MXPA05012298A - Proceso de manufactura de una proteina anticoagulante extractada de nematodos (nap). - Google Patents
Proceso de manufactura de una proteina anticoagulante extractada de nematodos (nap).Info
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Abstract
La presente invencion proporciona un proceso para la manufactura de Proteinas Anticoagulantes extractadas de Nematodos (NAPS), en donde la NSP manufacturada mediante el metodo del proceso reclamado es una substancia de farmaco NAP que puede ser formulada como un producto de farmaco NAP. La presente invencion proporciona substancias de farmacos NAP y los productos de farmacos NAP manufacturados mediante el proceso aqui descrito. En una modalidad, la presente invencion proporciona un proceso para la manufactura de una substancia de farmaco rNAPc2/prolina y el producto de farmaco rNAPc2/prolina, y proporciona una substancia de farmaco rNAPc2/prolina manufacturada mediante el proceso aqui descrito.
Description
PROCESO DE MANUFACTURA DE UNA PROTEÍNA ANTICOAGULANTE EXTRACTADA DE NEMÁTODOS (NAP)
SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio de prioridad de la solicitud también pendiente "Método de Tratamiento de Enfermedad Hemorrágica Utilizando un Inhibidor de Factor Vlla/Factor de Tejidos" presentada en Mayo 6, 2003. Campo de la Invención La presente invención se refiere a un proceso para la manufactura de proteínas que son anticoagulantes en el plasma humano y a proteínas producidas mediante este proceso. Específicamente, la presente invención se refiere a procesos para la fabricación de Proteínas Anticoagulantes Extractadas de Nemátodos (NAPs) y relacionadas con las NAPs manufacturadas mediante este proceso. En particular, la presente invención se refiere a las substancias de fármacos NAP y productos de fármacos NAP y procesos para su fabricación. Antecedentes de la Invención El descubrimiento y purificación de proteínas terapéuticas que tienen valor potencial como productos farmacéuticos, se puede llevar a cabo en un laboratorio de investigación utilizando materiales y métodos que no son adecuados para la producción comercial en gran escala de los productos farmacéuticos. Para generar productos farmacéuticos en una escala comercial, las operaciones de manufactura biotecnológica deben de ser robustas y se pueden escalar sin comprometer la calidad del producto (Gottschalk, 2003, BioProcess Intl 1(4): páginas 54 a 61). Los procesos de manufactura para productos farmacéuticos deben proporcionar métodos efectivos en costos, mejorar los rendimientos del producto, una capacidad suficiente para cubrir la demanda y, de manera ideal, deben de proporcionar la capacidad de escalación del proceso para responder a las fluctuaciones en la demanda. Los procesos de manufactura para proteínas terapéuticas deben desarrollar métodos efectivos en costos para la producción de cantidades grandes de la proteína en una forma funcional, así como métodos para purificar la proteína para generar un producto farmacéutico de una pureza adecuada para su uso pretendido. Los métodos de "escala de investigación" de purificación de proteínas, también conocidos como métodos de "escala de laboratorio", o "escala de banca", con frecuencia están enlazados cercanamente con los métodos que fueron utilizados para descubrir y caracterizar la proteína terapéutica. Con frecuencia, un rendimiento de solamente microgramos o miligramos de proteína purificada es suficiente para caracterizar y elaborar la secuencia de la proteína. Aún después de que se ha desarrollado un sistema de expresión para producir de manera recombinante una proteína terapéutica, dichos sistemas de expresión no son necesariamente adecuados para producir la proteína en una escala comercial. Además, los métodos de purificación de escala de purificación pueden utilizar solventes orgánicos, ácidos fuertes y otros reactivos que no son deseables o prácticos en una escala comercial y algunas veces, no permitidos en la fabricación de productos farmacéuticos. Además, estos métodos de purificación pueden utilizar métodos de separación tales como el colado molecular o la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) que son métodos de purificación poderosos en el laboratorio, pero no se pueden escalar fácilmente en los niveles de producción comercial . Los procesos de escala piloto, por ejemplo, volúmenes de fermentación de 10L a 100L en una célula huésped que expresa la proteína terapéutica, son adecuados para estudiar adicionalmente el proceso de producción o para producir cantidades suficientes de una proteína terapéutica para estudios clínicos tempranos, pero hasta los procesos de escala piloto, no siempre se pueden escalar para fabricar las cantidades requeridas para los estudios clínicos de la fase final. Un método para aumentar la capacidad de manufactura de biotecnología comprende extender la capacidad de producción y eficiencia de los sistemas de expresión microbianos. Una variedad de "fábricas" biológicas bien establecidas están disponibles para la producción de proteínas terapéuticas. Sin embargo, debido a que la producción de la proteína funcional está íntimamente relacionada con la maquinaria celular del organismo que produce la proteína, cada sistema de expresión tiene ventajas y desventajas para utilizarse en una producción de gran escala de productos farmacéuticos, dependiendo de la proteína. El E. coli ha sido la "fábrica" de elección para la expresión de muchas proteínas debido a que es fácil de manejar, crece rápidamente, requiere medios de crecimiento que no son costosos y puede secretar proteínas en el medio, lo cual facilita la recuperación. Sin embargo, muchas proteínas eucarióticas producidas en el E. coli son producidas en una forma no terminada y no funcional que carece de la glucosilación y otras modificaciones posteriores a la traducción, así como la formación de proteínas con un enlace de disulfuro apropiado y un doblez tri-dimensional. Además, el material producido en el E. coli puede tener contaminación de endotoxinas. Con frecuencia se encuentran restricciones similares utilizando especies de Bacilos como sistemas de expresión. Los sistemas de cultivo de células de mamíferos proporcionan cantidades pequeñas de proteínas eucarióticas con una glucosilación y doblez apropiados, pero los cultivos de células de mamíferos son costosos, pueden ser difíciles de escalar para los niveles de producción comercial y pueden ser inestables y requerir el uso del suero animal. Los sistemas de expresión de células de insectos son rápidos, y relativamente fáciles de desarrollar, y ofrecen buenos niveles de expresión de las proteínas de mamífero, pero pueden ser costosos, solamente se pueden escalar de manera moderada y pueden producir una glucosilación inapropiada. Los sistemas de expresión de levadura son populares debido a que son fáciles de cultivar, rápidos y se pueden escalar; sin embargo, algunos sistemas de expresión de levadura han producido resultados inconsistentes, y a veces es difícil lograr rendimientos altos. Un sistema de expresión de levadura que ha mostrado una gran promesa es el Pichia pastoris metanotrófico. Comparado con otros sistemas de expresión eucariótica, el Pichia ofrece muchas ventajas, debido a que no tiene el problema de las endotoxinas asociadas con la bacteria, ni los problemas de contaminación viral de las proteínas producidos en los cultivos de células animales (Ciño, Am Biotech Lab, Mayo 1999). El Pichia utiliza metanol como la fuente de carbón en ausencia de glucosa, utilizando un promotor de oxidasa de alcohol inducido por metanol (AOX1), el cual generalmente controla la expresión de la enzima la cual cataliza el primer paso en el metabolismo de metanol, como un promotor que se puede inducir por metanol para dirigir la expresión de proteínas heterólogas. El índice de crecimiento prolífico del Pichia lo hace fácilmente escalable a la producción en escala comercial, aunque los retos de escalación incluyen el control del pH, limitación de oxígeno, limitación de nutrientes, fluctuación de temperatura y consideraciones de seguridad para el uso del metanol (Gottschalk, 2003, BioProcess Intl 1(4): páginas 54 a 61; Ciño Am Biotech Lab, Mayo 1999). La producción bajo las condiciones de la Buena Práctica de Manufactura (cGMP) son posibles con el Pichia pastoris, en una escala de fermentaciones de 1000L (Gottschalk, 2003, BioProcess Intl 1(4): páginas 54 a 61). Otro método para aumentar la capacidad de manufactura biotecnológica es mejorar la recuperación de la proteína y el procesamiento descendente de los productos de fermentación. En el procesamiento descendente, los procesos deben de ser ajustables para acomodar los cambios y mejoras en la titulación de fermentación, la composición de los medios y la viabilidad celular, mientras que maximizan la productividad de la capacidad existente (Gottschalk, 2003, BioProcess Intl 1(4): páginas 54 a 61). Los avances recientes en cromatografía y filtración proporcionan aumentos importantes en la selectividad, recuperación y ofrecen altas capacidades y tiempos del ciclo bajos para que sean compatibles con volúmenes grandes y niveles de expresión altos de los procesos de fermentación de alimentación de lote actuales (Gottschalk, 2003, BioProcess Intl 1(4): páginas 54 a 61). No obstante las grandes ventajas para la mejora de la manufactura biotecnológica, no existen soluciones globales para cada proteína. El proceso de manufactura para una proteína terapéutica específica requiere soluciones novedosas e innovadoras a los problemas que pueden ser específicos para esa proteína o familia de proteínas. De un modo similar, las aplicaciones comerciales exitosas, con frecuencia dependen de una combinación de propiedades específicas de la proteína o familia de proteínas y los procesos de producción utilizados para fabricar la proteína o la familia de proteínas como productos farmacéuticos. Sumario de la Invención La presente invención proporciona un proceso para la manufactura de Proteínas Anticoagulantes purificadas extractadas de Nemátodos (NAPs), y substancias para fármacos NAP purificados y productos de fármacos NAP fabricados mediante este proceso. La presente invención proporciona un proceso para la manufactura de cantidades grandes (escala comercial) de substancias de fármacos NAP y productos de fármacos NAP. En particular, la presente invención proporciona un proceso para la fabricación de una substancia de fármaco NAP que incluye los pasos de: (a) un proceso de fermentación que comprende producir el NAP en un huésped adecuado, en donde por lo menos se integra una secuencia que codifica el NAP en el genoma del huésped; (b) un proceso de recuperación en el cual el NAP es separado de la célula y los desechos celulares; y (c) un proceso de purificación para purificar la substancia de fármaco NAP de los contaminantes. Un huésped adecuado es Pichia pastoris. El proceso puede incluir además la introducción de la substancia de fármaco NAP en una formulación final de un fármaco. El proceso puede incluir además un proceso de rellenado que incluye la filtración a granel de la substancia del fármaco NAP en la formulación del fármaco final, y un proceso de llenado que puede incluir el abastecimiento de la substancia de fármaco NAP en la formulación final del fármaco en formas de dosificación para generar el producto del fármaco NAP y puede incluir además, la liofilización del producto del fármaco NAP. El proceso aquí proporcionado puede ser utilizado para fabricar la substancia del fármaco NAP purificada o el producto del fármaco NAP a partir de rNAPc2 (AcaNAPc2), rNAPc2/prolina (AcaNAPc2/prolina), AcaNAP5, AcaNAP6, AcaNAP23, AcaNAP31, AcaNAP42, AcaNAP48, AceNAP5, AceNAP7, AduNAP4, AcaNAP24, AcaNAP25, AcaNAP44, ó AcaNAP46. La presente invención proporciona una substancia de fármaco NAP fabricada mediante el proceso aquí descrito. La presente invención proporciona una substancia de fármaco NAP manufacturada utilizando un NAP seleccionado a partir de, pero sin limitarse a, rNAPc2 (AcaNAPc2), rNAPc2/prolina (AcaNAPc2/prolina), AcaNAP5, AcaNAP6, AcaNAP23, AcaNAP31, AcaNAP42, AcaNAP48, AceNAP5, AceNAP7, AduNAP4, AcaNAP24, AcaNAP25, AcaNAP44, ó AcaNAP46. En una modalidad, una substancia de fármaco NAP de la presente invención puede ser fabricada utilizando rNAPc2/prolina. La presente invención proporciona además un producto de fármaco NAP manufacturado mediante el proceso aquí descrito. La presente invención proporciona un producto de fármaco NAP manufacturado utilizando un NAP seleccionad a partir de, pero sin limitarse a, rNAPc2 (AcaNAPc2), rN APc2/prolina (AcaNAPc2/prolina), AcaNAP5, AcaNAP6, AcaNAP23, AcaNAP31, AcaNAP42, AcaNAP48, AceNAP5, AceNAP7, AduNAP4, AcaNAP24, AcaNAP25, AcaNAP44, ó AcaNAP46. En una modalidad, una substancia de fármaco NAP de la presente invención es fabricada utilizando rNAPc2/prolina. De acuerdo con otro aspecto, la presente invención proporciona un proceso para la manufactura de substancias de fármaco rN APc2/proIina y productos de fármaco r APc2/prolina. La presente invención proporciona además una substancia de fármaco rNAPc2/prolina y productos del fármaco rNAPc2/prolina manufacturados mediante el proceso aquí descrito. En particular, la presente invención proporciona un proceso para la manufactura de una substancia de fármaco rNAPc2/prolina que incluye un proceso de fermentación, un proceso de recuperación y un proceso de purificación. El proceso aquí proporcionado incluye un proceso de fermentación en donde la rNAPc2/prolina es producida en Pichia pastoris que tiene por lo menos una secuencia que codifica la r APc2/prolina que está integrada en el genoma, en donde el proceso de fermentación incluye una fermentación de semilla para cultivar la célula huésped en una densidad celular deseada y un proceso de fermentación de producción que comprende la fermentación de lote de glicerol, fermentación de lote alimentada de glicerol, fermentación de adaptación de metanol y fermentación de inducción de metanol, hasta aproximadamente siete días. El proceso aquí proporcionado incluye además un proceso de recuperación que incluye cromatografía de intercambio de iones de lecho expandido para separar la rNAPc2/prolina de las células y desechos celulares. El proceso aquí proporcionado proporciona además un proceso de purificación que incluye cromatografía de interacción hidrofóbica que utiliza medios de cromatografía de interacción hidrofóbica, recolectando fracciones de rNAPc2/prolina por lo menos una ultrafiltración/diafiltración (UF/DF) de las fracciones de rNAPc2/prolina, cromatografía de intercambio de iones, y recolección de las fracciones de rNAPc2/prolina de la cromatografía de intercambio de iones, en donde las fracciones de rNAPc2/prolina de la cromatografía de intercambio de iones contiene la substancia del fármaco rNAPc2/prolina. De acuerdo con un aspecto, el proceso incluye el control de la temperatura para la fermentación, manteniendo en particular la temperatura de la fermentación de adaptación de metanol en un rango de aproximadamente 28 ± 2 °C durante aproximadamente las primeras cuatro horas y de aproximadamente 25 + 1 °C por el resto de la fermentación de adaptación de metanol. De acuerdo con otro aspecto, el pH es mantenido en un pH de aproximadamente 2.9 ± 0.1 durante la fermentación de adaptación de metanol, y la fermentación de inducción de metanol. En una modalidad, el proceso de recuperación incluye cromatografía de intercambio de iones de lecho expandido de resina Streamline SP XL en un pH de aproximadamente 3.2 ± 0.2 y el paso de purificación incluye cromatografía de interacción hidrofóbica Source 15PHE en un pH aproximado de 3.0 ± 0.1 y cromatografía de iones Source 15Q, seguidos por UF/DF de las fracciones NAP de la cromatografía de intercambio de iones. Además, se proporciona un proceso para la manufactura de un producto líquido de fármaco rNAPc2/prolina que incluye la manufactura de la substancia de fármaco rNAPc2/prolina mediante el proceso aquí descrito, seguido por la introducción de la substancia del fármaco rNAPc2/prolina en la formulación final del fármaco, un proceso de rellenado que incluye la filtración a granel y un paso de llenado que comprende el abastecimiento de rNAPc2/prolina en una forma de dosificación final, dicho abastecimiento se hace en un contenedor o frasco para generar un producto de fármaco líquido rNAPc2/prolina, y puede incluir además la liofilización del producto del fármaco rNAPc2/prolina. La presente invención proporciona un producto líquido de fármaco rNAPc2/prolina manufacturado mediante este proceso, y el producto de fármaco de rNAPc2/prolina liofilizado fabricado mediante este proceso. La presente invención proporciona un proceso para la manufactura de cantidades grandes (escala comercial) de la substancia de fármaco NAP, en particular la substancia del fármaco rNAPc2/prolina. La substancia del fármaco NAP fabricada mediante el proceso aquí proporcionado puede ser formulada y abastecida como un producto de fármaco NAP, incluyendo un producto líquido de fármaco NAP o un producto de fármaco NAP liofilizado. También, la substancia del fármaco rNAPc2/prolina fabricada mediante el proceso aquí proporcionado puede ser formulada y abastecida como un producto de fármaco rNAPc2/prolina, incluyendo un producto de fármaco líquido rNAPc2/prolina o un producto de fármaco rNAPc2/prolina liofilizado. Este proceso es adecuado para una producción eficiente en escala comercial de la substancia de fármaco NAP y los productos de fármaco NAP que tienen niveles deseados de actividad y pureza. En contraste, los métodos anteriormente descritos para la purificación de las NAPs fueron métodos de escala de investigación que no se podían escalar para la producción en escalas grandes de las NAPs, y se utilizaron reactivos y materiales que no son deseables en la producción de substancias de fármacos y productos de fármacos. Por ejemplo, un proceso de recuperación descrito anteriormente consistía de la centrifugación para eliminar las células. En el proceso anterior, el sobrenadante era purificado entonces mediante cromatografía de intercambio de cationes, cromatografía de filtración de gel (conocida también como colado molecular), y finalmente, cromatografía de fase inversa. Sin embargo, como aquí se proporcionan, las propiedades de las NAPs, particularmente la rNAPc2/prolina hicieron posible modificaciones en el proceso en escala de investigación para reemplazar el paso de centrifugación por un método que se puede escalar y limpiar, para eliminar ambos el paso de cromatografía de filtración de gel difícil de escalar, y una cromatografía líquida de fase inversa de alta presión ( P-HPLC) que comprendía el uso de un solvente orgánico flamable y equipo especializado y mejorar la pureza del producto final. En el proceso aquí proporcionado, un paso de cromatografía de intercambio de iones de lecho expandido, en particular, un paso de cromatografía de lecho expandido Streamline SP XL, eliminó las operaciones unitarias múltiples generalmente utilizadas para un paso de recuperación del proceso comercial (por ejemplo, una combinación de microfiltración y ultrafiltración). Como aquí se proporciona, el paso Streamline SP XL fue utilizado para separar la rNAPc2/prolina de los desechos celulares y el intercambio del producto en un regulador adecuado para el primer paso de purificación. Aunque el método anteriormente descrito utilizaba filtración de gel y cromatografía de fase inversa, estos pasos de columna fueron reemplazados en la presente invención por cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) y cromatografía de intercambio de aniones, en particular HIC utilizando Source 15PHE e intercambio de aniones utilizando Source 15Q, lo cual dio como resultado una purificación importante de la rNAPc2/prolina a través de la remoción de la proteína y los contaminantes que no son proteináceos. Parece que el pl relativamente bajo de la rNAPc2/prolina (pl = 4.1) y otros NAPs podía estar involucrado en la producción del resultado sorprendente de que el enlace superior a la matriz y una recuperación general más alta del producto del paso HIC, dependen de la realización de este paso de cromatografía en un pH bajo de aproximadamente 3.2. Además, las eficiencias del proceso resultaron de llevar a cabo los pasos en un pH de aproximadamente 3, iniciando desde los últimos pasos de fermentación a través de cromatografía Streamiine y HIC, lo cual eliminó el intercambio de regulador entre los pasos. Breve Descripción de los Dibujos La figura 1 ¡lustra un mapa de un vector dei vector de expresión rNAPc2/prol¡na de Pichia pastoris, pYAM7sp8/rNAPc2/prolina utilizado para la producción de rNAPc2/prolina, que muestra los puntos de referencia. Las figuras 2A y 2B ilustran un diagrama de flujo de fermentación que muestra los materiales y reactivos utilizados, el proceso y equipo utilizado, y las condiciones que son controladas y monitoreadas para cada paso del proceso de fermentación; la fermentación comienza con la preparación del matraz de semillas y continúa a partir de la fermentación de semillas a través de la fermentación de producción. La figura 3 ilustra un diagrama de flujo de recuperación que muestra los materiales y reactivos utilizados, el proceso y equipo utilizado, y las condiciones que son controladas y monitoreadas durante el proceso de recuperación. Las figuras 4A y 4B ilustran un diagrama de flujo de purificación que muestra los materiales y reactivos utilizados, el proceso y equipo utilizado, y las condiciones que son controladas y monltoreadas durante el proceso de purificación; la purificación incluye los pasos de cromatografía de intercambio e interacción hidrofóbica en Source 15PHE, el paso de ultrafiltración/diafiltración #1 (UF/DF #1), cromatografía de intercambio de iones Source 15Q, el paso UF/DF final, la filtración a granel, el rellenado y el almacenamiento del producto purificado. La figura 5 ilustra un diagrama de flujo de un producto de fármaco líquido que muestra los materiales y reactivos utilizados, el proceso y equipo utilizado, y las condiciones que son controladas y monitoreadas durante el proceso de elaboración del producto de fármaco líquido. Este proceso incluye un paso de composición, un paso de filtración y llenado, y la transferencia de frascos con el producto del fármaco líquido en el almacenamiento. La figura 6 ilustra un diagrama de flujo de la formulación del producto de fármaco liofilizado que muestra los materiales y reactivos utilizados, el proceso y equipo utilizado, y las condiciones que son controladas y monitoreadas durante el proceso de formulación del producto de fármaco liofilizado. El proceso incluye un paso UF/DF, un paso de composición, un paso de filtración de granel y rellenado, y la transferencia a la unidad de liofilización. Descripción Detallada de la Invención La presente invención proporciona un proceso para la manufactura de Proteínas Anticoagulantes purificadas extractadas de Nemátodos (NAPs), tales como las que se describen en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,863,894; 5,864,009; 5,866,542; 5,866,543; 5,872,098; y 5,945,275 (cuyo contenido total de cada una está incorporado a la presente descripción como referencia), en donde las NAPs caracterizadas hasta la fecha tienen actividad anticoagulante y/o actividad de proteasa de serina. La presente invención proporciona NAPs purificadas manufacturadas mediante el método del proceso reivindicado, en donde dicha NAP purificada es una substancia de fármaco NAP que puede ser formulada como un producto de fármaco NAP. La presente invención puede ser particularmente adecuada para la manufactura de polipéptidos que incluyen por lo menos un dominio NAP. La presente invención proporciona substancias de fármaco NAP y productos de fármaco NAP manufacturados mediante el proceso aquí descrito. En una modalidad, la presente invención proporciona un proceso para la manufactura de una substancia de fármaco rNAPc2/prol¡na y un producto de fármaco rNAPc2/prolina, y proporciona la substancia de fármaco rNAPc2/prolina y el producto de fármaco r APc2/prolina manufacturado mediante el proceso aquí descrito. Las Proteínas Anticoagulantes extractadas de Nemátodos (NAPs), son designadas así, debido a que el primer NAP originalmente aislado fue extractado de un nemátodo, la uncinaria canina, Ancyclostoma caninum. El término "dominio NAP" se refiere a una secuencia que se considera que tiene propiedades anticoagulantes. Generalmente, un dominio NAP es una secuencia de aminoácidos que contiene menos de aproximadamente 120 residuos de aminoácidos, y contiene 10 residuos de cisteína, tal y como se describe en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,863,894; 5,864,009; 5,866,542; 5,866,543; 5,872,098; y 5,945,275. El "dominio NAP" también se puede referir a secuencias de ácidos nucleicos o nucleótidos que codifican una o más secuencias de aminoácidos o polipéptidos que tienen dominios NAP. Los dominios NAP representativos, secuencias de aminoácidos NAP, características ampliamente definidas de esta familia de proteínas y moléculas de ácido nucleico, las cuales codifican dichas proteínas, se describen en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,863,894; 5,864,009; 5,866,542; 5,866,543; 5,872,098; y 5,945,275. La substancia de fármaco NAP de la presente invención incluye anticoagulantes caracterizados por inhibir la coagulación de la sangre, lo cual incluye la coagulación del plasma. Las substancias de fármaco NAP de la presente invención incluyen, entre otros, aquellos que aumentan el tiempo de coagulación medido del plasma humano, en los ensayos del tiempo de protrombina (PT) y/o el tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT), tal y como se describe en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,863,894; 5,864,009; 5,866,542; 5,866,543; 5,872,098; y 5,945,275. Un experto en la técnica puede utilizar otros ensayos para determinar la actividad anticoagulante de las substancias de fármaco NAP. Un experto en la técnica puede también utilizar otros ensayos para determinar otras actividades biológicas de las substancias de fármaco NAP. Los términos "AcaNAPc2" ó "rNAPc2" se refieren a proteínas recombinantes de la familia NAP. La preparación y secuencia del AcaNAPc2 se describe en la Patente Norteamericana No. 5,866,542. Los términos "AcaNAPc2/prolina ", "AcaNAPc2P", "rNAPc2/prolina" y "rNAPc2/Pro" se refieren a una proteína recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos de AcaNAPc2 la cual ha sido modificada para agregar un residuo de prolina en la terminal C de la secuencia de AcaNAPc2. Los términos "Substancia de Fármaco" o "Ingrediente Farmacéutico Activo" (API) se refieren a material activo farmacéuticamente que puede ser formulado posteriormente con excipientes para producir un producto de fármaco. La substancia de fármaco puede estar en forma de granel. El término "Producto de Fármaco" se refiere a la forma de dosificación acabada (por ejemplo, cápsulas, tabletas, producto líquido en un frasco, polvo liofilizado en un frasco) que contiene la substancia del fármaco en el regulador de formulación final, y generalmente contiene ingredientes inactivos. El producto de fármaco puede ser una substancia de fármaco formulada. El término "Excipiente" se refiere a los ingredientes inactivos agregados intencionalmente al producto de fármaco, en donde deberá entenderse que los excipientes no tienen propiedades farmacológicas en las cantidades utilizadas. El término "Impureza" se refiere a un componente presente en una substancia de fármaco, formulación API, o producto de fármaco que no es el producto deseado, una substancia relacionada con el producto, o excipiente, en donde está entendido que una impureza puede estar relacionada con el producto o relacionada con el proceso. El término "Productos de degradación" se refiere a variantes, especialmente a variantes moleculares, que resultan de los cambios en la substancia de fármaco o el producto de fármaco con el paso del tiempo debidos a la luz, pH, temperatura, agua o reacción con un excipiente o un sistema de contenedor/empaque/envoltura. El término "USP" se refiere a estándares establecidos en la Farmacopea de los Estados Unidos de América (USP) y el Formulario Nacional (NF) (United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville Maryland (2002), "USP26-NF-21", cuyo contenido total está incorporado al presente documento como referencia), y los Estándares de Referencia USP. La información adicional se puede encontrar en la dirección http:Wwww.usp.org, o consultando el USP-NF. La presente invención proporciona un proceso que produce una substancia de fármaco NAP de alta pureza, en donde no se utilizó materia prima de origen animal para paso alguno de fermentación o purificación. Este proceso se puede escalar y es adecuado para ser operado en un producto a una escala de producción comercial. La presente invención proporciona un proceso para la manufactura de la substancia de fármaco NAP y el producto de fármaco NAP, en donde el proceso incluye procesos de fermentación, recuperación, purificación, filtración y rellenado. Se proporciona un proceso de fermentación por medio del cual la NAP es producida en un huésped adecuado, en donde son integradas las secuencias que codifican la NAP en el genoma del huésped. Se proporciona un proceso de recuperación, el cual mejora el rendimiento y pureza de las proteínas recuperadas en el paso de fermentación, en donde el proceso de recuperación permite una captura más eficiente de la NAP comparado con la metodología más convencional, tal como la microfiltración y ultrafiltración. Se proporciona un proceso de purificación por medio del cual la substancia del fármaco NAP es purificada de los contaminantes, en donde las formulaciones deseadas son logradas utilizando una combinación de métodos, incluyendo pero sin limitarse a, ultrafiltración, diafiltración, cromatografía de interacción hidrofóbica, y cromatografía de intercambio de iones. Se proporciona un proceso de rellenado opcional, en donde el producto de fármaco NAP es introducido en paquetes y puede ser liofilizado. Los procesos de la presente invención son adecuados para la manufactura de substancias de fármacos NAP y productos de fármacos NAP. Un experto en la técnica puede modificar los procesos aquí descritos para mejorar la expresión, recuperación, purificación, formulación o rellenado de una substancia de fármaco NAP particular. En un ejemplo no limitativo, un experto en la técnica puede determinar el punto isoeléctrico (pl) de una NAP de interés particular y puede hacer ajustes menores a las condiciones, tales como la capacidad de enlace o el pH del paso de cromatografía para lograr la filtración mejorada de la substancia de fármaco NAP deseada. La presente invención proporciona substancias de fármaco NAP purificadas aquí descritas a partir de NAPs, incluyendo pero sin limitarse a AcaNAPc2, AcaNAPc2/prolina, AcaNAP5, AcaNAP6, AcaNAP23, AcaNAP31, AcaNAP42, AcaNAP48, AceNAP5, AceNAP7, AduNAP4 AcaNAP24, AcaNAP25, AcaNAP46, y AcaNAP44. En particular, la presente invención proporciona rNAPc2/prolina. Un experto en la técnica puede identificar otras proteínas NAP adecuadas para utilizarse en los procesos aquí descritos para la manufactura de substancias de fármacos NAP purificadas.
Fermentación La presente invención proporciona un proceso de fermentación en el cual es producida la NAP en un huésped adecuado. Tal y como está propuesto, se integran una o más secuencias que codifican la NAP en un genoma del huésped, y el huésped produce la NAP durante el proceso de fermentación. En una modalidad, la rNAPc2/prolina es producida como una proteína secretada por Pichia pastoris en un proceso de fermentación tal y como aquí se proporciona. Como aquí se proporciona, el proceso de fermentación incluye un proceso de fermentación de semilla en donde las células huésped son cultivadas a una densidad celular deseada y un proceso de fermentación de producción en donde la NAP es producida en un título deseado. Un proceso de fermentación de semilla proporciona un inoculo denso adecuadamente para un proceso de fermentación para producir niveles altos de NAP. El proceso de fermentación aquí propuesto incluye además una fermentación de producción para producir niveles altos de NAP. La fermentación de producción incluye clases diferentes: un lote de glicerol; un lote alimentado de glicerol; adaptación de metanol e inducción de metanol. La fase de lote de glicerol construye la biomasa. En la fase de lote alimentada de glicerol, se alimenta una solución enriquecida con glicerol al cultivo para aumentar la biomasa y reprimir la expresión. En la fase de adaptación de metanol, se termina la alimentación de glicerol y se reemplaza por la alimentación de metanol la cual induce al huésped a producir NAP. En la fase de inducción de metanol, las condiciones del procesamiento al final de la fase de adaptación de metanol son mantenidas con el objeto de mantener la producción de NAP. De acuerdo con un aspecto, el rango de pH para la fermentación es controlado para lograr el título de nivel alto deseado de NAP. En una modalidad, el pH para la fermentación es controlado en un rango de aproximadamente 2.9 + 0.1 unidades de pH durante la fermentación de adaptación de metanol y la fermentación de inducción de metanol. De acuerdo con otro aspecto, la temperatura para la fermentación es controlada. En una modalidad, la temperatura de la fase de adaptación de metanol para la fermentación es sostenida en una temperatura de aproximadamente 28 ± 2 °C por las primeras cuatro horas para ayudar a la adaptación exitosa a la alimentación de metanol y la temperatura para el resto de la fase de adaptación de metanol, es sostenida en aproximadamente 25 + 1 °C para favorecer el título alto de NAP. De acuerdo con un aspecto, el título de NAP continúa aumentando sin efectos dañinos en el producto durante siete días, lo cual logra un nivel general alto de producción de NAP.
En modalidades ilustrativas, el proceso de fermentación aquí proporcionado ha sido realizado en fermentadores de 15L, 100L, 150L y 1000L y el material de las fermentaciones de 15L, 100L y 150L ha sido purificado para generar la substancia de fármaco NAP. En una modalidad, el proceso de fermentación produce rNAPc2/prolina en un título alto. En varias modalidades, la fermentación para producir la rNAPc2/prolina ha sido realizada en fermentadores de 15L, 100L, 150L y 1000L, y la substancia del fármaco de rNAPc2/prolina ha sido purificada de las fermentaciones de 15L, 100L y 150L. Recuperación La presente invención proporciona un proceso de recuperación para mejorar la producción y pureza de las proteínas NAP del paso de fermentación. El proceso de recuperación aquí proporcionado permite la captura de la NAP y la remoción de células y desechos celulares en donde el proceso de recuperación aquí proporcionado es más eficiente comparado con la metodología más convencional, tal como la microfiltración/ultrafiltración. Sin desear estar limitados por esta teoría, la eficiencia mejorada de la recuperación aquí proporcionada, puede ser el resultado de una combinación de aspectos del Pichla pastoris, es decir que el Pichia pastorls crea una biomasa densa durante la fermentación. Además, las proteínas NAP son proteínas relativamente pequeñas y por lo tanto, requieren membranas de filtración de tamaño de poro pequeño, las cuales tienen índices de flujo lento que dan como resultado tiempos largos de procesamiento. De acuerdo con un aspecto, el proceso de recuperación utiliza cromatografía de intercambio de iones, incluyendo el uso de una unidad de cromatografía de intercambio de iones de lecho expandido para separar la NAP de las células y desechos celulares, y para intercambiar el producto en un regulador adecuado para utilizarlo en los pasos de purificación siguientes. En una modalidad, la resina del intercambio de iones Streamline SP XL (Amersham Biosciences) de la unidad de cromatografía de lecho expandido es utilizada para recuperar la substancia del fármaco NAP, tal y como aquí se describe. En otra modalidad, la rNAPc2/prolina es separada de los desechos celulares de la célula huésped expresando la rNAPc2 utilizando cromatografía de lecho expandido. En una modalidad especialmente preferida, la rNAPc2/prolina es recuperada utilizando la unidad de intercambio de iones Streamline XL. Alternativamente, el proceso de recuperación para capturar eficientemente la NAP del paso de fermentación se puede llevar a cabo utilizando métodos diferentes a la cromatografía de intercambio de iones de lecho expandido. Un experto en ia técnica puede probar y evaluar métodos alternativos para capturar la NAP y eliminar células y desechos celulares, incluyendo pero sin limitarse a cromatografía por afinidad, centrifugación, filtración, precipitación diferencial, y otros métodos que serán determinados. Purificación La presente invención proporciona un proceso de purificación en el cual la substancia del fármaco NAP es purificada de los contaminantes. Como aquí se proporciona, el proceso de purificación incluye cromatografía de interacción hidrofóbica, recolectando las fracciones de NAP, por lo menos una fracción de ultrafiltración y diafiltración (UF/DF) día NAP, cromatografía de intercambio de iones, la recolección de las fracciones NAP de la cromatografía de intercambio de iones y otro paso UF/DF, y una filtración final. Deberá quedar entendido que cada paso proporcionado en el proceso de purificación aumenta la pureza de la substancia del fármaco NAP, de modo que un experto en la técnica puede determinar el paso de pureza requerido para un uso particular y seleccionar los pasos y condiciones necesarias para lograr el nivel deseado de pureza de la substancia del fármaco NAP. La eficiencia de proceso general ha sido mejorada manteniendo un pH bajo (aproximadamente 3) en la solución iniciando a partir del caldo de fermentación a través del paso de recuperación y el primer paso de purificación (cromatografía de interacción hidrofóbica Source 15PHE).
Estos pasos fueron diseñados especialmente para ser llevados a cabo en el mismo pH, para eliminar los pasos de intercambio de pH/regulador requeridos en otros procesos, reduciendo de este modo, el tiempo y la mano de obra requeridos, así como reduciendo el potencial de pérdidas del producto. Estos pasos son llevados a cabo en un pH inferior a aproximadamente 5, preferentemente en un pH inferior a aproximadamente 4, más preferentemente en un pH de aproximadamente 3. En una modalidad, la cromatografía de interacción hidrofóbica utiliza medios de cromatografía de interacción hidrofóbica Source 15PHE en un pH de aproximadamente 3.0 + 0.1. Como aquí se proporciona, el proceso de purificación utiliza cromatografía de interacción hidrofóbica para remover contaminantes, en donde el uso de un pH bajo permite el enlace de cantidades grandes de NAP a los medios hidrofóbicos y el uso de un gradiente de elución permite la separación de impurezas estrechamente relacionadas. Como aquí se proporciona, la fracción de NAP elulda de los medios de cromatografía de interacción hidrofóbica pasa por la ultrafiltración y diafiltración (UF/DF) para concentrar el producto y llevar a cabo el intercambio de regulador, después del cual, la NAP en un regulador adecuado es aplicada a un medio de intercambio de iones para remover la mayor parte de la proteína restante y los contaminantes no proteináceos, incluyendo los contaminantes relacionados íntimamente. Finalmente, como aquí se proporciona, la fracción de NAP recolectada de la cromatografía de intercambio de iones, que contiene la substancia del fármaco NAP altamente purificada (API), pasa por UF/DF para concentrar la substancia del fármaco NAP e intercambiarla en la formulación de regulación final. En una modalidad, el eluido acondicionado filtrado del paso de cromatografía Streamllne SP XL utilizado para la recuperación de NAP, es aplicado a una columna de medios de cromatografía de interacción hidrofóbica Source 15PHE (Amersham Biosciences), en un pH bajo (aproximadamente 3.0 ± 0.1) en donde cantidades grandes de NAP se enlazan a la columna, seguido por la elución de gradiente de Source 15PHE, la adición de hidróxido de sodio para elevar el pH hasta aproximadamente 5 o mayor, y luego la UF/DF de la fracción de NAP eluida, después de lo cual la solución NAP es aplicada a una columna de medios de cromatografía de iones Source 15Q (Amersham Biosciences) y el gradiente de elución es utilizado para separar la substancia del fármaco NAP de los contaminantes íntimamente relacionados. En una modalidad, las fracciones de NAP de la cromatografía de intercambio de iones contienen la substancia del fármaco NAP. En otra modalidad, el proceso de purificación se lleva a cabo como se describió anteriormente para obtener substancia del fármaco rNAPc2/prolina altamente purificada.
Como aquí se proporciona, las soluciones que contienen NAP pueden pasar por varios pasos de filtración para obtener la substancia del fármaco NAP en concentraciones deseadas o en formulaciones deseadas. Se pueden incluir, según se desee, pasos de filtración adicionales. Por consiguiente, las fracciones NAP eluidas de los pasos de cromatografía pueden ser filtradas, concentradas, desaladas, y pasar por el intercambio de regulador utilizando la ultrafiltración (UF) sola o en combinación con diafiltración (DF) o una combinación de ultrafiltración y diafiltración (UF/DF). Como aquí se proporciona, la UF/DF puede ser utilizada para intercambiar el regulador de elución de cromatografía de interacción hidrofóbica para el regulador de carga de cromatografía de intercambio de iones, o intercambiar el regulador de elución de cromatografía de iones por un regulador de formulación final, o una formulación de fármaco al granel que va a ser utilizada para el producto de fármaco NAP. La UF/DF se puede llevar a cabo utilizando uno o más filtros. De acuerdo con un aspecto, se utiliza un solo filtro (o membrana de filtro), con un tamaño de poro de peso molecular seleccionado para la UF/DF. Alternativamente, se pueden utilizar filtros múltiples, según sean necesarios, para la escalación. En una modalidad, la fracción NAP con el pH ajustado del paso de cromatografía de interacción hidrofóbica pasa por la ultrafiltración utilizando un filtro con un tamaño de poro de 3kDa MW para lograr la concentración deseada, y entonces el conjunto retenido que contiene NAP es diafiltrado contra 5 o más volúmenes del regulador de carga de intercambio, utilizando la misma membrana de filtro del tamaño de poro 3kDa MW hasta que se determina que han sido logradas las condiciones del regulador deseadas. En una modalidad, las fracciones NAP de la cromatografía de intercambio de iones pasan por lo menos un paso a una UF/DF final. En otra modalidad, las fracciones de NAP del paso de cromatografía de intercambio de iones pasan por la UF/DF como se describió anteriormente para intercambiar la substancia del fármaco NAP en el regulador de la formulación del fármaco final. En otra modalidad, se utilizan filtros de ultrafiltración de celulosa regenerada con un tamaño de poro 3kDa MW para la ultrafiltración o diafiltración. Un experto en la técnica puede seleccionar y evaluar los filtros y membranas de filtros que son adecuados para, y compatibles con, las condiciones experimentales y las metas deseadas. Filtración al Granel Como aquí se proporciona, la substancia del fármaco
NAP en regulador de formulación final puede ser filtrada y almacenada, y pasar por pasos de procesamiento adicionales. En una modalidad, la substancia del fármaco NAP en la formulación final pasa por un proceso de llenado. En una modalidad, la substancia del fármaco NAP al granel es transferida a un entorno estéril adecuado, por ejemplo, "área de clase 100" en una instalación de manufactura, y filtrada en contenedores estériles. En otra modalidad, la substancia del fármaco NAP es filtrada, por ejemplo, utilizando un filtro de 0.2 µ??, y los contenedores del material adecuado se someten al autoclave, es decir, contenedores hechos de etileno propileno fluorinado (FEP), copolímero de etileno tetrafluoroetileno (EFTE), u otro material que cubre los requerimientos de la Enmienda de Aditivos de Alimentos de los Fármaco, s Alimentos y Cosméticos Federales de los Estados Unidos de América, y la designación de Clase VI de la USP. En una modalidad, el producto del fármaco a granel rNAPc2/prolina es transferido a un área de Clase 100 y filtrado utilizando un filtro de 0.2 µ?? Millipak en una botella de 1 litro de Nalgeno moldeado Tefzel® FEP serie 1600, sin recubrimiento, y un cierre de tornillo Tefzel®ETFE no contaminado después de lo cual, las botellas son transferidas a un congelador a una temperatura entre -20 ± 10 °C para el almacenamiento. La substancia del fármaco NAP al granel puede ser filtrada de nuevo y llenada utilizando el mismo método para la filtración final, es decir, el contenido de botellas más pequeñas llenadas como se describió anteriormente, puede ser transferido a un contenedor más grande. En una modalidad, el contenido de las botellas de Teflón FEP que contienen la substancia del fármaco rNAPc2/prolina como se describió anteriormente son transferidas en un área de Clase 100 de carboy sometidaa a autoclave, se vuelven a filtrar y son llenadas. Faso de Llenado De acuerdo con un aspecto, la presente invención proporciona además un paso de llenado, en donde la substancia del fármaco NAP en la formulación final del fármaco es llenada en un frasco, contenedor u otro empaque aséptico. El paso de llenado puede incluir pasos de filtración adicionales, y puede incluir el uso de la suite de llenado anterior para llenar frascos individuales, contenedores y otros empaques. Un paso de llenado puede proporcionar un frasco del producto de fármaco NAP, en donde el producto de fármaco NAP se encuentra en la forma de dosificación final. Un paso de llenado líquido puede proporcionar un frasco del producto del fármaco NAP en forma líquida. El producto del fármaco NAP puede ser utilizado en la forma introducida durante el paso de llenado, es decir, una dosis unitaria de solución que contiene el producto de fármaco NAP. Alternativamente, la formulación del producto de fármaco NAP puede ser manipulada adicionalmente después del paso de llenado, es decir, el producto de fármaco NAP de un frasco después de un paso de llenado líquido puede entonces ser liofilizado. Como aquí se proporciona, la substancia del fármaco NAP en la concentración final deseada puede ser filtrada en una suite de llenado aséptica y luego llenada en frascos individuales previamente esterilizados. En una modalidad, la substancia del fármaco rNAPc2/prolina a granel, (en una concentración de 12 ± 1.2 mg/mL) es diluida en 3 mg/mL en una solución de 0.2 alanina, y 25 mM de fosfato de sodio monobásico, pH 7.0. La rNAPc2/prolina diluida entonces es diafiltrada con > 5 volúmenes de una solución de alanina/fosfato. La solución de rNAPc2/prolina es removida y los filtros son enjuagados con solución de alanina/fosfato. La solución de rNAPc2/prolina diafiltrada entonces es diluida a 2 mg/mL (medido por el ensayo UV descrito a continuación en los ejemplos) con los enjuagues del filtro, y la solución de alanina/fosfato. Los 2 mg/mL de solución de rNAPc2/prolina entonces son diluidos con un volumen igual de 25 mM de fosfato de sodio, 8% de sacarosa, pH 7.0 para lograr una concentración de 1.0 ± 0.1 mg/mL de rNAPc2. Finalmente, la solución de rNAPc2/prolina de 1 mg/mL formulada es filtrada utilizando un filtro de 0.2 µ?t? Millipak (Millipore Corp.) antes del paso de llenado. El producto del fármaco rNAPc2/prolina en 1 mg/mL es filtrado en una suite de llenado aséptica a través de dos filtros de 0.2 ?? Millipak en línea. La rNAPc2/prolina entonces es llenada en frascos de vidrio de 3 ce individuales previamente esterilizados y parcialmente tapados. Como una modalidad alternativa, la substancia del fármaco rNAPc2/prolina al granel puede ser formulada para un producto de fármaco líquido. Esto se describe en el ejemplo 5.1. LiofUización La presente invención proporciona un paso opcional de liofilización para producir el producto del fármaco NAP liofilizado. Después del paso de llenado, el producto del fármaco NAP en los frascos u otros contenedores son secados por congelación y luego sellados, es decir, se acomodan bien los tapones de los frascos y los frascos son tapados. La formulación liofilizada mantiene una alta pureza y una estabilidad sostenida cuando el producto del fármaco NAP es sometido a un esfuerzo de temperatura severo, por ejemplo, 28 días a una temperatura de 50°C. La presente invención será explicada adicionalmente por medio de ejemplos específicos que se presentan a continuación con el propósito de mostrar las características de los procesos para la manufactura de la rNAPc2/prolina y las características de la r APc2/prolina producida mediante estos procesos, incluyendo datos y métodos de caracterización del producto purificado. En los ejemplos siguientes, los efectos anteriormente mencionados son aclarados describiendo los procesos para la manufactura de la substancia del fármaco de rNAPc2/prolina adecuados para la formulación como productos de fármacos para utilizarse en una composición farmacéutica. Sin embargo, estas modalidades se establecen para la ilustrar la invención y no deberán ser interpretadas como limitación de la misma, siendo definida la presente invención por las reivindicaciones. EJEMPLOS Ejemplo 1. Preparación de bancos de células para el sistema de expresión de la substancia del fármaco NAP Ejemplo 1.1. Sistema de Expresión de rNAPc2/prolina El gen rNAPc2 fue clonado en un vector de expresión de Pichia pastoris, pYAM7sp8 (Laroche et al., 1994, Biotechnology 12: páginas 1119 a 1124), utilizando el rescate por PCR. El vector pYAM7sp8 (figura 1) es un derivado de pHIL-D2 (Despreaux and Manning, 1993, Gene 106: páginas 35 a 41). Este vector contiene el promotor y la señal de terminación de transcripción del gen de AOX1 de Pichia pastoris, un péptido de señal de secreción (una fusión de la secuencia de señal de fosfatasa de ácido de Pichia pastoris y la pro-secuencia de un factor de a-acoplamiento híbrido de S. cerevisiae), y el marcador HIS4 para seleccionar los transfectores. Los cebadores PCR utilizados para rescatar el gen rNAPc2/prol¡na del clon del fago (Jespers et al., 1995, Biotechnology 13: páginas 387 a 382) fueron: A8: 5GCG TTT AAA GCA ACG ATG CAG TGT GGT G 3' (SEQ ID NO: 1) A9: 5 C GCT CTA GAA GCT TCA TGG GTT TCG AGT
TCC GGG ATA TAT AAA GTC 3' (SEQ ID NO: 2) Estos cebadores agregan los sitios Dra1 y Xba\ a los extremos 5' y 3' respectivamente, del fragmento rescatado de ADN,. El subrayado indica los nucleótidos que hibridan a la plantilla. El cebador A9 (SEQ ID NO: 2) también inserta un codón de prolina justamente antes del codón de terminación, el cual convierte la secuencia de codificación de una codificación AcaNAPc2 (SEQ ID NO: 3) a una codificación AcaNAPc2/prolina (SEQ ID NO: 4). El fragmento PCR resultante fue digerido con Dra1 y Xoa1 y clonado en pYAM7sp8 digerido con Sí¿v1 y Spe1. Ligando los extremos romos de pYA 7sp8 (Sfu1) y el fragmento PCR (Dra1) se tuvo como resultado una fusión dentro del cuadro del péptido de señal de secreción de P. pastoris para la porción madura de la rNAPc2/prolina. Ligando los extremos Xba1 y Spe1 del fragmento PCR y pYAM7sp8 se tuvo como resultado la destrucción del sitio pYAM7ps8 Spe1. La cepa de expresión P. pastoris fue construida integrando el cassette de expresión en un genoma de P. pastoris mediante recombinación homologa. La construcción pYAM7sp8/NAPc2 fue digerida con Aor1. El plásmido digerido fue electroporado en células P. pastoris GS115 (his4-). Los transfectores fueron seleccionados para el fenotipo de utilización de metanol (mut+) y la expresión de alto nivel de rNAPc2. Un solo aislado (designado como GS 115/AcaNAPc2P-55) fue seleccionado para la generación del Banco de Célula Maestra (MCB). La cepa de producción fue analizada mediante Southern blots que fueron probados por genes rNAPc2 ó HIS4 radiomarcados. Estos exámenes mostraron que fueron integradas copias múltiples del cassette de expresión en el sitio 3' del gen AOX1. Ejemplo 1.2. Banco de Célula Maestra (MCB) El Banco de Célula Maestra (MCB) fue preparado utilizando un banco previo de un solo aislado de la colonia (GS115/AcaNAPc2P-55). El matraz que contiene el medio del frasco YEPD (bacto peptona, extracto de levadura y dextrosa) con 2% de glucosa fue incubado con 0.5 mL del prebanco y cultivado a una densidad óptica (A550nm) de 0.5 a 1.0. El cultivo fue recolectado, diluido con glicerol a una concentración final de 15% como un crio-conservador, y congelado en crio-frascos almacenados a una temperatura inferior a -60°C. Ejemplo 1.3. Banco de Células de Trabajo del Fabricante (MWCB) Un nuevo Banco de Células de Trabajo del Fabricante (MWCB) fue manufacturado de un frasco de MCB. El frasco de MCB fue utilizado para inocular un frasco que contiene el medio de Peptona de Levadura (peptona y extracto de levadura) y 2% de dextrosa. El frasco fue incubado a una temperatura de 28 ± 2 °C y 250 rpm hasta que la densidad óptica (A6oonm) fue de 17.0 ± 5.0. El cultivo fue recolectado, y se le agregó glicerol como crio-conservador, a una concentración final de 9%. Se llenaron alícuotas de 1.1 ± 0.1 mL en crio-frascos de 2.0 mL, que fueron congelados y almacenados a una temperatura de -70 ± 10 °C. Ejemplo 1.4. Métodos de Prueba Utilizados para el Análisis de Banco de Células Maestras Identificación del Huésped. El cultivo del banco de células de rNAPc2/prolina fue rayado sobre placas de Agar de Tripticasa de Soya (TSA), y las placas fueron incubadas para el cultivo. El aislado fue preparado para identificación utilizando un sistema de identificación Vitek® el cual utiliza una cámara de temperatura controlada y una unidad de sensor fotométrico para monitorear los cambios en la turbidez de la suspensión aislada, la cual había sido inoculada en la tarjeta de prueba de levadura Vitek® que contiene substratos para 26 pruebas bioquímicas convencionales. Para las identificaciones del huésped del banco de células rNAPc2/prolina, el bio-patrón de reacción resultante fue comparado con un organismo de control positivo (Pichia pastoris, ATCC No. 76273) bio-patrón de reacción. Concentración de Células Viables. La concentración de células viables del banco de células rNAPc2/prolina fue medida mediante la enumeración de las unidades formadoras de colonia viables (CFU) mediante la preparación de diluciones en serie de tres frascos del banco de células (cada uno del inicio, la parte media y el extremo). Las diluciones fueron colocadas en placas por triplicado sobre placas TSA e incubadas, los CFUs son contados y los cálculos se realizan para determinar la concentración de células como CFU/mL. Análisis de Secuencia Estructural del Gen. El cultivo de banco de células fue preparado para la formación de secuencia del gen amplificando el gen de rNAPc2/prolina incorporado en el genoma del huésped utilizando la técnica de Reacción de Cadena de Polimerasa (PCR). El producto PCR fue purificado y la concentración determinada. Entonces se elaboró una secuencia del producto PCR, utilizando métodos de terminación de cadena didesoxi (Sanger). La secuencia del gen resultante del banco de células fue comparada con una secuencia de ADN conocida de rNAPc2. La identidad fue confirmada mediante un cotejo del 100%. Ensayo de Contaminación que no es del Huésped. El caldo de fermentación de rNAPc2/prolina fue probado para la contaminación para los que no son huéspedes, inoculando 100 ml_ en cada una de diez placas TSA. Tres placas fueron incubadas en tres temperaturas (20-25°C, 30-34°C y 35-39°C). Durante el séptimo día del período de incubación, las placas fueron inspeccionadas para determinar las colonias microbianas que difieren del huésped característico, anotando particularmente las diferencias en la morfología de la colonia, color y/o tamaño de la colonia. La cepa Gram también se realizó en la placa de lectura final. Los controles negativos apropiados fueron incubados en el ensayo. Ejemplo 1.5. Métodos de Prueba Utilizados para el Análisis del Banco de Células de Trabajo del Fabricante Identificación del Huésped. El cultivo del banco de células rNAPc2/prolina fue rayado sobre placas de Agar Dextrosa Sabouraud (SDA) y las placas fueron incubadas para el cultivo a una temperatura entre 20°C y 25°C durante 7 días. En paralelo, fue rayado un control positivo (cepa ATCC de K. pastoris, un nombre alternativo de P. pastoris) en placas SDA de la misma manera. Las colonias seleccionadas que crecieron entonces fueron probadas mediante la tinción gram. Después de la incubación, por lo menos dos colonias morfológicamente similares de cada placa SDA fueron seleccionadas para las placas SDA de la muestra de prueba y la placa SDA del control positivo. Estas colonias fueron sub-cultivadas en placas SDA separadas e incubadas a una temperatura de 20°C a 25°C durante 7 días. La prueba API 20C AUX y la tinción Gram entonces se realizaron en la proliferación de cada placa de sub-cultivo. El sistema de prueba API (bioMérieux SA; Marcy l'Etoile, Francia) es una prueba de identificación microbiana manual que contiene 20 pruebas bioquímicas miniatura. La tira de prueba 20C AUX contiene 20 pruebas bioquímicas específicas para la identificación de levadura. Los resultados de la prueba API para la muestra de prueba del banco de células rNAPc2/prolina fueron comparados con los resultados obtenidos para el control positivo para confirmar la identificación. Concentración de Células Viables. La concentración de células viables del banco de células rNAPc2/prolina fue medida mediante la enumeración de unidades formadoras de colonia viables (CFUs) mediante la preparación de diluciones en serie de dos frascos del banco de células, extraídos un frasco antes de la congelación del banco y un frasco después de la congelación del banco. Un alícuota de 100 µ? de cada dilución se colocó en placas TSA por duplicado y fueron incubadas de un período de 5 a 7 días. Todas las placas con colonias que se podían contar (30 - 300 CFUs) fueron contadas. Las cuentas obtenidas de las placas de la misma dilución de muestra de prueba fueron promediadas, multiplicadas por esa dilución, y divididas entre el tamaño del alícuota de 100 µ?_ para reportar los resultados como CFU/mL.
Elaboración de Secuencia de ADN. El ADN total fue aislado del banco de células recientemente creado (artículo de prueba). El gen NAPc2/prolina fue amplificado mediante reacción de cadena de polimerasa (PCR) utilizando homólogos cebadores para las secuencias 5' y 3' del gen NAPc2/prolina clonado. El fragmento de ADN resultante (aproximadamente 500 bp) fue purificado utilizando métodos estándar y se utilizaron como una plantilla para la elaboración de secuencia de ADN utilizando una estrategia de camino del cebador realizada utilizando un equipo de elaboración de secuencia de ciclo terminador de radio marcado Termo Sequenase (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Las películas de la elaboración de secuencias fueron leídas mediante digitalización y los datos de la secuencia ensamblados y analizados utilizando el software Sequencher™, versión 3.0 (Gene Codes Corp., Ann Arbor, MI). La secuencia de consenso producida del artículo de prueba fue comparada entonces con la secuencia teórica para el gen NAPc2/prolina. Contaminación que no es del Huésped. Antes de la congelación del banco de células recientemente creado (artículo de prueba), se sometió un frasco para la prueba que no es del huésped. Una muestra del caldo fue diluida cien veces en solución salina. Las placas duplicadas de nueve tipos de medios diferentes fueron inoculadas con 100 µ?_ de la muestra de prueba diluida. Además, un control positivo (cepa ATCC de K. pastoris, un nombre alterno de P. pastoris) fue diluido e inoculado en placas de la misma manera. Otro conjunto de placas no fue inoculado y fue designado como las placas de los controles negativos. Todas las placas excepto la placa SDA fueron Incubadas a una temperatura de 30°C a 35°C durante un período de 48 a 72 horas; las placas SDA fueron incubadas a una temperatura de 20°C a 25°C durante 7 días. Las placas fueron examinadas por los crecimientos después de los días 1 y 2 ó 3. Además, las placas SDA fueron examinadas por el crecimiento después de 7 días. Cualesquiera colonias aberrantes fueron identificadas mediante la prueba API y la tinción Gram. Después del día 2 ó 3, por lo menos dos colonias similares morfológicamente de cada placa TSA fueron seleccionadas de las placas TSA de muestra de prueba y las placas TSA de control positivo. Estas colonias fueron sub-cultivadas en placas TSA separadas e incubadas a una temperatura de 30°C a 35°C durante un período de 48 a 72 horas. La prueba API 20C AUX y la tinción gram entonces se realizaron en la proliferación de cada placa de sub-cultivo. El sistema de prueba API (bioMérieux SA; Marcy l'Etoile, Francia) era una prueba de identificación microbiana manual que contiene 20 pruebas bioquímicas miniatura. La tira de prueba 20C AUX contiene 20 pruebas bioquímicas específicas para la identificación de levadura. Los resultados de la prueba API para el artículo de prueba fueron comparados con los resultados obtenidos por el control positivo para confirmar la identificación. Ejemplo 2. Manufactura de la Substancia del Fármaco de rNAPc2/prolina El proceso de manufactura para la producción de la substancia de fármaco rNAPc2/prolina consiste de fermentación, recuperación, purificación, filtración al granel y llenado. Las siguientes secciones describen las operaciones de las unidades individuales de cada etapa del proceso. Los diagramas de flujo para cada operación de la unidad son presentados en las figuras de la 2 a la 4, en donde los diagramas resumen el equipo, reguladores, componentes y parámetros de entrada y salida. La substitución de proveedores y materiales puede cubrirse, según sea necesario, mientras se mantenga el cumplimiento con los requerimientos de la International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) Active Pharmaceutical Ingrediente (API) Good Manufacturing Protocol (G P) requirements. Ejemplo 2.1 Fermentación Esta sección describe el procedimiento de fermentación para la producción de rNAPc2/prolina. La proteína rNAPc2/prolina fue producida como una proteína secretada por Pichia pastoris. El proceso de fermentación para rNAPc2/prolina consistía de frascos de semilla, una fermentación de semilla y una fermentación de producción (Figura 2, Diagrama de Flujo de Fermentación). Todos los componentes de los medios utilizaron Agua Purificada, USP. Frascos de Semilla para la Fermentación de Semilla. El propósito de la unidad de la operación de unidad de frasco de semilla fue proporcionar un inoculo denso adecuado para la fermentación de semilla. Tres frascos de MWCB fueron deshelados y se utilizó un mililitro para inocular de manera aséptica cada uno de los tres matraces de agitación desviada de dos litros por un contenido de 250 mL de medio sometido a autoclave a un pH de 6.0± de 0.1 (tabla 1). Los matraces fueron cubiertos y transferidos al agitador del encubador a una velocidad de 250 ± 5 rpm y una temperatura de 2°C. Los matraces fueron encubados por un período de 27.5 + 2.0 horas, hasta que la densidad celular medida por el peso de células húmedas (WCW) fue de > 30 g/L. Una vez que estos dos parámetros fueron logrados, el contenido de los dos frascos fue transferido de manera aséptica a una botella de inoculo sometida a autoclave.
Tabla I. Medio del Frasco de Semilla
Fermentación de la Semilla El propósito de la fermentación de la semilla fue proporcionar un inoculo adecuadamente denso para la fermentación de producción. El medio para la fermentación de semilla (tabla 2) incluyendo las Sales de Traza PTM4 (tabla 3) fue transferido a un termentador de semilla. El medio fue esterilizado por vapor, se permitió que se enfriara y se ajustó el pH a 5.0 ± 0.2 con hidróxido de amonio del 28% al 30% esterilizado porfiltro. Una solución antiespuma esterilizada por filtro del 5% (v/v) KF088 en metanol al 50% se agregó entonces a través de un tapón en una concentración de 0.5 M 1/1. Cuando la temperatura se estabilizó a una temperatura de 28.0 + 1.0 °C, el medio fue inoculado con el contenido de la botella del inoculo del frasco de semillas en una proporción de 2.5%. el pH del cultivo de fermentación fue mantenido en un pH de 5.0 ± 0.2 con hidróxido de amonio del 28% al 30%. La proliferación de la fermentación fue monitoreada midiendo el peso de las células húmedas (WCW). La fermentación fue realizada por un período de 15 ± 5 horas hasta un peso de célula húmeda final de > 20 g/L. Una porción del cultivo de fermentación de semilla fue transferida a través de una línea de transferencia esterilizada por vapor a un bote de inoculo sometido a autoclave. Una muestra de fermentación de semilla final fue probada para determinar la contaminación que no es del huésped.
Tabla 2. Medios de Fermentación de Semilla
Tabla 3. Sales de Trazas PTM4 Componentes Concentración Sulfato Cúprico, Pentahidrato 2,0 g/L Yoduro de Sodio 0,08 g/L Molibdato de Sodio, Dihidrato 0,2 g/L Cloruro de Zinc 7,0 g/L Sulfato Ferroso, Heptahidrato 22,0 g/L Ácido Bórico 0,02 g/L Cloruro de Cobalto, Hexahidrato 0,5 g/L Sulfato de manganeso, onohidrato 3,0 g/L d-Biotina 0,2 g/L Ácido Sulfúrico 1,0 mUL Fermentación de Producción El propósito de la fermentación de producción fue producir niveles altos de proteína rNAPc2/prolina. Para lograr esto, el cultivo fue cultivado en una densidad alta de células antes de la inducción del gen rNAPc2/prol¡na. El medio para la fermentación de producción (tabla 4) fue preparado en un fermentador de producción. Estos componentes de los medios fueron disueltos y mezclados con agua USP purificada y luego esterilizados por vapor. El tanque fue enfriado a su temperatura de operación inicial de 28.0 ± 1.0°C. entonces se agregó una solución antiespuma esterilizada por filtro del 5% (v/v) KF880 en 50% de metanol. El pH fue ajustado a su rango de operación inicial de 5.0 ± 0.3 con hidróxido de amonio esterilizado por filtro del 28% al 30%. Cuando se lograron las condiciones iniciales de operación, el medio fue inoculado con el contenido del inoculo de fermentación de semilla de la lata en un proporción de 1 kg de inoculo por 10 kg del medio guardado inicialmente (peso previo a la inoculación).
Tabla 4. Medio de Fermentación de Producción
La fermentación del medio consistió de cuatro fases diferentes: lote de glicerol, lote de glicerol de alimentación, adaptación de metanol e inducción de metanol. En toda la fermentación, los niveles de oxígeno disueltos fueron mantenidos en aproximadamente 35% mediante la adición de aire en un índice constante y el uso de una contrapresión y agitación variable. Si se necesitaba oxígeno adicional una vez que se había logrado la agitación, el chorro de agua fue suplementado con gas de oxígeno. El pH del cultivo en el fermentador fue mantenido con hidróxido de amonio del 28% al 30%. La solución antiespuma fue agregada periódicamente para controlar la formación de espuma. La primera fase de fermentación, la fase del lote de glicerol, construcción de biomasa. El fermentador fue operado a una temperatura de 28 ± 2°C hasta que el glicerol del medio fue agotado, según fue detectado por un pico de oxígeno ocasionado por el cese del metabolismo del giicerol. Esto fue seguido por la fase del lote alimentada del giicerol en la cual fue alimentada una solución del 50% p/p de giicerol a un cultivo en una cantidad de 18.0 + 1.0 mL/kg peso previo a la inoculación/hora para un total de 8.5 horas para aumentar la biomasa y reprimir la expresión. Durante las primeras 4.5 horas de esta fase de alimentación de giicerol, el punto de ajuste del pH del cultivo fue disminuido de 5.0 ± 0.3 a 2.9 ± 0.1 en un índice de 0.5 unidades de pH por hora y mantenido en este pH el resto de la fermentación, es decir, por la duración de la fase de inducción del gen inducido por metanol. La temperatura fue mantenida en 28 ± 2°C durante toda esta fase. El WCW fue de > 225 g/L antes del final de la fase del lote de alimentación de giicerol. En la fase de adaptación de metanol, la alimentación de giicerol fue terminada y reemplazada por la alimentación de metanol, la cual induce a que el organismo produzca rNAPc2. La alimentación de metanol (con un contenido de 6.0 mL/ FO880 antiespuma) fue iniciada en un peso previo a la incoculación de 3.0 mL/kg/hora. El cultivo fue probado para la adaptación de metanol comenzando a las 2 horas después de la iniciación de la adición de metanol. La prueba de adaptación de metanol consistió de determinar brevemente la alimentación y verificar un pico en el oxígeno disuelto. Después de las primeras cuatro horas de la adición de metanol la temperatura fue disminuida a una temperatura de 25 + 1°C durante un período de 2 horas. Después de las primeras cuatro horas de adición de metanol y después de la verificación de que el cultivo estaba utilizando el metanol, el índice de alimentación de metanol fue aumentado por 1.0 mL/kg previo a la inoculación/hora. El consumo de metanol fue medido cada hora para asegurarse que el metanol estaba siendo agotado completamente, en cuyo punto el índice de alimentación de metanol fue aumentado por un 1.0 mL/kg de peso previo a la inoculación/hora, hasta un índice de alimentación final de 6.0 mL/kg de peso previo a la inoculación/hora. Durante la fase de inducción de metanol, las condiciones de procesamiento final de la fase de adaptación de metanol fueron mantenidas en toda la implementación restante. Comenzando aproximadamente a las 48 horas de tiempo de fermentación total, se monitoreó la producción de rNAPc2/prolina determinando la concentración del sobrenadante del caldo medido por un ensayo de Fase Inversa C8. El fermentador de producción fue recolectado después de 144 a 168 horas en el fermentador de producción, y después de que la concentración de rNAPc2/prolina medida por el ensayo de Fase Inversa C8 era de = 0.55 g/L. Una muestra de la fermentación final fue probada para determinar la contaminación que no es del huésped.
El pH fue mantenido en un pH de 2.9 ± 0.1 durante la fase de adaptación de metano! y la fase de inducción de metanol. El caldo de fermentación tenía un pH de 2.9 ± 0.1. Ejemplo 2.2 Recuperación Esta sección describe los procedimientos de recuperación para la producción de rNAPc2/prolina. El proceso de recuperación para la rNAPc2/prolina consistió de una operación de unidad de cromatografía de lecho expandido como lo muestra el diagrama de flujo de la figura 3. Cromatografía de Intercambio de Iones Streamline El propósito del paso de cromatografía de intercambio de iones Streamline SP XL fue separar la rNAPc2/prolina de los deshechos celulares e intercambiar el producto en un regulador adecuado para un primer paso de cromatografía de purificación. El medio utilizado para lograr la separación fue la columna de cromatografía de intercambio de iones de lecho expandido de resina Streamline SP XL (Amersham Biosciences). El caldo de fermentación (en un pH de 2.9 ± 0.1) fue diluido con agua purificada hasta que la conductividad era de > 9 mS/cm. La solución fue ajustada a una concentración de 150 mM de acetato y el pH fue ajustado a un pH de 3.1 ± 0.2 utilizando ácido acético 17.4 M. La solución de carga fue aplicada al lecho expandido de resina que había sido equilibrado con 500 mM de acetato de sodio, pH 3.2 seguido por 50 mM de acetato de sodio, pH 3.2. La columna fue lavada en la modalidad de flujo ascendente con 50 mM de acetato de sodio, pH 3.2 y luego con 50 mM de acetato de sodio/150mM NaCI, pH 3.2. Se permitió que se asentara el lecho de resina y se realizó un lavado adicional utilizando 50 mM de acetato de sodio/150mM de NaCI, en un modo de flujo descendente. La rNAPc2/prolina fue eluida mediante la aplicación de 50 mM de acetato de sodio/350mM de NaCI, pH 3.2, y la concentración de rNAPc2/prolina fue medida mediante un ensayo de Fase Inversa C8. En la preparación del paso de cromatografía de purificación 15PHE, se agregó sulfato de sodio sólido al eluido Streamline en una concentración final de 0.85M. El pH fue ajustado a un pH de 3.1 ± 0.2 utilizando ácido cítrico 2.4 M, y la conductividad fue verificada que fuera de 100 ± 10 mS/cm. El eluido Streamline acondicionado fue filtrado a través de filtros de 0.45 pm. Ejemplo 2.3. Purificación Esta sección describe los procedimientos de purificación para la producción de rNAPc2/prolina. El proceso de manufactura de purificación para la rNAPc2/prolina consistió de un paso de cromatografía de interacción hidrofóbica, un paso de ultrafiltración y diafiltración, un paso de cromatografía de intercambio de iones seguido por un paso de ultrafiltración/diafiltración y una filtración final y llenado de la substancia del fármaco rNAOc2/prolina, también denominada el Ingrediente Farmacéuticamente Activo (API), tal y como se muestra en la figura 4. Cromatografía de Interacción Hidrofóbica Source 15PHE El paso de purificación inicial purificó parcialmente el producto removiendo algunos contaminantes de la proteína y no proteináceos de la rNAPc2/prolina utilizando medios de columna de cromatografía de interacción hidrofóbica Source 15PHE (Amersham Biosciences). El filtrado, el eluido Streamline acondicionado fue aplicado a la columna Source 15PHE previamente equilibrada con 50mM de citrato de sodio/sulfato de sodio 1.1M, pH 3.0. Después de cargarla, la columna fue lavada con regulador de equilibrio. La proteína rNAPc2/prolina fue eluida de la columna utilizando un gradiente de columna de volumen 15 de 1.1 M a 0.3 M de sulfato de sodio en 50mM de citrato de sodio, pH 3.0, seguido por un gradiente sostenido de sulfato de sodio 0.3M hasta que la absorbancia UV regresó a la línea de base. Las fracciones fueron recolectadas en el pico de elución rNAPc2/prolina y luego analizadas mediante el ensayo de Fase Inversa C18. Las fracciones que contienen alta pureza de la pureza de rNAPc2/prolina fueron conjuntadas y probadas mediante la concentración por el ensayo UV. El pH del conjunto Source 15PHE fue ajustado a un pH de 5.3 ± 0.1 mediante la adición de NaOH 5N.
Paso #1 Ultrafiltración/Diafiltración (UF/DF "1) El propósito de la UF/DF #1 fue concentrar el producto e intercambiar la rNAPc2/prolina en el regulador utilizado para la cromatografía Source 15Q. Se utilizaron filtros de ultrafiltración de celulosa regenerada de un tamaño de poro de peso molecular de 3kD. El conjunto Source 15PHE con el pH ajustado fue concentrado a 2.0 + 0.5 g/L (medido por Concentración UV) en las membranas UF/DF#1 que habían sido equilibradas anteriormente con 50m de acetato de sodio, pH 5.3. el conjunto entonces fue diafiltrado con > 5 volúmenes de 50mM de acetato de sodio, pH 5.3, y hasta que el pH era de 5.3 ± 0.1 y la conductividad era de < 6.0 mS/cm. El conjunto UF/DF#1 diafiltrado fue filtrado a través de un filtro de 0.2 µ?? en preparación para la carga en la columna Source 15Q. Cromatografía de Intercambio de Iones Source 15Q La operación de la unidad de cromatografía final eliminó la mayor parte de la proteína restante y los contaminantes no proteináceos de la rNAPc2/prolina utilizando una columna de medios de cromatografía de intercambio de iones Source 15Q (Amersham Biosciences). El conjunto UF/DF#1 filtrado fue aplicado a una columna de cromatografía Source 15Q equilibrada anteriormente de 500mM de acetato de sodio, pH 5.3 seguido por 50mM de acetato de sodio, pH 5.3. Después de la carga, la columna fue lavada con 50mM de acetato de sodio, pH 5.3 en regulador de equilibrio. Un gradiente lineal de volumen de la columna 20 de 0 a 400mM NaCI en 50mM de acetato de sodio, pH 5.3 fue aplicado a la columna. Las fracciones fueron recolectadas en el pico de elución y analizadas por el ensayo de Fase de Inversa C18. Las fracciones que contienen alta pureza de la pureza de rNAPc2/prolina fueron conjuntadas y probadas por la Concentración del ensayo UV. Paso Final de Ultrafiltración/Diafiltración (UF/DF Final) El propósito de la UF/DF Final fue concentrar el producto e intercambiar la rNAPc2/prolina en el regulador de formulación final. Se utilizaron filtros de ultrafiltración de celulosa regenerada de un tamaño de poro de peso molecular de 3kD. El conjunto Source 15Q fue concentrado a 12.0 ± 0.5 g/L
(medido por la concentración de UV), en las membranas Finales de UF/DF, equilibradas previamente con el regulador de formulación final, 65mM de fosfato de sodio/80mM de cloruro de sodio, pH 7.0. El conjunto fue entonces diafiltrado con > 6 volúmenes del regulador de la formulación, hasta que el pH era de 7.0 ± 0.1. Ejemplo 2.4 Filtración al Granel y Llenado La API de rNAPc2/prolina purificada fue transferida en un área de Clase 100 y filtrada utilizando un filtro Millipak de 0.2 pm dentro de una botella de 1 litro de Nalgeno moldeado Tefzel® FEP serie 1600 (etileno propileno fluorinado), con un cierre de tornillo no contaminante sin recubrimiento moldeado Tefzel® ETFE (copolímero de etileno tretrafluoroetileno). Las botellas fueron transferidas a un congelador a una temperatura de -20 ± 10°C para el almacenamiento. El API al granel puede ser filtrado de nuevo y llenado utilizando el mismo método que se utilizó para la filtración final. El contenido de las botellas de Teflón FEP fue transferido al carboy sometido al autoclave en el área de Clase 100, se volvió a filtrar y se llenó. Con respecto a los contenedores y cierres de almacenamiento: ambos el FEP y el ETFE cubren los requerimientos de la enmienda de Aditivos de Alimentos de la Ley Federal de Alimentos, Fármacos y Cosméticos de los Estados Unidos de América. El material cumplió con los requerimientos de la designación USP Clase VI. Ejemplo 3. Controles en el Proceso: Métodos de Prueba de rNAPc2/prolina en Proceso Las condiciones que fueron monitoreadas, incluyendo los criterios de aceptación en el proceso, se encuentran en la lista de los diagramas de flujo de proceso (figuras de la 2 a la
4). A continuación se presentan descripciones breves de los métodos de prueba en proceso. Métodos de Prueba de rNAPc2 en Proceso pH. Se leyó una muestra utilizando un medidor de pH que había sido calibrado con estándares de pH que se pueden rastrear NIST inmediatamente antes de la prueba. El pH de la muestra fue leído a una temperatura de 25 ± 2°C. Conductividad. Los componentes electrolíticos de la solución fueron medidos utilizando un medidor de conductividad que había sido estandarizado con los soportes de los estándares de conductividad de rango que iba a ser medido. La conductividad de la muestra fue leída en ~25°C. Peso de Células Húmedas. Se agregaron aproximadamente 1.5 m L de muestras de fermentación a tubos de microcentrífuga tarados y fueron centrifugados a 10,000 rpm durante aproximadamente 5 minutos. El sobrenadante de cada tubo fue decantado y los tubos que contienen los sólidos fueron pesados. El peso de las células húmedas fue igual al peso neto dividido entre el volumen de la muestra original. Ensayo de Contaminación que no es del Huésped. El caldo final de las muestras de fermentación de semilla y producción fue probado por la contaminación final del huésped inoculando 100 iL sobre cada una de las nueve placas TSA. Tres placas fueron incubadas en tres temperaturas (20-25°C, 30-34°C y 35-39°C). Durante el período de incubación de siete días, las placas fueron revisadas por colonias microbianas que difieren del huésped característico, observando particularmente las diferencias en la morfología de la colonia, el color y/o el tamaño de la colonia. La tinción Gram también se realizó en la fecha de lectura final. Los controles negativos apropiados fueron incluidos en el ensayo. Ensayo de Fase Inversa C8 (Concentración y Pureza).
Los sobrenadantes de las muestras de fermentación de producción y las muestras Streamiine SP XL fueron filtradas en filtros de 0.22 µ?t? y luego inyectadas en una columna de Fase Inversa Kromasil C8, 4.6 x 250 mm. La columna fue equilibrada con 22% de acetonitrilo, 0.1% de ácido trifluoroacético (TFA) antes de la inyección de la muestra. Entonces se operó un gradiente lineal del 22% al 28% de acetonitrilo en TFA al 0.1% durante veinte minutos en un rango de 1 mL/minuto para eluir el material de rNAPc2/prolina. Las diluciones estándar en la rNAPc2/prolina que tenían concentraciones conocidas fueron utilizadas para generar una curva estándar basada en la regresión lineal de la rNAPc2/prolina mg/mL contra el área pico. La cantidad de rNAPc2/prolina en cualquier muestra fue extrapolada de la curva estándar y dividida entre el volumen de muestras inyectadas para determinar la concentración de rNAPc2/prolina en las muestras. La pureza de la rN APc2/prolina fue calculada como un porcentaje del área pico total. Concentración por UV. La concentración de cada conjunto de purificación de la cromatografía Source 15PHE a través del paso UF/DF final, fue determinada utilizando la absorbancia en 280 nm en un espectrofotometro calibrado de manera adecuada. El instrumento se colocó en cero utilizando el regulador aplicable y en solución antes de operarse las muestras de prueba. Las muestras de prueba fueron preparadas diluyendo dentro de un rango lineal (entre 0.13 -1.62 AU). La absorbancia promedio en 280 nm fue dividida entre el coeficiente de extinción [0.59 AU/cm"1(mg/mL)'1] y multiplicado por el factor de dilución para obtener la concentración en mg/mL. Ensayo de Fase Inversa C18 (Pureza). La pureza de las fracciones Source 15PHE y el conjunto, el conjunto UF/DF #1, las fracciones Source 15Q y el conjunto, y el conjunto UFDF final fueron analizados cada uno mediante un ensayo de Fase Inversa C18. La rNAPc2/prolina fue separada de otros componentes de una muestra mediante cromatografía de Fase Inversa de gradiente lineal. Las muestras fueron diluidas, de ser necesario, a aproximadamente 1 mg/mL en cPBS y se inyectaron 30 pL en la columna de Fase Inversa C18 Waters Symmetry (partículas de 5 pm, longitud 4.6 mm I.D. x 250 mm, Waters Corp., Bedford MA) equilibradas en 78% de fase móvil A (0.1% de TFA en agua), y 22% de fase móvil B (0.1% de TFA en acetonitrilo). El porcentaje de la fase móvil B entonces fue aumentado linealmente a 26% durante un período de tiempo de veinte minutos, utilizando un índice de flujo de 1 mL/min. Los picos fueron monitoreados por el detector UV en 210 mm. La pureza de la rN APc2/prolina fue calculada dividiendo el área del pico de rNAPc2/prolina entre el área del pico total en el cromatograma y expresando esa proporción como un porcentaje. Ejemplo 4. Métodos de Prueba API de rNAPc2/prolina Apariencia, Ph, y concentración: un alícuota del artículo de prueba fue examinado visualmente por el color, claridad y la presencia de cualquier material extraño visible. Una muestra fue leída utilizando un medidor de pH calibrado con estándar de pH que puede rastrear NIST inmediatamente antes de la prueba. El pH de la muestra fue leído en 25 ± 2°C. La concentración de la muestra fue determinada utilizando su absorbancia en 280 nm en un espectrofotómetro calibrado de manera adecuada. El instrumento es blanqueado utilizando un diluyente de muestra antes de operar las muestras de prueba. Se preparan muestras de prueba por triplicado diluyéndolas dentro de un rango lineal de (0.13 -1.62 AU) establecido durante la validación del método. La absorbancia promedio en 280 nm es dividida entre 0.59 AU/cm-1 (mg/mL)"1 (el coeficiente de extinción) y multiplicado por el factor de dilución para obtener la concentración en mg/mL. Mapa del Péptido: los artículos de prueba de rNAPc2/prolina y el estándar de referencia de rNAPc2/prolina fueron reducidos y alquilados antes de la digestión enzimática. La rNAPc2/prolina fue desnaturalizada mediante el tratamiento con una concentración alta de clorhidrato de guanidina, y luego reducida con ditiotreitol . Las cisteínas reducidas entonces fueron alquiladas con yodoacetamidas. Las preparaciones de rNAPc2/prolina reducidas y alquiladas fueron digeridas con 2% p/p de tripsina durante aproximadamente 16 horas a una temperatura de 37 ± 2°C. Los péptidos trípticos de cada una de las muestras de proteína rNAPc2/prolina digeridas fueron entonces separados mediante cromatografía de fase inversa para generar un patrón de fragmento en la forma de un cromatograma o "huella". El perfil de elución de la muestra fue comparado visualmente con un perfil de elución estándar utilizando los tiempos de retención del pico. Los perfiles deben de ser comparados, sin picos nuevos o eliminados. Coomassie SDS-PAGE (Identidad/Pureza): Las muestras de prueba, estándar de referencia rNAPc2/prolina y el marcador de intensidad de rNAPc2/prolina fueron diluidos, con o sin un agente de reducción, utilizando un Regulador de Preparación de Muestra LDS Novex NuPAGE® (pH 8.4) a una concentración final de 0.5, 0.5, y 0.005 mg/mL, respectivamente. Una mezcla de los estándares de proteína (Novex Mark 12®) fue diluida de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras reducidas fueron calentadas durante cinco minutos a una temperatura de 95 + 2°C. Las muestras reducidas y sin reducir fueron operadas en gels separados. Las cargas de muestra de diez µg del estándar de referencia y la muestra de prueba, una carga de muestra de 0.1 pg del marcador de intensidad (1% de. carga de muestra), y la masa apropiada del estándar ark 12 fueron analizadas por electroforesis en Novex NuPAGE® antes de la fundición del 4 al 12% de acrilamida Bis-Tris gel en un pH de 6.4. Los gels fueron teñidos con un tinte azul Coomassie coloidal Novex. Para confirmar la identidad, la banda principal fue comparada visualmente con el estándar de referencia y con la mezcla de los estándar de proteína. La intensidad de cualquiera de las bandas de impureza fue preparada visualmente con la banda del 1% del marcador de intensidad. Cualquier banda de impureza mayor del marcador fue reportada. Si no estaba presente banda de impureza alguna mayor que el marcador, la pureza fue reportada como que era comparable con la referencia. Observar que la banda de rNAPc2/prolina no apareció en el tamaño molecular deseado. Debido a su forma no esférica, la rNAPc2/prolina corre en un tamaño molecular aparente más grande. La banda de rNAPc2/prolina corre entre 21.5 y 31 kDa estándares en gels no reducido mientras que la banda rNAPc2/prolina fue operada con un estándar de 21.5 kDa en gels reducidos (Novex son productos de Invitrogen Corp., Carlsbad CA). Fase Inversa C18: la rNAPc2/prolina fue separada de los otros componentes de una mezcla mediante HPLC de fase inversa de gradiente lineal. La pureza de la rNAPc2/prolina fue reportada como la proporción del área del pico de rNAPc2/prolina dividido entre el área total del pico en el cromatograma, expresado como un porcentaje. Se inyectaron en la columna de Fase Inversa C18 Waters Symmetry volúmenes de treinta µ?_ de diluciones de la muestra en aproximadamente 1 mg/mL en cPBS (partículas de 5 µ?p, longitud 4.6 mm I.D. x 250 mm, Bedford A) equilibradas en 78% de fase móvil A (0.1% de TFA en agua) y 22% de fase móvil B (0.1% de RFA en acetonitrilo). El porcentaje de la fase móvil B fue entonces aumentado linealmente a 26% durante un período de tiempo de veinte minutos, utilizando un rango de flujo de 1 mL/min. Los picos fueron monitoreados por el detector UV en 210 nm. Endotoxina: Las mediciones de endotoxina se realizaron de acuerdo con el método UPS Bioactividad: la rNAPc2/prolina prolongó el tiempo de coagulación del plasma humano iniciado por la adición de tromboplastina de una manera dependiente de la concentración. El efecto anticoagulante de la rN APc2/prolina en la coagulación de plasma humano fue medido directamente en un ensayo de coagulación de tiempo de tromboplatina en cerebro de conejo (factor de tejido, Simplastin-Excel) para iniciar la coagulación. Ambos el estándar de referencia de rNAPc2/prolina y la muestra de rNAPc2/prolina fueron diluidos en 1035 nM en el regulador de ensayo. El instrumento de prueba (Coag-A- ate® MAX, Organon Teknika, ahora propiedad de BioMérieux, Durham NC), entonces hizo un conjunto de dilución en el plasma humano desde la preparación del inicio e inhibió los tiempos de coagulación resultantes (CTs) en segundos. Las curvas fueron definidas por la adaptación de regresión lineal CTs log de la rNAPc2/prolina contra las concentraciones de dilución. La bioactividad del artículo de prueba fue calculada entonces como la proporción de la inclinación de la curva del artículo de prueba con la inclinación de la curva en los tiempos del estándar de referencia por la actividad del estándar de referencia. Biocarga: La Cuenta Aeróbica Total (TAC), y Cuenta de Levaduras/Moho Total (TYMC), en la muestra fueron determinados filtrando dos alícuotas de 10mL a través de filtros de membrana de éster de celulosa de 0.45 prn separados. Las membranas de filtro fueron separadas y una fue incubada en una placa de agar TSA a una temperatura de 30-35°C durante un período de 48 a 72 horas y la otra en una placa de agar SDA a una temperatura de 20-25°C durante un período de 5 a 7 días. Después del período de incubación, las unidades formadoras de colonias (CFU) en ambos tipos de agar fueron enumeradas. El número combinado de CFU por 100mL de muestra fue reportado. ADN Residual: El ensayo del Umbral de ADN Total (Molecular Devices Corp. Sunnyvale CA) fue específico para el ADN de un solo hilo. Tuvo tres etapas. En la etapa de reacción, el ADN de un solo hilo reaccionó con dos proteínas de enlace en el reactivo de marcado. Una proteína de enlace fue una proteína de enlace de ADN de un solo hilo de alta afinidad (SSB) de E. coli, conjugado a biotina. La Streptavidina, también presente se enlazó de manera estrecha a la biotina en el conjugado SSB. La otra proteína de enlace fue en anticuerpo antiADN monoclonal contra el ADN de un solo hilo, conjugado en la ureasa de la enzima. Estas proteínas de enlace formaron un complejo con ADN en solución a una temperatura de 37°C. La etapa de separación ocurrió en la Threshold Workstation. El complejo de ADN fue filtrado a través de una membrana de nitrocelulosa recubierto con biotina. La biotina de la membrana reaccionó con streptavidina en complejo de ADN, capturando el complejo. Un paso de lavado rápido eliminó la enzima no específica de la membrana. Para la etapa de detección, el pegado (que contiene la membrana de microcelulosa recubierta con biotina) fue colocado en el Lector del Umbral, el cual contiene la urea del substrato. La reacción enzimática cambió el pH local de la solución del substrato. El sensor de silicón registró un cambio en el potencial de superficie el cual es proporcional al cambio del pH. La Threshold Workstation, la computadora y el Software Threshold monitorearon los cambios potenciales de la superficie en cada sitio de medición. En las mediciones de estas cinéticas analizadas por computadora se cuantificaron los resultados, utilizando una curva estándar generada anteriormente. El Software Threshold calculó la concentración de cada muestra en picogramas de ADN. Exclusión por Tamaño: la rNAPc2/prolina fue separada de otros componentes de una mezcla mediante cromatografía de exclusión por tamaño en base a las diferencias de tamaño molecular. La identidad de rNAPc2/prolina fue confirmada comparando el tiempo de retención promedio (RT) de los duplicados de tres muestras con los estándares de adaptabilidad de cinco sistemas. El porcentaje de tiempos de retención debe de ser de 97.0% a 103.0%. La pureza de la rNAPc2/prolina fue calculada diluyendo el agua del pico de rNAPc2/prolina entre el área del pico total en el cromatograma, y expresándolo como un porcentaje. Las diluciones de la muestra fueron preparadas en cPBS a una concentración nominal de aproximadamente 1 mg/ml e inyectadas en una columna de exclusión por tamaño (Superdex 75 10/30, Amersham Biosciences). El rango de flujo fue mantenido en 0.5 mL/min. Los picos fueron monitoreados mediante detección UV en 210 nm. Peso Molecular mediante Espectrometría de Masa: El peso molecular fue determinado por espectrometría de masa de electro-rociado utilizando un espectrómetro de masa de cuatro polos VG Bio-Q (Quattro Upgrade) (manufacturado por Micromass, Danvers, MA, actualmente propiedad de Water Corp, Bedford, MA). La muestra fue diluida a aproximadamente 1 mg/mL con 0.1% de ácido trifiuoroacético acuoso e inyectada en un Cartucho Trap previamente lavado para des-salario- el cartucho entonces fue eluído a través del puerto de inyección en el espectrómetro. Elaboración de Secuencia de la Terminal-N: Se elaboró una secuencia del artículo de prueba a través de 15 residuos de la terminal N utilizando el Sistema de Elaboración de Secuencia Procise de Terminal-N (Applied Biosystems, Foster City, CA). se elaboró la secuencia de un estándar de calibración de ß-lactoglobulina a través de 15 residuos antes y después del artículo de prueba. No se observaron residuos Cys (cisteína) en el sistema Procise. La secuencia obtenida es comparada con la secuencia teórica del artículo de prueba. Ejemplo 5. Fabricación del Producto de Fármaco de rNAPc2/prolina Ejemplo 5.1. Manufactura del Producto de Fármaco Líquido El proceso de manufactura del producto de fármaco líquido de rNAPc2/prolina está subrayado en la figura 5, el diagrama de flujo del producto de fármaco. El API de rNAPc2/prolina congelado fue removido del almacenamiento de -20°C y descongelado a una temperatura de 2 a 8°C. Una vez descongelado, el API fue transferido al área de elaboración del incompuesto para conjuntarlo y mezclarlo. Para producir el producto del fármaco, el API fue diluido con 65m de fosfato de sodio/80mM NaCI, pH 7.0 a una concentración final de 1.0 ± 0.1 mg/mL medida por la concentración del ensayo UV (descrito anteriormente). Esta dilución se realizó en pasos con mediciones de concentración en el proceso para asegurar que era lograda la concentración especificada. El API diluido entonces fue filtrado a través de un filtro Millipore Millipak de 0.2 µ?t? y colocado en un almacenamiento de corto plazo a una temperatura de entre 2°C y 8°C. Para el paso de llenado, el API diluido fue filtrado en una suite de llenado aséptica a través de dos filtros Millipore Millipak de 0.2 pm en línea. Se tomaron muestras para la prueba de esterilidad al granel. El API diluido entonces fue llenado en frascos de 2 ce previamente esterilizados los cuales fueron tapados y cubiertos inmediatamente. El volumen objetivo de los frascos era de 0.6 ml_. Antes del almacenamiento, los frascos fueron inspeccionados visualmente al 100% bajo condiciones controladas utilizando iluminación y fondos diseñados para iluminar los frascos y el producto, de modo que los frascos defectuosos o los frascos que contienen particulados visibles pudieran ser detectados fácilmente y eliminados del lote. Entonces los frascos fueron cargados en las charolas de almacenamiento marcadas y guardados en el almacenamiento de corto plazo a una temperatura de 2°C a 8°C, y el almacenamiento de largo plazo a una temperatura de -20 ± 10°C. La tabla 5 es una lista de la composición por frasco del producto de fármaco líquido rNAPc2/prolina.
Tabla 5. Composición de Fármaco de rNAPc2/prolina Líquida
Ejemplo 5.2. Fabricación del Producto del Fármaco Liofilizado Una solución de la Substancia del Fármaco al Granel de rNAPc2/prolina (en una concentración de 12 + 1.2 mg/mL en 65 mM de fosfato de sodio/80 mM de cloruro de sodio en un pH de 7.0 ± 0.1) fue diluido a 3 mg/mL en una solución de Alanina 0.2 M, y 25 mM de fosfato de sodio monobásico, pH 7.0. La rNAPc2/prolina diluida entonces fue intercambiada de regulador con la solución de alanina/fosfato. La solución de rNAPc2/prolina entonces fue diluida a 2 mg/mL (medida por la concentración de ensayo UV), con una solución alanina/fosfato. 2 mg/mL de solución de rNAPc2/prolina entonces fue diluida con un volumen igual de 25 mM de fosfato de sodio, 4% de sacarosa, pH 7.0, para lograr una concentración de 1.0 ± 0.1 mg/mL rNAPc2. Finalmente, 1 mg/mL de la solución formulada de rNAPc2/prolina fue filtrada utilizando un filtro de 0.2 pm. Para el llenado, 1 mg/mL de solución de rNAPc2/prolina fue filtrado a través de un filtro de 0.2 pm. La rNAPc2/prolina entonces fue llenada en frascos de vidrio de 3 ce individuales previamente esterilizados y tapada parcialmente. Los frascos entonces fueron secados por congelación en un liofilizador. Después de la liofílización los tapones fueron empujados hacia abajo, y los frascos fueron tapados. La formulación liofilizada mantiene la alta pureza y la estabilidad sostenida cuando el producto de fármaco NAP es sometido a esfuerzos de temperatura severos, por ejemplo, 28 días a una temperatura de 50°C. La tabla 6 es una lista de la composición por frasco del producto de fármaco de rNAPc2/prolina liofilizado.
Tabla 6. Composición de Fármaco de rNAPc2/prolina Liofilizada
Ejemplo 6. Predicción de puntos isoeléctricos de la proteína NAP El punto isoeléctrico (pl) de varias NAPs se determinó para confirmar que el proceso aquí descrito era adecuado para fabricar otras substancias de fármaco NAP y la substancia de fármaco NAP. Las secuencias de la proteína NAP descritas en la patente 5,866,542 fueron calculadas por los programas de predicción de pl. La tabla 7 presenta el pl de las proteínas NAP descritas en la patente en los Estados Unidos calculado por ProtParam y Atalier Biolnformatique. ProtParam el cual utiliza ExPASy (Expert Protein Analysis System) desarrollado por el Instituto Suizo de Bioinformática (SIB) y que se encuentra en la dirección http://us.expasy.org/tools/protparam.html. el cual es recibido por North Carolina Supercomputing Center (NCSS). Atalier Biolnformatique (aB¡) y se encuentra en la direcc http://www.up. univ-mrs.fr/~wabim/d abim/compo-p.html. recibido por la Unversité Aix-Marseille I. Tabla 7. pl Pronosticado de Proteínas NAP Nombre de la Secuencia pl calculado por ProtParam pl calculado por Atalier Biolnformatique AcaNAP5 4.32 4.10 AcaNAP6 4.25 4.03 AcaNAPc2 4.31 4.10 AcaNAPc2/prol¡na 4.31 4.10 AcaNAP23 4.54 4.30 AcaNAP24 4.72 4.45 AcaNAP25 4.72 4.48 AcaNAP31,42, 46 4.28 4.07 AcaNAP44 4.74 4.48 AcaNAP48 4.34 4.13 AceNAP5 4.49 4.25 AceNAP7 4.62 4.37 AduNAP4 4.55 4.33 HpoNAP5 7.62 7.50
Claims (44)
- REIVINDICACIONES 1. Un proceso para la manufactura de una substancia de fármaco de proteína anticoagulante extractada de nemátodos (NAP) el cual comprende: (a) un proceso de fermentación que comprende la NAP que se produce en un huésped adecuado, en donde por lo menos se integra una secuencia que codifica la NAP en el genoma del huésped; (b) un proceso de recuperación que comprende la separación de la NAP de las células y los deshechos celulares; y (c) un proceso de purificación que comprende la substancia del fármaco NAP purificada de los contaminantes.
- 2. El proceso tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el proceso de purificación comprende además la introducción de la substancia NAP en una formulación de fármaco final.
- 3. El proceso tal y como se describe en la reivindicación 2, el cual comprende además un proceso de llenado para producir un producto de fármaco NAP.
- 4. El proceso tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque la NAP es seleccionada del grupo consistente de rNAPc2, rNAPc2/prolina, AcaNAP5, AcaNAP6, AcaNAP23, AcaNAP31, AcaNAP42, AcaNAP48, AceN AP5, AceNAP7, AduNAP4, AcaNAP24, AcaNAP25, AcaNAP44 ó AcaNAP46.
- 5. El proceso tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque la NAP es rNAPc2/prolina.
- 6. El proceso tal y como se describe en la reivindicación 2, caracterizado porque la NAP es seleccionada del grupo consistente de rNAPc2, (AcaNAPc2), rNAPc2/prolina, (AcaNAPc2/prolina), AcaNAP5, AcaNAP6, AcaNAP23, AcaNAP31, AcaNAP42, AcaNAP48, AceNAP5, AceNAP7, AduNAP4, AcaNAP24, AcaNAP25, AcaNAP44 ó AcaNAP46.
- 7. El proceso tal y como se describe en la reivindicación 2, caracterizado porque la NAP es rNAPc2/prolina.
- 8. El proceso tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el huésped es Pichia pastoris.
- 9. El proceso tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el proceso de fermentación comprende un proceso de fermentación de semilla en donde las células huésped con cultivadas a una densidad celular deseada y un proceso de fermentación de producción en donde la NAP es producida a un título deseado.
- 10. El proceso tal y como se describe en la reivindicación 9, caracterizado porque el proceso de fermentación de producción comprende la fermentación del lote de glicerol, fermentación del lote alimentado por glicerol, fermentación de adaptación de metanol y fermentación de inducción de metanol.
- 11. El proceso tal y como se describe en la reivindicación 10, el cual comprende además controlar el rango de pH para la fermentación en aproximadamente 2.9 ± 0.1 unidades de pH durante la fermentación de adaptación de metanol y la fermentación de inducción de metanol.
- 12. El proceso tal y como se describe en la reivindicación 10, el cual comprende además controlar la temperatura para la fermentación.
- 13. El proceso tal y como se describe en la reivindicación 12, el cual comprende mantener la temperatura de la fase de adaptación de metanol de la fermentación en una temperatura de aproximadamente 28 ± 2°C por aproximadamente las primeras cuatro horas y en una temperatura de aproximadamente 25 + 1°C por el resto de la fase de adaptación de metanol.
- 14. El proceso tal y como se describe en la reivindicación 10, caracterizado porque la fermentación de producción se lleva a cabo durante hasta aproximadamente siete días, durante cuyo período el título de NAP continúa aumentando.
- 15. El proceso tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el proceso de recuperación comprende cromatografía de intercambio de iones de lecho expandido.
- 16. El proceso tal y como se describe en la reivindicación 15, el cual comprende cromatografía de intercambio de iones de lecho expandido de resina Streamiine SP XL.
- 17. El proceso tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el proceso de purificación comprende cromatografía de interacción hidrofóbica, recolectando fracciones de NAP, por lo menos una ultrafiltración/diafiltración (UF/DF) de las fracciones NAP, cromatografía de intercambio de iones y recolectando las fracciones NAP de la cromatografía de intercambio de iones.
- 18. El proceso tal y como se describe en la reivindicación 17, caracterizado porque las fracciones de NAP en la cromatografía de intercambio de iones contienen la substancia del fármaco NAP.
- 19. El proceso tal y como se describe en la reivindicación 17, caracterizado porque la cromatografía de interacción hidrofóbica comprende la utilización de medios de cromatografía de interacción hidrofóbica Source 15PHE en un pH de aproximadamente 3.0 ± 0.1.
- 20. El proceso tal y como se describe en la reivindicación 17, caracterizado porque la cromatografía de intercambio de iones comprende la utilización de medios de cromatografía de iones Source 15Q.
- 21. El proceso tal y como se describe en la reivindicación 17, el cual comprende además por lo menos una UF/DF final de las fracciones de la cromatografía de intercambio de iones.
- 22. El proceso tal y como se describe en la reivindicación 21, caracterizado porque la UF/DF intercambia la substancia del fármaco NAP en el regular de formulación del fármaco final para generar el producto del fármaco NAP.
- 23. El proceso tal y como se describe en la reivindicación 3, caracterizado porque el proceso de llenado comprende la filtración al granel de la substancia del fármaco NPA en la formulación del fármaco final.
- 24. El proceso tal y como se describe en la reivindicación 23, el cual comprende además el paso de llenado de abastecimiento de la substancia del fármaco NAP en una forma de dosificación para producir un producto de fármaco NAP.
- 25. El proceso tal y como se describe en la reivindicación 24, caracterizado porque el proceso de llenado comprende además la liofilización del producto de fármaco NAP.
- 26. Un proceso para la manufactura de una substancia de fármaco de rNAPc2/prolina el cual comprende: (a) un proceso de fermentación en donde la rNAPc2/prolina es producida en Plchia pastoris que tiene por lo menos una secuencia que codifica la rNAPc2/prolina y está integrada en el genoma, que comprende la fermentación de semilla para cultivar células huésped a una densidad celular deseada y un proceso de fermentación de producción que comprende la fermentación del lote de glicerol, fermentación del lote alimentado de glicerol, fermentación de adaptación del metanol y fermentación de inducción de metanol, por hasta aproximadamente siete días; (b) un proceso de recuperación que comprende cromatografía de intercambio de iones de lecho expandido para separar la rNAPc2/prolina de la células y los desechos celulares; y (c) un proceso de purificación que comprende cromatografía de interacción hidrofóbica que utiliza medios de cromatografía de interacción hidrofóbica recolectando las fracciones de rNAPc2/prolina, por lo menos una uitrafiltración/diafiltración (UF/DF) de las fracciones de rNAPc2/prolina, cromatografía de intercambio de iones, y la recolección de fracciones de rNAPc2/prolina de la cromatografía de intercambio de iones; en donde las fracciones de rN APc2/prolina de la cromatografía de intercambio de iones contienen la substancia del fármaco rNAPc2/prolina.
- 27. El proceso tal y como se describe en la reivindicación 26, el cual comprende además controlar la temperatura para la fermentación.
- 28. El proceso tal y como se describe en la reivindicación 27, el cual comprende mantener la temperatura de la fermentación de adaptación de metanol en aproximadamente 28 ± 2°C durante aproximadamente las primeras cuatro horas y a una temperatura de 25 ± 1°C por el resto de la fermentación de adaptación de metanol.
- 29. El proceso tal y como se describe en la reivindicación 26, el cual comprende mantener el pH en aproximadamente 2.9 ± 0.1 durante la fermentación de adaptación de metanol y la fermentación de inducción de metanol.
- 30. El proceso tal y como se describe en la reivindicación 26, el cual comprende cromatografía de intercambio de iones del lecho expandido Streamiine SP XL en un pH de aproximadamente 3.2 ± 0.2.
- 31. El proceso tal y como se describe en la reivindicación 26, el cual comprende cromatografía de interacción hidrofóbica Source 15PHE en un pH de aproximadamente 3.0 + 0.1.
- 32. El proceso tal y como se describe en la reivindicación 26, el cual comprende cromatografía de intercambio de iones Source 15PHE.
- 33. El proceso tal y como se describe en la reivindicación 26, el cual comprende además por lo menos una UF/DF final de las fracciones de la cromatografía de intercambio de iones.
- 34. El proceso para la manufactura de un producto de fármaco de rNAPc2/prolina líquido que comprende el proceso tal y como se describe en la reivindicación 26 y comprende además la introducción de la substancia de fármaco rNAPc2/prolina en una formulación final de fármaco, un proceso de llenado que comprende la filtración al granel de la substancia del fármaco de rNAPc2/prolina en una formulación de fármaco final, y un paso de llenado que comprende abastecer la rNAPc2/prolina en una forma de dosificación y un contenedor para generar un producto de fármaco de rNAPc2/prollna líquido.
- 35. El proceso para la manufactura de un producto de fármaco de rNAPc2/prolina liofilizado, que comprende el proceso tal y como se describe en la reivindicación 34, y comprende además la liofilización del producto de fármaco o líquido de rN APc2/prolina en el contenedor.
- 36. Una substancia de fármaco NAP manufacturada mediante el proceso tal y como se describe en la reivindicación 1.
- 37. Una substancia de fármaco NAP tal y como se describe en la reivindicación 36, caracterizada porque la NAP es seleccionada de rNAPc2, (AcaNAPc2), rNAPc2/prolina, (AcaNAPc2/prolina), AcaNAP5, AcaNAP6, AcaNAP23, AcaNAP31, AcaNAP42, AcaNAP48, AceNAP5, AceNAP7, AduNAP4, AcaNAP24, AcaNAP25, AcaNAP44 ó AcaNAP46.
- 38. Una substancia de fármaco NAP tal y como se describe en la reivindicación 37, caracterizada porque la NAP es rNAPc2/prolina.
- 39. Un producto de fármaco NAP manufacturado mediante el proceso tal y como se describe en la reivindicación 2.
- 40. Un producto de fármaco NAP tal y como se describe en la reivindicación 39, caracterizado porque la NAP es seleccionada de rNAPc2, (AcaNAPc2), rNAPc2/prolina, (AcaNAPc2/prolina), AcaNAP5, AcaNAP6, AcaNAP23, AcaNAP31, AcaNAP42, AcaNAP48, AceNAP5, AceNAP7, AduNAP4, AcaNAP24, AcaNAP25, AcaNAP44 ó AcaNAP46.
- 41. Un producto de fármaco NAP tal y como se describe en la reivindicación 40, en donde la NAP es rNAPc2/pro|ina.
- 42. Una substancia de fármaco de rNAPc2/prolina tal y como se describe en la reivindicación 26.
- 43. Un producto de fármaco de rNAPc2/prolina líquido tal y como se describe en la reivindicación 34.
- 44. Un producto de fármaco de rNAPc2/prolina liofilizado tal y como se describe en la reivindicación 35.
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