CN114480353B

CN114480353B - 一种制备重组人奥克纤溶酶的方法

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Publication number: CN114480353B
Application number: CN202210051762.9A
Authority: CN
Inventors: 彭红卫; 李宁
Original assignee: Chengdu Jingze Biopharmaceutical Co ltd; Shanghai Jingze Biological Technology Co ltd; Jingze Biomedical Hefei Co ltd
Current assignee: Chengdu Jingze Biopharmaceutical Co ltd; Shanghai Jingze Biological Technology Co ltd; Jingze Biomedical Hefei Co ltd
Priority date: 2022-01-17
Filing date: 2022-01-17
Publication date: 2023-06-23
Anticipated expiration: 2042-01-17
Also published as: CN114480353A

Abstract

本发明提供了一种制备重组人奥克纤溶酶的方法，属于生物医药技术领域。该方法包括以下步骤：(1)制备酶切后的葡激酶：取重组葡激酶进行酶切，将酶切物分离纯化，得到酶切后的葡激酶；其中，酶切后的葡激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；(2)制备重组纤溶酶：在重组纤溶酶原中加入酶切后的葡激酶进行酶切，将酶切物分离纯化，得到重组纤溶酶。本发明首次发现利用上述方法能够有效去除重组纤溶酶中的杂质A，提高了重组克纤溶酶的纯度，排除了药品在临床应用中潜在的稳定性和安全性风险。本发明的方法成本较低，操作简单，适合工业化生产。

Description

一种制备重组人奥克纤溶酶的方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种制备重组人奥克纤溶酶的方法。

背景技术

人体内的血栓常引发严重的心血管疾病，此类疾病发病突然，死亡率极高，溶栓治疗是治疗此类疾病的常用手段。人纤溶酶原是人体纤溶系统的关键成份之一。利用纤溶酶原激活剂将人纤溶酶原活化后得到的纤溶酶具有丝氨酸蛋白酶活性，能够降解包括层粘连蛋白、纤连蛋白和胶原蛋白等在内的多种蛋白。研究发现，纤溶酶能够通过水解玻璃体后膜和视网膜基底膜之间的粘附分子，使玻璃体和视网膜分离，达到治疗玻璃体黄斑粘连和黄斑牵引的目的。

人纤溶酶由791个氨基酸组成，分子量约为88kD，形成两条链，重链和轻链之间以二硫键连接。人奥克纤溶酶(Ocriplasmin)作为只保留酶活性片段的重组丝氨酸蛋白酶类的纤溶酶，能够通过诱导玻璃体液化及减弱玻璃体黄斑粘连，起到药物性玻璃体后脱离的作用，避免了手术完成玻璃体后脱离创伤大、脱离不彻底等缺陷。重组人奥克纤溶酶具有纤溶酶的蛋白水解催化活性，并且比人纤溶酶更加稳定。

目前微生物发酵后进一步活化是制备重组纤溶酶的主要方法。该方法先由毕赤酵母工程菌发酵得到不具活性的重组纤溶酶原，然后利用纤溶酶原活化剂进行酶切反应，获得具有活性的重组纤溶酶。常见的纤溶酶原活化剂有链激酶、葡激酶和尿激酶。其中，与链激酶、尿激酶相比，葡激酶由于具有更高的特异性而被广泛使用。天然的葡激酶(Staphylokinase，SAK)是金黄色葡萄球菌溶原性噬菌体合成的一种单链蛋白，由136个氨基酸组成，分子量15.5kDa。但是天然的葡激酶非常稀有，制备成本很高，为了降低生产成本，目前工业上主要采用重组葡激酶作为纤溶酶原活化剂来制备纤溶酶。

申请号为201911398263.1的中国专利申请报道了一种重组人奥克纤溶酶的制备方法，该方法包括以下步骤：(a)提供重组人纤溶酶原溶液；(b)将所述重组人奥克纤溶酶原溶液通过阳离子层析柱，得含有重组人奥克纤溶酶原的洗脱液；(c)将氨甲环酸加入所述洗脱液，并加入重组葡激酶进行酶切反应，得初级酶切液；和(d)将所述初级酶切液通过疏水层析柱，得到纯化后的重组人奥克纤溶酶溶液。该方法容易操作，纯化步骤简单，产物收率较高。但是，发明人在进一步的研究中发现，利用该方法获得的重组人奥克纤溶酶在RP-HPLC图谱上产生了一个杂质(命名为杂质A)。

在药品开发中，杂质是否能被全面准确地控制，直接关系到药品的质量可控性与安全性。在药物的研究、生产和临床使用方面，必须严格控制杂质的种类和含量。为了提高重组人奥克纤溶酶产品的纯度，减少药物在临床应用中的安全性和稳定性风险，需要开发出一种制备不含上述杂质A的重组纤溶酶的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备不含杂质A的重组纤溶酶的方法。

本发明提供了一种制备重组纤溶酶的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)制备酶切后的葡激酶：

取重组葡激酶进行酶切，将酶切物分离纯化，得到酶切后的葡激酶；其中，酶切后的葡激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；

(2)制备重组纤溶酶：

在重组纤溶酶原中加入酶切后的葡激酶进行酶切，将酶切物分离纯化，得到重组纤溶酶。

进一步地，步骤(1)中，所述重组葡激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

进一步地，步骤(1)中，所述酶切时采用的酶切试剂为肠激酶，酶切的温度为20～26℃，时间为14～20小时。

进一步地，步骤(1)中，所述分离纯化的方法为：

(1.1)将酶切物上样到NI亲和层析柱，用平衡缓冲液冲洗，收集含有酶切后的葡激酶的流穿液；

其中，NI亲和层析柱的填料为NI Bestarose 6FF；

平衡缓冲液为pH＝5.5的50mM碳酸盐缓冲液；

(1.2)将步骤(1.1)收集的流穿液上样到阳离子层析柱，用洗脱剂洗脱，收集含有酶切后的葡激酶的洗脱液；

其中，阳离子层析柱的填料为UniGel 50SP；

洗脱的方式为梯度洗脱；

洗脱剂由缓冲液A和缓冲液B组成，其中缓冲液B的浓度从0％增加到100％；缓冲液A为10mM碳酸盐缓冲液，pH＝5.5；缓冲液B为含10mM碳酸盐和0.5M NaCl的溶液，pH＝5.5；

(1.3)将步骤(1.2)收集的洗脱液上样到混合模式层析柱，用平衡缓冲液冲洗，收集含有酶切后的葡激酶的流穿液；

其中，混合模式层析柱的填料为Bestarose Diamond MIX-A；

平衡缓冲液为pH＝5.4的10mM碳酸盐缓冲液。

进一步地，步骤(2)中，所述重组纤溶酶原与酶切后的葡激酶的质量比为1:(100～140)；所述酶切的温度为20～26℃，时间为2～6小时。

进一步地，步骤(2)中，所述分离纯化的方法为：将酶切物上样到疏水层析柱，用洗脱剂洗脱，收集含有重组纤溶酶的洗脱液；

其中，疏水层析柱的填料为Capto Butyl Impress GE；

洗脱剂为20％～50％的缓冲液X，洗脱剂中缓冲液X的浓度从20％增加到50％；

缓冲液X为含20mM磷酸盐和0.2M氨甲环酸的溶液。

进一步地，步骤(2)中，所述重组纤溶酶原为重组人奥克纤溶酶原，所述重组人奥克纤溶酶原具有如SEQ ID NO：1所示的N端氨基酸序列。

进一步地，步骤(2)中，所述重组纤溶酶原是按照以下方法制得的：

(a)种子活化与扩增：将表达重组纤溶酶原的毕赤酵母工程菌活化，扩增，得到种子液；

(b)发酵：将步骤(1)的种子液接种至发酵培养基，进行发酵培养，当发酵液中细胞湿重大于等于180g/L，同时溶解氧大于等于100％时，加入诱导剂进行诱导，同时加入由质量比为1：(1～4)的酵母粉和蛋白胨组成的氮源，诱导表达35～75小时，终止发酵；

(c)收集发酵上清，分离提纯得到重组纤溶酶原。

进一步地，步骤(a)中，所述种子液OD₆₀₀值为5.0～15.0；

进一步地，步骤(b)中，所述诱导剂为甲醇，甲醇的加入量为发酵培养基体积的40-74％；所述氮源由质量比为1：2的酵母粉和蛋白胨组成；所述氮源的加入量为发酵培养基体积的2.5-4.25％；所述诱导表达的时间为52～54小时。

进一步地，步骤(b)中，在加入诱导剂的同时还加入了终浓度为0.01～0.2mol/L的赖氨酸类似物。

进一步地，所述赖氨酸类似物的终浓度为0.1mol/L，赖氨酸类似物为氨甲环酸。

进一步地，步骤(b)中，所述种子液与发酵培养基的体积比为(1～15)：100，发酵培养的温度为28～32℃，pH＝2.5～5.5，溶解氧≥8％；优选的，所述种子液与发酵培养基的体积比为(3～10)：100，发酵培养的温度为30.0±1.0℃，pH＝5.0±0.5，溶解氧≥10％。

进一步地，当发酵液中溶解氧大于等于100％时补加碳源，待发酵液中细胞湿重大于等于180g/L时，停止补加碳源，继续发酵直至发酵液中的溶解氧再次大于等于100％。

进一步地，所述细胞湿重为180～220g/L；

所述补加的碳源为甘油，优选为50％甘油，所述甘油的加入量为发酵培养基体积的3％-8.3％。

本发明中的重组葡激酶指按照基因工程领域常规方法，利用工程菌发酵提纯得到的重组蛋白。该重组葡激酶中除了包含天然葡激酶片段外，还包含另外的蛋白片段，例如标签蛋白，热稳定性蛋白(例如硫氧还原蛋白)等。

与现有技术相比，本发明取得了以下有益效果：

(i)以现有技术中的葡激酶融合蛋白对重组人奥克纤溶酶进行酶切，经疏水层析分离得到的重组人奥克纤溶酶中含有杂质A；但是，以酶切后的SAK酶对重组人奥克纤溶酶进行酶切，经疏水层析分离得到的重组人奥克纤溶酶中不含杂质A。本发明首次发现利用本发明的方法能够有效去除重组人奥克纤溶酶中的杂质A。

(ii)本发明的方法得到了不含杂质A的重组人奥克纤溶酶，提高了重组人奥克纤溶酶的纯度，排除了药品在临床应用中潜在的稳定性和安全性风险。

(iii)本发明的方法避免了使用天然的葡激酶，成本较低，本发明的方法操作简单，适合工业化生产。

(iv)本发明方法中采用的发酵工艺不仅能够显著提高重组人奥克纤溶酶原的表达量，还能减少发酵上清中重组人奥克纤溶酶原的降解。该发酵工艺显著提高了重组人奥克纤溶酶原的产量，进而显著提高了重组人奥克纤溶酶的产量。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1：32F171104、32F171105及32F171106批发酵过程OD₆₀₀值图。

图2：32F171104、32F171105及32F171106批发酵过程活性趋势图。

图3：32F171106批非还原电泳图。

图4：32F171106批还原电泳图。

图5：JZB32FE20170104批发酵过程OD₆₀₀值图和活性趋势图。

图6：JZB32FE20170104批非还原电泳图。

图7：JZB32FE20170104批还原电泳图。

图8：添加YP或硫酸铵发酵过程OD₆₀₀值图和活性趋势图。

图9：JZB32FE20170608批非还原电泳图。

图10：JZB32FE20170608批还原电泳图。

图11：实施例4对葡激酶融合蛋白进行酶切后的样品(编号为EK-SAK-meiqie-30min-20190107)和酶切并纯化后的样品(编号为EK-SAK-FT-20190107)的高效液相色谱图叠加。

图12：重组人奥克纤溶酶原(编号为32S181203-PM)和实施例4中利用酶切后的SAK酶对重组人奥克纤溶酶原溶液进行酶切后所得样品(编号为JZB32-meiqie-4h-20190122)的高效液相色谱图叠加。

图13：实施例4制得的纯化后的重组人奥克纤溶酶样品(编号为JZB32-CH-HIC-E1-20190122)和对照例1制得的纯化后的重组人奥克纤溶酶样品(编号为32S171103)的高效液相色谱图叠加。

具体实施方式

本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。

本发明实施例采用的工程菌是表达重组人奥克纤溶酶原的工程菌，该工程菌是按照基因工程领域常规方法构建的，构建方法如下：采用基因工程技术，将合成的编码基因片段克隆入表达载体pPICZαA中构建形成重组表达载体；然后将重组表达载体转化到大肠杆菌DH5α中扩增培养，采用试剂盒提取重组表达载体；重组表达载体经过线性化，进一步纯化后，采用电击转化入感受态酵母宿主Pichia Pastoris X33中，得到目的基因整合到酵母基因组中的重组工程菌；经筛选得到稳定、高表达的工程菌。

本发明采用的YPD、BMGY及BSM培养基为市售培养基，

YPD：酵母浸出粉胨葡萄糖培养基。

YP溶液的组成为：酵母粉50g/L，蛋白胨100g/L。

50％甘油指体积浓度为50％的甘油水溶液。

底物显色法检测目的蛋白活性的方法如下：尿激酶(Urokinase，UK)是一种纤溶酶原激活剂，它能将纤溶酶原激活为纤溶酶，纤溶酶对赖氨酸具有高度的亲和性能并能裂解Lys-X位点，发色底物S-2403被纤溶酶水解后释放出游离的对硝基苯胺(pNA)，pNA在415nm处有较高吸收峰。本发明通过检测pNA在415nm处的吸收峰来判断纤溶酶原的活性。

SDS-PAGE电泳检测方法如下：取1ml发酵上清液放入离心管中离心，然后取40ul离心上清放入1.5ml离心管，另加入20ul还原或非还原loading Buffer，100℃加热5分钟，取20ul样品进行电泳胶点样，150V电泳60分钟，对电泳胶进行染色脱色照胶。

实施例1：发酵重组人奥克纤溶酶原的工艺

本实施例的工艺步骤如下：

1、种子液制备

取工程菌甘油种子解冻，接种到BMGY培养基摇瓶中振荡培养后扩增，得到OD₆₀₀值在5.0～15.0的种子液。

2、发酵罐发酵培养(32F171104批)

将上述制备得到的种子液接种到BSM基础培养基发酵(接种的种子液体积为BSM基础培养基体积的10％)，培养温度30.0±1.0℃，控制发酵液pH在5.0±0.5，维持溶解氧(D.O)在10％以上。培养待发酵液中初始甘油耗尽(此时发酵液中的溶解氧上升至100％)，补充初始发酵液体积3％的50％甘油，当发酵液中细胞湿重达到192g/L时，停止补加甘油。待发酵液中补加的甘油耗尽，加入甲醇进行诱导，甲醇的加入量为初始发酵液体积的40％，诱导的同时补加氨甲环酸至终浓度为0.1mol/L，并补加初始发酵液体积的2.5％的YP溶液，诱导52小时结束发酵。

上述“初始发酵液体积”即初始BSM基础培养基体积。

4、分离提纯

收集发酵上清，分离提纯得到重组人奥克纤溶酶原(样品编号为JZB32FE20170608批)。

上述分离提纯的方法为：将发酵上清在12000～15000g，2-8℃的条件下离心15～30min，然后将离心后的上清液过0.45μm孔径滤器进行过滤，将滤液进行混合模式层析：以MMC Mustang为层析填料作为层析填料，上样样品满足：pH＝6.0，电导不高于16mS/cm，保留时间2min。上样后，依次以18％B(180mmol/L NaCl)淋洗3-9CV，35％B(350mmol/L NaCl)洗脱，收集目的蛋白。

所得重组人奥克纤溶酶原的N端氨基酸序列为：APSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQ(SEQ ID NO：1)。

实施例2：发酵重组人奥克纤溶酶原的工艺

本实施例的工艺步骤如下：

1、种子液制备

2、发酵罐发酵培养(32F171105)

将上述制备得到的种子液接种到BSM培养基发酵(接种的种子液体积为BSM基础培养基体积的10％)，培养温度30.0±1.0℃，控制发酵液pH在5.0±0.5，维持D.O在10％以上。培养待发酵液中初始甘油耗尽(此时发酵液中的溶解氧上升至100％)，补充初始发酵液体积6.25％的50％甘油，当发酵液中细胞湿重达到180g/L时，停止补加甘油。待发酵液中补加的甘油耗尽(此时发酵液中的溶解氧再次上升至100％)，加入甲醇进行诱导，甲醇的加入量为初始发酵液体积的62.5％，诱导的同时补加氨甲环酸使之终浓度为0.1mol/L，同时补初始发酵液体积的4.25％的YP溶液。诱导53小时结束发酵。

上述“初始发酵液体积”即初始BSM基础培养基体积。

3、分离提纯

收集发酵上清，分离提纯得到重组人奥克纤溶酶原。分离提纯方法同实施例1。

实施例3：发酵重组人奥克纤溶酶原的工艺

1、种子液制备

2、发酵罐发酵培养(32F171106)

发酵基础培养基为BSM培养基，培养温度30.0±1.0℃，控制发酵液pH在5.0±0.5，维持D.O在10％以上。培养待发酵液中初始甘油耗尽(此时发酵液中的溶解氧上升至100％)，补充初始发酵液体积8.3％的50％甘油，当发酵液中细胞湿重达到185g/L时，停止补加甘油。待发酵液中补加的甘油耗尽(此时发酵液中的溶解氧再次上升至100％)，加入甲醇进行诱导，甲醇的加入量为初始发酵液体积的74％，诱导的同时补加氨甲环酸使之终浓度为0.1mol/L，同时补初始发酵液体积的3.8％的YP溶液。诱导54小时结束发酵。

上述“初始发酵液体积”即初始BSM基础培养基体积。

3、分离提纯

以下为对实施例1-3发酵工艺的测试结果。结果见表1、图1、图2、图3及图4。表1中，32F171104、32F171105、32F171106批开始诱导时对应的培养时间分别为24.5小时、24小时、25小时。

表1：实施例1-3发酵过程OD₆₀₀值和活性检测数据

由上表1数据及图1、图2、图3及图4结果可知，本发明发酵培养工艺多批生产目均能得到目的蛋白，且目的蛋白的表达量稳定，检测发酵液最终活性均大于200μg/mL(即3480IU/mL)，其中32F171106批次的终点活性达320ug/mL(即5568IU/mL)。

实施例4：制备重组人奥克纤溶酶的方法

一、制备酶切后的SAK酶

本实施例采用的重组葡激酶是由SAK酶片段+linker(含有His标签)+硫氧还原蛋白片段组成的融合蛋白(下文简称葡激酶融合蛋白)，在SAK酶片段的末端和linker片段之间有四个天冬氨酸和一个赖氨酸组成的特定位点。EK酶可以特异性切割此位点，进一步纯化将SAK酶片段和linker(含有His标签)+硫氧还原蛋白片段分开，得到酶切后的SAK酶。该葡激酶融合蛋白的氨基酸序列为：ggtaccgacgacgacgacaagtctagcagcttcgataagggcaaatataaaaaaggtgacgatgcgtcgtatttcgaaccgaccggcccgtacctgatggttaacgtgaccggcgtggatagcaaaggcaacgaactgctgagcccgcactacgttgaattcccgatcaaaccgggcaccaccctgaccaaagaaaaaatcgaatactacgttgaatgggcgctggacgcgaccgcgtacaaagaattccgcgtggttgaactggacccgagcgcgaaaatcgaggtgacctactacgacaaaaacaaaaagaaagaagaaaccaagagcttcccgatcaccgaaaaaggcttcgtggttccggatctgagcgaacacatcaaaaatccgggcttcaacctgatcaccaaagtggtgatcgagaaaaaataatgagagctc(SEQ ID NO：2)。

本实施例采用的肠激酶(简称EK酶)为来源于南京金斯瑞生物技术有限公司。

1、EK酶对葡激酶融合蛋白进行酶切

在8mL葡激酶融合蛋白溶液(其中葡激酶融合蛋白的浓度为2mg/mL)中添加24uLEK酶溶液(其中EK酶的活性为10IU/uL)，混匀，在23±2℃的水浴中静置17±0.1小时，过滤，得到酶切后的SAK酶溶液，编号为EK-SAK-meiqie-30min-20190107。

2、酶切后的纯化：

(1)NI亲和层析

以步骤1酶切后的SAK酶溶液为上样样品，以NI Bestarose 6FF作为亲和层析介质进行亲和层析，以pH5.5±0.1的50mM CB(碳酸盐)缓冲液为平衡缓冲液，收集含有目标成分(即酶切后的SAK酶)的流穿液，待下一步处理。(2)阳离子层析

取步骤(1)收集的流穿液，用注射用水稀释5倍后作为上样样品，进行阳离子层析，层析参数如下：

层析填料UniGel 50SP，货号H03W14KB，批次2017042702，厂家：苏州纳微科技股份有限公司；

层析柱：柱直径/柱高：100*500mm；柱体积：0.85L；AKTApilot：GE；APPS 200D：利穗；

洗脱剂：以0-100％B的洗脱剂梯度洗脱。洗脱剂由缓冲液A和缓冲液B组成，其中缓冲液B的浓度从0％增加到100％；缓冲液A为10mM碳酸盐缓冲液，pH＝5.5；缓冲液B为含10mM碳酸盐和0.5M NaCl的溶液，pH＝5.5。

收集含有目标成分(即酶切后的SAK酶)的洗脱液。(3)混合模式层析

取步骤(2)收集的洗脱液，调节pH＝5.5，作为上样样品，以Bestarose DiamondMIX-A作为层析介质进行混合模式层析，以pH5.4±0.1的10mM CB缓冲液作为平衡缓冲液，收集含有目标成分(即酶切后的SAK酶)的流穿液，待下一步处理。(4)过滤

取步骤(3)收集的流穿液，使用0.22μm滤器过滤，得到酶切后纯化的SAK酶原液(编号为EK-SAK-FT-20190107)，-20℃保存。

酶切后纯化的SAK酶的氨基酸序列为：SSSFDKGKYKKGDDASYFEPTGPYLMVNVTGVDSKGNELLSPHYVEFPIKPGTTLTKEKIEYYVEWALDATAYKEFRVVELDPSAKIEVTYYDKNKKKEETKSFPITEKGFVVPDLSEHI KNPGFNLITK VVIEKK(SEQ ID NO：3)。

从图11可以看出，利用本发明工艺对葡激酶融合蛋白进行酶切和纯化后可以得到较高纯度的SAK酶。

二、制备重组人奥克纤溶酶

(2.1)发酵液固液分离：

取实施例1收集的发酵上清液，离心，去除发酵培养液中大部分的不溶性杂质(例如宿主细胞和细胞碎片)，然后将离心后的清液使用0.45μm孔径滤器进行过滤，保留滤液。待下一步操作。

离心工艺参数设定为：12000-15000g，2-8℃，15-30min。

(2.2)混合模式层析(MMC)：

取步骤(2.1)过滤后的滤液作为上样样品，以MMC Mustang(厂家：博格隆(上海)生物技术有限公司)作为层析填料，以35％B(350mmol/L NaCl)作为洗脱液，收集含有目标成分(即重组人奥克纤溶酶原)的洗脱液。(2.3)酶切：

2.3.1酶切样品前处理：在步骤(2.2)收集的30mL洗脱液中添加10mL0.8M氨甲环酸，使样品中氨甲环酸的终浓度为0.2M，所得稀释液作为上样样品；

2.3.2酶切：在步骤2.3.1所得稀释液中添加0.53mL上文步骤(1.4)获得的酶切后的SAK酶，控制重组人奥克纤溶酶原与SAK酶的质量比为120：1，混匀溶液，将溶液置于23±2℃的水浴中进行酶切反应，4±0.1小时后取出(编号为JZB32-meiqie-4h-20190122)。

2.3.3酶切样品后处理：在步骤2.2.2酶切后的溶液中以1:1的体积比添加含20mMPB，2M(NH₄)₂SO₄，0.2M氨甲环酸的液体进行稀释，然后过滤，取滤液待下一处理。

(2.4)疏水层析：

以步骤2.3.3过滤后的滤液作为上样样品进行疏水层析，层析仪：AKTA Pure 25MGE；填料：Capto Butyl Impress(GE)，以20％-50％缓冲液B(缓冲液B：20mM PB，0.2M氨甲环酸)为洗脱液，收集含有目标成分(即重组人奥克纤溶酶)的洗脱液。

上述疏水层析后收集的洗脱液即本实施例纯化后的重组人奥克纤溶酶溶液。

三、稀配、过滤

(3.1)稀配

在步骤(2.4)收集的样品中加入含4.5g/L NaCl，0.583g/L一水柠檬酸的液体进行稀释，并用NaOH调pH至3.1±0.1，然后添加甘露醇，使最终样品中甘露醇浓度为1.87g/L，蛋白浓度为1.25mg/mL。

(3.2)原液：

取步骤(3.1)稀配后的样品，经0.2μm孔径滤膜过滤，于-20±5℃保存。

对照例1：制备重组人奥克纤溶酶的对照方法(利用重组葡激酶酶切重组人奥克纤溶酶原)

参照实施例4步骤二的方法，区别仅在于将步骤(2.3)中酶切后的SAK酶替换为未经酶切的葡激酶融合蛋白，得到纯化后的重组人奥克纤溶酶溶液。

以下通过实验例证明本发明的有益效果。

实验例1：发酵诱导过程中添加氨甲环酸对目的蛋白活性的影响

1、实验方法

(1)对比例1发酵工艺：

取238冻存菌液以YPD培养基活化过夜，得种子液，OD₆₀₀值为1.597。接种1.56mL种子液至25mLBSM培养基，摇床培养，培养18h后，将菌液离心取沉淀以25mL BSM培养基重悬，并添加0.5％甲醇培养，培养75h时结束培养，取样检测活性分析。

(2)JZB32FE20170104批发酵工艺：

取工程菌甘油种子解冻，接种到BMGY培养基摇瓶中振荡培养后扩增，得到OD₆₀₀值在5.0～15.0的种子液，接种至BSM培养基发酵，培养控制为30.0±1.0℃，控制发酵液pH在5.0±0.5，D.O在10％以上，培养待发酵液中初始甘油耗尽(此时发酵液中的溶解氧上升至100％)，补充初始发酵液体积的3.3％的50％甘油，当发酵液中细胞湿重达到185g/L时，停止补加甘油。待发酵液中补加的甘油耗尽(此时发酵液中的溶解氧再次上升至100％)，开始流加甲醇进行诱导，甲醇的加入量为初始发酵液体积的50％，诱导的同时补加氨甲环酸使之终浓度为0.1mol/L，待细胞湿重达300～450g/L结束发酵，发酵过程检测活性数据和SDS-PAGE电泳衡量目的蛋白的表达。

2、实验结果

表2：JZB32FE20170104批发酵过程OD₆₀₀值和活性检测数据

结果如表2、图5、图6和图7所示。实验结果显示：对比例1发酵工艺的发酵液上清酶活为2400IU/mL(即139.8μg/mL)；JZB32FE20170104批发酵工艺在在对比例1的基础上，在诱导发酵过程中添加了氨甲环酸，其在发酵至74.3小时时，发酵液上清酶活达3676IU/mL，明显高于对比例1的发酵工艺。可见，在诱导过程中添加氨甲环酸能提高目的蛋白的活性。

实验例2：发酵诱导过程中氮源的选择对目的蛋白的表达和活性的影响

通过实验例1中JZB32FE20170104批目的蛋白活性和电泳图可知，目标蛋白在发酵后期出现降解，在此基础上，本发明进行以下实验，探索发酵诱导过程中氮源的选择对目的蛋白的表达和活性的影响。

1、实验方法

发酵基础培养基为BSM培养基，发酵罐发酵2批(分别编号为JZB32FE20170608、JZB32FE20170615)，培养温度30.0±1.0℃，种子液OD₆₀₀值在5.0～15.0，控制发酵液pH在5.0±0.5，维持D.O在10％以上。培养待发酵液中初始甘油耗尽(此时发酵液中的溶解氧上升至100％)，开始流加50％甘油，甘油加入量为初始发酵液体积的3.3％，当发酵液中细胞湿重达到180～220g/L时，停止补加甘油。待发酵液中补加的甘油耗尽(此时发酵液中的溶解氧再次上升至100％)，开始流加甲醇进行诱导，甲醇的加入量为初始发酵液体积的50％，诱导时添加氨甲环酸至终浓度0.1mol/L，并分别在JZB32FE20170608批次中流加YP溶液，JZB32FE20170615批次流加硫酸铵，YP溶液或硫酸铵加入量为初始发酵液体积的3.5％，待细胞湿重达300～450g/L结束发酵，收集发酵上清，以检测的目的蛋白的活性数据和SDS-PAGE电泳衡量来衡量目的蛋白的表达。

2、实验结果

实验结果见表3、图8、图9及图10。

表3：添加硫酸铵或YP发酵过程OD₆₀₀值和活性检测数据

可以看出，与实验例1的JZB32FE20170104批数据相比，JZB32FE20170608(添加YP)批在诱导发酵过程中添加YP溶液能够有效提高目的蛋白活性。

另外，与发酵诱导过程中添加硫酸铵(JZB32FE20170615批)相比，与发酵诱导过程中添加YP(JZB32FE20170608批)的发酵OD₆₀₀值和目的蛋白的活性有显著的提高(活性高达6507IU/mL)，目标蛋白表达量也有显著的提高。

上述实验结果表明，发酵诱导过程中添加YP比硫酸铵能更有效的提高目的蛋白的表达和活性。

实验例3：发酵pH对目的蛋白活性的影响

1、实验方法

参照实施例1的发酵工艺，区别仅在于将发酵液pH从发酵液pH在调整为7.0或3.0。分别检测不同pH条件下目的蛋白的表达和活性。

2、实验结果

结果显示，发酵液pH为7.0时，目的蛋白的活性较低，最大不超过500IU/mL；发酵液pH为3.0时，目的蛋白的活性最大不超过2000IU/mL，且在发酵诱导后期活性大幅度下降。

上述实验结果表明，在pH为5.0±0.5时发酵培养能够有效提高目的蛋白的表达和活性。

实验例4：接种OD600对目的菌种生长及蛋白活性表达的影响

参照实施例1的发酵工艺，改变接枝种子液的OD₆₀₀值，观察菌种生长情况。结果显示，接种OD₆₀₀值太小会导致菌种生长不起来，种子液OD₆₀₀值在5.0～15.0有利于后续菌种的生长和目的蛋白的表达。

实验例5：高效液相色谱表征

1、测试样品

实施例4步骤(2.4)疏水层析后收集的纯化后重组人奥克纤溶酶样品(编号为JZB32-CH-HIC-E1-20190122)；得到的纯化后的重组人奥克纤溶酶，对照例1疏水层析后收集的纯化后重组人奥克纤溶酶样品(编号为32S171103)。

2、色谱条件

高效液相色谱仪，反相色谱柱，Zorbax 300SB-C18；

色谱柱：Zorbax 300SB-C18(5μm，4.6X250mm)；

标准进样量：10μL；

检测波长：215nm；

柱温：60℃；

流速：1.0mL/min；

供试品浓度：1mg/mL。

3、实验结果

从图13可以看出，对照例1制得的纯化后的重组人奥克纤溶酶在保留时间39min处有杂质峰，即杂质A。但是，本发明实施例4制得的纯化后的重组人奥克纤溶酶未在保留时间39min处出现杂质A的检测峰。

上述实验结果表明，以葡激酶融合蛋白对重组人奥克纤溶酶进行酶切，经疏水层析分离得到的重组人奥克纤溶酶中含有杂质A；但是，以酶切后的SAK酶对重组人奥克纤溶酶进行酶切，经疏水层析分离得到的重组人奥克纤溶酶中不含杂质A。本发明的方法有效去除了重组人奥克纤溶酶中的杂质A。

综上，本发明提供了一种制备重组纤溶酶的方法。本发明首次发现利用该方法能够有效去除重组纤溶酶中的杂质A，提高了重组克纤溶酶的纯度，排除了药品在临床应用中潜在的稳定性和安全性风险。本发明的方法成本较低，操作简单，适合工业化生产。

SEQUENCE LISTING

<110> 景泽生物医药（合肥）有限公司

上海景泽生物技术有限公司

成都景泽生物制药有限公司

<120> 一种制备重组人奥克纤溶酶的方法

<130> GYKH1285-2021P0114028CC

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Ala Pro Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val Glu Pro Lys Lys Cys

1 5 10 15

Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp Pro

20 25 30

Trp Gln

<210> 2

<211> 441

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Gly Gly Thr Ala Cys Cys Gly Ala Cys Gly Ala Cys Gly Ala Cys Gly

1 5 10 15

Ala Cys Ala Ala Gly Thr Cys Thr Ala Gly Cys Ala Gly Cys Thr Thr

20 25 30

Cys Gly Ala Thr Ala Ala Gly Gly Gly Cys Ala Ala Ala Thr Ala Thr

35 40 45

Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Thr Gly Ala Cys Gly Ala Thr Gly

50 55 60

Cys Gly Thr Cys Gly Thr Ala Thr Thr Thr Cys Gly Ala Ala Cys Cys

65 70 75 80

Gly Ala Cys Cys Gly Gly Cys Cys Cys Gly Thr Ala Cys Cys Thr Gly

85 90 95

Ala Thr Gly Gly Thr Thr Ala Ala Cys Gly Thr Gly Ala Cys Cys Gly

100 105 110

Gly Cys Gly Thr Gly Gly Ala Thr Ala Gly Cys Ala Ala Ala Gly Gly

115 120 125

Cys Ala Ala Cys Gly Ala Ala Cys Thr Gly Cys Thr Gly Ala Gly Cys

130 135 140

Cys Cys Gly Cys Ala Cys Thr Ala Cys Gly Thr Thr Gly Ala Ala Thr

145 150 155 160

Thr Cys Cys Cys Gly Ala Thr Cys Ala Ala Ala Cys Cys Gly Gly Gly

165 170 175

Cys Ala Cys Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Ala Cys Cys Ala Ala Ala

180 185 190

Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Thr Cys Gly Ala Ala Thr Ala Cys Thr

195 200 205

Ala Cys Gly Thr Thr Gly Ala Ala Thr Gly Gly Gly Cys Gly Cys Thr

210 215 220

Gly Gly Ala Cys Gly Cys Gly Ala Cys Cys Gly Cys Gly Thr Ala Cys

225 230 235 240

Ala Ala Ala Gly Ala Ala Thr Thr Cys Cys Gly Cys Gly Thr Gly Gly

245 250 255

Thr Thr Gly Ala Ala Cys Thr Gly Gly Ala Cys Cys Cys Gly Ala Gly

260 265 270

Cys Gly Cys Gly Ala Ala Ala Ala Thr Cys Gly Ala Gly Gly Thr Gly

275 280 285

Ala Cys Cys Thr Ala Cys Thr Ala Cys Gly Ala Cys Ala Ala Ala Ala

290 295 300

Ala Cys Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala Ala Gly Ala Ala Gly Ala

305 310 315 320

Ala Ala Cys Cys Ala Ala Gly Ala Gly Cys Thr Thr Cys Cys Cys Gly

325 330 335

Ala Thr Cys Ala Cys Cys Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Cys Thr

340 345 350

Thr Cys Gly Thr Gly Gly Thr Thr Cys Cys Gly Gly Ala Thr Cys Thr

355 360 365

Gly Ala Gly Cys Gly Ala Ala Cys Ala Cys Ala Thr Cys Ala Ala Ala

370 375 380

Ala Ala Thr Cys Cys Gly Gly Gly Cys Thr Thr Cys Ala Ala Cys Cys

385 390 395 400

Thr Gly Ala Thr Cys Ala Cys Cys Ala Ala Ala Gly Thr Gly Gly Thr

405 410 415

Gly Ala Thr Cys Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala

420 425 430

Thr Gly Ala Gly Ala Gly Cys Thr Cys

435 440

<210> 3

<211> 136

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Ser Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Lys Gly Asp Asp Ala Ser

1 5 10 15

Tyr Phe Glu Pro Thr Gly Pro Tyr Leu Met Val Asn Val Thr Gly Val

20 25 30

Asp Ser Lys Gly Asn Glu Leu Leu Ser Pro His Tyr Val Glu Phe Pro

35 40 45

Ile Lys Pro Gly Thr Thr Leu Thr Lys Glu Lys Ile Glu Tyr Tyr Val

50 55 60

Glu Trp Ala Leu Asp Ala Thr Ala Tyr Lys Glu Phe Arg Val Val Glu

65 70 75 80

Leu Asp Pro Ser Ala Lys Ile Glu Val Thr Tyr Tyr Asp Lys Asn Lys

85 90 95

Lys Lys Glu Glu Thr Lys Ser Phe Pro Ile Thr Glu Lys Gly Phe Val

100 105 110

Val Pro Asp Leu Ser Glu His Ile Lys Asn Pro Gly Phe Asn Leu Ile

115 120 125

Thr Lys Val Val Ile Glu Lys Lys

130 135

Claims

1.一种制备重组纤溶酶的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

（1）制备酶切后的葡激酶：

取重组葡激酶进行酶切，将酶切物分离纯化，得到酶切后的葡激酶；其中，酶切后的葡激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述酶切时采用的酶切试剂为肠激酶，酶切的温度为20~26℃，时间为14~20小时；

（2）制备重组纤溶酶：

先按照以下方法制得重组纤溶酶原：

（a）种子活化与扩增：将表达重组纤溶酶原的毕赤酵母工程菌活化，扩增，得到种子液；

（b）发酵：将步骤（1）的种子液接种至发酵培养基，进行发酵培养，当发酵液中细胞湿重大于等于180g/L，同时溶解氧大于等于100%时，加入诱导剂进行诱导，同时加入由质量比为1：（1~4）的酵母粉和蛋白胨组成的氮源，诱导表达35~75小时，终止发酵；在加入诱导剂的同时还加入了终浓度为0.01~0.2mol/L的氨甲环酸；

（c）收集发酵上清，分离提纯得到重组纤溶酶原；所述重组纤溶酶原为重组人奥克纤溶酶原，所述重组人奥克纤溶酶原的N端氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；

然后在重组纤溶酶原中加入酶切后的葡激酶进行酶切，将酶切物分离纯化，得到重组纤溶酶。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述重组葡激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述分离纯化的方法为：

（1.1）将酶切物上样到NI亲和层析柱，用平衡缓冲液冲洗，收集含有酶切后的葡激酶的流穿液；

其中，NI亲和层析柱的填料为NI Bestarose 6FF；

平衡缓冲液为pH=5.5的50mM碳酸盐缓冲液；

（1.2）将步骤（1.1）收集的流穿液上样到阳离子层析柱，用洗脱剂洗脱，收集含有酶切后的葡激酶的洗脱液；

其中，阳离子层析柱的填料为UniGel 50SP；

洗脱的方式为梯度洗脱；

洗脱剂由缓冲液A和缓冲液B组成，其中缓冲液B的浓度从0%增加到100%；缓冲液A为10mM碳酸盐缓冲液，pH=5.5；缓冲液B为含10mM 碳酸盐和0.5M NaCl的溶液，pH=5.5；

（1.3）将步骤（1.2）收集的洗脱液上样到混合模式层析柱，用平衡缓冲液冲洗，收集含有酶切后的葡激酶的流穿液；

其中，混合模式层析柱的填料为Bestarose Diamond MIX-A；

平衡缓冲液为pH=5.4的10mM碳酸盐缓冲液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述重组纤溶酶原与酶切后的葡激酶的质量比为1:（100~140）；所述酶切的温度为20~26℃，时间为2~6小时。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述分离纯化的方法为：将酶切物上样到疏水层析柱，用洗脱剂洗脱，收集含有重组纤溶酶的洗脱液；

其中，疏水层析柱的填料为Capto Butyl Impress GE；

洗脱剂为20%~50%的缓冲液X，洗脱剂中缓冲液X的浓度从20%增加到50%；

缓冲液X为含20mM磷酸盐和0.2M氨甲环酸的溶液。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于：步骤（a）中，所述种子液OD₆₀₀值为5.0~15.0；

步骤（b）中，所述诱导剂为甲醇，甲醇的加入量为发酵培养基体积的40-74%；所述氮源由质量比为1：2的酵母粉和蛋白胨组成；所述氮源的加入量为发酵培养基体积的2.5-4.25%；所述诱导表达的时间为52~54小时。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述氨甲环酸的终浓度为0.1mol/L。