KR20140022839A - 하이드로포빈의 정제 방법 - Google Patents

하이드로포빈의 정제 방법 Download PDF

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KR20140022839A
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마이클 쉘
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다니스코 유에스 인크.
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Abstract

본 발명은 유기 용매를 포함하는 하이드로포빈의 회수 및/또는 정제 방법에 관한 것이며, 분리 기술을 필요로 하지 않는다. 특히, 본 발명은 하이드로포빈 II의 선택적 알코올 침전 방법에 관한 것이다.

Description

하이드로포빈의 정제 방법 {METHODS OF PURIFYING HYDROPHOBIN}
관련 출원 및 참고로 포함함
본 출원은 2011년 4월 15일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/475,933호의 우선권을 주장한다. 2009년 12월 17일자로 국제특허 공개 WO 2009/152176호로 공개된, 2009년 6월 9일자로 출원된 국제특허 출원 제PCT/US2009/046783호, 2011년 2월 17일자로 국제특허 공개 WO 2011/019686호로 공개된, 2010년 8월 10일자로 출원된 국제특허 출원 제PCT/US2010/044964호, 2010년 8월 10일자로 출원된 국제특허 출원 제PCT/US2010/044964호 및 2012년 3월 29일자로 출원된 국제특허 출원 제PCT/US12/31104호를 참조한다.
전술한 출원, 및 그 안에 인용된 또는 그의 처리 중에 인용된 모든 문서("출원 인용된 문서") 및 출원 인용된 문서에서 인용되거나 또는 참고된 모든 문서와, 본 명세서에서 인용되거나 또는 참고된 모든 문서("본 명세서에서 인용된 문서"), 및 본 명세서에서 인용된 문서에서 인용되거나 또는 참고된 모든 문서는 본 명세서에서 또는 본 명세서에 참고로 포함된 임의의 문서에서 언급된 임의의 제품에 대한 임의의 제조업자의 사용 설명서, 설명서, 제품 사양 및 제품 시트와 함께, 본 명세서에 참고로 포함되며, 본 발명의 실시에 이용될 수 있다. 더 구체적으로, 모든 참조된 문서는 마치 각각의 개별 문서를 참고로 포함시키는 것으로 특정적으로 그리고 개별적으로 나타내는 것처럼 동일한 정도로 참고로 포함된다.
본 발명은 유기 용매를 포함하는 하이드로포빈의 회수 및/또는 정제 방법에 관한 것이며, 분리 기술을 필요로 하지 않는다.
하이드로포빈은 사상균, 예를 들어 쉬조필룸 코뮨(Schizophyllum commune)에서 나타나는 약 100 내지 150개의 아미노산의 작은 단백질이다. 하이드로포빈은 대개 8개의 시스테인 단위를 갖는다. 하이드로포빈은 천연 공급원으로부터 단리될 수 있지만, 유전 공학적 방법에 의해 또한 얻어질 수 있다 (예를 들어, 국제특허 공개 WO 2006/082251호 및 국제특허 공개 WO 2006/131564호).
하이드로포빈은 다양한 진균류 구조, 예를 들어 기균사, 포자, 자실체의 표면 상에 수불용성 형태로 퍼져 있다. 하이드로포빈의 유전자는 자낭균류, 불완전균류 및 담자균류로부터 단리될 수 있다. 일부 진균류, 예를 들어 쉬조필룸 코뮨, 코프리누스 시네레우스(Coprinus cinereus), 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans)는 하나 초과의 하이드로포빈 유전자를 갖는다. 상이한 하이드로포빈은 진균류의 상이한 발생 단계에 명백하게 연루되어 있다. 여기서 하이드로포빈은 아마도 상이한 기능의 원인이 된다 (문헌[van Wetter et al., 2000, Mol. Microbiol., 36, 201-210]; 문헌[Kershaw et al. 1998, Fungal Genet. Biol, 1998, 23, 18-33]).
지금까지 확인된 하이드로포빈은 일반적으로 클래스(class) I 또는 클래스 II 중 어느 하나로 분류된다. 상기 둘 모두의 유형은 계면에서 양친매성 필름으로 자기-조립되는 분비형 단백질로서 진균류에서 확인되었다. 클래스 I 하이드로포빈의 조립체는 일반적으로 상대적으로 불용성이며, 반면에 클래스 II 하이드로포빈의 조립체는 다양한 용매에 쉽게 용해된다.
하이드로포빈에 있어서의 생물학적 기능으로서, 기균사의 생성을 위한 물의 표면 장력의 감소 외에, 포자의 소수성화가 또한 기재되어 있다 (문헌[Wosten et al. 1999, Curr. Biol., 19, 1985-88]; 문헌[Bell et al. 1992, Genes Dev., 6, 2382-2394]). 더욱이, 하이드로포빈은 지의류의 자실체에서 가스 채널을 라이닝하는 역할을 하며 진균류 병원체에 의한 식물 표면의 인식 시스템에서의 성분으로서의 역할을 한다 (문헌[Lugones et al. 1999, Mycol. Res., 103, 635-640]; 문헌[Hamer & Talbot 1998, Curr. Opinion Microbiol., volume 1, 693-697]).
이전에는, 하이드로포빈은 관례적인, 시간이 걸리는 단백질의 화학적 정제 (예를 들어 컬럼 정제 및 HPLC) 및 단리 방법 (예를 들어 결정화)을 이용하여 단지 중간 정도의 수율 및 순도로 제조되었다. 유전자적 방법의 도움으로 더욱 많은 양의 하이드로포빈을 제공하려는 시도도 성공적이지 못하였다.
본 기술 분야에서 다량의 하이드로포빈을 정제하는 더욱 빠른 그리고 더욱 경제적인 방법을 위한 더욱 효과적인 방법에 대한 필요성이 있다.
본 출원에서의 임의의 문서의 인용 또는 확인은 그러한 문서를 종래 기술로서 본 발명에서 이용가능함을 인정하는 것은 아니다.
본 발명은 생물계면활성제, 유리하게는 하이드로포빈, 더욱 유리하게는 하이드로포빈 II의 용도 또는 이의 정제 방법에 관한 것이며, 이는 침전제, 바람직하게는 유기화제, 더 바람직하게는 알코올, 가장 바람직하게는 C1-C3 알코올을 생물계면활성제 용액에 첨가하여 제1 침전물을 생성하는 단계, 침전제/생물계면활성제 용액으로부터 상청액을 가만히 따라내는 단계 및 동일하거나 또는 상이한 침전제를 상청액에 첨가하여 제2 침전물을 생성하는 단계를 포함할 수 있고, 여기서, 제2 침전물은 생물계면활성제, 유리하게는 정제된 하이드로포빈, 더 유리하게는 정제된 하이드로포빈 II일 수 있다. 제1 침전물을 생성하기 위한 침전제는 제2 침전물을 생성하기 위한 침전제와 동일하거나 또는 상이할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명은 C1-C3 알코올을 하이드로포빈 용액에 첨가하여 제1 침전물을 생성하는 단계, C1-C3 알코올/하이드로포빈 용액으로부터 상청액을 가만히 따라내는 단계 및 C1-C3 알코올을 상청액에 첨가하여 제2 침전물을 생성하는 단계를 포함할 수 있는 하이드로포빈 II의 정제 방법 또는 용도에 관한 것이며, 여기서, 제2 침전물은 정제된 하이드로포빈 II일 수 있다. 제1 침전물을 생성하기 위한 알코올은 제2 침전물을 생성하기 위한 알코올과 동일하거나 또는 상이할 수 있다.
본 발명은 부분적으로는 순수 클래스 II 하이드로포빈이 조 농축물로부터 아이소프로판올 침전에 의해 정제될 수 있다는 본 출원인의 놀라운 발견에 기초한다.
제1 실시 형태에서, 알코올은 아이소프로판올일 수 있다. 유리한 실시 형태에서, 약 2 내지 3배 부피, 바람직하게는 2 내지 3배 부피, 더 바람직하게는 2.5배 부피의 아이소프로판올을 첨가하여 제1 침전물을 생성할 수 있다. 다른 유리한 실시 형태에서, 약 1배 부피, 바람직하게는 1배 부피의 아이소프로판올을 상기 상청액에 첨가하여 제2 침전물을 생성할 수 있다.
제2 실시 형태에서, 알코올은 메탄올일 수 있다. 유리한 실시 형태에서, 약 1 내지 2배 부피, 바람직하게는 1 내지 2배 부피, 더 바람직하게는 1.5배 부피의 메탄올을 첨가하여 제1 침전물을 생성할 수 있다. 다른 유리한 실시 형태에서, 약 1배 부피, 바람직하게는 1배 부피의 메탄올을 상기 상청액에 첨가하여 제2 침전물을 생성할 수 있다.
제3 실시 형태에서, 알코올은 에탄올일 수 있다. 유리한 실시 형태에서, 약 1 내지 2배 부피, 바람직하게는 1 내지 2배 부피, 더 바람직하게는 1.5배 부피의 에탄올을 첨가하여 제1 침전물을 생성할 수 있다. 다른 유리한 실시 형태에서, 약 1배 부피, 바람직하게는 1배 부피의 에탄올을 상기 상청액에 첨가하여 제2 침전물을 생성할 수 있다.
상기 실시 형태들에서, 제1 침전물은 갈색 침전물일 수 있고/있거나 제2 침전물은 백색 침전물일 수 있다.
특히 유리한 실시 형태에서, 용도 또는 방법은 실온에서 수행될 수 있다. 더욱이, 침전제, 바람직하게는 유기화제, 더 바람직하게는 알코올, 가장 바람직하게는 C1-C3 알코올이 생물계면활성제, 유리하게는 하이드로포빈, 더 유리하게는 하이드로포빈 II의 정제를 위하여 재활용되거나 또는 재사용될 수 있다.
상기 용도 또는 방법에 의해 정제된 생물계면활성제, 유리하게는 하이드로포빈, 더 유리하게는 하이드로포빈 II는 동결건조될 수 있다. 특히, 정제된 생물계면활성제, 유리하게는 하이드로포빈, 더 유리하게는 하이드로포빈 II의 순도는 SDS-PAGE, HPLC, 질량 분광법 또는 아미노산 분석에 의해 분석될 수 있다.
따라서, 본 발명의 목적은, 본 출원인이 권리를 유보하도록 본 발명 내에 임의의 이전에 공지된 생성물, 그 생성물의 제조 방법, 또는 그 생성물의 사용 방법을 포함시키는 것을 하지 않고 이로써 임의의 이전에 공지된 생성물, 공정 또는 방법에 대한 권리 포기를 밝히고자 하는 것이다. 본 발명은, 본 출원인이 권리를 유보하도록 본 발명의 범주 내에 USPTO (35 U.S.C. §112, 제1 단락) 또는 EPO (EPC의 제83조)의, 서면으로 된 기재 및 구현가능성 요건을 충족시키지 않는 임의의 생성물, 그 생성물의 제조 방법, 또는 그 생성물의 사용 방법을 포함시키고자 하는 것이 아니며 이로써 임의의 이전에 기재된 생성물, 그 생성물의 제조 방법, 또는 그 생성물의 사용 방법에 대한 권리 포기를 밝히고자 하는 것임이 추가로 주목된다.
본 명세서에서, 그리고 특히 특허청구범위 및/또는 단락들에서, "포함하다", "포함하였다", "포함하고 있는" 등과 같은 용어는 미국 특허법에서 이에 기인한 의미를 가질 수 있으며; 예를 들어 상기 용어들은 "함유하다", "함유하였다", "함유하고 있는" 등을 의미할 수 있고; "본질적으로 이루어진" 및 "본질적으로 이루어지다"와 같은 용어는 미국 특허법에서 이들에 기인한 의미를 가지며, 예를 들어 상기 용어들은 명백하게 기술되지 않은 요소들은 고려하지만 종래 기술에서 발견되거나 또는 본 발명의 기본적인 또는 신규한 특성에 영향을 주는 요소들은 배제함이 주목된다.
이들 실시 형태 및 다른 실시 형태는 하기의 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용에 의해 개시되거나 또는 이로부터 자명해지며 이에 포함된다.
예로서 주어진 것으로서 본 발명을 단지 기재된 특정 실시 형태에 한정하고자 하는 것이 아닌 하기의 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용은 첨부된 도면과 함께 가장 잘 이해될 수 있다.
<도 1>
도 1은 나타낸 완충제 (10 mM 트리스(Tris)-HCl, pH 8.0, 0.01% 트윈(Tween)-80) 중에 샘플들을 희석시키고, 이를 1x 환원제를 함유하는 LDS 샘플 완충제 (인비트로겐(Invitrogen))와 2:1로 혼합함으로써 SDS-PAGE에 의해 분석한, 정제된 HFBII를 나타낸다. 샘플들을 90℃에서 5분 동안 인큐베이션하고, 15 ㎕를 SDS-PAGE 겔 (12%, 1 mM 비스-트리스, 10개의 레인, 인비트로겐)의 각각의 웰 내에 로딩하였다. 겔을 1x MES 완충제 (인비트로겐)에서 200 V에서 35분 동안 진행시키고, 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue)를 이용하여 염색하고, 탈염색시켰다 (10% 에탄올, 10% 아세트산). 생성된 겔 이미지는 정제된 HFBII에 있어서 HFBII의 선명한 밴드를 나타내며, 비정제된 농축물 (1/100)에 있어서는 어떠한 미량의 보이는 비-하이드로포빈 밴드도 나타내지 않는다.
<도 2>
도 2는 HFBII의 1 mg/g의 용액의 RP-HPLC를 나타내며, 이는 샘플을 10% 아세토니트릴에 희석시킴으로써 제조하였다. 인산나트륨 완충제 ("A", 25 mM, pH 2.5) 및 아세토니트릴 ("B", 0.05% TFA)의 구배를 이용하여 C5 컬럼 (슈펠코 디스커버리(Supelco Discovery) C5, 300 Å, 5 ㎛, 2.1 x 100 ㎜)에서 역상 HPLC 시스템 (애질런트(Agilent))에 의해 HFBII를 분리하였다. 상기 HFBII 용액을 상기 컬럼 (60℃) 상에 주입하고 (20 ㎕), 0.8 mL/분으로 6분에 걸쳐 10% 용매 B로부터 70% B로 증가시킴으로써 용출시켰다. 상기 시스템을 10% B로 되돌리고, 2분 동안 평형화한 후 다음 주입을 하였다. HFBII를 222 ㎚에서의 흡광도에 의해 모니터링하였다. HFBII는 하나의 큰 피크 및 작은 숄더(shoulder) - N-말단 페닐알라닌 절단(truncation)에 상응함 - 로서 4.38분에 컬럼으로부터 용출된다. 다른 피크들은 크로마토그램에서 전혀 관찰되지 않는다.
<도 3>
도 3은 스테인리스강 MALDI 플레이트 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)) 상에 스포팅되고(spotted), 0.5 ㎕의 포화 시나핀산 용액 (50% 아세토니트릴)과 혼합되고 건조된, 정제된 HFBII (0.5 ㎕)의 질량 분광법 결과를 나타낸다. 샘플을 MALDI-TOF MS (보이저(Voyager), 어플라이드 바이오시스템즈)로 분석하여 양의 모드에서 4,000 내지 20,000 m/z를 획득하였다. 생성된 스펙트럼은 7189.8 m/z에서 주 피크를 나타내며, 이는 HFBII의 질량에 상응한다 (이론치: m+1 = 7189.4 m/z). 다른 피크들은 공지된 N-말단 페닐알라닌 절단 (m+1 = 7040.49 m/z) 및 기체상 HFBII 이량체 (14380 m/z)에 기인할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "생물계면활성제" 또는 "생물학적으로 생성된 계면활성제"는 단백질, 당지질, 리포펩티드(lipopeptide), 지단백질, 인지질, 중성 지질 또는 지방산일 수 있으며, 물과 소수성 액체 사이, 또는 물과 공기 사이의 계면 장력과 같은 표면 장력을 감소시킬 수 있고 이는 생물학적 시스템으로부터 생성되거나 또는 수득될 수 있다. 생물계면활성제는 하이드로포빈을 포함한다. 생물계면활성제는 리포펩티드 및 지단백질, 예를 들어 서팩틴, 펩티드-지질, 세라웨틴, 비스코신, 서브틸리신, 그라미시딘, 폴리믹신을 포함한다. 생물계면활성제는 당지질, 예를 들어 람노리피드, 소포로리피드, 트레할로리피드 및 셀로바이오리피드를 포함한다. 생물계면활성제는 에멀산, 바이오디스퍼산, 만난-지질-단백질, 리포산, 탄수화물-단백질-지질, 단백질 PA와 같은 중합체를 포함한다. 생물계면활성제는 미립자, 예를 들어 소포, 핌브리아 및 전세포를 포함한다. 생물계면활성제는 글리코시드, 예를 들어 사포닌을 포함한다. 생물계면활성제는 섬유상 단백질, 예를 들어 피브로인을 포함한다. 생물계면활성제는 자연적으로 발생될 수 있거나 또는 이것은 자연에서는 발견되지 않는, 돌연변이 유발되거나 또는 유전자 엔지니어링된 변이체일 수 있다. 이는 본 발명에 따라 생물계면활성제의 용해도를 저하시킴으로써 발포를 제어하는 것을 돕기 위하여 더욱 낮은 용해도를 위하여 엔지니어링된 생물계면활성제 변이체를 포함한다. 생물계면활성제는 본 명세서에 기재된 바와 같이 관련 생물계면활성제, 유도체형 생물계면활성제, 변이체형 생물계면활성제 및 동족 생물계면활성제를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "생물 시스템"은 살아있는 유기체, 예를 들어 미생물, 식물, 진균류, 곤충, 척추동물 또는 합성 생물학에 의해 생성된 생물 형태를 포함하거나 또는 이로부터 유래된다. 살아있는 유기체는 고전적인 육종, 클론 선발, 돌연변이 유발 및 유전적 다양성을 생성하기 위한 유사한 방법에 의해 수득되는, 자연에서 발견되지 않는 변이체일 수 있거나, 또는 이것은 재조합 DNA 기술에 의해 수득되는 유전자 엔지니어링된 유기체일 수 있다. 살아있는 유기체는 그 전체가 사용될 수 있거나, 또는 이것은 기관 배양물, 식물 재배품종(cultivar), 현탁 세포 배양물, 유착 세포 배양물 또는 무세포(cell free) 제제와 같은 성분들의 공급원일 수 있다.
생물 시스템은 이것이 생물계면활성제를 봉쇄시킬 때 살아있는 세포를 함유할 수 있거나 또는 살아있는 세포를 함유하지 않을 수 있다. 생물 시스템은 천연 공급원으로부터 발견하여 수집할 수 있거나, 이것은 경작되거나, 재배될 수 있거나 또는 이것은 산업적 조건 하에서 성장될 수 있다. 생물 시스템은 공급된 전구체 또는 영양소로부터 생물계면활성제를 합성할 수 있거나 또는 이것은 그의 환경으로부터 생물계면활성제를 풍부화할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "생성"은 화학물질 및 생물학적 생성물의 생성을 위한 제조 방법에 관련되며, 이는 수확, 수집, 압밀, 채혈, 침연(maceration), 균질화, 담금(mashing), 양조, 발효, 회수, 고체 액체 분리, 세포 분리, 원심분리, 여과 (예를 들어, 진공 여과), 제형화, 보관 또는 수송을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "발효 브로쓰 조성물"은 관심대상의 단백질, 예를 들어 하이드로포빈을 함유하는 세포 성장 배지를 말한다. 세포 성장 배지는 세포 및/또는 세포 잔사를 포함할 수 있으며, 농축될 수 있다. 예시적인 발효 브로쓰 조성물로는 하이드로포빈-함유, 한외여과-농축 발효 브로쓰가 있다. 미세여과는 예를 들어 세포 분리에 있어서 세포 잔사를 보유하고 단백질을 통과시키는 데 통상적으로 사용되는 반면, 한외여과는 예를 들어 농축에 있어서 단백질을 보유하고 용질을 통과시키는 데 통상적으로 사용된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 펩티드 결합에 의해 연결되는 아미노산 잔기들을 포함하는 임의의 길이의 중합체를 말하기 위하여 상호교환가능하게 사용된다. 아미노산 잔기에 대한 통상적인 1문자 또는 3문자 암호가 본 명세서에서 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있으며, 이것은 변형 아미노산을 포함할 수 있으며, 이것은 비-아미노산이 개재될 수 있다. 상기 용어는 또한 자연적으로 변형되었거나 또는 개재에 의해; 예를 들어 다이설파이드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예를 들어 표지화 성분과의 콘쥬게이션(conjugation)에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 예를 들어 아미노산의 하나 이상의 유사체 (예를 들어, 비천연 아미노산 등을 포함함)와, 당업계에 공지된 다른 변형을 함유하는 폴리펩티드가 상기 정의 내에 또한 포함된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "배양액"은 생물계면활성제 및 다른 용해성 또는 불용성 성분들을 포함하는 액체인데, 상기 액체로부터 관심대상의 생물계면활성제를 회수하고자 한다. 이러한 성분은 다른 단백질, 비단백질성 불순물, 예를 들어 세포 또는 세포 잔사, 핵산, 다당류, 지질, 화학물질, 예를 들어 소포제, 응집제, 염, 당류, 비타민, 성장 인자, 침전제 등을 포함한다. "배양액"은 또한 "단백질 용액", "액체 배지", "다이어필터링된(diafiltered) 브로쓰", "청징화된 브로쓰", "농축물", "조절된(conditioned) 배지", "발효 브로쓰", "용해된(lysed) 브로쓰", "용해물", "세포 브로쓰", 또는 단순히 "브로쓰"로 칭해질 수 있다. 세포는, 존재할 경우 박테리아 세포, 진균류 세포, 식물 세포, 동물 세포, 인간 세포, 곤충 세포, 합성 세포 등일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "회수"는 생물계면활성제 및 하나 이상의 바람직하지 못한 성분을 포함하는 액체 배양물에, 바람직하지 못한 성분, 예를 들어 세포 및 세포 잔사, 다른 단백질, 아미노산, 다당류, 당류, 폴리올, 무기 또는 유기 염, 산 및 염기, 및 미립자형 물질 중 적어도 일부로부터 생물계면활성제를 분리하는 공정을 가하는 공정을 말한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "생물계면활성제 생성물"은 최종 사용자, 예를 들어 고객에게 제공하기에 적합한 생물계면활성제 제제를 말한다. 생물계면활성제 생성물은 세포, 세포 잔사, 배지 성분, 제형 부형제, 예를 들어 완충제, 염, 방부제, 환원제, 당류, 폴리올, 계면활성제 등을 포함할 수 있으며, 이들은 생물계면활성제의 기능적 보관 수명을 연장시키거나 또는 생물계면활성제의 최종 사용 응용을 용이하게 하기 위하여 첨가되거나 또는 보유된다. 생물계면활성제 생성물은 또한 정제될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 기능적으로 및/또는 구조적으로 유사한 생물계면활성제는 "관련 생물계면활성제"인 것으로 간주된다. 이러한 생물계면활성제는 상이한 속 및/또는 종의 유기체 또는 심지어 다른 강의 유기체 (예를 들어, 박테리아 및 진균류)로부터 유래될 수 있다. 또한, 관련 생물계면활성제는 일차 서열 분석에 의해 결정되거나, 삼차 구조 분석에 의해 결정되거나, 또는 면역학적 교차 반응성에 의해 결정되는 동족체를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "유도체형 생물계면활성제"는 N- 및 C-말단(들) 중 어느 하나 또는 이들 둘 모두에의 하나 이상의 아미노산의 부가, 아미노산 서열 내의 하나의 또는 다수의 상이한 부위에서의 하나 이상의 아미노산의 치환, 및/또는 단백질의 어느 한 말단 또는 양 말단에서의 또는 아미노산 서열 내의 하나 이상의 부위에서의 하나 이상의 아미노산의 결실 및/또는 아미노산 서열 내의 하나 이상의 부위에서의 하나 이상의 아미노산의 삽입에 의해 생물계면활성제로부터 유도된 단백질-기재 생물계면활성제를 말한다. 생물계면활성제 유도체의 제조는 천연 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 변형시키고, 상기 DNA 서열로 적합한 숙주를 형질전환시키고, 변형 DNA 서열을 발현시켜 유도체형 단백질을 형성함으로써 성취될 수 있다. "유도체형 생물계면활성제"는 또한 지질 또는 탄수화물 부분이 합성 동안 또는 합성 후에 단백질 골격에 부착된 생물계면활성제 유도체를 포함한다.
관련 (및 유도체형) 생물계면활성제는 "변이체형 생물계면활성제"를 포함한다. 변이체형 단백질-기재 생물계면활성제는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 치환, 결실 및/또는 삽입에 의해 기준/모 생물계면활성제, 예를 들어 야생형 생물계면활성제와 상이하다. 상이한 아미노산 잔기의 수는 하나 이상, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50개의 아미노산 잔기 또는 그보다 많은 아미노산 잔기일 수 있다. 변이체형 생물계면활성제는 야생형 생물계면활성제와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 심지어 적어도 약 99%의 아미노산 서열 동일성, 또는 그보다 큰 아미노산 서열 동일성을 공유한다. 또한 변이체형 생물계면활성제는 선택된 모티프, 도메인, 에피토프, 보존 영역 등에서 기준 생물계면활성제와 상이할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "키메라" 또는 "키메릭"은 상이한 유기체로부터 유래된 것일 수 있는 다수의 성분들을 소유하는 단일 조성물, 유리하게는 폴리펩티드를 말한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "키메릭"은 개별 단백질 부분들의 기능 또는 활성에 상응하는 영역들을 소유하는 융합 단백질을 생성하도록 엔지니어링된, 계면활성제 또는 이의 변이체형 계면활성제를 포함하는, 종렬형으로 배열된 모이어티(moiety)들을 말하기 위하여 사용된다. 일 실시 형태
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "유사 서열"은 생물계면활성제와 유사한 기능, 삼차 구조 및/또는 보존 잔기를 제공하는 단백질-기재의 생물계면활성제 내의 서열을 말한다. 예를 들어, 알파-나선 또는 베타-시트 구조를 함유하는 에피토프 영역에서, 유사 서열 내의 대체 아미노산은 바람직하게는 동일한 특정 구조를 유지한다. 상기 용어는 또한 아미노산 서열뿐만 아니라 뉴클레오티드 서열도 말한다. 일부 실시 형태에서, 유사 서열은 대체 아미노산이 유사한 기능 또는 개선된 기능을 나타내는 변이 효소를 생성하도록 개발된다. 일부 실시 형태에서, 생물계면활성제에 있어서 아미노산의 삼차 구조 및/또는 보존 잔기는 관심대상의 절편 또는 단편에 또는 그 근처에 위치한다. 따라서, 관심대상의 절편 또는 단편이 예를 들어 알파-나선 또는 베타-시트 구조를 함유할 경우, 대체 아미노산은 바람직하게는 그 특정 구조를 유지한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "동족 생물계면활성제"는 기준 생물계면활성제와 유사한 활성 및/또는 구조를 갖는 생물계면활성제를 말한다. 동족체는 반드시 진화론적으로 관련된 것으로 의도되는 것은 아니다. 따라서, 상기 용어는 상이한 유기체들로부터 수득되는 동일하거나, 유사하거나 또는 상응하는 생물계면활성제(들)(즉, 구조 및 기능 면에서)를 포함하는 것으로 의도된다. 일부 실시 형태에서, 기준 생물계면활성제와 유사한 사차, 삼차 및/또는 일차 구조를 갖는 상동체를 확인하는 것이 바람직하다.
서열들 사이의 상동성의 정도는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 결정될 수 있다 (예를 들어, 문헌[Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482]; 문헌[Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol., 48:443]; 문헌[Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444]; 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package; 미국 위스콘신주 매디슨 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)) 내의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA와 같은 프로그램; 및 문헌[Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12:387-395]).
예를 들어, PILEUP는 서열 상동성 수준을 결정하는 데 유용한 프로그램이다. PILEUP는 진행식 쌍별 정렬을 이용하여 관련 서열들의 군으로부터 다수의 서열 정렬을 생성한다. 또한 이것은 정렬 생성에 사용되는 클러스터링(clustering) 관계를 나타내는 트리(tree)를 플로팅할 수 있다. PILEUP는 펭(Feng) 및 두리틀(Doolittle)의 진행식 정렬법을 단순화시킨 것을 이용한다 (문헌[Feng and Doolittle (1987) J. Mol. Evol. 35:351-360]). 상기 방법은 히긴스(Higgins) 및 샤프(Sharp)에 의해 기재된 것과 유사하다 (문헌[Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-153]). 유용한 PILEUP 파라미터는 3.00의 디폴트 갭 가중치, 0.10의 디폴트 갭 길이 가중치 및 가중 말단 갭을 포함한다. 유용한 알고리즘의 다른 예로는 BLAST 알고리즘이 있으며, 이는 알트슐(Altschul) 등의 문헌[Altschul et al. (1990) J. Mol . Biol . 215:403-410]; 및 문헌[Karlin et al. (1993) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90:5873-5787]에 기재되어 있다. 하나의 특히 유용한 BLAST 프로그램으로는 WU-BLAST-2 프로그램이 있다 (문헌[Altschul et al. (1996) Meth. Enzymol. 266:460-480]). 파라미터 "W", "T" 및 "X"는 정렬의 민감성 및 속도를 결정한다. BLAST 프로그램은 디폴트로서 11의 단어 길이(W), 50의 BLOSUM62 스코어링 매트릭스 (문헌[Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl . Acad . Sci . USA 89:10915] 참조) 정렬치(B), 10의 기대치(E), M′5, N′-4 및 양 가닥의 비교를 이용한다. 유리하게는, BLAST 프로그램 또는 BLAST 알고리즘을 실행하는 프로그램을 이용하여 서열 상동성 또는 동일성의 수준을 결정한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 적어도 2가지의 핵산 또는 폴리펩티드의 맥락에서 "사실상 유사한" 및 "사실상 동일한"이라는 어구는 전형적으로 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 기준 서열(즉, 야생형 서열)과 비교하여 적어도 약 70%의 동일성, 적어도 약 75%의 동일성, 적어도 약 80%의 동일성, 적어도 약 85%의 동일성, 적어도 약 90%의 동일성, 적어도 약 91%의 동일성, 적어도 약 92%의 동일성, 적어도 약 93%의 동일성, 적어도 약 94%의 동일성, 적어도 약 95%의 동일성, 적어도 약 96%의 동일성, 적어도 약 97%의 동일성, 적어도 약 98%의 동일성, 또는 심지어 적어도 약 99%의 동일성, 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 서열을 포함함을 의미한다. 서열 동일성은 표준 파라미터를 사용하여 BLAST, ALIGN, 및 CLUSTAL과 같은 공지된 프로그램을 이용하여 결정될 수 있다. (예를 들어 문헌[Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]; 문헌[Henikoff et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915]; 문헌[Karin et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:5873]; 및 문헌[Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244] 참조). BLAST 분석 수행용 소프트웨어는 미국 국립 생물공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)를 통하여 공개적으로 입수가능하다. 또한, 데이터베이스는 FASTA를 이용하여 검색될 수 있다 (문헌[Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448]). 유리하게는, BLAST 프로그램 또는 BLAST 알고리즘을 실행하는 프로그램을 이용하여 서열 상동성 또는 동일성의 수준을 결정한다. 두 폴리펩티드가 사실상 동일하다는 하나의 표시는 제1 폴리펩티드가 제2 폴리펩티드와 면역적 교차 반응성을 갖는다는 것이다. 전형적으로, 보존적 아미노산 치환에 의해 상이해진 폴리펩티드들은 면역적 교차 반응성을 갖는다. 따라서, 소정 폴리펩티드는, 예를 들어 두 펩티드가 보존적 치환에 의해서만 상이해질 경우, 제2 폴리펩티드와 사실상 동일하다. 두 핵산 서열이 사실상 동일하다는 다른 표시는, 상기 두 분자가 엄격한 조건 하에서 (예를 들어, 중간 엄격도 내지 높은 엄격도의 범위 내에서) 서로와 혼성화된다는 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "야생형" 및 "천연" 생물계면활성제는 자연에서 발견되는 것이다. 용어 "야생형 서열" 및 "야생형 유전자"는 숙주 세포에 있어서 자연 발생되거나 또는 천연인 서열을 말하기 위하여 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용된다. 일부 실시 형태에서, 야생형 서열은 단백질 엔지니어링 프로젝트의 출발점인 관심대상의 서열을 말한다. 자연 발생 단백질을 코딩하는 유전자는 당업자에게 공지된 일반적인 방법에 따라 수득될 수 있다. 일반적으로 이 방법은 생물계면활성제의 영역들을 코딩하는 추정 서열들을 갖는 표지된 프로브를 합성하는 단계, 이 단백질을 발현하는 유기체로부터 게놈 라이브러리를 제조하는 단계 및 프로브에의 혼성화에 의해 관심대상의 유전자에 대하여 라이브러리를 스크리닝하는 단계를 포함한다. 그 후 양성으로 혼성화된 클론을 지도화하고 서열결정한다.
본 발명의 방법은 배양액으로부터의 생물계면활성제의 단리에 적용될 수 있다. 유리하게는, 생물계면활성제는 미생물에 의해 분비되는 용해성 세포외 생물계면활성제이다.
예시적인 생물계면활성제 군으로는 사상균에 의해 발현되는 시스테인-풍부 폴리펩티드 부류인 하이드로포빈이 있다. 하이드로포빈은 세포 및 인공 물질을 비롯하여 대상의 표면 상에 소수성 코팅을 형성하는 능력으로 유명한 작은 (대략 100개의 아미노산) 폴리펩티드이다. 1991년에 쉬조필룸 코뮨에서 처음에 발견된 하이드로포빈은 현재 다수의 사상균에서 인식되었다. 소수도(hydropathy) 및 다른 생물물리학적 특성의 차이를 기반으로 하여, 하이드로포빈은 클래스 I 또는 클래스 II로 분류된다.
하이드로포빈의 발현은 통상적으로 발효 동안 다량의 하나 이상의 발포 방지제(즉, 소포제)의 첨가를 필요로 한다. 달리, 하이드로포빈 폴리펩티드에 의해 생성되는 거품은 브리더 필터(breather filter)를 포화시키며, 통풍구를 오염시키며, 압력 증가를 야기하며, 단백질 수율을 감소시킨다. 그 결과, 통상적으로 하이드로포빈의 조 농축물은 숙주 세포 오염물질 뿐만 아니라 잔류량의 소포제도 함유하며, 이는 특히 하이드로포빈이 식품 첨가제로서 의도될 때 하이드로포빈 제제에서 바람직하지 못하다.
하이드로포빈은 그의 실제 분자량보다 더 큰 겉보기 분자량을 갖는 형태로 가역적으로 존재할 수 있으며, 이는 하이드로포빈이 본 발명의 방법을 이용한 회수에 적절해지게 한다. 하이드로포빈을 함유하는 액체 또는 거품은 기재된 바와 같이 단백질 회수를 위하여 발효기로부터 연속적으로 또는 주기적으로 수확될 수 있거나 또는 발효 작업의 마지막에 배치식으로 수확될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "하이드로포빈"은 친수성 / 소수성 계면에서 자기-조립이 가능한 그리고 하기 화학식 I을 갖는 폴리펩티드를 말할 수 있다:
[화학식 I]
(Y1)n-B1-(X1)a-B2-(X2)b-B3-(X3)c-B4-(X4)d-B5-(X5)e-B6-(X6)f-B7-(X7)g-B8-(Y2)m
여기서, m 및 n은 독립적으로 0 내지 2000이며; B1, B2, B3, B4, B5, B6, B7 및 B8은 각각 독립적으로 Cys, Leu, Ala, Pro, Ser, Thr, Met 또는 Gly으로부터 선택되는 아미노산이고, 잔기 B1 내지 B8 중 6개 이상은 Cys이며; X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, Y1 및 Y2는 독립적으로 임의의 아미노산을 나타내고; a는 1 내지 50이며; b는 0 내지 5이고; c는 1 내지 100이며; d는 1 내지 100이고; e는 1 내지 50이며; f는 0 내지 5이고; g는 1 내지 100이다.
일부 실시 형태에서, 하이드로포빈은 하이드로포빈 코어 내에 40 내지 120개의 아미노산의 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 하이드로포빈은 하이드로포빈 코어 내에 45 내지 100개의 아미노산의 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 하이드로포빈은 하이드로포빈 코어 내에 50 내지 90개, 바람직하게는 50 내지 75개, 또는 55 내지 65개의 아미노산의 서열을 갖는다. 용어 "하이드로포빈 코어"는 잔기 B1로부터 시작하여 잔기 B8로 종결되는 서열을 의미한다.
화학식 I에서, 잔기 B1 내지 B8 중 6개 이상, 또는 7개 이상, 또는 8개 전부가 Cys이다.
화학식 I에서, 일부 실시 형태에서 m은 적합하게는 0 내지 500, 또는 0 내지 200, 또는 0 내지 100, 또는 0 내지 20, 또는 0 내지 10, 또는 0 내지 5, 또는 0이다.
화학식 I에서, 일부 실시 형태에서 n은 적합하게는 0 내지 500, 또는 0 내지 200, 또는 0 내지 100, 또는 0 내지 20, 또는 0 내지 10, 또는 0 내지 3이다.
화학식 I에서, 일부 실시 형태에서, a는 3 내지 25, 또는 5 내지 15이다. 일 실시 형태에서, a는 5 내지 9이다.
화학식 I에서, 일부 실시 형태에서, b는 0 내지 2, 또는 바람직하게는 0이다.
화학식 I에서, 일부 실시 형태에서, c는 5 내지 50, 또는 5 내지 40이다. 일부 실시 형태에서, c는 11 내지 39이다.
화학식 I에서, 일부 실시 형태에서, d는 2 내지 35, 또는 4 내지 23이다. 일부 실시 형태에서, d는 8 내지 23이다.
화학식 I에서, 일부 실시 형태에서, e는 2 내지 15, 또는 5 내지 12이다. 일부 실시 형태에서, e는 5 내지 9이다.
화학식 I에서, 일부 실시 형태에서, f는 0 내지 2, 또는 0이다.
화학식 I에서, 일부 실시 형태에서, g는 3 내지 35, 또는 6 내지 21이다. 일 실시 형태에서, g는 6 내지 18이다.
일부 실시 형태에서, 본 발명에서 사용되는 하이드로포빈은 하기 화학식 II를 가질 수 있다:
[화학식 II]
(Y1)n-B1-(X1)a-B2-(X2)b-B3-(X3)c-B4-(X4)d-B5-(X5)e-B6-(X6)f-B7-(X7)g-B8-(Y2)m
여기서, m 및 n은 독립적으로 0 내지 20이며; B1, B2, B3, B4, B5, B6, B7 및 B8은 각각 독립적으로 Cys, Leu, Ala, Pro, Ser, Thr, Met 또는 Gly으로부터 선택되는 아미노산이고, 잔기 B1 내지 B8 중 7개 이상은 Cys이며; a는 3 내지 25이고; b는 0 내지 2이며; c는 5 내지 50이고; d는 2 내지 35이며; e는 2 내지 15이고; f는 0 내지 2이며; g는 3 내지 35이다.
화학식 II에서, 잔기 B1 내지 B8 중 7개 이상, 또는 8개 전부는 Cys이다.
일부 실시 형태에서, 본 발명에서 사용되는 하이드로포빈은 하기 화학식 III을 가질 수 있다:
[화학식 III]
(Y1)n-B1-(X1)a-B2-B3-(X3)c-B4-(X4)d-B5-(X5)e-B6-B7-(X7)g-B8-(Y2)m
여기서, m 및 n은 독립적으로 0 내지 20이며; B1, B2, B3, B4, B5, B6, B7 및 B8은 각각 독립적으로 Cys, Leu, Ala, Pro, Ser, Thr, Met 또는 Gly으로부터 선택되는 아미노산이고, 잔기 B1 내지 B8 중 7개 이상은 Cys이며; a는 5 내지 15이고; c는 5 내지 40이며; d는 4 내지 23이고; e는 5 내지 12이며; g는 6 내지 21이다.
화학식 III에서, 잔기 B1 내지 B8 중 7개 이상, 또는 8개는 Cys이다.
화학식 I, II 및 III에서, 잔기 B1 내지 B8 중 6개 또는 7개가 Cys일 때, 잔기 B3 내지 B7은 Cys인 것이 바람직하다.
화학식 I, II 및 III에서, 잔기 B1 내지 B8 중 7개가 Cys일 때, 일부 실시 형태에서, (a) B1 및 B3 내지 B8은 Cys이고, B2는 Cys 이외의 것이며; (b) B1 내지 B7은 Cys이고, B8은 Cys 이외의 것이며, (c) B1은 Cys 이외의 것이고, B2 내지 B8은 Cys이다. 잔기 B1 내지 B8 중 7개가 Cys일 때, 다른 잔기는 Ser, Pro 또는 Leu인 것이 바람직하다. 일부 실시 형태에서, B1 및 B3 내지 B8은 Cys이며, B2는 Ser이다. 일부 실시 형태에서, B1 내지 B7은 Cys이며, B8은 Leu이다. 추가의 실시 형태에서, B1은 Pro이며, B2 내지 B8은 Cys이다.
본 발명에서 사용되는 하이드로포빈의 시스테인 잔기는 환원된 형태로 존재하거나 또는 임의의 가능한 조합으로 서로와 다이설파이드(-S-S-) 가교체를 형성할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 잔기 B1 내지 B8 중 8개 전부가 Cys일 때, 다이설파이드 가교체가 시스테인 잔기들의 하기 쌍들 중 하나 이상 (바람직하게는 2개 이상, 더 바람직하게는 3개 이상, 가장 바람직하게는 4개 전부) 사이에서 형성될 수 있다: B1과 B6; B2와 B5; B3과 B4; B7과 B8. 일부 실시 형태에서, 잔기 B1 내지 B8 중 8개 전부가 Cys일 때, 다이설파이드 가교체가 시스테인 잔기들의 하기 쌍들 중 하나 이상 (2개 이상, 또는 3개 이상, 또는 4개 전부) 사이에서 형성될 수 있다: B1과 B2; B3과 B4; B5와 B6; B7과 B8.
본 발명에서 유용한 특정 하이드로포빈의 예에는 하기 간행물에 기재되고 예시된 것이 포함되며, 이들의 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다: 문헌[Linder et al., FEMS Microbiology Rev. 2005, 29, 877-896]; 문헌[Kubicek et al., BMC Evolutionary Biology, 2008, 8, 4]; 문헌[Sunde et al., Micron, 2008, 39, 773-784]; 문헌[Wessels, Adv. Micr. Physiol. 1997, 38, 1-45]; 문헌[
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et al., Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 2006, 62, 356-367]; 문헌[Scholtmeijer et al., Appl. Environ. Microbiol., 2002, 68, 1367-1373]; 문헌[Yang et al, BMC Bioinformatics, 2006, 7 Supp. 4, S16]; 국제특허 공개 WO 01/57066호; 국제특허 공개 WO 01/57528호; 국제특허 공개 WO 2006/082253호; 국제특허 공개 WO 2006/103225호; 국제특허 공개 WO 2006/103230호; 국제특허 공개 WO 2007/014897호; 국제특허 공개 WO 2007/087967호; 국제특허 공개 WO 2007/087968호; 국제특허 공개 WO 2007/030966호; 국제특허 공개 WO 2008/019965호; 국제특허 공개 WO 2008/107439호; 국제특허 공개 WO 2008/110456호; 국제특허 공개 WO 2008/116715호; 국제특허 공개 WO 2008/120310호; 국제특허 공개 WO 2009/050000호; 미국 특허 공개 제2006/0228484호; 및 유럽 특허 제2042156A호.
하이드로포빈은 본 기술 분야에 공지된 임의의 클래스 I 또는 클래스 II 하이드로포빈, 예를 들어 아가리쿠스(Agaricus) 종 (예를 들어, 아가리쿠스 비스포루스(Agaricus bisporus)), 아그로사이베(Agrocybe) 종 (예를 들어, 아그로사이베 아에게리타(Agrocybe aegerita)), 아젤로마이세스(Ajellomyces) 종 (예를 들어, 아젤로마이세스 캅술라투스(Ajellomyces capsulatus), 아젤로마이세스 더마티티디스(Ajellomyces dermatitidis)), 아스페르길루스 종 (예를 들어, 아스페르길루스 아르비이(Aspergillus arvii), 아스페르길루스 브레비페스(Aspergillus brevipes), 아스페르길루스 클라바투스(Aspergillus clavatus), 아스페르길루스 두리카울리스(Aspergillus duricaulis), 아스페르길루스 엘립티쿠스(Aspergillus ellipticus), 아스페르길루스 플라부스(Aspergillus flavus), 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스페르길루스 푸미신네마투스(Aspergillus fumisynnematus), 아스페르길루스 렌툴루스(Aspergillus lentulus), 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger), 아스페르길루스 유니라테랄리스(Aspergillus unilateralis), 아스페르길루스 비리디누탄스(Aspergillus viridinutans)), 뷰베리아(Beauveria) 종 (예를 들어, 뷰베리아 바시아나(Beauveria bassiana)), 클라비셉스(Claviceps) 종 (예를 들어, 클라비셉스 푸시포르미스(Claviceps fusiformis)), 콕시디오이데스(Coccidioides) 종 (예를 들어 콕시디오이데스 포사다시이(Coccidioides posadasii)), 코흐리오볼루스(Cochliobolus) 종 (예를 들어 코흐리오볼루스 헤테로스트로푸스(Cochliobolus heterostrophus)), 크리니펠리스(Crinipellis) 종 (예를 들어 크리니펠리스 페르니시오사(Crinipellis perniciosa)), 크라이포넥트리아(Cryphonectria) 종 (예를 들어, 크라이포넥트리아 파라시티카(Cryphonectria parasitica)), 다비디엘라(Davidiella) 종 (예를 들어 다비디엘라 타시아나(Davidiella tassiana)), 딕티오네마(Dictyonema) 종 (예를 들어 딕티오네마 글라브라툼(Dictyonema glabratum)), 에메리셀라(Emericella) 종 예를 들어, 에메리셀라 니둘란스(Emericella nidulans)), 플람물리나(Flammulina) 종 (예를 들어, 플람물리나 벨루티페스(Flammulina velutipes)), 푸사륨(Fusarium) 종 (예를 들어, 푸사륨 쿨모룸(Fusarium culmorum)), 지베렐라(Gibberella) 종 (예를 들어, 지베렐라 모닐리포르미스(Gibberella moniliformis)), 글로메렐라(Glomerella) 종 (예를 들어, 글로메렐라 그라미니콜라(Glomerella graminicola)), 그리폴라(Grifola) 종 (예를 들어, 그리폴라 프론도사(Grifola frondosa)), 헤테로바시디온(Heterobasidion) 종 (예를 들어, 헤테로바시디온 안노숨(Heterobasidion annosum)), 하이포크레아(Hypocrea) 종 (예를 들어, 하이포크레아 제코리나, 하이포크레아 릭시이(Hypocrea lixii), 하이포크레아 비렌스(Hypocrea virens)), 락카리아(Laccaria) 종 (예를 들어, 락카리아 비콜로르(Laccaria bicolor)), 렌티눌라(Lentinula) 종 (예를 들어, 렌티눌라 에도데스(Lentinula edodes)), 마그나포르테(Magnaporthe) 종 (예를 들어, 마그나포르테 오리자에( Magnaporthe oryzae)), 마라스미우스(Marasmius) 종 (예를 들어, 마라스미우스 클라도필루스(Marasmius cladophyllus)), 모닐리오프토라(Moniliophthora) 종 (예를 들어, 모닐리오프토라 페르니시오사( Moniliophthora perniciosa)), 네오사르토리아(Neosartorya) 종 (예를 들어, 네오사르토리아 아우레올라(Neosartorya aureola), 네오사르토리아 펜넬리아에(Neosartorya fennelliae), 네오사르토리아 피세리(Neosartorya fischeri), 네오사르토리아 글라브라(Neosartorya glabra), 네오사르토리아 히라추카에(Neosartorya hiratsukae), 네오사르토리아 니시무라에(Neosartorya nishimurae), 네오사르토리아 오타니이(Neosartorya otanii), 네오사르토리아 슈도피세리(Neosartorya pseudofischeri), 네오사르토리아 쿠아드리신크타(Neosartorya quadricincta), 네오사르토리아 스파툴라타(Neosartorya spathulata), 네오사르토리아 스피노사(Neosartorya spinosa), 네오사르토리아 스트라메니아(Neosartorya stramenia), 네오사르토리아 우다가와에(Neosartorya udagawae)), 뉴로스포라(Neurospora) 종 (예를 들어, 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa), 뉴로스포라 디스크레타(Neurospora discreta), 뉴로스포라 인터메디아(Neurospora intermedia), 뉴로스포라 시토필라(Neurospora sitophila), 뉴로스포라 테트라스페르마(Neurospora tetrasperma)), 오피오스토마(Ophiostoma) 종 (예를 들어 오피오스토마 노보-울미(Ophiostoma novo-ulmi), 오피오스토마 쿠에르쿠스(Ophiostoma quercus)), 파라콕시디오이데스(Paracoccidioides) 종 (예를 들어, 파라콕시디오이데스 브라실리엔시스(Paracoccidioides brasiliensis)), 파살로라(Passalora) 종 (예를 들어, 파살로라 풀바( Passalora fulva), 팍실루스 필라멘토수스(Paxillus filamentosus), 팍실루스 인볼루투스(Paxillus involutus)), 페니실륨(Penicillium) 종 (예를 들어, 페니실륨 카멤베르티(Penicillium camemberti), 페니실륨 크리소게눔(Penicillium chrysogenum), 페니실륨 마르네페이(Penicillium marneffei)), 플레비옵시스(Phlebiopsis) 종 (예를 들어 플레비옵시스 기간테아( Phlebiopsis gigantea)), 피솔리투스(Pisolithus) (예를 들어 피솔리투스 틴크토리우스(Pisolithus tinctorius)), 플레우로투스(Pleurotus) 종 (예를 들어 플레우로투스 오스트레아투스(Pleurotus ostreatus)), 포도스포라(Podospora) 종 (예를 들어 포도스포라 안세리나(Podospora anserina)), 포스티아(Postia) 종 (예를 들어 포스티아 플라센타(Postia placenta)), 파이레노포라(Pyrenophora) 종 (예를 들어 파이레노포라 트리티시-레펜티스(Pyrenophora tritici-repentis)), 쉬조필룸 종 (예를 들어, 쉬조필룸 코뮨), 탈라로마이세스(Talaromyces) 종 (예를 들어 탈라로마이세스 스티피타투스(Talaromyces stipitatus)), 트리코데르마 종 (예를 들어, 트리코데르마 아스페렐룸(Trichoderma asperellum), 트리코데르마 아트로비리데(Trichoderma atroviride), 트리코데르마 비리데(Trichoderma viride), 트리코데르마 레에세이 [이전에는 하이포크레아 제코리나]), 트리콜로마(Tricholoma) 종 (예를 들어, 트리콜로마 테레움(Tricholoma terreum)), 운시노카르푸스(Uncinocarpus) 종 (예를 들어, 운시노카르푸스 레에세이(Uncinocarpus reesii)), 베르티실리움(Verticillium) 종 (예를 들어, 베르티실리움 달리아에(Verticillium dahliae)), 잔토닥틸론(Xanthodactylon) 종 (예를 들어, 잔토닥틸론 플람메움(Xanthodactylon flammeum)), 잔토리아(Xanthoria) 종 (예를 들어, 잔토리아 칼시콜라(Xanthoria calcicola), 잔토리아 카펜시스(Xanthoria capensis), 잔토리아 엑타네오이데스(Xanthoria ectaneoides), 잔토리아 플람메아(Xanthoria flammea), 잔토리아 카로오엔시스(Xanthoria karrooensis), 잔토리아 리굴라타(Xanthoria ligulata), 잔토리아 파리에티나(Xanthoria parietina), 잔토리아 투르비나타(Xanthoria turbinata)) 등으로부터의 하이드로포빈일 수 있다. 하이드로포빈은 예를 들어 문헌[Sunde, M et al. (2008) Micron 39:773-84]; 문헌[Linder, M. et al. (2005) FEMS Microbiol Rev. 29:877-96]; 및 문헌[
Figure pct00006
, H. et al. (2001) Ann. Rev. Microbiol. 55:625-46]에 개관되어 있다.
특히 유리한 실시 형태에서, 하이드로포빈은 트리코데르마 종 (예를 들어, 트리코데르마 아스페렐룸), 트리코데르마 아트로비리데, 트리코데르마 비리데, 트리코데르마 레에세이 [이전에는 하이포크레아 제코리나]), 유리하게는 트리코데르마 레에세이 유래의 것이다.
본 기술 분야에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 하이드로포빈은 클래스 I 및 II로 분류된다. 클래스 I 및 II의 하이드로포빈은 용해도를 비롯하여 다수의 이유로 구별될 수 있음이 본 기술 분야에 공지되어 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 하이드로포빈은 계면 (예를 들어, 물/공기 계면)에서 양친매성 계면 필름으로 자기-조립된다. 클래스 I 하이드로포빈의 상기 조립된 양친매성 필름은 일반적으로 단지 강산 (전형적으로, pKa가 4 미만인 것, 예를 들어 포름산 또는 트라이플루오로아세트산)에 재가용화되며, 반면에, 클래스 II의 것은 더욱 넓은 범위의 용매에 용해성이다.
일부 실시 형태에서, 하이드로포빈은 클래스 II 하이드로포빈이다. 일부 실시 형태에서, 하이드로포빈은 클래스 I 하이드로포빈이다.
일부 실시 형태에서, 용어 "클래스 II 하이드로포빈"은 물/공기 계면에서 상기에 기재된 자기-조립 특성을 갖는 하이드로포빈을 포함하며, 상기 조립된 양친매성 필름은 실온에서 수성 에탄올 용액 (60% (v/v))에서 0.1% (w/w) 이상의 농도로 재용해될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 용어 "클래스 I 하이드로포빈"은 상기에 기재된 자기-조립 특성을 갖지만 이러한 특정한 재용해 특성은 갖지 않는 하이드로포빈을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 용어 "클래스 II 하이드로포빈"은 물/공기 계면에서 상기에 기재된 자기-조립 특성을 갖는 하이드로포빈을 포함하며, 상기 조립된 양친매성 필름은 실온에서 소듐 도데실 설페이트 수용액 (2% (w/w))에서 0.1% (w/w) 이상의 농도로 재용해될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 용어 "클래스 I 하이드로포빈"은 상기에 기재된 자기-조립 특성을 갖지만 이러한 특정한 재용해 특성은 갖지 않는 하이드로포빈을 포함한다.
클래스 I 및 II의 하이드로포빈은 또한 하이드로포빈 단백질의 다수의 영역의 소수성 / 친수성에 의해 구별될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 용어 "클래스 II 하이드로포빈"은 상기에 기재된 자기-조립 특성을 가지며 잔기 B3과 잔기 B4 사이의 영역, 즉 모이어티 (X3)c이 주로 소수성인 하이드로포빈을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 용어 "클래스 I 하이드로포빈"은 상기에 기재된 자기-조립 특성을 갖지만 잔기 B3과 잔기 B4사이의 영역, 즉 기 (X3)c가 주로 친수성인 하이드로포빈을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 용어 "클래스 II 하이드로포빈"은 상기에 기재된 자기-조립 특성을 가지며 잔기 B7과 잔기 B8 사이의 영역, 즉 모이어티 (X7)g가 주로 소수성인 하이드로포빈을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 용어 "클래스 I 하이드로포빈"은 상기에 기재된 자기-조립 특성을 갖지만 잔기 B7과 잔기 B8 사이의 영역, 즉 모이어티 (X7)g가 주로 친수성인 하이드로포빈을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 용어 "클래스 II 하이드로포빈"은 상기에 기재된 자기-조립 특성을 가지며 잔기 B3과 잔기 B4 사이의 영역, 즉 모이어티 (X3)c이 주로 소수성인 하이드로포빈을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 용어 "클래스 I 하이드로포빈"은 상기에 기재된 자기-조립 특성을 갖지만 잔기 B3과 잔기 B4사이의 영역, 즉 기 (X3)c가 주로 친수성인 하이드로포빈을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 용어 "클래스 II 하이드로포빈"은 상기에 기재된 자기-조립 특성을 가지며 잔기 B7과 잔기 B8 사이의 영역, 즉 모이어티 (X7)g가 주로 소수성인 하이드로포빈을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 용어 "클래스 I 하이드로포빈"은 상기에 기재된 자기-조립 특성을 갖지만 잔기 B7과 잔기 B8 사이의 영역, 즉 모이어티 (X7)g가 주로 친수성인 하이드로포빈을 포함한다.
하이드로포빈 단백질의 다양한 영역들의 상대적인 소수성 / 친수성은 문헌[Kyte and Doolittle, J. Mol. Biol., 1982, 157, 105-132]에 기술된 방법을 이용하여 하이드로포빈의 소수도(hydropathy) 패턴을 비교함으로써 확립될 수 있다. 컴퓨터 프로그램을 이용하여 단백질의 아미노산 서열을 따라 단백질의 친수성 및 소수성을 계속해서 평가할 수 있다. 이 목적을 위하여, 상기 방법은 소수도 척도 (문헌으로부터 유래된 다수의 실험적 관찰에 기초함)를 이용하여 20개 아미노산 측쇄들 각각의 친수성 및 소수성 특성을 비교한다. 상기 프로그램은 이동-절편 접근법을 이용하며, 상기 접근법은 소정 길이의 절편 내에서 이것이 서열을 통하여 진행할 때 평균 소수도를 계속적으로 결정한다. 연속 스코어들을 아미노 말단으로부터 카르복시 말단으로 도시한다. 이와 동시에, 중심점 선이 인쇄되며, 이는 대부분의 서열결정된 단백질에서 발견되는 아미노산 조성들의 소수도의 대평균(grand average)에 상응한다. 상기 방법이 하이드로포빈에 대하여 문헌[Wessels, Adv . Microbial Physiol . 1997, 38, 1-45]에 추가로 기재되어 있다.
클래스 II 하이드로포빈은 또한 그의 보존된 서열을 특징으로 할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본 발명에서 사용되는 클래스 II 하이드로포빈은 하기 화학식 IV를 가질 수 있다:
[화학식 IV]
(Y1)n-B1-(X1)a-B2-B3-(X3)c-B4-(X4)d-B5-(X5)e-B6-B7-(X7)g-B8-(Y2)m
여기서, m 및 n은 독립적으로 0 내지 200이며; B1, B2, B3, B4, B5, B6, B7 및 B8은 각각 독립적으로 Cys, Leu, Ala, Ser, Thr, Met 또는 Gly으로부터 선택되는 아미노산이고, 잔기 B1 내지 B8 중 6개 이상은 Cys이며; a는 6 내지 12이고; c는 8 내지 16이며; d는 2 내지 20이고; e는 4 내지 12이며; g는 5 내지 15이다.
화학식 IV에서, 일부 실시 형태에서, a는 7 내지 11이다.
화학식 IV에서, 일부 실시 형태에서, c는 10 내지 12이다. 일부 실시 형태에서, c는 11이다.
화학식 IV에서, 일부 실시 형태에서, d는 4 내지 18이다. 일부 실시 형태에서, d는 4 내지 16이다.
화학식 IV에서, 일부 실시 형태에서, e는 6 내지 10이다. 일부 실시 형태에서, e는 9 또는 10이다.
화학식 IV에서, 일부 실시 형태에서, g는 6 내지 12이다. 일부 실시 형태에서, g는 7 내지 10이다.
일부 실시 형태에서, 본 발명에서 사용되는 클래스 II 하이드로포빈은 하기 화학식 V를 가질 수 있다:
[화학식 V]
(Y1)n-B1-(X1)a-B2-B3-(X3)c-B4-(X4)d-B5-(X5)e-B6-B7-(X7)g-B8-(Y2)m
여기서, m 및 n은 독립적으로 0 내지 10이며; B1, B2, B3, B4, B5, B6, B7 및 B8은 각각 독립적으로 Cys, Leu 또는 Ser으로부터 선택되는 아미노산이고, 잔기 B1 내지 B8 중 7개 이상은 Cys이며; a는 7 내지 11이고; c는 11이며; d는 4 내지 18이고; e는 6 내지 10이며; g는 7 내지 10이다.
화학식 IV 및 V에서, 일부 실시 형태에서, 잔기 B1 내지 B8 중 7개 이상은 Cys이거나, 또는 잔기 B1 내지 B8 중 8개 전부는 Cys이다.
화학식 IV 및 V에서, 일부 실시 형태에서, 잔기 B1 내지 B8 중 7개가 Cys일 때, 잔기 B3 내지 B7은 Cys인 것이 바람직하다.
화학식 IV 및 V에서, 일부 실시 형태에서, 잔기 B1 내지 B8 중 7개가 Cys일 때, (a) B1 및 B3 내지 B8은 Cys이고, B2는 Cys 이외의 것이거나; (b) B1 내지 B7은 Cys이고, B8은 Cys 이외의 것이거나, 또는 (c) B1은 Cys 이외의 것이고, B2 내지 B8은 Cys인 것이 바람직하다. 일부 실시 형태에서, 잔기 B1 내지 B8 중 7개가 Cys일 때, 다른 잔기는 Ser, Pro 또는 Leu인 것이 바람직하다. 일부 실시 형태에서, B1 및 B3 내지 B8은 Cys이며, B2는 Ser이다. 일부 실시 형태에서, B1 내지 B7은 Cys이며, B8은 Leu이다. 일부 실시 형태에서, B1은 Pro이며, B2 내지 B8은 Cys이다.
화학식 IV 및 V에서, 일부 실시 형태에서, 기 (X3)c는 서열 모티프 ZZXZ를 포함하며, 여기서, Z는 지방족 아미노산이고; X는 임의의 아미노산이다. 용어 "지방족 아미노산"은 글리신(G), 알라닌(A), 류신(L), 아이소류신(I), 발린(V) 및 프롤린(P)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 의미한다.
일부 실시 형태에서, 기 (X3)c는 LLXV, ILXV, ILXL, VLXL 및 VLXV로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 모티프를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 기 (X3)c는 서열 모티프 VLXV를 포함한다.
화학식 IV 및 V에서, 일부 실시 형태에서, 기 (X3)c는 서열 모티프 ZZXZZXZ를 포함하며, 여기서, Z는 지방족 아미노산이고; X는 임의의 아미노산이다. 일부 실시 형태에서, 기 (X3)c는 서열 모티프 VLZVZXL을 포함하며, 여기서, Z는 지방족 아미노산이고; X는 임의의 아미노산이다.
본 출원인은 다른 방법에 의해 생성된 하이드로포빈 II가 C 말단에서 클립핑된(clipped) 하나 이상의 아미노산으로 이어질 수 있음을 관찰하였다. 본 발명의 방법은 전장 하이드로포빈 II 및 C 말단에서 클립핑된 하이드로포빈 II 둘 모두를 침전시킬 것이다.
하이드로포빈-유사 단백질 (예를 들어, "차플린(chaplin)")이 사상 박테리아(filamentous bacteria), 예를 들어 방선균류(Actinomycete) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces) 종에서 또한 확인되었다 (국제특허 공개 WO01/74864호; 문헌[Talbot, 2003, Curr. Biol, 13: R696-R698]). 진균류 하이드로포빈과는 대조적으로 이들 박테리아 단백질은 단지 최대 하나의 다이설파이드 가교체를 형성할 수 있으며, 그 이유는 상기 박테리아 단백질이 단지 2개의 시스테인 잔기를 가질 수 있기 때문이다. 이러한 단백질은 하이드로포빈에 대한 기능적 등가물의 일례이며, 임의의 유형의 분자가 본 발명의 방법의 생물계면활성제의 영역 이내이다.
생물계면활성제를 생성하는 발효는 생물반응기 또는 발효기 내에서 액체 발효 배지에서 숙주 세포 또는 미생물을 배양함으로써 수행된다. 배지의 조성 (예를 들어, 영양소, 탄소 공급원 등), 온도 및 pH는 배양물의 성장 및/또는 생물계면활성제의 생성에 적절한 조건을 제공하도록 선택된다. 보통, 공기 또는 산소-풍부화 공기가 배양물의 호흡을 위하여 산소를 제공하도록 배지 내로 살포된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "발효 브로쓰 조성물"은 관심대상의 단백질, 예를 들어 하이드로포빈을 함유하는 세포 성장 배지를 말한다. 세포 성장 배지는 세포 및/또는 세포 잔사를 포함할 수 있으며, 농축될 수 있다. 예시적인 발효 브로쓰 조성물로는 하이드로포빈-함유, 한외여과-농축 발효 브로쓰가 있다. 미세여과는 예를 들어 세포 분리에 있어서 세포 잔사를 보유하고 단백질을 통과시키는 데 통상적으로 사용되는 반면, 한외여과는 예를 들어 농축에 있어서 단백질을 보유하고 용질을 통과시키는 데 통상적으로 사용된다.
유리하게는, 교차-유동 막 여과 회수 방법은 하이드로포빈 농축물의 제조를 허용할 수 있으며, 이는 참고로 포함된 국제특허 공개 WO 2011/019686호에 기재된 바와 같다. 다른 실시 형태에서, 크기 배제 여과 및 결정화가 또한 하이드로포빈 농축물의 제조를 허용할 수 있다.
본 발명은 생물계면활성제, 유리하게는 하이드로포빈, 더 유리하게는 하이드로포빈 II의 정제 방법을 포함하며, 상기 정제 방법은 침전제를 생물계면활성제, 유리하게는 하이드로포빈, 더 유리하게는 하이드로포빈 II의 용액에 첨가하여 제1 침전물을 생성하는 단계, 침전제/생물계면활성제 용액으로부터 상청액을 가만히 따라내는 단계 및 동일하거나 또는 상이한 침전제를 상청액에 첨가하여 제2 침전물을 생성하는 단계를 포함할 수 있고, 여기서, 제2 침전물은 생물계면활성제, 유리하게는 정제된 하이드로포빈, 더 유리하게는 정제된 하이드로포빈 II일 수 있다. 적합한 침전제의 예에는 무기 염, 유기화제 및 이의 조합이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 제1 침전물을 생성하기 위한 침전제는 제2 침전물을 생성하기 위한 침전제와 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 적합한 침전제들의 임의의 조합이 본 발명에 의해 고려될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 유기화제는 물 중에 혼화가능한 유기 용매이다. 당업자라면 화학 분야의 당업자에게 공지된 방법 및/또는 지식을 이용하여 특정 유기화제가 물 중에 혼화가능한지에 대하여 확인할 수 있다. 예를 들어, 특정 유기화제가 물에 첨가될 때 2상 혼합물의 부재는 상기 유기화제가 물 중에 혼화가능함을 나타낸다. 특정 유기화제가 물에 첨가될 때 2상 혼합물의 존재는 상기 유기화제가 물 중에 혼화가능하지 않음을 나타낸다. 적합한 유기화제의 예에는 아세토니트릴, 아세톤, 알코올, 다이메틸 포름아미드(DMF), 다이메틸 설폭사이드(DMSO), 다이옥산 및 테트라하이드로푸란(THF)이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
유리하게는, 침전제는 알코올, 더 유리하게는 C1-C4 알코올, 가장 유리하게는 C1-C3 알코올이다. 알코올은 1가 또는 다가일 수 있다. C1-C4 알코올의 예에는 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올 (아이소프로판올 또는 아이소프로필 알코올), t-부탄올 등이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. C1-C3 알코올의 예에는 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 및 2-프로판올 (아이소프로판올 또는 아이소프로필 알코올)이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 유리하게는 알코올은 메탄올, 에탄올 또는 아이소프로필 알코올이다.
이론에 의해 구애되지 않고서, 침전제, 바람직하게는 알코올, 더 바람직하게는 C1-C4 알코올, 가장 바람직하게는 C1-C3 알코올의 첨가량은 일차적으로 제1 침전물 중 단백질을 침전시킬 것이다. 침전제/생물계면활성제 용액으로부터 상청액을 가만히 따라내고 동일하거나 상이한 침전제, 바람직하게는 알코올, 더 바람직하게는 C1-C4 알코올, 가장 바람직하게는 C1-C3 알코올을 상청액에 첨가하면 제2 침전물에서 생물계면활성제, 유리하게는 하이드로포빈, 더 유리하게는 하이드로포빈 II가 생성될 수 있다.
생물계면활성제, 유리하게는 하이드로포빈, 더 유리하게는 하이드로포빈 II는 아이소프로필 알코올 또는 아이소프로판올에 의해 침전될 수 있다. 약 2 내지 3배 부피의 아이소프로판올, 유리하게는 약 2.5배 부피의 아이소프로판올을 물 중의, 1배 부피의 생물계면활성제, 유리하게는 하이드로포빈, 더 유리하게는 하이드로포빈 II의 용액에 첨가하여 제1 침전물을 생성할 수 있으며, 이는 유리하게는 갈색 침전물일 수 있다. 상기 상청액을 가만히 따라낼 수 있으며, 약 1배 부피의 아이소프로판올을 첨가함으로써 생물계면활성제, 유리하게는 하이드로포빈, 더 유리하게는 하이드로포빈 II를 제2 침전물로서 침전시킬 수 있는데, 상기 침전물은 유리하게는 백색 침전물일 수 있다.
유리하게는, 아이소프로판올이 첨가된다. 2 내지 3배 부피의 아이소프로판올, 유리하게는 2.5배 부피의 아이소프로판올을 물 중의, 1배 부피의 생물계면활성제, 유리하게는 하이드로포빈, 더 유리하게는 하이드로포빈 II의 용액에 첨가할 수 있다. 당업자라면 초기 침전물 (이는 갈색 침전물일 수 있음)의 형성을 확인할 수 있지만, 초기 침전물은 교반 용액에서 약 15분 후 형성될 수 있다. 당업자라면 유리하게는 백색 침전물일 수 있는 제2 침전물의 형성을 확인할 수 있지만, 생물계면활성제, 유리하게는 하이드로포빈, 더 유리하게는 하이드로포빈 II의 제2 침전물은 교반 용액에서 약 10분 후 형성된다.
생물계면활성제, 유리하게는 하이드로포빈, 더 유리하게는 하이드로포빈 II는 메탄올에 의해 침전될 수 있다. 약 1 내지 2배 부피의 메탄올, 유리하게는 약 1.5배 부피의 메탄올을 물 중의, 1배 부피의 생물계면활성제, 유리하게는 하이드로포빈, 더 유리하게는 하이드로포빈 II의 용액에 첨가하여 제1 침전물을 생성할 수 있으며, 이는 유리하게는 갈색 침전물일 수 있다. 상기 상청액을 가만히 따라낼 수 있으며, 약 3배 부피의 메탄올을 첨가함으로써 생물계면활성제, 유리하게는 하이드로포빈, 더 유리하게는 하이드로포빈 II를 제2 침전물로서 침전시킬 수 있는데, 상기 침전물은 유리하게는 백색 침전물일 수 있다.
유리하게는, 메탄올은 실온에서 첨가된다. 1 내지 2배 부피의 메탄올, 유리하게는 1.5배 부피의 메탄올을 물 중의, 1배 부피의 생물계면활성제, 유리하게는 하이드로포빈, 더 유리하게는 하이드로포빈 II의 용액에 첨가할 수 있다. 당업자라면 유리하게는 갈색 침전물일 수 있는 초기 침전물의 형성을 확인할 수 있지만, 초기 침전물은 교반 용액에서 약 15분 후 형성될 수 있다. 당업자라면 유리하게는 백색 침전물일 수 있는 제2 침전물의 형성을 확인할 수 있지만, 생물계면활성제, 유리하게는 하이드로포빈 더 유리하게는 하이드로포빈 II의 제2 침전물은 교반 용액에서 약 10분 후 형성된다.
생물계면활성제, 유리하게는 하이드로포빈, 더 유리하게는 하이드로포빈 II는 에탄올에 의해 침전될 수 있다. 약 1 내지 2배 부피의 에탄올, 유리하게는 약 1.5배 부피의 에탄올을 물 중의, 1배 부피의 생물계면활성제, 유리하게는 하이드로포빈, 더 유리하게는 하이드로포빈 II의 용액에 첨가하여 제1 침전물을 생성할 수 있으며, 이는 유리하게는 갈색 침전물일 수 있다. 상기 상청액을 가만히 따라낼 수 있으며, 약 3배 부피의 에탄올을 첨가함으로써 생물계면활성제, 유리하게는 하이드로포빈, 더 유리하게는 하이드로포빈 II를 제2 침전물로서 침전시킬 수 있는데, 상기 침전물은 유리하게는 백색 침전물일 수 있다.
유리하게는, 에탄올은 실온에서 첨가된다. 1 내지 2배 부피의 에탄올, 유리하게는 1.5배 부피의 에탄올을 물 중의, 1배 부피의 생물계면활성제, 유리하게는 하이드로포빈, 더 유리하게는 하이드로포빈 II의 용액에 첨가할 수 있다. 당업자라면 유리하게는 갈색 침전물일 수 있는 초기 침전물의 형성을 확인할 수 있지만, 초기 침전물은 교반 용액에서 약 15분 후 형성될 수 있다. 당업자라면 유리하게는 백색 침전물일 수 있는 제2 침전물의 형성을 확인할 수 있지만, 생물계면활성제, 유리하게는 하이드로포빈, 더 유리하게는 하이드로포빈 II의 제2 침전물은 교반 용액에서 약 10분 후 형성된다.
당업자라면, 초기 침전물이 존재하는지를 결정함으로써 그리고 추가로, 제2 침전물의 존재에 의해 결정되는 바와 같이 생물계면활성제, 유리하게는 하이드로포빈, 더 유리하게는 하이드로포빈 II가 상청액으로부터 침전되는지를 결정함으로써 특정한 침전제의 특정한 부피를 결정할 뿐만 아니라 특정 침전제, 바람직하게는 유기화제, 더 바람직하게는 알코올이 이를 결정하는지에 대해서도 확인할 수 있다. 유리하게는, 초기 또는 제1 침전물은 갈색이며, 제2 침전물은 백색이다. 이러한 관찰은 당업자의 범위 이내이다.
본 발명의 특히 유리한 실시 형태는 침전제, 바람직하게는 유기화제, 더 바람직하게는 알코올이 재사용되거나 또는 재활용되고 이럼으로써 낭비를 감소시킬 수 있다는 것이다. 다시 말하면, 생물계면활성제, 유리하게는 하이드로포빈, 더 유리하게는 하이드로포빈 II의 침전에 사용되는 침전제, 바람직하게는 유기화제, 더 바람직하게는 알코올은 생물계면활성제, 유리하게는 하이드로포빈, 더 유리하게는 하이드로포빈 II의 추가의 침전을 위하여 재사용되거나 또는 재활용될 수 있다.
침전물은 원심분리에 의해 수확되고 동결건조될 수 있으며, 이는 미세 분말을 생성할 수 있다. 유리한 실시 형태에서, 상기 분말은 백색이다. 상기 분말은 용매 (예를 들어 물, 물/알코올 믹스, 물/유기물 믹스 (예를 들어 물/아세토니트릴), 유기 용매, 예를 들어 DMSO 또는 DMF)에 용해될 수 있으며, 냉동될 수 있다.
생물계면활성제, 유리하게는 하이드로포빈, 더 유리하게는 하이드로포빈 II의 순도는 SDS-PAGE, HPLC, 질량 분광법 및 아미노산 분석법과 같은 그러나 이에 한정되지 않는, 본 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 도 1 내지 도 3 및 표 1은 본 명세서에 개시된 방법에 의해 단리된 하이드로포빈 II의 순도를 예시하는 것이다.
본 발명 및 본 발명의 이점을 상세하게 설명하였지만, 첨부된 특허청구범위에 정의된 본 발명의 사상 및 범주로부터 벗어나지 않고서 다양한 변화, 치환 및 변경이 본 발명에서 이루어질 수 있음을 이해해야 한다.
본 발명을 하기 실시예에서 추가로 예시할 것이며, 하기 실시예는 단지 예시 목적으로 주어진 것으로서, 어떠한 방식으로든 본 발명을 한정하는 것으로 의도되는 것은 아니다.
실시예
하이드로포빈 II의 아이소프로판올 침전. 비정제된 하이드로포빈 농축물 (200 mL, 150 mg/g)을 1 L 유리 비커에 첨가하고, 500 mL (2.5배 부피)의 아이소프로판올과 서서히 혼합하였다. 상기 용액을 실온에서 15분 동안 교반하여 갈색 침전물을 형성하였다. 상기 혼합물을 원심분리하고 (5 min, 10,000 rpm, 소발 초원심분리기(Sorvall Untracentrifuge), SLA-1500 회전자), HFBII-함유 상청액을 청결한 1 L 유리 비커 내에 가만히 따라냈다. 아이소프로판올 (1배 부피)을 상기 상청액에 첨가하고, 실온에서 10분 동안 교반하여 백색 미세 침전물을 생성하였다. 이 침전물을 원심분리 (10 min, 10,000 rpm)에 의해 수확하고, 1200 mL 동결건조 병으로 옮기고, 62시간 동안 동결건조시켜 미세한 백색 분말을 생성하였다. 상기 분말을 100 mL의 탈이온수에 용해시키고, 냉동하였다.
건조 고형물 분석. 1 g의 정제된 HFBII의 고형물 함량을 전자레인지 건조 (옴니마크 마이크로웨이브 수분 분석기(Omnimark μWave Moisture Analyzer))에 의해 분석하였더니 건조 고형물이 7.33%였다.
SDS-PAGE. 도 1에 도시된 바와 같이, 나타낸 완충제 (10 mM 트리스-HCl, pH 8.0, 0.01% 트윈-80) 중에 샘플들을 희석시키고, 이를 1x 환원제를 함유하는 LDS 샘플 완충제 (인비트로겐)와 2:1로 혼합함으로써 SDS-PAGE에 의해 정제 HFBII를 분석하였다. 샘플들을 90℃에서 5분 동안 인큐베이션하고, 15 ㎕를 SDS-PAGE 겔 (12%, 1 mM 비스-트리스, 10개의 레인, 인비트로겐)의 각각의 웰 내에 로딩하였다. 겔을 1x MES 완충제 (인비트로겐)에서 200 V에서 35분 동안 진행시키고, 쿠마시 브릴리언트 블루를 이용하여 염색하고, 탈염색시켰다 (10% 에탄올, 10% 아세트산). 생성된 겔 이미지는 정제된 샘플 중 HFBII에 있어서 선명한 밴드를 나타내며, 비정제된 농축물 (1/100)에 있어서는 어떠한 미량의 보이는 비-하이드로포빈 밴드도 나타내지 않는다.
RP-HPLC. 도 2에 나타낸 바와 같이, HFBII의 1 mg/g의 용액은 샘플을 10% 아세토니트릴에 희석시킴으로써 제조하였다. 인산나트륨 완충제 ("A", 25 mM, pH 2.5) 및 아세토니트릴 ("B", 0.05% TFA)의 구배를 이용하여 C5 컬럼 (슈펠코 디스커버리 C5, 300 Å, 5 ㎛, 2.1 x 100 ㎜)에서 역상 HPLC 시스템 (애질런트)에 의해 HFBII를 분리하였다. 상기 HFBII 용액을 상기 컬럼 (60℃) 상에 주입하고 (20 ㎕), 0.8 mL/분으로 6분에 걸쳐 10% 용매 B로부터 70% B로 증가시킴으로써 용출시켰다. 상기 시스템을 10% B로 되돌리고, 2분 동안 평형화한 후 다음 주입을 하였다. HFBII를 222 ㎚에서의 흡광도에 의해 모니터링하였다. HFBII는 하나의 큰 피크 및 작은 숄더 - N-말단 페닐알라닌 절단에 상응함 - 로서 4.38분에 컬럼으로부터 용출된다. 다른 피크들은 크로마토그램에서 전혀 관찰되지 않는다.
질량 분광법. 도 3에 나타낸 바와 같이, 정제된 HFBII (0.5 ㎕)를 스테인리스강 MALDI 플레이트 (어플라이드 바이오시스템즈) 상에 스포팅하고, 0.5 ㎕의 포화 시나핀산 용액 (50% 아세토니트릴)과 혼합하고, 건조시켰다. 샘플을 MALDI-TOF MS (보이저, 어플라이드 바이오시스템즈)로 분석하여 양의 모드에서 4,000 내지 20,000 m/z를 획득하였다. 생성된 스펙트럼은 7189.8 m/z에서 주 피크를 나타내며, 이는 HFBII의 질량에 상응한다 (이론치: m+1 = 7189.4 m/z). 다른 피크들은 공지된 N-말단 페닐알라닌 절단 (m+1 = 7040.49 m/z) 및 기체상 HFBII 이량체 (14380 m/z)에 기인할 수 있다.
아미노산 분석. 정제된 HFBII (1 mL)를 외부 실험실 (에이에이에이 서비시즈, 인크.(AAA Services, Inc.))에 의해 이중으로 아미노산 분석에 대하여 분석하였다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 그 결과는 HFBII가 63.2 mg/g으로 존재하며, 용액 중 주 단백질임을 나타내며, 이는 계산된 아미노산 조성과 관찰된 아미노산 조성 사이의 유사성에 의해 나타내어지는 바와 같다.
[표 1]
Figure pct00007
알코올 침전 스캔. 대안적인 알코올들을, HFBII를 선택적으로 침전시키는 그들의 능력에 대하여 분석하였다. 공용매들을 1배 부피의 HFBII 농축물에 첨가하고, 14,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 침전에 대하여 평가하였다. 1배 부피 및 2배 부피의 메탄올을 첨가하면 각각 진한 갈색 또는 연한 갈색 침전물이 생성되었다. 이 용액의 상청액을 3배 부피의 메탄올 (총 5)과 혼합하여 큰 백색 침전물을 생성하였으며, 이는 정확하게 아이소프로판올을 이용하여 관찰된 바와 같았다. 유사한 결과들이 공용매로서 에탄올을 이용할 경우 관찰되었다. 글리세롤은 4:1의 비에서 어떠한 단백질도 침전시킬 수 없었다. 또한, 1-부탄올 및 1-옥탄올은 어떠한 단백질도 침전시키지 않았으며, 대신 2상 혼합물을 형성하였다. 따라서, 작은 사슬 (C3 이하)의 알코올은 HFBII의 선택적 침전에서 효과적이다.
* * *
이와 같이 본 발명의 바람직한 실시 형태들을 상세하게 설명하였지만, 상기 단락들에 의해 정의된 본 발명은 상기 설명에 개시된 특정한 상술에 한정되지 않으며 그 이유는 그의 많은 분명한 변화가 본 발명의 사상 또는 범주로부터 벗어나지 않고서 가능하기 때문임을 이해하여야 한다.

Claims (20)

  1. 하이드로포빈 II를 정제하는 방법으로서, C1 -C3 알코올을 하이드로포빈 용액에 첨가하여 제1 침전물을 생성하는 단계, 상청액을 C1 -C3 알코올/하이드로포빈 용액으로부터 가만히 따라내는 단계 및 C1-C3 알코올을 상청액에 첨가하여 제2 침전물을 생성하는 단계를 포함하며, 여기서 제2 침전물은 정제된 하이드로포빈 II인 방법.
  2. 제1항에 있어서, C1-C3 알코올은 아이소프로판올인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 약 2 내지 3배 부피의 아이소프로판올을 첨가하여 제1 침전물을 생성하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 약 2.5배 부피의 아이소프로판올을 첨가하여 제1 침전물을 생성하는 방법.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 약 1배 부피의 아이소프로판올을 상청액에 첨가하여 제2 침전물을 생성하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, C1-C3 알코올은 메탄올인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 약 1 내지 2배 부피의 메탄올을 첨가하여 제1 침전물을 생성하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 약 1.5배 부피의 메탄올을 첨가하여 제1 침전물을 생성하는 방법.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 약 1배 부피의 메탄올을 상청액에 첨가하여 제2 침전물을 생성하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, C1-C3 알코올은 에탄올인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 약 1 내지 2배 부피의 에탄올을 첨가하여 제1 침전물을 생성하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 약 1.5배 부피의 에탄올을 첨가하여 제1 침전물을 생성하는 방법.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 약 1배 부피의 에탄올을 상청액에 첨가하여 제2 침전물을 생성하는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 실온에서 수행되는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 하이드로포빈 II 정제를 위하여 알코올을 재활용하거나 또는 재사용하는 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 하이드로포빈 II를 동결건조시키는 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 하이드로포빈 II의 순도를 SDS-PAGE, HPLC, 질량 분광법 또는 아미노산 분석법으로 분석하는 방법.
  18. 제1항 내지 제17항의 방법들 중 어느 하나에 따라 하이드로포빈 II를 정제하기 위한 C1-C3 알코올의 용도.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 침전물은 갈색 침전물인 방법 또는 용도.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 침전물은 백색 침전물인 방법 또는 용도.
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