에 있어서, 생산은 거품 형성을 일으킬 수 있는 조건의 채집을 포함하는 방법.
30. 제 25 단락에 있어서, 생산은 거품 형성을 일으킬 수 있는 조건의 압착을 포함하는 방법.
31. 제 25 단락에 있어서, 생산은 거품 형성을 일으킬 수 있는 조건의 방혈을 포함하는 방법.
32. 제 25 단락에 있어서, 생산은 거품 형성을 일으킬 수 있는 조건의 잘게자름을 포함하는 방법.
33. 제 25 단락에 있어서, 생산은 거품 형성을 일으킬 수 있는 조건의 균질화를 포함하는 방법.
34. 제 25 단락에 있어서, 생산은 거품 형성을 일으킬 수 있는 조건의 매싱을 포함하는 방법.
35. 제 25 단락에 있어서, 생산은 거품 형성을 일으킬 수 있는 조건의 달임을 포함하는 방법.
36. 제 25 단락에 있어서, 생산은 거품 형성을 일으킬 수 있는 조건의 회수를 포함하는 방법.
37. 제 25 단락에 있어서, 생산은 거품 형성을 일으킬 수 있는 조건의 고체-액체 분리를 포함하는 방법.
38. 제 25 단락에 있어서, 생산은 거품 형성을 일으킬 수 있는 조건의 원심분리를 포함하는 방법.
39. 제 25 단락에 있어서, 생산은 거품 형성을 일으킬 수 있는 조건의 세포분리를 포함하는 방법.
40. 제 25 단락에 있어서, 생산은 거품 형성을 일으킬 수 있는 조건의 임의의 환기 공정을 포함하는 방법.
41. 제 25 단락에 있어서, 생산은 액체를 펌핑, 및/또는 설비를 충전, 및/또는 설비를 비움, 및/또는 설비를 청소, 및/또는 설비를 헹구는 것을 포함하며, 이러한 조건이 거품 형성을 일으킬 수 있는 방법.
42. 제 25 단락에 있어서, 생물계면활성제는 하이드로포빈 II, 람노리피드, 소포로리피드 또는 서팩틴을 포함하는 방법.
43. 제 25 단락에 있어서, 생물계면활성제의 불용화는:
침전제를 용액에 첨가하고;
용액의 pH를 저하 또는 상승시키고; 및/또는
용액의 온도를 감소 또는 증가시키는 것을 포함하는 방법.
44. 제 25 단락에 있어서, 생물계면활성제의 불용화는:
침전제를 용액에 첨가하는 것을 포함하는 방법.
45. 제 43 또는 44 단락에 있어서, 침전제는 염, 알코올, 수혼화성 유기 용매, 또는 수용성 중합체 또는 양이온성 중합체인 방법.
46. 제 43 또는 제 44 단락에 있어서, 침전제는 그 음이온으로서 할라이드, 구연산염, 초산염, 질산염, 탄산염; 황산염; 인산염; 술파메이트; 포스포네이트, 술파메이트를 포함하거나, 또는 아질산염이고, 그 양이온으로서 암모늄, 칼슘, 철, 마그네슘, 리튬, 칼륨 또는 나트륨을 포함하는 염을 포함하는 염인 방법.
47. 제 42 단락에 있어서, 염은 염화염 또는 황산염을 포함하는 방법.
48. 제 43 단락에 있어서, 염화염은 염화칼슘 또는 염화나트륨이고, 황산염은 황산암모늄 또는 황산나트륨인 방법.
49. 제 42 단락에 있어서, 침전제는 알코올이고, 알코올은 1가 또는 다가 알코올 C_1-C₆ 알코올인 방법.
50. 제 42 단락에 있어서, 침전제는 메탄올, 에탄올, 또는 아이소프로필 알코올인 방법.
51. 제 25 단락에 있어서, 생물계면활성제의 불용화는:
발효 매질의 pH를 저하 및/또는
발효 매질의 온도 증가를 포함하는 방법.
52. 제 25 내지 51 단락 중 어느 하나에 있어서, 거품 감소 지수는 1 초과, 및/또는 거품 감소 지수는 2 초과, 및/또는 거품 감소 지수는 3 초과이고;
여기에서 본 방법은 거품억제제의 첨가 없이 수행되고;
및/또는 본 방법은 불용화 없이 수행된 방법에 비교하여, 감소된 양의 거품억제제를 이용하여 수행되는 것인 방법.
53. 제 25 내지 51 단락 중 어느 하나에 있어서, 본 방법은:
발효 매질을 생물반응기로 공급하고;
침전제를 첨가하거나 또는 침전 조건을 적용하고;
불용화된 생물계면활성제를 채집하고;
용액 또는 그의 성분 또는 숙주 세포를 보충하고; 그리고 불용화된 생물계면활성제와 함께 채집된 임의의 용액 또는 그의 성분 또는 숙주 세포를 재순환시키는 것을 포함하는, 연속 공정인 방법.
54. 제 25 내지 51 단락 중 어느 하나에 있어서, 용액 중 가용성 생물계면활성제의 농도는 약 10 g/㎏ 미만인 방법.
55. 제 25 내지 51 단락 중 어느 하나에 있어서, 용액 중 가용성 생물계면활성제의 농도는 약 0.1 g/㎏ 내지 약 10 g/㎏의 범위인 방법.
56. 제 25 내지 51 단락 중 어느 하나에 있어서, 용액 중 가용성 생물계면활성제의 농도는 약 0.1 g/㎏ 내지 약 5 g/㎏의 범위인 방법.
57. 제 25-51 단락 중 어느 하나에 있어서, 용액 중 가용성 생물계면활성제의 농도는 약 0.1 g/㎏ 내지 약 1.0 g/㎏의 범위인 방법.
58. 제 25 내지 51 단락 중 어느 하나에 있어서, 생산된 생물계면활성제의 적어도 50%가 불용화되는 것인 방법.
59. 제 25 내지 51 단락 중 어느 하나에 있어서, 생산된 생물계면활성제의 적어도 75%가 불용화되는 것인 방법.
60. 제 25 내지 51 단락 중 어느 하나에 있어서, 생산된 생물계면활성제의 적어도 90%가 불용화되는 것인 방법.
61. 제 25 내지 51 단락 중 어느 하나에 있어서, 생산된 생물계면활성제의 적어도 95%가 불용화되는 것인 방법.
62. 제 25 내지 51 단락 중 어느 하나에 있어서, 용액 중 가용성 생물계면활성제의 농도는 약 0.1 g/㎏ 내지 약 10 g/㎏의 범위이고, 생산된 생물계면활성제의 적어도 50%가 불용화되는 것인 방법.
63. 제 25 내지 51 단락 중 어느 하나에 있어서, 용액은 발효 매질을 포함하는 방법.
64. 생산 동안 거품을 형성하는 생물계면활성제의 거품형성 제어방법으로서:
숙주 세포에 의한 용액 중 생물계면활성제의 생산과 동시에 생물계면활성제를 불용화하고,
하기와 같이 되도록 거품형성을 제어하는 것을 포함하는 방법:
거품 감소 지수는 1 초과, 및/또는 거품 감소 지수는 2 초과, 및/또는 거품 감소 지수는 3 초과이고; 및/또는
용액 중 가용성 생물계면활성제의 농도가 약 1 g/㎏ 이하이고; 및/또는
생산된 생물계면활성제의 적어도 25%는 불용화되고; 및/또는
본 방법은 거품억제제의 첨가 없이 수행되고; 및/또는
본 방법은 불용화 없이 수행된 방법에 비교하여, 감소된 양의 거품억제제를 이용하여 수행됨.
65. 제 64 단락에 있어서, 용액은 발효 매질이고;
여기에서 생산은 발효 매질 중에서 숙주 세포에 의한 생물계면활성제의 발현을 포함하고;
숙주 세포는 생물계면활성제를 세포밖으로 분비하고;
여기에서 생물계면활성제는 거품 형성을 일으킬 수 있는 조건의 발효 매질 중에 가용성인 방법.
66. 제 64 단락에 있어서, 생산은 거품 형성을 일으킬 수 있는 조건의 진공여과를 포함하는 방법.
67. 제 64 단락에 있어서, 생산은 거품 형성을 일으킬 수 있는 조건의 수확을 포함하는 방법.
68. 제 64 단락에 있어서, 생산은 거품 형성을 일으킬 수 있는 조건의 채집을 포함하는 방법.
69. 제 64 단락에 있어서, 생산은 거품 형성을 일으킬 수 있는 조건의 압착을 포함하는 방법.
70. 제 64 단락에 있어서, 생산은 거품 형성을 일으킬 수 있는 조건의 방혈을 포함하는 방법.
71. 제 64 단락에 있어서, 생산은 거품 형성을 일으킬 수 있는 조건의 잘게자름을 포함하는 방법.
72. 제 64 단락에 있어서, 생산은 거품 형성을 일으킬 수 있는 조건의 균질화를 포함하는 방법.
73. 제 64 단락에 있어서, 생산은 거품 형성을 일으킬 수 있는 조건의 매싱을 포함하는 방법.
74. 제 64 단락에 있어서,생산은 거품 형성을 일으킬 수 있는 조건의 달임을 포함하는 방법.
75. 제 64 단락에 있어서, 생산은 거품 형성을 일으킬 수 있는 조건의 회수를 포함하는 방법.
76. 제 64 단락에 있어서, 생산은 거품 형성을 일으킬 수 있는 조건의 고체 액체 분리를 포함하는 방법.
77. 제 64 단락에 있어서, 생산은 거품 형성을 일으킬 수 있는 조건의 원심분리를 포함하는 방법.
78. 제 64 단락에 있어서, 생산은 거품 형성을 일으킬 수 있는 조건의 세포 분리를 포함하는 방법.
79. 제 64 단락에 있어서, 생산은 거품 형성을 일으킬 수 있는 조건의 임의의 환기 공정을 포함하는 방법.
80. 제 64 단락 또는 제 65 단락에 있어서, 생물계면활성제는 하이드로포빈 II, 람노리피드, 소포로리피드 또는 서팩틴을 포함하는 방법.
81. 제 64, 제 64 또는 제 80 단락 중 어느 하나에 있어서, 생물계면활성제의 불용화는 용액에 침전제를 첨가하는 것을 포함하거나 또는 본질적으로 이루어지는 것인 방법.
82. 제 81 단락에 있어서, 침전제는 그 음이온으로서 할라이드, 구연산염, 초산염, 질산염, 탄산염; 황산염; 인산염; 술파메이트; 포스포네이트, 술파메이트를 포함하거나, 또는 아질산염이고, 그 양이온으로서 암모늄, 칼슘, 철, 마그네슘, 리튬, 칼륨 또는 나트륨을 포함하는 염을 포함하거나 또는 이로 본질적으로 이루어지는 염인 방법.
83. 제 82 단락에 있어서, 염은 황산염을 포함하거나 또는 이로 본질적으로 이루어지는 것인 방법.
84. 제 81 단락에 있어서, 침전제는 알코올을 포함하거나 또는 이로 본질적으로 이루어지는 것인 방법.
85. 거품형성 감소를 위하여 조성물 중 조건을 하기와 같이 되도록 조절하는 것을 포함하는, 생물계면활성제의 생산동안 거품이 감소되도록 조성물의 조건을 제어하는 것을 포함하는, 생산 동안 생물계면활성제의 거품형성 제어방법:
거품 감소 지수는 1 초과, 및/또는 거품 감소 지수는 2 초과, 및/또는 거품 감소 지수는 3 초과;
발효 매질 중 가용성 생물계면활성제의 농도가 약 1 g/㎏ 이하; 및/또는 생산된 생물계면활성제의 적어도 25%는 불용화됨; 및/또는
본 방법은 거품억제제의 첨가 없이 수행됨; 및/또는 본 방법은 불용화 없이 수행된 방법에 비교하여, 감소된 양의 거품억제제를 이용하여 수행됨.
86. 제 85 단락에 있어서, 조성물 중 조건의 조절은:
조성물의 pH를 조절하고;
조성물의 온도를 조절하는 것을 포함하는 것인 방법.
87. 제 85 단락에 있어서,
생산 동안 조성물의 물리적 조건을 감독하여 거품형성이 발생되는 때를 결정하고;
거품형성을 감소시키기 위하여 조성물에 침전제를 제공하는 것을 포함하는 방법.
88. 제 87 단락에 있어서, 침전제는 염, 알코올, 수혼화성 유기 용매, 수용성 중합체 또는 양이온성 중합체를 포함하는 방법.
89. 제 87 단락에 있어서, 침전제는 그 음이온으로서 할라이드, 구연산염, 초산염, 질산염, 탄산염; 황산염; 인산염; 술파메이트; 포스포네이트, 술파메이트를 포함하거나, 또는 아질산염이고, 그 양이온으로서 암모늄, 칼슘, 철, 마그네슘, 리튬, 칼륨 또는 나트륨을 포함하는 염을 포함하는 것인 방법.
90. 제 89 단락에 있어서, 염은 염화염 또는 황산염을 포함하는 방법.
91. 제 90 단락에 있어서, 염화염은 염화칼슘 또는 염화나트륨이고, 황산염은 황산암모늄 또는 황산나트륨인 방법.
92. 제 88 단락에 있어서, 침전제는 알코올을 포함하는 방법.
93. 상기 1, 2, 17-20, 26, 42, 53, 64, 65 또는 80 단락 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포가 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei)인 방법.
94. 상기 1, 2, 17-20, 26, 42, 53, 64, 65 또는 80 단락 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포가 바실러스 서브틸리스인 방법.
95. 상기 1, 2, 17-20, 26, 42, 53, 64, 65 또는 80 단락 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포가 바실러스 리체니포르미스인 방법
96. 상기 1, 2, 17-20, 26, 42, 53, 64, 65 또는 80 단락 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포가 아스퍼질러스 종인 방법.
* * *
이로써 본 발명의 바람직한 실시양태를 상세하게 설명하였으나, 상기 단락들에 의해 정의된 본 발명은 상기 설명에서 설명된 구체적인 세부내용들로 제한되는 것은 아니고, 본 발명의 기술사상 또는 범주에서 벗어나지 않으면서 많은 명백한 변형들이 가능한 것으로 이해되어야 한다.

Claims (14)

1. 숙주 세포가 세포 밖으로 생물계면활성제를 분비하고 생물계면활성제가 발효 매질 중에 가용성인 경우, 발효 매질 중에서 숙주 세포에 의한 그 생산 동안 거품을 형성하는 생물계면활성제의 거품형성 제어 방법으로서, 숙주 세포에 의한 생물계면활성제의 생산과 동시에, 생물계면활성제를 불용화하고, 그로써 불용화된 생물계면활성제가 거품을 형성하지 않음에 따라 거품형성이 제어되는 것을 포함하는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 생물계면활성제는 하이드로포빈 II, 람노리피드, 소포로리피드 또는 서팩틴(surfactin)을 포함하는 것인 방법.
3. 제 1항에 있어서, 거품 감소 지수는 1 초과, 및/또는 거품 감소 지수는 2 초과, 및/또는 거품 감소 지수는 3 초과; 및/또는 발효 매질 중 가용성 생물계면활성제의 농도는 약 1 g/㎏ 이하; 및/또는 생산된 생물계면활성제의 적어도 25%는 불용화됨; 및/또는 본 방법은 거품억제제의 첨가 없이 수행됨; 및/또는 본 방법은 불용화 없이 수행된 방법에 비교하여, 감소된 양의 거품억제제를 이용하여 수행됨; 및/또는 본 방법은 침전제를 첨가 및/또는 침전 조건을 적용함으로써 수행되는 것인 방법.
4. 제 1항에 있어서, 발효 매질을 생물반응기로 공급하고, 침전제를 첨가하거나 또는 침전 조건을 적용하고, 불용화된 생물계면활성제를 채집하고, 발효 매질 또는 그의 성분 또는 숙주 세포를 다시 보충하고; 그리고 선택적으로 불용화된 생물계면활성제와 함께 채집된 임의의 발효 매질 또는 그의 성분 또는 숙주 세포를 재순환시키는 것을 포함하는 연속 공정인 방법.
5. 숙주 세포가 세포 밖으로 생물계면활성제를 분비하고 생물계면활성제가 발효 매질 중에 가용성인 경우, 발효 매질 중에서 숙주 세포에 의한 그 생산 동안 거품을 형성하는 생물계면활성제의 거품형성 제어 방법으로서, 숙주 세포에 의한 생물계면활성제의 생산과 동시에, 생물계면활성제를 불용화하고, 그로써 불용화된 생물계면활성제가 거품을 형성하지 않음에 따라 거품형성이 제어되는 것을 포함하고, 여기에서 거품 감소 지수는 1 초과, 및/또는 거품 감소 지수는 2 초과, 및/또는 거품 감소 지수는 3 초과; 및/또는 발효 매질 중 가용성 생물계면활성제의 농도는 약 1 g/㎏ 이하; 및/또는 생산된 생물계면활성제의 적어도 25%는 불용화됨; 및/또는 본 방법은 거품억제제의 첨가 없이 수행됨; 및/또는 본 방법은 생물계면활성제를 불용화하지 않고 수행된 방법에 비교하여, 감소된 양의 거품억제제를 이용하여 수행; 및/또는 본 방법은 침전제를 첨가 및/또는 침전 조건을 적용함으로써 수행되는 것인 방법.
6. 생산 동안 거품을 형성하는 용액 중에서 생물계면활성제의 거품 형성 제어 방법으로서,
   거품 형성을 일으킬 수 있는 조건점에서, 생물계면활성제의 생산 동안 동시적으로 생물계면활성제를 불용화하는 것을 포함하고, 이로써 불용화된 생물계면활성제가 거품을 형성하지 않음에 따라, 거품형성이 제어되는 방법.
7. 제 6항에 있어서, 용액은 발효 매질을 포함하고, 여기에서 생산은 발효 매질 중의 숙주 세포에 의한 생물계면활성제의 발현을 포함하고, 여기에서 숙주 세포는 생물계면활성제를 세포 밖으로 분비하고, 이 생물계면활성제는 발효 배지 중에 가용성이며, 이에 의한 조건이 거품 형성을 발생시킬 수 있는 것인 방법.
8. 제 6항에 있어서,
   발효 매질을 생물반응기로 공급하고;
   침전제를 첨가하거나 또는 침전 조건을 적용하고;
   불용화된 생물계면활성제를 채집하고;
   용액 또는 그의 성분 또는 숙주 세포를 보충하고;
   그리고 선택적으로 불용화된 생물계면활성제와 함께 채집된 임의의 용액 또는 그의 성분 또는 숙주 세포를 재순환시키는 것을 포함하는, 연속 공정인 방법.
9. 생산 동안 거품을 형성하는 생물계면활성제의 거품형성 제어 방법으로서,
   숙주 세포에 의한 용액 중 생물계면활성제의 생산과 동시에, 생물계면활성제를 불용화하고,
   거품형성을 하기와 같이 되도록 제어하는 것을 포함하는 방법:
   거품 감소 지수는 1 초과, 및/또는 거품 감소 지수는 2 초과, 및/또는 거품 감소 지수는 3 초과; 및/또는
   용액 중 가용성 생물계면활성제의 농도는 약 1 g/㎏ 이하; 및/또는
   생산된 생물계면활성제의 적어도 25%는 불용화됨; 및/또는
   본 방법은 거품억제제의 첨가 없이 수행됨; 및/또는
   본 방법은 불용화 없이 수행된 방법에 비교하여, 감소된 양의 거품억제제를 이용하여 수행됨.
10. 제 1항, 제 5항, 제 6항 또는 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 생물계면활성제는 하이드로포빈 II, 람노리피드, 소포로리피드 또는 서팩틴을 포함하는 방법.
11. 제 1항, 제 5항, 제 6항 또는 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포는 트리코더마 리세이인 방법.
12. 제 1항, 제 5항, 제 6항 또는 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포는 바실러스 서브틸리스인 방법.
13. 제 1항, 제 5항, 제 6항 또는 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포는 바실러스 리체니포르미스인 방법.
14. 제 1항, 제 5항, 제 6항 또는 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포는 아스퍼질러스 종인 방법.

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